CN1675357A

CN1675357A - 编码抗体的副粘病毒载体及其应用

Info

Publication number: CN1675357A
Application number: CNA038186543A
Authority: CN
Inventors: 井上诚; 长谷川护; 弘中孝史
Original assignee: Dnavec Research Inc
Current assignee: Dnavec Research Inc
Priority date: 2002-06-03
Filing date: 2003-06-03
Publication date: 2005-09-28
Also published as: WO2003102183A1; WO2003102183A9; US20050191617A1; CA2488270A1; AU2003241953A1; JPWO2003102183A1

Abstract

本发明提供了表达包含抗体可变区的多肽的副粘病毒载体。本发明所述编码抗体可变区H链和L链的载体成功地同时表达这些抗体链来形成Fab，并成功地高水平表达单链抗体。本发明的载体适合作为基因治疗载体，用于对活体进行体内给药或回体给药。具体地，表达抗神经伸长抑制物的抗体片段的载体可以用于神经损伤的基因治疗。此外，本发明的表达抑制免疫活化信号传递的抗体的载体使得能够由所述载体对基因进行长期表达。

Description

编码抗体的副粘病毒载体及其应用

技术领域

本发明涉及编码多肽的副粘病毒载体及其应用，所述多肽包含抗体可变区。

背景技术

单克隆抗体作为药物的有效性已被广泛认识，目前有不下10种单克隆抗体药物已经投入市场，或已经制出即将投入市场(Dickman，S.，Science 280：1196-1197，1998)。单克隆抗体药物的特征在与，它们仅选择性结合唯一的特定抗原，从而表达它们抑制或消除该抗原的活性。因此，对于它们将来的医药开发有较高预期。但是，单克隆抗体药物也存在以下问题：1)它们通常用哺乳动物杂交瘤制备，而制备杂交瘤的费用一般较高，且2)由于它们通常是进行全身给药，因此引起副作用，如发热，虽然是轻微的。已经有人尝试用诸如大肠杆菌(Escherichia coli)等细菌，酵母或昆虫细胞来制备抗体，但仍担心糖链修饰等差异可能影响抗体的生物活性和抗体蛋白的抗原性。

发明内容

本发明的一个目标是提供副粘病毒载体及其应用，所述载体编码包含抗体可变区的多肽。

本发明人认为，如果基因导入载体可以用于表达目前广泛应用的单克隆抗体药物，并且预期在将来有更广泛的应用，那就有可能在病灶附近局部表达该抗体药物，这很有可能减轻副作用，并解决开发单克隆抗体药物总是伴有的费用问题。

近年开发了多种用于基因治疗的基因导入载体，并预计可以依据载体的类型进行基因导入型细胞的局部表达。具体地，本发明人迄今为止已经用仙台病毒(SeV)开发了一种新的可以用于基因导入和基因治疗的基因导入载体。SeV是非分节段负链RNA病毒，属于副粘病毒科(Paramyxovirus)，是鼠副流感病毒的一种。本发明人新近构建了表达单克隆抗体的SeV，并用它们进行实验来确立在活体内表达单克隆抗体的新的基因疗法。本发明人采用了传播型和传播能力缺陷型这两种SeV，来构建携带神经轴索伸长抑制物(axonal outgrowth inhibitor，NOGO)中和抗体(IN-1)的Fab基因(H和L链)的载体。结果成功重建了这两种载体，并成功回收了2⁹HAU(约5×10⁸CIU/ml)的传播型载体和2.7×10⁷CIU/ml的传播能力缺陷型(F基因缺陷型)载体。将这些载体导入细胞，细胞培养上清在氧化条件下检测到约47kDa的带，在还原条件下检测到约30kDa的带，表明氧化条件下形成了Fab抗体，且其中的H和L链是相结合的。由于表达抗神经轴索伸长抑制物抗体的载体预计可以应用于脊髓损伤，本发明的载体可以用于脊髓损伤的基因治疗。

