CN1787832A

CN1787832A - 治疗与骨破坏相关的炎症性疾病的方法

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Publication number: CN1787832A
Application number: CNA2004800128993A
Authority: CN
Inventors: 居石克夫; 米满吉和; 山下彰久; 吉村昭彦; 长谷川护
Original assignee: Dnavec Research Inc
Current assignee: Dnavec Research Inc
Priority date: 2003-03-19
Filing date: 2004-03-05
Publication date: 2006-06-14
Also published as: CA2519414A1; EP1611900A1; US20070173466A1; AU2004222418A1; WO2004082704A1; KR20050114241A; JPWO2004082704A1

Abstract

本发明涉及治疗与骨破坏相伴的炎症性疾病的方法，包括给患病部位施用病毒载体，该载体包含抑制成纤维细胞生长因子－2(FGF2)－FGF受体1－Ras－Raf－MAP激酶介导的信号传递的基因。本发明还涉及用于治疗与骨破坏相伴的炎症性疾病的治疗组合物，它包含上述载体。通过局部施用病毒载体抑制FGF2信号传递，可以同时抑制炎症性骨破坏中的炎症和骨破坏二者。本发明提供了特异性针对目前难以治疗的骨关节炎等炎症性疾病的有效治疗方法和治疗组合物。

Description

治疗与骨破坏相关的炎症性疾病的方法

技术领域

本发明涉及通过调节成纤维细胞生长因子-2(FGF2)功能并抑制它的细胞内信号传递***，来治疗与骨破坏相伴的炎症性疾病。本发明的方法特别可以用于治疗类风湿性关节炎(RA)。

背景技术

当今世界关于RA治疗的研究开发出多种策略和疾病修饰性(diseasemodifying)抗类风湿药物(DMARD)。RA治疗的主要技术(RA治疗策略)在下文中列出。这些技术是使用抗RA的生物学制剂进行的治疗和策略。

(1)调节肿瘤坏死因子(TNF)的治疗方法

这些是RA治疗中用可溶性TNF受体(Moreland，L.W.et al.，N.Engl.J.Med.337：141-147(1997)；Bathon，J.M.et al.，N.Engl.J.Med.343：1586-1593(2000))或抗-TNF-α抗体(Maini，R.N.et al.，Ann.Rheum.Dis.58：I56-I60(1999)；Lipsky P.E.et al.，N.Engl.J.Med.343：1594-1602(2000)；Maini，R.N.et al.，Lancet 354：1932-1939(1999)调节TNF-α功能的抗细胞因子疗法。

(2)调节白细胞介素-1(IL-1)的治疗方法

这些是RA治疗中用IL-1受体拮抗剂调节IL-1功能的抗细胞因子疗法(Cohen，S.et al.，Arthritis Rheum.46：614-624(2002))。

(3)调节IL-6的治疗方法

这些是RA治疗中用抗-IL-6受体单克隆抗体调节IL-6功能的抗细胞因子疗法(Nishimoto，N.et al.，Ann.Rheum.Dis.59：I21-I27(2000))。

(4)调节VEGF功能的治疗方法

这些是RA治疗中用可溶性VEGF受体(Miotla，J.et al.，Lab.Invest.，80：1195-205(2000))或抗-VEGF抗体(Lu，J.et al.，J.Immunol.164：5922-7(2000)；Sone，H.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.281：562-8(2001))抑制VEGF功能的抗细胞因子疗法。

但这些传统技术存在一些问题。例如，一个主要问题是，最终很难防止骨关节破坏。也就是说，虽然传统的技术和药物通过抑制滑膜炎起到缓解主观和客观症状的效果，但它们直接抑制骨关节破坏的效果很差。使用传统技术和药物所观察到的唯一效果是延迟骨破坏的进展，这被认为是由于对炎症进行抑制的结果，因此很难最终避免骨关节破坏。不仅如此，在用嵌合性中和抗体进行的治疗中，由于同时产生人抗-中和抗体，使中和抗体的效果减弱，因此这些疗法在临床使用时必需同时使用氨甲喋呤等免疫抑制剂。此外，还有观点认为，在靶向炎症性细胞因子的抗-细胞因子疗法中，以及在生物学制剂全身给药***中，可能在无病灶的器官出现各种意外的副作用。

发明内容

本发明提供了通过抑制FGF2功能或阻断其细胞内信号传递***来治疗与骨破坏相伴的炎症性疾病的方法。本发明还提供了治疗疾病的组合物，其包含编码蛋白的载体，所述载体抑制FGF2功能或阻断其细胞内信号传递***。

FGF2是一种生长因子，它在细胞分化和发育过程中起重要作用(Klansbrun，M.，1989，Prog.Growth Factor Res.1：207-235；Mason，I.，1994，Cell 78：547-552；Bikfalvi，A.et al.，1997，Endocr.Rev.18：26-45)。FGF2在FGF受体(FGFR)介导的正常发育过程和组织再生中起重要作用，它还与癌症生长和炎症有关(Basilico，C.and Moscatelli，D，1992，Adv.Cancer Res.59：115-165；Klein，S et al.，1997，Experientia Suppl.79：159-192；Jackson，J.etal.，1997，FASEB J.11：457-465)。此外，FGF2增强成纤维细胞、血管内皮细胞、成骨细胞、表皮细胞等细胞的增殖，并且在血管新生、骨和软骨形成、伤口愈合等方面也起到调节因子的作用(Marie，P.et al.，2000，Joint BoneSpine 67：150-156；Boyce，B.et al.，1999，Lab.Invest.79：83-94；Goldfarb，M.1996，Cytokine Growth Factor Rev.7：311-325；Chikazu，D.et al.，2000，J.Biol.Chem.275：31444-31450；Yamashita，A.et al.，2002，J.Immnol.168：450-457；Collon-Osdoby，P.et al.，2002，J.Bone Mineral Res.17：1859-1871)。已知FGF2结合FGFR1 IIIb，FGFR1 IIIc，FGFR2 IIIc，FGFR3 IIIc和FGFR4(Ornitz et al.，1996，J.Biol.Chem.，271：15292-15297)。当FGF2结合FGFR时，下游信号分子受酪氨酸磷酸化活性的作用而被磷酸化，将信号传递给Ras、Raf-1、MAPKK和MAPK。本发明人因此考虑，利用表达抑制信号传递的基因的载体抑制上述信号传递，可以对炎症性骨疾病进行基因治疗。

本发明人构建了编码分泌型FGF2受体、Sprouty2和Spred的病毒载体，所述受体抑制FGF2功能，所述Sprouty2和Spred阻断FGF2的细胞内信号传递***。然后，本发明人对RA模型大鼠的患病关节施用上述载体进行基因治疗。结果表明，在施用任一种上述载体的模型大鼠中，关节的炎症被显著抑制，而且，骨质损失减少，在施用了上述载体的关节中还观察到显著的治疗效果。因此，本发明人通过在患病骨区，局部施用能表达抑制FGF2功能或阻断其细胞内信号传递***的蛋白的载体，起到同时抑制患病部位的炎症和骨破坏的效果，成功地显著改善了症状。目前对于RA等与骨破坏相伴的炎症性疾病缺乏有效的治疗方法；而本发明的这些新治疗方法可以利用基因治疗在患病部位同时抑制炎症和骨破坏。通过对患病部位局部用药，可以预防全身用药引起的副作用。此外，经由上述载体表达信号传递的抑制因子，可以长时间维持治疗效果。

因此，本发明涉及通过抑制FGF2功能和抑制其细胞内信号传递***来治疗与骨破坏相伴的炎症性疾病的方法。本发明还涉及这些治疗中所用的药物组合物。具体地，本发明涉及每一项权利要求中描述的发明。而且，本发明包含每一项权利要求所列出的一或多项(或所有)发明的所需组合。更具体地，本发明涉及：