此外，本发明人发现，表达抗体的副粘病毒载体还可以作为具有减弱的免疫原性的载体来使用。将病毒载体给药至活体内可以诱导对该病毒的免疫反应，从而消除该病毒载体并抑制导入基因的长期表达。在这类情况下，载体多次给药也是很困难的。如果载体包含对免疫反应的诱导进行抑制的活性，则可以抑制抗该载体的免疫反应，并有可能使导入基因长期表达和多次(反复)给药。因此，表达抗免疫信号分子的抗体的载体都是有效的。例如，协同刺激信号可以与来自免疫细胞如T细胞的T细胞受体(TCR)、抗原、和主要组织相容性复合物(MHC)抗原的信号一起发挥作用，它属于第二信号，通过用载体表达抗传递协同刺激信号的分子的抗体，可以消除该第二信号，并使T细胞失活。这样的副粘病毒载体能抑制抗所述载体的细胞免疫，并长期表达导入的基因。

因此，本发明提供的载体适合于体内(in vivo)给药，尤其是在基因治疗中，并且预计可以应用于多种疾病和损伤。此外，由所述副粘病毒载体能使导入的基因在哺乳动物细胞中以极高水平表达，因此可以在这些哺乳动物细胞(包括人的细胞)中产生大量所需抗体。因此，所述表达抗体的副粘病毒载体不仅在临床上具有极高应用价值，而且在产业上具有极高应用价值。

本发明涉及编码多肽的副粘病毒载体及其应用，所述多肽包含抗体可变区。本发明更具体地涉及：

(1)一种副粘病毒载体，其编码包含抗体可变区的多肽。

(2)(1)的副粘病毒载体，其中所述副粘病毒是仙台病毒。

(3)(1)的副粘病毒载体，其中所述多肽是分泌型多肽。

(4)(1)的副粘病毒载体，其中所述载体编码包含抗体H链可变区的多肽和包含抗体L链可变区的多肽。

(5)(4)的副粘病毒载体，其中所述包含抗体H链可变区的多肽和包含抗体L链可变区的多肽彼此相连形成Fab。

(6)(5)的副粘病毒载体，其中至少一种抗体可变区源自抗配体或受体的抗体。

(7)(6)的副粘病毒载体，其中所述抗体与抑制神经细胞生存或分化或轴索伸长的蛋白质结合。

(8)(7)的副粘病毒载体，其中所述抗体是抗NOGO抗体。

(9)(6)的副粘病毒载体，其中所述抗体是抗与免疫信号传递相关的受体或其配体的抗体。

(10)(9)的副粘病毒载体，其中所述抗体是抗表达在T细胞或抗原呈递细胞表面的受体或其配体的抗体。

(11)(10)的副粘病毒载体，其中所述受体或其配体是T细胞或抗原呈递细胞的协同刺激信号的信号传递分子。

(12)(11)的副粘病毒载体，其中所述信号传递分子是选自CD28，CD80，CD86，LFA-1，ICAM-1(CD54)，PD-1，或ICOS的分子。

(13)(9)的副粘病毒载体，其中所述载体还编码另一种外来基因。

(14)制备包含抗体可变区的重组多肽的方法，包括以下步骤：

(a)将(1)的病毒载体导入哺乳动物细胞；和

(b)从导入了所述载体的哺乳动物细胞或其培养上清回收所产生的多肽。

(15)一种多肽，由(14)的方法制得。

(16)促进神经形成的方法，包括将(7)的载体送达需要形成神经的部位。

(17)治疗脊髓损伤的方法，包括将(7)的载体送达损伤部位。

(18)抑制免疫反应的方法，包括给药(9)所述载体。

(19)(18)的方法，还包括给药抗体或给药CTLA-4或其片段的步骤，所述抗体抗与免疫信号传递相关的受体或其配体。

(20)增强载体的基因表达的方法，所述增强基因表达通过使该载体持续进行基因表达和/或通过重复给药该载体来实现，所述方法包括给药(9)所述载体。

(21)(20)的方法，还包括给药抗体或给药CTLA-4或其片段的步骤，所述抗体抗与免疫信号传递相关的受体或其配体。

(22)一种载体组合物，所述载体的表达持续性延长，所述组合物包含(9的载体和可药用承运体。

(23)一种基因导入试剂盒，包含(a)(9)的载体和(b)抗与免疫信号传递相关的受体或其配体的抗体，或CTLA-4或其片段。

本发明中的“抗体”是包含免疫球蛋白可变区的多肽的统称，更具体地包括：免疫球蛋白链(H或L链)、包含其可变区的片段、以及包含这些片段的多肽。抗体可以是天然抗体或人工制备的抗体。例如，它们可以是两种或更多抗体的嵌合体(例如，人的抗体与另一种哺乳动物的抗体的嵌合体)。本发明中的“抗体”还包括通过Fc区取代或通过CDR移植构建的重组抗体(例如，人源化抗体)。“免疫球蛋白可变区”是指免疫球蛋白H或L链的可变区(即，V_H或V_L)或其一部分。L链可以是κ链或γ链。本发明中，可变区可以包含含有任一种互补决定区(CDR)的氨基酸序列，具体地，可以包含H或L链的CDR1，CDR2或CDR3。优选地，在本发明中，免疫球蛋白可变区包含H或L链的CDR1，CDR2，以及CDR3。在本发明中，免疫球蛋白包括任一类免疫球蛋白，例如，IgM，IgG，IgA，IgE，和IgD。

重组病毒是指利用重组多核苷酸制备的病毒。重组多核苷酸是指一种多核苷酸，其中的核苷酸并非按照自然状态结合。具体地，重组多核苷酸是其结合经过了人工修饰(切割或连接)的多核苷酸。重组多核苷酸可以通过将多核苷酸合成，核酸酶处理，连接酶处理等等组合，用本领域已知的基因重组方法来生成。重组蛋白可以通过表达编码所述蛋白的重组多核苷酸来产生。重组病毒可以通过表达编码所述病毒基因组的多核苷酸，然后重建所述病毒来生成，其中所述多核苷酸通过基因操作而构建。“重组蛋白”是指由重组多核苷酸生成的蛋白或人工合成的蛋白。

本发明中，“基因”是指遗传物质，编码转录单位的核酸。基因可以是RNA或DNA。本发明中，编码蛋白的核酸被称为该蛋白的基因。基因也可以不编码蛋白。例如，编码功能性RNA如核酶或反义RNA的基因被称为核酶的基因或反义RNA的基因。基因可以是天然产生的或是人工设计的序列。此外，本发明中，“DNA”包括单链DNA和双链DNA。“编码蛋白”是指多核苷酸包含编码该蛋白的氨基酸序列的ORF有义链或反义链，致使该蛋白可以在合适的条件下表达。

本发明中，副粘病毒是指属于副粘病毒科的病毒，或其衍生物。副粘病毒是一组以非分节段的负链RNA为其基因组的病毒，包括副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)(包括呼吸道病毒属(Respirovirus)(也称为副粘病毒属(Paramyxovirus))，腮腺炎病毒属(Rubulavirus)，和麻疹病毒属(Morbillivirus))，以及肺病毒亚科(Pneumovirinae)(包括肺病毒属(Pneumovirus)和间质肺病毒属(Metapneumovirus))。本发明可以应用的副粘病毒的具体实例有，仙台病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒(RS病毒)，牛瘟病毒，瘟热病毒，猴副流感病毒(SV5)，和人副流感病毒1，2，和3型，等等。更具体地例如，仙台病毒(SeV)，人副流感病毒-1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，海豹瘟热病毒(phocinedistemper virus，PDV)，犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)，海豚麻疹病毒(dolphin molbillivirus)(DMV)，小反刍兽疫病毒(peste-des-petits-ruminants virus，PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛瘟病毒(RPV)，亨德拉病毒(Hendra)，立百病毒(Nipah)，人副流感病毒-2(HPIV-2)，猴副流感病毒5(SV5)，人副流感病毒-4a(HPIV-4a)，人副流感病毒-4b(HPIV-4b)，腮腺炎病毒(Mumps)，和新城疫病毒(NDV)。更优选的实例包括选自下组的病毒：仙台病毒(SeV)，人副流感病毒-1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，海豹瘟热病毒(PDV)，犬瘟热病毒(CDV)，海豚麻疹病毒(DMV)，小反刍兽疫病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛瘟病毒(RPV)，亨德拉病毒(Hendra)，和立百病毒(Nipah Virus)。本发明的病毒优选属于副粘病毒亚科(包括呼吸道病毒属，腮腺炎病毒属和麻疹病毒属)，更优选属于呼吸道病毒属(也称副粘病毒属)的病毒或其衍生物。本发明可利用的呼吸道病毒属的病毒包括，人副流感病毒1型(HPIV-1)，人副流感病毒3型(HPIV-3)，牛副流感病毒3型(BPIV-3)，仙台病毒(也称鼠副流感病毒1型)，猴副流感病毒10型(SPIV-10)等。本发明的副粘病毒最优选仙台病毒。这些病毒可源自天然株，野生型株，突变株，实验室传代株，人工构建株等。