[1].治疗与骨破坏相伴的炎症性疾病的方法，包括施用载体，所述载体编码蛋白或核酸，所述蛋白或核酸抑制由成纤维细胞生长因子-2(FGF2)-FGF受体1-Ras-Raf-MAP激酶介导的信号传递。

[2].方法[1]，其中所述载体是负链RNA病毒载体。

[3].方法[2]，其中所述负链RNA病毒载体是仙台病毒载体。

[4].方法[1]，其中所述抑制信号传递的蛋白选自可溶性FGF受体、Sprouty2或Spred。

[5].方法[1]，其中所述疾病是骨关节炎。

[6].治疗与骨破坏相伴的炎症性疾病的治疗组合物，包括编码蛋白或核酸的载体和可药用承运体，所述蛋白或核酸抑制由成纤维细胞生长因子-2(FGF2)-FGF受体1-Ras-Raf-MAP激酶介导的信号传递。

[7].组合物[6]，其中所述载体是负链RNA病毒载体。

[8].组合物[7]，其中所述负链RNA病毒载体是仙台病毒载体。

[9].组合物[6]，其中所述抑制信号传递的蛋白选自可溶性FGF受体、Sprouty2或Spred。

[10].组合物[6]，其中所述疾病是骨关节炎。

本发明提供了治疗与骨破坏相伴的炎症性疾病的方法，该方法通过抑制FGF2功能和抑制其细胞内信号传递***来一并治疗骨疾病中的炎症和骨破坏。也就是说，本发明人提供了治疗策略，在所述策略中，由FGF2-FGF受体1-Ras-Raf-MAP激酶***介导的一连串细胞外和/或细胞内FGF2信号传递被抑制。患病部位的炎症和骨破坏，可以通过对该患病部位施用编码FGF2信号传递***抑制因子的载体而同时抑制。FGF2与FGF受体(FGFR)受体结合，形成二聚体，并通过诱导酪氨酸自我磷酸化而被活化。活化的FGFR酪氨酸激酶使Src激酶和磷脂酶Cγ(PLCγ)等酶的酪氨酸，以及Shc和FGF受体底物2(FRS2)等接头(adaptor)蛋白的酪氨酸被磷酸化。磷酸化的Shc和FRS2与Grb2结合，将Sos集中(recruit)到细胞膜，由Sos活化Ras。活化的Ras与Raf-1激酶结合并活化MAPK激酶，后者再活化MAP激酶。一种被称为SHP2的酪氨酸磷酸酶与FRS2结合。由FGF2-FGF受体1-Ras-Raf-MAP激酶介导的信号传递是如上所述的始于FGF2且止于MAPK，的信号传递。抑制该信号传递是指，例如，抑制这种从FGF2到FGF受体1、Ras、Raf和MAP激酶的信号传递***中的一或多个目标点。例如，可以抑制FGF2，FGF受体1，Shc，Grb2，Sos，FRS2，SHP2，Ras，Raf，MAPKK和MAPK的活性(如与其它信号分子的相互作用或磷酸化活性)。此外，可以抑制每一种信号分子的表达(如转录，翻译，或mRNA-蛋白的稳定性)。

抑制由FGF2-FGF受体-1-Ras-Raf-MAP激酶介导的信号传递的蛋白和核酸的例子包括，抗参与该信号传递的分子的反义核酸、具有RNA干扰(RNAi)效应的RNA、核酶、抗体等。反义核酸的例子包括，含有针对信号分子编码基因中至少13个、优选至少14个、更优选至少15个、更优选至少20个连续有义链核苷酸的反义序列的核酸。例如，含有针对早期转录子中外显子-内含子边界和内含子-外显子边界的反义序列的核酸，含有翻译起始密码子的区域，以及成熟mRNA中蛋白编码序列都是优选的。核酶的例子包括切割靶基因mRNA的核酶。例如，锤头型核酶(Rossi，et al.(1991)Pharmac.Ther.50：245-254)和发卡型核酶(Hampel，et al.(1990)Nucl.AcidsRes.18：2999-304)已知能切割特定的核苷酸序列。这些核酶可以用催化活性切割与反义序列杂交的多核苷酸中的特定位置。与对信号分子活性有重要意义的结构域(例如磷酸化位点或与其它信号分子相互作用的位点)结合的抗体都被用作抑制信号传递的抗体。

在本发明一个优选实施方案中，抑制由FGF2-FGF受体1-Ras-Raf-MAP激酶介导的信号传递的蛋白组合物由载体表达。有两种主要的优选方式进行抑制：(1)利用可溶性FGF受体基因抑制信号传递，和(2)利用抑制细胞内信号传递***(Ras-Raf-MAP激酶***)的基因。本发明的具体实施例如下：

1. 利用可溶性FGF受体基因进行基因治疗

目前有多项研究报道，滑膜组织表达FGF受体1-4，破骨细胞仅表达受体1，而且由FGF受体1-MAPK(p42/p44MAPK)介导的信号传递在破骨细胞分化和生物功能表达方面很重要。在本发明优选实施方案中，将人可溶性FGF受体(hsFGFR)基因通过载体直接导入滑膜组织中进行基因治疗，从而在细胞外抑制FGF2的功能。可溶性FGF是在FGF受体胞外区包含FGF2结合结构域的蛋白，它在细胞内表达后被分泌到细胞外侧。编码分泌蛋白的核酸可以通过使FGF受体基因中编码跨膜区和胞内区的核酸缺失而获得。分泌到细胞外的可溶性FGF受体通过与FGF2结合，以及通过干扰FGF2与内源FGFR-1结合而抑制FGF2信号传递。将携带编码可溶性FGF受体的基因的载体施用至骨破坏部位，可以观察到显著抑制炎症和骨破坏的效应。可溶性FGF受体可以是包含FGF受体上与FGF2结合的FGF2结合区的分泌蛋白，它们包括天然蛋白和通过基因重组人工制备的蛋白。具体例子包括，含有FGFR1a IIIb(Accession NM_015850，NP_056934，AAB19502，Isacchi，A.et al.，1990，Nucleic Acids Res.18：1906；Johnson，D.E.et al.，1991，Mol.Cell.Biol.11：4627-4634)，FGFR1b(IIIb)(AccessionNM_023106，NP_075594，AAB19502，Isacchi，A.et al.，1990，Nucleic AcidsRes.18：1906；Johnson，D.E.et al.，1991，Mol.Cell.Biol.11：4627-4634)，FGFR1a(IIIc)(Accession NM_015850，NP_056934，AAB19502，Isacchi，A.etal.，1990，Nucleic Acids Res.18：1906)，FGFR1b(IIIc)(Accession NM_023106，NP_075594，AAB19502，Isacchi，A.et al.，1990，Nucleic Acids Res.18：1906)，FGFR2(IIIc)(Accession NM_022962，NP_075251，Johnson，D.E.et al.，1991，Mol.Cell.Biol.11：4627-4634)，FGFR3(IIIc)(Accession P22607，Keegan，K.etal.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：1095-1099)，and FGFR4(AccessionAAB25788，Ron，D.et al.，1993，J.Biol.Chem.268：5388-5394)等胞外区的分泌蛋白。尤其优选FGFR1 IIIa和成纤维细胞生长因子受体((FGFr)，分泌型)，它们以剪接变体的形式存在于自然界，并且发挥FGF2的天然抑制剂的功能。例如，分泌型FGFr的基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)在登录号M341888中描述，氨基酸序列(SEQ ID NO：2)在蛋白ID AAA35839中描述(Johnson，D.E.et al.，Mol.Cell.Biol.10(9)，4728-4736(1990))。