本发明中，“载体”是用于将核酸导入细胞的承运体(carrier)。副粘病毒载体是源自副粘病毒的用于将核酸导入细胞的承运体。SeV等副粘病毒是优秀的基因导入载体。由于副粘病毒仅在宿主细胞的细胞质中进行转录和复制，并且由于它们没有DNA时期，它们不发生染色体整合。故它们不会造成由染色体异常带来的癌症或永生化等安全问题。副粘病毒的这种特征对采用副粘病毒作为载体时的安全性有很大贡献。当用于表达外来基因时，SeV几乎不表现任何核苷酸突变，即使在连续多次传代后也是如此，这表明其基因组具有高度稳定性，能长期稳定表达所***的外来基因(Yu，D.etal.，Genes Cells 2，457-466(1997))。SeV还具有其它性质，例如，由于它不具有衣壳结构蛋白，故***并包装的基因的大小具有一定柔软性(flexibility)。传播型SeV载体可以导入至少4kb的外来基因，并且可以通过添加转录单位而同时表达两种以上的基因。因此，可以从同一载体表达抗体H链和L链(实施例1)。

已知SeV对啮齿动物具有致病性，可以引起肺炎。但对人类不具有致病性。鼻内给药野生型仙台病毒不会对非人灵长类造成严重的有害作用，有报告支持这一点(Hurwitz，J.L.et al.，Vaccine 15：533-540，1997)。更引人注目的优点是其“高感染性”和“高表达水平”。SeV载体通过与细胞膜蛋白糖链上的唾液酸结合而感染细胞，由于唾液酸在几乎所有细胞中均有表达，因此有广谱感染性，即高感染性。当基于SeV复制子的传播型载体释放病毒粒子时，这些病毒粒子可以再感染周围细胞，在受感染细胞的细胞质中持续表达复制性多核糖核蛋白(replicating multipleribonucleoprotein，RNP)拷贝，并随着细胞***将它们扩散到子代细胞，从而可以期待持续表达。SeV载体有非常宽的组织适用范围，这表明这些载体可以用于各种类型的抗体治疗(和分析)。由于只在细胞质内转录和复制的特征性表达机制，使其携带的基因的表达量非常高(Moriya，C.etal.，FEBS Lett.425(1)105-111(1998)；WO00/70070)。此外，通过缺失包膜基因而制得的非传播型SeV载体已经回收成功(WO00/70070；Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))，因此可以改进SeV载体，以便在维持其“高感染性”和“高表达量”的同时，提高其“安全性”。

SeV的这些特征使副粘病毒载体包括SeV可以有效进行基因治疗和基因导入，并且在以体外(in vivo)或回体(ex vivo)抗体表达为目的的基因治疗中SeV有望成为一种选择。特别是，能共表达高水平H链和L链且对人无毒性的载体具有很高临床可能性。通过将用于治疗(和分析)的抗体基因***副粘病毒载体，并使载体发挥功能，可以期待该抗体基因在病灶附近高水平表达，产生确定的治疗效果，并减小副作用。而且，所述载体还很有可能解决单克隆抗体医药开发所一直伴随的成本问题。我们认为，这些效果在可以诱导导入的基因暂时性强表达的副粘病毒载体，包括SeV，中更为明显。

副粘病毒载体包含副粘病毒基因组RNA。基因组RNA是指具备这样的能力的RNA，它与副粘病毒蛋白一起形成RNP，使这些蛋白表达基因组中的基因，使核酸复制形成子代RNP。副粘病毒是在其基因组中具有单链负链RNA的病毒，这种RNA可编码基因的反义序列。通常副粘病毒基因组在3’前导区和5’尾随区之间含有反义形式的病毒基因。各基因开放阅读框之间存在一组序列：转录终止序列(E序列)，间插序列(I序列)和转录起始序列(S序列)，这样一来，编码各基因ORF的RNA可以被转录为单独的顺反子。本发明载体的基因组RNA包含编码N(核衣壳)，P(磷)和L(大蛋白)的反义RNA序列，这些蛋白对于所述RNA编码基因的表达以及RNA本身的自主复制十分必要。所述RNA还可以编码形成病毒粒子所必需的M(基质)蛋白。所述RNA还可以编码病毒粒子感染所必需的包膜蛋白。副粘病毒包膜蛋白包括，引起细胞膜融合的F(融合)蛋白，以及细胞粘附所必需的HN(血凝素-神经氨酸酶)蛋白。但是，HN蛋白并非感染一些细胞类型所必需的蛋白(Markwell，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(4)：978-982(1985))，仅有F蛋白就可以实现感染。所述RNA可以编码除了F蛋白和/或HN蛋白以外的包膜蛋白。

本发明的副粘病毒载体可以是，例如，副粘病毒基因组RNA与病毒蛋白形成的复合体，即核糖核蛋白体(RNP)。RNP可以，例如，与所需转染试剂一起导入细胞。这种RNP更具体而言，可以是含有副粘病毒基因组RNA，N蛋白，P蛋白，和L蛋白的复合体。将RNP导入细胞后，病毒蛋白使基因组RNA中编码病毒蛋白的顺反子转录，同时，基因组自身复制，形成子代RNP。基因组RNA的复制可以用RT-PCR，Northern杂交等检测RNA拷贝数的增加来确认。

本发明的副粘病毒载体优选副粘病毒的病毒粒子。术语“病毒粒子”指通过病毒蛋白的作用从细胞中释放的含有核酸的微小粒子。副粘病毒的病毒粒子在来源于细胞膜的脂质膜(也称包膜)中包含上述RNP，该RNP包含基因组RNA和病毒蛋白。病毒粒子可以具有感染力。感染力是指副粘病毒载体由于保留了它们的细胞粘附能力和膜融合能力，而将该载体中的核酸导入该病毒粒子所粘附的细胞中的能力。本发明的副粘病毒载体可以是传播型载体或传播能力缺陷型载体。“传播型”是指，当病毒载体导入宿主细胞时，该病毒可以在细胞中自主复制，产生感染性病毒粒子。

例如，副粘病毒亚科的每一种病毒中的基因概述如下。其中N基因通常也称为“NP”。

呼吸道病毒(Respirovirus)属 NP P/C/V M F HN - L

腮腺炎病毒(Rubullavirus)属 NP P/V M F HN (SH) L

麻疹(Morbillivirus)属 NP P/C/V M F H - L

例如，每种仙台病毒基因的碱基序列的数据库登录号是：N基因为M29343，M30202，M30203，M30204，M51331，M55565，M69046和X17218；P基因为M30202，M30203，M30204，M55565，M69046，X00583，X17007和X17008；M基因为D11446，K02742，M30202，M30203，M30204，M69046，U31956，X00584和X53056；F基因为D00152，D11446，D17334，D17335，M30202，M30203，M30204，M69046，X00152和X02131；HN基因为D26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X0280和X56131；L基因为D00053，M30202，M30203，M30204，M69040，X00587和X58886。其它病毒编码的病毒基因有：N基因，如CDV，AF014953；DMV，X75961；HPIV-1，D01070；HPIV-2，M55320；HPIV-3，D10025；Mapuera，X85128；Mumps，D86172；MV，K01711；NDV，AF064091；PDPR，X74443；PDV，X75717；RPV，X68311；SeV，X00087；SV5，M81442；Tupaia，AF079780；P基因，如CDV，X51869；DMV，Z47758；HPIV-1，M74081；HPIV-3，X04721；HPIV-4a，M55975；HPIV-4b，M55976；Mumps，D86173；MV，M89920；NDV，M20302；PDV，X75960；RPV，X6831；SeV，M30202；SV5，AF052755；Tupaia，AF079780；C基因，如CDV，AF014953；DMV，Z47758；HPIV-1，M74081；HPIV-3，D00047；MV，ABO16162；RPV，X68311；SeV，AB005796；and Tupaia，AF079780；M基因，如CDV，M12669；DMV，Z30087；HPIV-1，S38067；HPIV-2，M62734；HPIV-3，D00130；HPIV-4a，D10241；HPIV-4b，D10242；Mumps，D86171；MV，AB012948；NDV，AF089819；PDPR，Z47977；PDV，X75717；RPV，M34018；SeV，U31956；SV5，M32248；F基因，如CDV，M21849；DMV，AJ224704；HPN-1，M22347；HPIV-2，M60182；HPIV-3，X05303；HPIV-4a，D49821；HPIV-4b，D49822；Mumps，D86169；MV，AB003178；NDV，AF048763；PDPR，Z37017；PDV，AJ224706；RPV，M21514；SeV，D17334；SV5，AB021962；HN(H或N)基因，如CDV，AF112189；DMV，AJ224705；HPIV-1，U709498；HPIV-2，D000865；HPIV-3，AB012132；HPIV-4A，M34033；HPIV-4B，AB006954；Mumps，X99040；MV，K01711；NDV，AF204872；PDPR，Z81358；PDV，Z36979；RPV，AF132934；SeV，U06433；SV-5，S76876。但是，已知每种病毒有多种毒株，并且由于毒株之间的差异，还存在包含除上述以外的序列的基因。