2. 通过抑制细胞内信号传递***进行治疗

Spred作为与Sprouty2和Sprouty有关的Ras信号抑制因子，可通过与Ras结合、干扰Raf的磷酸化和活化、和抑制MAP激酶活化，来调节FGF受体和表皮生长因子(EGF)的生理作用。当利用基因治疗将Sprouty2或Spred基因导入滑膜组织和/或周围骨胳肌组织，从而局部表达所述基因时，可以抑制FGF2分子介导的滑膜炎和破骨细胞性骨吸收，发挥治疗效果。Sprouty2[人(Homo sapiens)]的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)和氨基酸序列(SEQ ID NO：4)分别具有登录号NM_005842和NP_005833。Spred2[鼠(Mus musculus)]的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)和氨基酸序列(SEQ ID NO：6)分别具有登录号AB063496和BAB62849。人Spred2序列具有登录号NM_181784和NP_861449(Hacohen，N.，et al.，Cell 92(2)，253-263(1998)；Glienke，J.，et al.，Mech.Dev.96(1)，91-99(2000)；Lim，J.，et al.，J.Biol.Chem.275(42)，32837-32845(2000)；Wong，E.S.，et al.，J.Biol.Chem.276(8)，5866-5875(2001)；Yusoff，P.，et al.，J.Biol.Chem.277(5)，3195-3201(2002)；Egan，J.E.，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(9)，6041-6046(2002)；Wakioka，T.，et al.，Nature 412(6847)，647-651(2001))。也可以使用Sef(与fgf基因表达类似)，它可以作为由Ras/Raf/MEK/MAPK介导的FGF信号传递***的拮抗剂(Furthauer，M.，et al.，Nat.Cell Biol.，2002，4(2)：170-4)。还可以使用fgf8，fgf3和Sprouty4。

Sef(与fgf基因表达类似)(也称IL17RLM，FLJ 35755或IL-17RD)的核苷酸序列是登录号NM_017563所示序列的第523-2307位，Sef的氨基酸序列见NP_060033(Clark，H.F.，et al.，Genome Res.13(10)，2265-2270(2003)；Yang，R.B.，et al.，J.Biol.Chem.278(35)，33232-33238(2003)；Kovalenko，D.，et al.，J.Biol.Chem.278(16)，14087-14091(2003)；Furthauer，M.，et al.，Nat.Cell Biol.4(2)，170-174(2002)；Tsang，M.，et al.，Nat.Cell Biol.4(2)，165-169(2002))。FGF8(成纤维细胞生长因子8)基因的核苷酸序列见登录号NM_033165所示序列的第237-782位。FGF8(成熟蛋白)的氨基酸序列见NP_149355的第23-204位(Gnanapragasam，V.J.，et al.，Br.J.Cancer 88，1432-1438(2003)；Gnanapragasam，V.J.，et al.，Oncogene 21，5069-5080(2002)；Tanaka，S.，et al.，Dig.Dis.Sci.46，1016-1012(2001)；Ghosh，A.K.，et al.，CellGrowth Difer.7，1425-1434(1996))。FGF3(成纤维细胞生长因子3)基因的核苷酸序列见登录号NM 005247所示序列的第543-1208位，FGF3(成熟蛋白)的氨基酸序列见NP_005238的第18-239位(Kong，M.，et al.，J.Biol.Chem.277(18)，15962-15970(2002)；Galdemard，C.，et al.，J.Biol.Chem.275(23)，17364-17373(2000)；Thompson，L.M.，et al.，Genomics 11(4)，1133-1142(1991))。Sprouty4(也称Spry4)基因的核苷酸序列见登录号NM_030964所示序列的第188-1153位，Sprouty4的氨基酸序列见NP_112226(Sasaki，A.，et al.，Nat.Cell Biol.5(5)，427-432(2003)；Leeksma，O.C.，et al.，Eur.J.Biochem.269(10)，2546-2556(2002))。

带有修饰的氨基酸的天然蛋白，例如自然界存在的变体和其它哺乳动物中的对应物，可以作为上述可溶性FGFR，也可以作为FGFR细胞内信号传递的抑制蛋白。具体地，本发明优选的蛋白包括天然可溶性FGFR或包括FGFR细胞内信号传递的抑制蛋白，它们的氨基酸序列中有一或多个氨基酸取代、缺失和/或添加；还包括与天然可溶性FGFR或FGFR细胞内信号传递的抑制蛋白有氨基酸同源性的蛋白，所述同源性至少70％、优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％；还包括与含有天然可溶性FGFR或FGFR细胞内信号传递的抑制蛋白的部分或完整编码区的核酸在严格条件下杂交的核酸所编码的蛋白，它们抑制由FGF2-FGF受体1-Ras-Raf-MAP激酶介导的信号传递。例如，可溶性FGFR可以包含所需变异，只要它是具有FGF2结合活性的分泌蛋白。而且，Sprouty2或Spred的变异体只要具有抑制Ras磷酸化的活性，就可以用在本发明中。

氨基酸取代、缺失和/或添加的数目通常不超过15个，优选不超过11个，更优选不超过9个，更优选不超过7个，更优选不超过5个。带有保守取代的氨基酸的蛋白倾向于维持它们的活性。保守取代包括在下述每一组中不同氨基酸之间的取代，诸如碱性氨基酸(如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性氨基酸(如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的氨基酸(如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性氨基酸(如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，具有β支链的氨基酸(如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)，以及芳族氨基酸(如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。氨基酸序列同一性可以利用，例如，BLAST程序来测定(Altschul，S.F.et al.，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)。具体地，可以使用blastp程序。例如，可以在NCBI(National Center for Biotechnology Information)的BLAST互联网网页上，关掉所有过滤器(filter)包括Low complexity，用默认参数进行检索(Altschul，S.F.et al.(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden，T.L.et al.(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul，S.F.et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang，J.& Madden，T.L.(1997)Genome Res.7：649-656)。例如，BLAST 2 Sequences program(Tatiana A et al.(1999)FEMS Microbiol Lett.174：247-250)可以比较两个序列，因此可以用该程序生成两个序列的对比排列，从而确定这些序列之间的同一性。对空隙的处理与对错配的处理类似。例如，可以计算与天然可溶性FGFR或FGFR细胞内信号传递抑制蛋白的完整氨基酸序列相比的同一性数值。而在杂交中，探针是根据包含天然可溶性FGFR或FGFR细胞内信号传递抑制蛋白编码区的核酸来制备，或根据需要进行杂交的核酸来制备，然后检测这些探针是否与其它核酸杂交，从而鉴定杂交。严格杂交条件例如是，在包含5×SSC，7％(W/V)SDS，100μg/ml变性鲑精DNA，5×Denhardt’s液(1×Denhardt’s溶液，其中含0.2％聚乙烯吡硌烷酮，0.2％牛血清白蛋白，和0.2％ ficoll)的溶液中、在48℃(优选50℃，更优选52℃)进行杂交，然后在与杂交相同的温度(优选60℃，更优选65℃，最优选68℃)振荡洗涤2小时。

所需载体***，包括病毒载体和质粒载体等裸露DNA，可以用作与编码抑制上述信号传递的蛋白的核酸或基因一起导入的载体。但优选病毒载体。病毒载体的例子包括，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、单纯疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、塞姆利基(Semliki)森林病毒载体、新培斯(Sindbis)病毒载体、痘苗病毒载体、禽痘病毒(fowlpox virus)载体和仙台病毒载体。这些病毒载体可以用基因工程方法制成重组病毒载体。

在本说明书中，“重组”病毒载体是指，通过重组多核苷酸生成的病毒载体，或通过扩增这些病毒载体得到的病毒载体。重组多核苷酸是指，在其序列的两端不同于自然状态的多核苷酸。更具体地，例如，人为取代的多核苷酸链或新构建的多核苷酸。重组多核苷酸可以用公知的重组技术，通过联合使用多核苷酸合成和核酸酶或连接酶处理等方法来制备。