这些病毒蛋白的ORF可以在基因组RNA中借助上述E-I-S序列而排列为反义序列。离基因组RNA3’端最近的ORF仅需要位于3’前导区和该ORF之间的S序列，不需要E序列或I序列。离基因组5’端最近的ORF需要位于5’尾随区和该ORF之间的E序列，不需要I序列或S序列。使用例如内部核糖体进入位点(IRES)序列可以将两个ORF转录成单个顺反子。在这种情况中，这两个ORF之间不需要E-I-S序列。在野生型副粘病毒中，典型的RNA基因组具有3’前导区和以反义方向顺序编码N，P，M，F，HN，和L蛋白的六种ORF，在另一端是5’尾随区。在本发明的基因组RNA中，与野生型病毒一样，优选在3’前导区之后依次是编码N，P，M，F，HN，和L蛋白的ORF，然后是5’尾随区，但基因排列不限于此。一些副粘病毒并未包含所有这6种病毒基因，但即使在这种情况下，优选将各个病毒基因按照上述在野生型中一样进行排列。一般情况下，持有N，P，和L基因的载体可以在细胞中从RNA基因组自主表达基因，复制基因组RNA。通过F基因和HN基因等编码包膜蛋白的基因，以及M基因的作用，可以形成感染性病毒粒子，并将它们释放到细胞外。从而使这种载体变成传播型病毒载体。可以将编码含抗体可变区的多肽的基因如下述***该基因组的蛋白非编码区。

此外，本发明的副粘病毒载体可以缺陷任一种野生型副粘病毒基因。例如，不含M、F或HN基因或其任意组合的副粘病毒载体可以优选作为本发明的副粘病毒载体。这种病毒载体可以通过，例如外来提供缺陷基因的产物而重建。如此制得的病毒载体象野生型病毒一样，粘附宿主细胞，引起细胞融合，但由于导入细胞中的载体基因组有病毒基因的缺陷，它们不形成与起始载体具有同样感染力的子代病毒粒子。因此，这种载体可以用作仅能进行一次基因导入的安全的病毒载体。基因组中可以缺陷的基因有F基因和/或HN基因。例如，用表达F基因缺陷型重组副粘病毒载体基因组的质粒，以及F蛋白表达载体和NP、P、L蛋白表达载体一起转染宿主细胞，可以重建病毒载体(WO00/70055和WO00/70070；Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。也可以通过，例如，利用已经在其染色体中***了F基因的那些宿主细胞来制得病毒。在外来供应这些蛋白的情况中，这些蛋白的氨基酸序列不必与病毒序列相同，可以使用另一种病毒的突变基因或同源基因作为代用品，只要它们的核酸导入活性与天然型的相同或更高即可。

此外，本发明的病毒载体可以制成包含下述包膜蛋白的载体，所述包膜蛋白与衍生该载体基因组的病毒的包膜蛋白不同。例如，在重构病毒时，可以通过表达除了基本病毒基因组编码的包膜蛋白以外的其它包膜蛋白来制备包含所需包膜蛋白的病毒载体。这类蛋白无特殊限制，包括其它病毒的包膜蛋白，例如，水泡性口炎病毒(VSV-G)的G蛋白。本发明的病毒载体包括含有VSV-G等包膜蛋白的假型病毒载体，所述包膜蛋白来自与衍生该基因组的病毒不同的病毒。通过设计病毒载体，使这些包膜蛋白不在RNA基因组中编码，可以在病毒粒子感染细胞后不表达这些病毒。