重组病毒载体可以用本领域技术人员公知的方法制备。例如，基因治疗中最常用的腺病毒载体可以按照Saito等的方法(Miyake，et al.，1996，Proc.Natl.Acd.Sci.USA，vol.93，1320-24；Kanegae，et al.，1996，Acta Paediatr.Jpn，vol.38，182-188；Kanegae，et al.，Biomannual Series 4-Idensi dounyu-tohatsugen kaisekihou(Gene Transfer and Expression-Analysis)，1994，43-58，Yodosha；Kanegae，et al.，1994，Saibokogaku(Cell Technology)，vol.13.Number8.757-763)制备。另外，例如，也可以用本领域公知方法制备逆转录病毒载体(Wakimoto，et al.，1995，Tanpakushitsu Kakusan Koso(Protein，Nucleic Acids，and Enzyme)，vol 40，2508-2513)和腺伴随病毒载体(Tamaki et al.，1995，Tanpakushitsu Kakusan Koso(Protein，Nucleic Acids，and Enzyme)，Vol.40，2532-2538)。可以用于将基因导入哺乳动物的其它病毒载体的制备方法如下：特表平6-502069、特公平6-95937和特公平6-71429公开了重组痘苗病毒的制备方法，特公平6-34727和特表平6-505626公开了重组***瘤病毒的制备方法，特开平5-308975公开了重组腺伴随病毒的制备方法，特表平6-508039公开了重组腺病毒的制备方法。

负链单链RNA病毒是本发明特别优选的病毒载体。负链单链RNA病毒载体是指将基因导入宿主细胞的载体，其中所述的病毒或其衍生物在它们的基因组中具有负链[即(-)链]单链RNA。负链单链病毒包括属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)(包括副粘病毒属(Paramyxovirus)，麻疹病毒属(Morbillivirus)，腮腺炎病毒属(Rubulavirus)和肺病毒属(Pneumovirus))，弹状病毒科(Rhabdoviridae)(包括水泡病毒属(Vesiculovirus)，狂犬病病毒属(Lyssavirus)，Ephemerovirus属等)，线状病毒科(Firoviridae)，正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(包括流感病毒A，B和C，Thogoto-样病毒等)，布尼病毒科(Bunyaviridae)(包括布尼病毒属(Bunyavirus)，汉坦病毒属(Hantavirus)，内罗病毒属(Nairovirus)，白蛉热病毒属(Phlebovirus)等)，沙粒病毒科(Arenaviridae)等的病毒。特别优选属于副粘病毒科的病毒(本文称副粘病毒载体)。本发明人发现，施用编码FGF2信号抑制因子的副粘病毒载体可以显著减轻骨破坏性关节炎的炎症和骨质损失二者。副粘病毒载体是RNA病毒载体，它们不将基因整合到染色体中，并具有在一定时间段内以极高水平表达外来基因的特征。这些载体的上述特征被认为在本发明方法中治疗骨破坏性炎症性疾病时导致特别优选的效果。

在本发明中应用的副粘病毒包括，例如，属于副粘病毒科的病毒，如仙台病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒，牛瘟病毒(rinderpest virus)，瘟热病毒(distemper virus)，猴副流感病毒(SV5)，和人副流感病毒I，II和III型。本发明优选的病毒包括那些属于副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)(包括呼吸道病毒属(Respirovirus)，腮腺炎病毒属，和麻疹病毒属)的病毒，更优选呼吸道病毒属(也称副粘病毒属)的病毒或其衍生物。本发明可以应用的呼吸道病毒包括，例如人副流感病毒-I型(HPIV-1)，人副流感病毒-III型(HPIV-3)，牛副流感病毒III型(BPIV-3)，仙台病毒(也称小鼠副流感病毒I型)，和猴副流感病毒X型(SPIV-10)。本发明的副粘病毒最优选仙台病毒。这些病毒可源自天然株，野生型株，突变株，实验室传代株，人工构建株等。不完整的病毒如DI颗粒(Willenbrink，W.and Neubert，W.J.，J.Virol.68：8413-8417(1994))和合成的寡核苷酸等等也可以当作制备本发明病毒载体的材料。

重组负链RNA病毒载体可以如下制备：将编码病毒基因组的DNA与适当的转录启动子连接，构建出重组DNA，将这些DNA在试管内或在细胞中进行转录，在有负链RNA病毒的L、P和NP蛋白共存的情况下重建RNP，从而产生包含该RNP的病毒载体。具体地，它们通常可以如下制备：(a)使编码负链RNA病毒的负链单链RNA或其互补(正)链的载体DNA在表达NP、P和L蛋白的细胞(辅助细胞)中转录，以及(b)培养这些细胞并从培养上清中回收病毒。从载体DNA转录得到的RNA与NP、L和P蛋白一起形成RNP复合物，并形成了包裹在含有包膜蛋白的外壳中的病毒粒子。病毒可以用已知方法从病毒载体DNA重建(Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997、Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16：578-587；Yu，D.et al.，1997，Genes Cells 2：457-466；WO 97/16539；WO 97/16538；Durbin，A.P.et al.，1997，Virology 235：323-332；Whelan，S.P.et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8388-8392；Schnell.M.J.et al.，1994，EMBO J.13：4195-4203；Radecke，F.et al.，1995，EMBO J.14：5773-5784；Lawson，N.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4477-4481；Garcin，D.et al.，1995，EMBO J.14：6087-6094；Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1：569-579；Baron，M.D.andBarrett，T.，1997，J.Viro.71：1265-1271；Bridgen，A.and Elliott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：15400-15404)。这些方法能从DNA重建所需的副粘病毒载体，包括：副流感病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、仙台病毒载体、以及其它负链RNA病毒载体。

负链RNA病毒表达极大量的蛋白，并可以将基因导入多种类型的细胞。尤其是，仙台病毒(SeV)对灵长类动物未显示出严重的有害作用，因此优选用于本发明的人类基因治疗(Hurwitz，J.L.et al.，Vaccine 15：533-540，1997)。

病毒载体可以是野生型病毒的衍生物。衍生物是指，载体携带的病毒基因或病毒蛋白经过了修饰、但没有彻底损害该病毒导入基因的能力。这些修饰可以破坏病毒的复制能力或降低病毒的抗原性。例如，可以应用复制缺陷型病毒，它缺失了病毒繁殖所必需的基因。当副粘病毒载体DNA中缺失F基因、HN基因和/或M基因等等基因时，不会形成有感染力的病毒粒子。但是，另外将这些缺失的基因、和/或编码其它病毒的包膜蛋白的基因导入宿主细胞中并使之表达，可以形成感染性病毒粒子。制备这些缺失型病毒载体的方法是已知的，因此这些载体可以用已知方法制备(参见WO00/70055和WO 00/70070)。载体表达外来基因的水平可以通过连接在该基因上游的转录起始序列的类型来调节(例如参见WO 01/18223)。这些载体还可以是包含另一种病毒的包膜蛋白的假型化病毒载体。所述包膜蛋白包括VSV-G(参见WO 00/70055和WO 00/70070)。

另外，可以使病毒中的辅助基因缺失。例如，敲除V基因(一种SeV辅助基因)，可以在不破坏培养细胞中基因的表达和复制的情况下，使SeV对小鼠等宿主的致病性显著降低(Kato，A.et al.，1997，J.Virol.71：7266-7272；Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16：578-587；Curran，J.et al.，WO01/04272，EP 1067179)。这种减毒载体特别优选作为病毒载体进行低毒性的体内或回体(ex vivo)基因导入。

可以将收集的病毒载体纯化使其达到基本纯。纯化可以用已知的纯化/分离方法进行，如过滤、离心分离和柱纯化，或它们的组合。“基本纯”是指病毒载体是其所在样品的主要成分，一般来说，当样品所含的全部蛋白(作为承运体和稳定剂加入的蛋白除外)中，来自病毒载体的蛋白比例至少为10％，优选至少20％，更优选至少50％，优选至少70％，更优选至少80％，进一步优选至少90％时，可以确定为基本纯的病毒载体。副粘病毒的纯化方法包括，采用纤维素硫酸酯或交联多糖硫酸酯的方法(特公昭JP62-30752特公昭JP62-33879和特公昭JP62-30753)，以及吸附于含有硫酸岩藻糖的多糖和/或其分解产物上的方法(WO97/32010)。