本发明的病毒载体可以是，例如，在其包膜表面具有可以粘附具体细胞的蛋白的载体，所述蛋白例如粘附因子，配体，受体，抗体或其片段；或者是，含有嵌合蛋白的载体，其中所述蛋白位于细胞外区域，而源自病毒包膜的多肽位于细胞内区域。因此还可以制备靶向具体组织的载体。所述蛋白可以由病毒基因组编码，或者通过在重建病毒之时表达除了病毒基因组以外的基因(例如，宿主染色体上的其它表达载体或基因)来供给。

本发明的载体所含的任何病毒基因可以通过修饰野生型基因而获得，从而例如降低病毒蛋白的免疫原性，或者提高RNA转录效率或复制效率。具体而言，例如，在副粘病毒载体中，可通过修饰至少一种复制因子：NP基因，P基因和L基因来增强转录或复制功能。包膜蛋白HN具有血凝素和神经氨酸酶两种活性；但是，当前一种活性降低时，可以提高病毒在血液中的稳定性，当后一种活性改变时，可以调控其感染力。修饰F蛋白可以调控膜融合能力。例如，可以分析作为细胞表面抗原分子的F蛋白或HN蛋白的表位，以此制备一种病毒载体，其针对这些蛋白的抗原递呈能力减弱。

本发明的载体可以缺陷任何辅助基因。例如，敲除V基因(一种SeV辅助基因)，可以在不破坏培养细胞中基因的表达和复制的情况下，使SeV对宿主如小鼠的致病性显著降低(Kato，A.et al.，1997，J.Virol.71：7266-7272；Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16：578-587；Curran，J.et al.，WO01/04272，EP1067179)。这种减毒载体特别优选作为体内或回体(exvivo)基因导入所用的无毒性病毒载体。

本发明的病毒载体可以在上述副粘病毒载体基因组中包含编码多肽的核酸，所述多肽含有抗体可变区。含抗体可变区的那些多肽可以是全长(完整)天然抗体，或其包含抗体可变区的片段，只要它们识别抗原。抗体片段包括Fab，F(ab’)2，和scFv。可将编码抗体片段的核酸***基因组的蛋白非编码区中的任何所需位置。例如，可以将上述核酸***3’-前导区与最靠近3’-端的病毒蛋白ORF之间；每种病毒蛋白ORF之间；和/或最靠近5’-端的病毒蛋白ORF与5’-尾随区之间。而且，在缺陷F或HN等基因的基因组中，可以将编码抗体片段的核酸***那些缺陷区。在将外来基因***副粘病毒时，优选所***的基因的链长为6的倍数(Journal of Virology，Vol.67，No.8，1993，p.4822-4830)。需在所***的外来基因与病毒ORF之间安排E-I-S序列。可以借助E-I-S序列串联***两个或多个基因。或者，可以借助IRES(内部核糖体进入位点)***所需基因。

本发明的载体可以编码，例如包含抗体H链可变区的多肽，以及包含抗体L链可变区的多肽。这两种多肽包含一或多个彼此相连的氨基酸。例如，野生型抗体在H链恒定区C_H1和C_H2之间包含半胱氨酸残基，它将H链和L链通过二硫键相连。通过从载体表达包含该半胱氨酸的抗体片段，可以使来自H链和L链的肽彼此相连(实施例1)。或者，通过将彼此相连的标签肽添加到抗体片段上，可以利用这些标签肽将来自H链和L链的肽相连。在天然抗体中，每条H链中还有两个半胱氨酸，形成两组二硫键，它们将H链彼此相连。含至少一个半胱氨酸残基的H链彼此相连，形成二价抗体。缺乏使H链结合的半胱氨酸的抗体片段形成单价抗体，如Fab。