病毒滴度可以通过测定CIU(细胞感染单位)或血凝活性(HA)来确定(WO 00/70070；Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1：569-579；Yonemitsu，Y.&Kaneda，Y.，Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated gene deliveryto vascular cells.Ed.by Baker AH.Molecular Biology of Vascular Diseases.Method in Molecular Medicine：Humana Press：pp.295-306，1999)。携带GFP(绿色荧光蛋白)标记基因等的载体，可以用所述标记作为指示剂(例如，GFP-CIU)，通过直接计数被感染的细胞来定量其滴度。如此测出的滴度可以按照与CIU(WO 00/70070)相同的方式进行处理。所得的载体可以作为预防和治疗与骨破坏相伴的炎症性疾病的药物。特别是，上述载体可以用作预防和治疗类风湿性关节炎的药物。

在制备包含病毒载体的组合物时，所述载体可以根据需要与可药用承运体(carrier)或介质(media)混合。“可药用承运体或介质”是指可以与本发明载体一起给药，不明显抑制该载体的基因导入活性的材料。具体地，所述载体可以与无菌水、生理盐水、培养介质或磷酸盐缓冲液(PBS)等适当混合，配制成药物。进一步地，上述材料中还可以含有植物油、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂和杀生物剂等。本发明的组合物可以是溶液、胶囊、糖浆等形式。包含所制得的病毒载体的组合物可以用作试剂或药学制剂。这些组合物可以作为抑制破骨细胞形成、或骨破坏和/或炎症的试剂或药学制剂，或作为预防或治疗骨破坏性疾病的药学制剂。

将上述制备的载体施用到患有与骨破坏相伴的炎症疾病的患者的患病部位，其症状可以显著减轻。本文中，“与骨破坏相伴的炎症性疾病”是指伴有骨的破坏、减少、吸收和/或骨质疏松以及炎症的疾病。这些疾病的例子具体包括类风湿性关节炎(RA)。由类风湿性关节炎引起的炎症和骨破坏可以用本发明的方法抑制。此外，对青年期类风湿性关节炎(juvenile rheumatoidarthritis)、牛皮癣关节炎(psoriatic arthritis)、以及好发于各种***疾病的多发性关节炎(multiple arthritis)等疾病进行治疗，也是本发明的目的。

RA是关节滑膜中的持续性炎症。RA增殖和肥大导致关节软骨及其周围部分发生骨破坏，引起与关节软骨变形和骨破坏有关的慢性疾病。本发明提供了治疗RA的方法，该方法通过调节FGF2功能并抑制其胞内信号传递***来进行，这种方法可以作为由RA引起的滑膜炎和骨破坏的统一疗法。即，本发明提供了对FGF2-FGF受体1-Ras-Raf-MAP激酶***介导的一连串FGF2信号传递***进行的胞外和胞内抑制，以此作为治疗RA的策略。

1. 抑制RA滑膜炎

RA滑膜的主要病变是增生性滑膜炎。在增生性滑膜炎中，由于被称为(病因学(morbid))血管新生的病理生理学现象而新形成的血管，对RA症状和骨破坏的形成和发展从以下几方面起重要作用：(1)滑膜组织供养途径，(2)炎症细胞进入途径，(3)破骨细胞始祖细胞进入途径，和(4)细胞因子等疾病介质进入途径。因此，调节血管新生因子功能的RA治疗策略是合适的。当滑膜中血管床减少时，一般认为炎症受到抑制。本发明还考虑发挥一种更具选择性且更强效的抗滑膜炎效应，因为它调节FGF2功能，而FGF2是众多血管新生因子中引起RA中炎症和骨破坏的特别有害的因子。

2. 抑制RA骨破坏

如前文所述，用常规技术很难对关节炎和骨破坏进行统一有效的治疗。据报道，本发明目标分子FGF2不仅具有血管新生因子的生物学功能，而且可以作为破骨细胞的分化因子和功能增强因子，在骨破坏中起关键作用。因此，通过调节FGF2功能，可以直接抑制破骨细胞的分化和功能，并抑制滑膜炎的进展。从而有可能即抑制滑膜炎症状，又抑制骨关节破坏，这正是RA治疗的最终目的。

3. 递药***

经由口服或静脉方式全身施用已知对RA有效的蛋白时，存在以下一些重要问题：(1)向关节滑膜部位递药，(2)在该部位获得有效浓度，(3)在各种器官中的副作用。另一方面，在本发明的基因疗法中，通过用载体在滑膜组织中表达治疗基因，可以使基因的有效表达水平在关节部位维持一段时间。利用这些基因治疗技术，有可能防止蛋白出现局部或全身的高浓度。

4. 生物药开发技术

本发明包括施用载体和基因的方法，所述基因抑制FGF2功能或阻断FGF2受体下游的细胞内信号传递***。即，通过选择性抑制细胞内信号传递***中的单一酶，可以制得更特异于疾病和症状的治疗药物。故，通过本发明有可能制得理想的选择性抑制疾病特异性分子的生物学配制剂。

所述载体的用量根据疾病、患者体重、年龄、性别、症状、用药目的、所施用的组合物的形式、施用方法、导入的基因等因素而不同，本领域技术人员可以作出适当决定。施用途径可以适当选择，但优选局部注射，以便特异性到达骨破坏性炎症的患病部位，或者优选用适当的递药***给药以便到达患病部位。在采用副粘病毒载体的情况下，优选可药用承运体中载体的浓度为约10⁵CIU/ml-10¹¹pfu/ml，更优选约10⁷CIU/ml-10⁹CIU/ml，最优选约1×10⁸CIU/ml-5×10⁸CIU/ml。给药剂量优选每单位面积为约10⁵pfu-10¹¹pfu，更优选约10⁷pfu-10⁹pfu，最优选约10⁸pfu-10⁹pfu。在联合施用多个载体的情况下，每一载体最好按上述的抑制剂量来施用。可以在单个或多个(2，3，4以及5-10个)部位给药。在回体(ex vivo)施用的情况下，可以使从患者收集到的细胞等与载体在该患者体外(例如，在试管中或在Petri培养皿中)接触。优选施用量为MOI 1-500，更优选2-300，还更优选约3-200。然后将细胞注射给患者。包含本发明载体的组合物可以对包括人以及猴、小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛、狗等非人哺乳动物在内的多种受试者施用。

附图说明

图1显示施用Raf抑制剂抑制破骨细胞的形成。结果均表示为均值±标准差。统计学分析用单侧ANOVA进行。^*：显著性水平p＜0.01为有显著差异(n＝各8个培养组)。

图2显示导入sFGFR基因的AIA治疗效果。图中，“载体注射”表示将带有sFGFR基因的SeV施用到足垫的时间。结果均表示为均值±标准误。统计学分析用Mann-Whitney U-检验进行。^*：显著性水平p＜0.01为有显著差异。

图3显示导入spry2基因的AIA治疗效果。图中，“载体注射”表示将带有spry2基因的SeV施用到足垫的时间。结果均表示为均值±标准误。统计学分析用Mann-Whitney U-检验进行。#：显著性水平p＜0.05和^*：显著性水平p＜0.01为有显著差异。

实施本发明的最佳方式

本发明参考以下实施例作具体说明，但不应理解为本发明仅限于此。该说明书全文各处引用的文献都全文引入作为参考。

[实施例1]Raf抑制剂影响经培养的破骨细胞的形成

1. 对来源于大鼠骨髓的巨噬细胞进行分离培养

对来源于大鼠骨髓的巨噬细胞用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)进行分离培养。使用8只Charles-River等级的Lewis大鼠(6周龄，KBT Oriental Co.，Ltd.，Tosu，Saga)，在麻醉条件下脱颈处死，切断颈动脉脱血。在无菌条件下摘出两侧股骨和胫骨的骨干部分，将培养液(α-改良基本培养基：α-MEM(GIBCO BRL，Rockville，Maryland，USA)注射到骨髓腔，收集骨髓细胞。红细胞用0.727％ NH₄Cl-0.017％ Tris-Cl(pH7.2)-磷酸盐缓冲液(PBS)洗净后，用含10％胎牛血清(FBS)和重组人M-CSF(rhM-CSF，10ng/ml，CHEMICONInternational，Inc.Temecula，CA)的α-MEM将5×10⁶个细胞以分散状态装入一个180ml烧瓶中。3天后，用PBS洗净，用包含0.05％胰蛋白酶(trypsine)/0.02％ EDTA的PBS使贴壁细胞脱壁，将10⁶个细胞装入一个180ml烧瓶中。3天后，用同样的方法收集细胞，贮存在液氮中。将用上述方法分离得到的大鼠骨髓来源的巨噬细胞作为M-CSF-依赖性骨髓巨噬细胞(MDBM)。

2. Raf抑制剂对破骨细胞形成的影响

将MDBM用预先制备的α-MEM接种在96孔板中，5×10³个细胞/孔，所述α-MEM中含有10％ FBS，rhM-CSF(10ng/ml)，核因子-kappa B配体的重组人可溶性受体激活剂(sRANKL，50ng/ml，PeproTech EC，Ltd.London，U.K.)，以及重组人FGF basic(rhFGF-2，10ng/ml，Genzyme/Techne，Minneapolis，MN，USA)。待细胞贴壁后，添加Raf抑制剂(Raf-1激酶抑制剂I，Calbiochem，San Diego，CA，USA)溶于二甲亚砜(DMSO)中形成的溶液(10μl/孔)。对照组仅加入等量的DMSO。3天后更换培养液，并再加Raf抑制剂。培养7天后，用白细胞酸性磷酸酶试剂盒(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)进行耐酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)染色。将含有至少3个核的TRAP-阳性多核细胞鉴定为破骨细胞，比较并检查所形成的破骨细胞的数目。结果表明，施用Raf抑制剂以浓度依赖的方式抑制了破骨细胞的形成，这种抑制在任何浓度都显著不同于对照(图1)。

[实施例2]导入sFGFR基因对AIA的影响：胞外阻断FGF-2

<方法>

1. AIA模型

为了建立AIA模型，给大鼠尾根部皮下注射1mg结核菌死菌(经过干燥的(Desiccated)丁酸分枝杆菌(Mycobacterium Butyricum)：MBD，Difco，Detroit，MI，USA)溶在矿物油(NACALAI TESQUE，Kyoto)中的100μl悬液。

2. 胞外阻断FGF2的实验方案

用重组仙台病毒载体(SeV)进行直接的基因导入，使靶基因在大鼠炎症局部表达，然后检查对关节炎的影响。具体地，先确认关节炎发病，然后，在施用佐剂的14天后，AIA+sFGFR组(n＝40)足垫给药带有可溶性FGF受体基因(sFGFR，SEQ ID NO：1)的SeV(SeV-sFGFR)，10⁸pfu/足；AIA+萤光素酶对照组(n＝28)足垫给药带有萤光素酶基因的SeV(SeV-luciferase)，10⁸pfu/足。

3. 测定后肢容积

用容积测量仪(MK-550；MUROMACHI KIKAI CO.，LTD.，Tokyo)连续测定后肢容积(HPV)，以便定量关节炎引起后肢肿胀的程度。

4. 对于骨/关节破坏的放射学评价

为了对骨/关节破坏进行放射学检查，在第21和28天，将大鼠处死，从后腿中部截取后肢，用软放射线成像法(soft ray radiography)对骨/关节的破坏程度分5个等级进行放射学评价(CMB-2；Softex Corporation，Tokyo)。本实施例中，骨/关节破坏的放射学指数(Radiological Index：RI)如下：0：无改变，1：轻度骨萎缩和软骨阴影肿胀，2：关节间隙变窄和中度骨萎缩，3：骨和软骨侵蚀或中度关节破坏，4：高度骨破坏导致关节构造消失。

<结果>

图2A显示后肢容积随时间的变化。第21天时，AIA+sFGFR组的后肢容积是3.06±0.1ml，AIA+萤光素酶组的是3.93±0.11ml。第28天时，AIA+sFGFR组的后肢容积是2.85±0.1ml，AIA+萤光素酶组的是3.29±0.12ml。在这两个时间点，因导入了sFGFR基因使FGF-2胞外信号被阻断，后肢肿胀被显著抑制。

图2B显示第14天和第21天之间的容积变化率。结果表明，AIA+sFGFR组的容积变化率是0.18±0.07ml，AIA+萤光素酶组的是0.86±0.09ml。可见，因载体给药7天后FGF-2胞外信号被阻断，容积变化率也被显著抑制。

图2C显示骨/关节破坏的放射学指数。第21天时，AIA+sFGFR组的放射学指数为1.42±0.29(n＝12)，AIA+萤光素酶组的为1.9±0.28(n＝10)。第28天时，AIA+sFGFR组的为1.27±0.18(n＝26)，AIA+萤光素酶组的为3.0±0.21(n＝14)。可见，在上述两个时间点，因FGF-2胞外信号被阻断，骨/关节破坏被显著抑制。

[实施例3]导入Spry2基因对AIA的影响：阻断FGF-2胞内信号

<方法>

1. AIA模型

给大鼠尾根部皮下注射1mg结核菌死菌(经过干燥的丁酸分枝杆菌：MBD，Difco)溶在矿物油(NACALAI TESQUE)中的100μl悬液。

2. 胞内阻断FGF2的实验方案

用重组仙台病毒载体(SeV)进行直接的基因导入，使靶基因在大鼠炎症局部表达，然后检查对关节炎的影响。具体地，先确认关节炎发病，然后，在施用佐剂的14天后，AIA+Spry2组(n＝33)足垫给药带有人Sprouty2基因(Spry2：SEQ ID N0：3)的SeV(SeV-spry2)，10⁸pfu/足；AIA+萤光素酶对照组(n＝33)足垫给药带有萤光素酶基因的SeV(SeV-luciferase)，10⁸pfu/足。

3. 测定后肢容积

用容积测量仪(MK-550；MUROMACHI KIKAI)连续测定后肢容积(HPV)，以便定量关节炎引起后肢肿胀的程度。

4. 对干骨/关节破坏的放射学评价

为了对骨/关节破坏进行放射学检查，在第21和28天，将大鼠处死，从后腿中部截取后肢，用软放射线成像法对骨/关节的破坏程度分5个等级进行放射学评价(CMB-2；Softex Corporation)。本实施例中，骨/关节破坏的放射学指数(Radiological Index：RI)如下：0：无改变，1：轻度骨萎缩和软骨阴影肿胀，2：关节间隙变窄和中度骨萎缩，3：骨和软骨侵蚀或中度关节破坏，4：高度骨破坏导致关节构造消失。

<结果>

图3A显示后肢容积随时间的变化。第21天时，AIA+Spry2组的后肢容积是3.33±0.1ml，AIA+萤光素酶组的是3.85±0.12ml。第28天时，AIA+Spry2组的后肢容积是3.07±0.12ml，AIA+萤光素酶组的是3.38±0.16ml。在这两个时间点，因导入了Spry2基因使FGFR 1/Ras/Raf/MAPK介导的FGF-2胞内信号传递途径被阻断，后肢肿胀被显著抑制。

图3B显示第14天和第21天之间的容积变化率。结果表明，AIA+Spry2组的容积变化率是0.21±0.07ml，AIA+萤光素酶组的是0.77±0.08ml。可见，因载体给药7天后FGF-2胞内信号传递途径被阻断，容积变化率也被显著抑制。

图3C显示骨/关节破坏的放射学指数。第21天时，AIA+Spry2组的放射学指数为1.36±0.20(n＝11)，AIA+萤光素酶组的为2.27±0.33(n＝11)。第28天时，AIA+Spry2组的为1.82±0.19(n＝22)，AIA+萤光素酶组的为3.0±0.28(n＝22)。可见，在上述两个时间点，因FGF-2胞内信号传递途径被阻断，骨/关节破坏被显著抑制。

工业实用性

基于“对FGF2或其信号传递***进行功能性抑制”的概念，本发明使对疾病更具特异性、更有效、且更安全的生物药配制剂成为可能。而且，本发明以RA治疗策略中的血管新生因子FGF2分子作为标靶，确立了不仅抑制关节炎、而且抑制疾病进展、还防止骨破坏的有效治疗方法。

序列表

<110>株式会社载体研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)

<120>治疗与骨破坏相关的炎症性疾病的方法

<130>D3-A0206P

<150>JP 2003-075964

<151>2003-03-19

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>900

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(900)

<223>

<400>1

atg tgg agc tgg aag tgc ctc ctc ttc tgg gct gtg ctg gtc aca gcc 48

Met Trp Ser Trp Lys Cys Leu Leu Phe Trp Ala Val Leu Val Thr Ala

1 5 10 15

aca ctc tgc acc gct agg ccg tcc ccg acc ttg cct gaa caa gat gct 96

Thr Leu Cys Thr Ala Arg Pro Ser Pro Thr Leu Pro Glu Gln Asp Ala

20 25 30

ctc ccc tcc tcg gag gat gat gat gat gat gat gac tcc tct tca gag 144

Leu Pro Ser Ser Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ser Ser Ser Glu

35 40 45

gag aaa gaa aca gat aac acc aaa cca aac ccc gta gct cca tat tgg 192

Glu Lys Glu Thr Asp Asn Thr Lys Pro Asn Pro Val Ala Pro Tyr Trp

50 55 60

aca tcc cca gaa aag atg gaa aag aaa ttg cat gca gtg ccg gct gcc 240

Thr Ser Pro Glu Lys Met Glu Lys Lys Leu His Ala Val Pro Ala Ala

65 70 75 80

aag aca gtg aag ttc aaa tgc cct tcc agt ggg acc cca aac ccc aca 288

Lys Thr Val Lys Phe Lys Cys Pro Ser Ser Gly Thr Pro Asn Pro Thr

85 90 95

ctg cgc tgg ttg aaa aat ggc aaa gaa ttc aaa cct gac cac aga att 336

Leu Arg Trp Leu Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Pro Asp His Arg Ile

100 105 110

gga ggc tac aag gtc cgt tat gcc acc tgg agc atc ata atg gac tct 384

Gly Gly Tyr Lys Val Arg Tyr Ala Thr Trp Ser Ile Ile Met Asp Ser

115 120 125

gtg gtg ccc tct gac aag ggc aac tac acc tgc att gtg gag aat gag 432

Val Val Pro Ser Asp Lys Gly Asn Tyr Thr Cys Ile Val Glu Asn Glu

130 135 140

tac ggc agc atc aac cac aca tac cag ctg gat gtc gtg gag cgg tcc 480

Tyr Gly Ser Ile Asn His Thr Tyr Gln Leu Asp Val Val Glu Arg Ser

145 150 155 160

cct cac cgg ccc atc ctg caa gca ggg ttg ccc gcc aac aaa aca gtg 528

Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala Gly Leu Pro Ala Asn Lys Thr Val

165 170 175

gcc ctg ggt agc aac gtg gag ttc atg tgt aag gtg tac agt gac ccg 576

Ala Leu Gly Ser Asn Val Glu Phe Met Cys Lys Val Tyr Ser Asp Pro

180 185 190

cag ccg cac atc cag tgg cta aag cac atc gag gtg aat ggg agc aag 624

Gln Pro His Ile Gln Trp Leu Lys His Ile Glu Val Asn Gly Ser Lys

195 200 205

att ggc cca gac aac ctg cct tat gtc cag atc ttg aag gta atc atg 672

Ile Gly Pro Asp Asn Leu Pro Tyr Val Gln Ile Leu Lys Val Ile Met

210 215 220

gca cca gtc ttc gtg ggc cag tct act ggg aag gag acc act gtc tcg 720

Ala Pro Val Phe Val Gly Gln Ser Thr Gly Lys Glu Thr Thr Val Ser

225 230 235 240

ggg gct caa gtt cct gtg ggc agg ctc agt tgc ccc cga atg gga tca 768

Gly Ala Gln Val Pro Val Gly Arg Leu Ser Cys Pro Arg Met Gly Ser

245 250 255

ttc ctc acg ctt cag gca cac aca ctc cat ctc agt agg gat eta gcc 816

Phe Leu Thr Leu Gln Ala His Thr Leu His Leu Ser Arg Asp Leu Ala

260 265 270

aca tcc ccc agg act agt aac aga ggt cac aaa gtg gag gtg agc tgg 864

Thr Ser Pro Arg Thr Ser Asn Arg Gly His Lys Val Glu Val Ser Trp

275 280 285

gaa cag agg gct gca ggg atg ggt ggt gct ggt ctg 900

Glu Gln Arg Ala Ala Gly Met Gly Gly Ala Gly Leu

290 295 300

<210>2

<211>300

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

Met Trp Ser Trp Lys Cys Leu Leu Phe Trp Ala Val Leu Val Thr Ala

1 5 10 15

Thr Leu Cys Thr Ala Arg Pro Ser Pro Thr Leu Pro Glu Gln Asp Ala

20 25 30

Leu Pro Ser Ser Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ser Ser Ser Glu

35 40 45

Glu Lys Glu Thr Asp Asn Thr Lys Pro Asn Pro Val Ala Pro Tyr Trp

50 55 60

Thr Ser Pro Glu Lys Met Glu Lys Lys Leu His Ala Val Pro Ala Ala

65 70 75 80

Lys Thr Val Lys Phe Lys Cys Pro Ser Ser Gly Thr Pro Asn Pro Thr

85 90 95

Leu Arg Trp Leu Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Pro Asp His Arg Ile

100 105 110

Gly Gly Tyr Lys Val Arg Tyr Ala Thr Trp Ser Ile Ile Met Asp Ser

115 120 125

Val Val Pro Ser Asp Lys Gly Asn Tyr Thr Cys Ile Val Glu Asn Glu

130 135 140

Tyr Gly Ser Ile Asn His Thr Tyr Gln Leu Asp Val Val Glu Arg Ser

145 150 155 160

Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala Gly Leu Pro Ala Asn Lys Thr Val

165 170 175

Ala Leu Gly Ser Asn Val Glu Phe Met Cys Lys Val Tyr Ser Asp Pro

180 185 190

Gln Pro His Ile Gln Trp Leu Lys His Ile Glu Val Asn Gly Ser Lys

195 200 205

Ile Gly Pro Asp Asn Leu Pro Tyr Val Gln Ile Leu Lys Val Ile Met

210 215 220

Ala Pro Val Phe Val Gly Gln Ser Thr Gly Lys Glu Thr Thr Val Ser

225 230 235 240

Gly Ala Gln Val Pro Val Gly Arg Leu Ser Cys Pro Arg Met Gly Ser

245 250 255

Phe Leu Thr Leu Gln Ala His Thr Leu His Leu Ser Arg Asp Leu Ala

260 265 270

Thr Ser Pro Arg Thr Ser Asn Arg Gly His Lys Val Glu Val Ser Trp

275 280 285

Glu Gln Arg Ala Ala Gly Met Gly Gly Ala Gly Leu

290 295 300

<210>3

<211>945

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(945)

<223>

<400>3

atg gag gcc aga gct cag agt ggc aac ggg tcg cag ccc ttg ctg cag 48

Met Glu Ala Arg Ala Gln Ser Gly Asn Gly Ser Gln Pro Leu Leu Gln

1 5 10 15

acg ccc cgt gac ggt ggc aga cag cgt ggg gag ccc gac ccc aga gac 96

Thr Pro Arg Asp Gly Gly Arg Gln Arg Gly Glu Pro Asp Pro Arg Asp

20 25 30

gcc ctc acc cag cag gta cat gtc ttg tct ctg gat cag atc aga gcc 144

Ala Leu Thr Gln Gln Val His Val Leu Ser Leu Asp Gln Ile Arg Ala

35 40 45

atc cga aac acc aat gag tac aca gag ggg cct act gtc gtc cca aga 192

Ile Arg Asn Thr Asn Glu Tyr Thr Glu Gly Pro Thr Val Val Pro Arg

50 55 60

cct ggg ctc aag cct gct cct cgc ccc tcc act cag cac aaa cac gag 240

Pro Gly Leu Lys Pro Ala Pro Arg Pro Ser Thr Gln His Lys His Glu

65 70 75 80

aga ctc cac ggt ctg cct gag cac cgc cag cct cct agg ctc cag cac 288

Arg Leu His Gly Leu Pro Glu His Arg Gln Pro Pro Arg Leu Gln His

85 90 95

tcg cag gtc cat tct tct gca cga gcc cct ctg tcc aga tcc ata agc 336

Ser Gln Val His Ser Ser Ala Arg Ala Pro Leu Ser Arg Ser Ile Ser

100 105 110

acg gtc agc tca ggg tcg cgg agc agt acg agg aca agt acc agc agc 384

Thr Val Ser Ser Gly Ser Arg Ser Ser Thr Arg Thr Ser Thr Ser Ser

115 120 125

agc tcc tct gaa cag aga ctg cta gga tca tcc ttc tcc tcc ggg cct 432

Ser Ser Ser Glu Gln Arg Leu Leu Gly Ser Ser Phe Ser Ser Gly Pro

130 135 140

gtt gct gat ggc ata atc cgg gtg caa ccc aaa tct gag ctc aag cca 480

Val Ala Asp Gly Ile Ile Arg Val Gln Pro Lys Ser Glu Leu Lys Pro

145 150 155 160

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Gly Glu Leu Lys Pro Leu Ser Lys Glu Asp Leu Gly Leu His Ala Tyr

165 170 175

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Arg Cys Glu Asp Cys Gly Lys Cys Lys Cys Lys Glu Cys Thr Tyr Pro

180 185 190

agg cct ctg cca tca gac tgg atc tgc gac aag cag tgc ctt tgc tcg 624

Arg Pro Leu Pro Ser Asp Trp Ile Cys Asp Lys Gln Cys Leu Cys Ser

195 200 205

gcc cag aac gtg att gac tat ggg act tgt gta tgc tgt gtg aaa ggt 672

Ala Gln Asn Val Ile Asp Tyr Gly Thr Cys Val Cys Cys Val Lys Gly

210 215 220

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Leu Phe Tyr His Cys Ser Asn Asp Asp Glu Asp Asn Cys Ala Asp Asn

225 230 235 240

cca tgt tct tgc agc cag tct cac tgt tgt aca cga tgg tca gcc atg 768

Pro Cys Ser Cys Ser Gln Ser His Cys Cys Thr Arg Trp Ser Ala Met

245 250 255

ggt gtc atg tcc ctc ttt ttg cct tgt tta tgg tgt tac ctt cca gcc 816

Gly Val Met Ser Leu Phe Leu Pro Cys Leu Trp Cys Tyr Leu Pro Ala

260 265 270

aag ggt tgc ctt aaa ttg tgc cag ggg tgt tat gac cgg gtt aac agg 864

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275 280 285

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290 295 300

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<211>315

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

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Met Glu Ala Arg Ala Gln Ser Gly Asn Gly Ser Gln Pro Leu Leu Gln

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100 105 110

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115 120 125

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165 170 175

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Arg Pro Leu Pro Ser Asp Trp Ile Cys Asp Lys Gln Cys Leu Cys Ser

195 200 205

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210 215 220

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Pro Cys Ser Cys Ser Gln Ser His Cys Cys Thr Arg Trp Ser Ala Met

245 250 255

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<210>5

<211>1230

<212>DNA

<213>鼠(Mus musculus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1230)

<223>

<400>5

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115 120 125

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Ser Ser Ser Thr Leu His Asn Glu Ala Glu Leu Gly Asp Asp Asp Val

130 135 140

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Phe Thr Thr Ala Thr Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ser Gln Lys Arg Glu

145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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Arg Leu Pro Arg Ser Tyr Pro Gln Val Thr Phe Pro Glu Asp Asp Glu

195 200 205

gaa att gta cgc atc aac ccc cga gag aag atc tgg atg acc ggt tat 672

Glu Ile Val Arg Ile Asn Pro Arg Glu Lys Ile Trp Met Thr Gly Tyr

210 215 220

gaa gac tac cgg cac gcg ccg gtt cgc ggc aaa tac tta gac acc aca 720

Glu Asp Tyr Arg His Ala Pro Val Arg Gly Lys Tyr Leu Asp Thr Thr

225 230 235 240

gaa gac gcg gac tcc tac gtg cgc ttc gcc aag ggc gaa gtc ccc aaa 768

Glu Asp Ala Asp Ser Tyr Val Arg Phe Ala Lys Gly Glu Val Pro Lys

245 250 255

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His Glu Tyr Thr Tyr Pro Tyr Val Asp Ser Ser Asp Phe Gly Phe Gly

260 265 270

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Glu Asp Pro Lys Gly Ser Val Ile Lys Thr Gln Pro Pro Arg Ala Lys

275 280 285

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Ser Arg Arg Arg Lys Glu Asn Gly Glu Arg Ser Arg Cys Val Tyr Cys

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Ala Pro Asp Ala Val Arg Thr Cys Ile Arg Arg Val Ser Cys Met Trp

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Cys Ala Asp Ser Met Leu Tyr His Cys Met Ser Asp Pro Glu Gly Asp

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<211>410

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<213>鼠(Mus musculus)

<400>6

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Arg Gly Val Arg Lys Ala Ile Glu Asp Leu Ile Glu Gly Ser Thr Thr

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Ser Ser Ser Thr Leu His Asn Glu Ala Glu Leu Gly Asp Asp Asp Val

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165 170 175

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180 185 190

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Glu Asp Tyr Arg His Ala Pro Val Arg Gly Lys Tyr Leu Asp Thr Thr

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260 265 270

Glu Asp Pro Lys Gly Ser Val Ile Lys Thr Gln Pro Pro Arg Ala Lys

275 280 285

Ser Arg Arg Arg Lys Glu Asn Gly Glu Arg Ser Arg Cys Val Tyr Cys

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Ala Pro Asp Ala Val Arg Thr Cys Ile Arg Arg Val Ser Cys Met Trp

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340 345 350

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370 375 380

Cys Tyr Leu Pro Leu Arg Ala Cys His Arg Cys Gly Val Met Cys Arg

385 390 395 400

Cys Cys Gly Gly Lys His Lys Ala Ala Ala

405 410

Claims

1.治疗与骨破坏相伴的炎症性疾病的方法，包括施用载体，所述载体编码蛋白或核酸，所述蛋白或核酸抑制由成纤维细胞生长因子-2(FGF2)-FGF受体1-Ras-Raf-MAP激酶介导的信号传递。

2.权利要求1的方法，其中所述载体是负链RNA病毒载体。

3.权利要求2的方法，其中所述负链RNA病毒载体是仙台病毒载体。

4.权利要求1的方法，其中所述抑制信号传递的蛋白选自可溶性FGF受体、Sprouty2或Spred。

5.权利要求1的方法，其中所述疾病是骨关节炎。

6.治疗与骨破坏相伴的炎症性疾病的治疗组合物，包括编码蛋白或核酸的载体和可药用承运体，所述蛋白或核酸抑制由成纤维细胞生长因子-2(FGF2)-FGF受体1-Ras-Raf-MAP激酶介导的信号传递。

7.权利要求6的组合物，其中所述载体是负链RNA病毒载体。

8.权利要求7的组合物，其中所述负链RNA病毒载体是仙台病毒载体。

9.权利要求6的组合物，其中所述抑制信号传递的蛋白选自可溶性FGF受体、Sprouty2或Spred。

10.权利要求6的组合物，其中所述疾病是骨关节炎。