在本发明中，Fab是指一条包含抗体H链可变区的多肽链与一条包含L链可变区的多肽链的复合体。这些多肽彼此结合，形成一个(单价)抗原结合位点。Fab通常可以通过用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白来获得，但具有与其同等的结构的抗体片段在本发明中也称为Fab。具体地，Fab可以是一种二聚体蛋白，其中免疫球蛋白L链与包含H链可变区(V_h)和C_H1的多肽链相连。H链片段的C末端位点可以不被木瓜蛋白酶切割，该片段可以是用另一种蛋白酶或试剂切割的片段，或者它可以是人工设计的片段。在本发明中，Fab包括Fab’(通过用胃蛋白酶消化免疫球蛋白，并裂解H链之间的二硫键而获得)和Fab(t)(通过用胰蛋白酶消化免疫球蛋白而获得)，因为它们具有与Fab同等的结构。免疫球蛋白的类别无限制，包括所有类别，如IgG和IgM。Fab通常在H链片段和L链片段的C末端附近包含半胱氨酸，致使这两种片段可以通过二硫键彼此相连。但是在本发明中，Fab不必被二硫键连接，而且例如，通过添加可以彼此相连从而与L链片段和L链片段相连的肽片段，可以使这两条链借助这些肽形成Fab。

在本发明中，F(ab’)2是指缺失了抗体恒定区的抗体，或具有与其同等的结构的蛋白复合体。具体地，F(ab’)2是指包含两个复合单位的蛋白复合体，其中的每一个复合单位包括一条含有抗体H链可变区的多肽链和一条含有抗体L链可变区的多肽链。F(ab’)2是含有两个抗原结合位点以及H链铰链区的抗体，一般通过用pH接近4的胃蛋白酶消化抗体而获得。但在本发明中，F(ab’)2可以通过用另一种蛋白酶或试剂切割而获得，或者可以人工设计。肽链可以通过二硫键或其它连接方式连接。免疫球蛋白类别不限，包括所有类别，如IgG和IgM。

scFv是指一种多肽，其中抗体H链可变区和L链可变区都包含在单个多肽链中。所述H链可变区和L链可变区借助适当长度的间隔臂相连，该间隔臂的长度适于所述H链和L链彼此相连，从而形成抗原结合位点。

载体中所携带的外来基因的表达水平可以用添加到该基因上游(负链3’-侧)的转录起始序列的类型来调节(WO01/18223)。也可以通过控制外来基因在基因组中的***位置来控制表达水平：***位置越靠近负链3’-末端，表达水平越高；***位置越靠近负链5’-末端，表达水平越低。因此，为获得所需表达水平，可以适当控制外来基因的***位置，使之与前和后的病毒蛋白编码基因的组合最佳。一般来说，由于认为抗体片段高水平表达较有利，故优选将编码抗体的外来基因与高效转录起始序列相连，并将其***负链基因组3’-端附近。具体地，可以将外来基因***3’-前导区与靠近3’-端的病毒蛋白ORF之间。或者，可以将外来基因***最靠近3’-端的病毒基因ORF与次靠近3’-端的病毒基因之间。在野生型副粘病毒中，最靠近基因组3’-端的病毒蛋白基因是N基因，次靠近的基因是P基因。反之，当不希望所***的基因高水平表达时，可以，例如，通过将外来基因***载体中尽可能靠近负链基因组5’-侧的位置，或者通过选择低效率转录起始序列，来抑制病毒载体的基因表达水平，从而获得相应效果。

当一条含H链可变区的多肽以及一条含L链可变区的多肽，这两者都要从载体表达时，可以将所述多肽各自的核酸***载体基因组中。优选这两种核酸借助E-I-S序列串联排列。优选使用转录起始效率高的S序列，例如，5’-CTTTCACCCT-3’(负链，SEQ ID NO：1)。

本发明的载体可以在编码抗体片段的基因的***位置以外持有其它外来基因。对这类外来基因没有限制。例如，它们可以是用于控制载体感染的标记基因，或者是细胞因子、激素及免疫***其它调节因子的基因。本发明的载体可以将基因直接(体内(in vivo))给药到活体中的目标位置，或者间接(回体(ex vivo))给药，即将本发明的载体导入来自患者的细胞或其它细胞中，然后将这些细胞注入目标位置。

本发明的载体所携带的抗体可以是抗宿主可溶性蛋白、膜蛋白、结构蛋白、酶等等的抗体。它们优选包括抗与信号传递相关的分泌蛋白或其受体的抗体，抗细胞内信号传递分子的抗体。例如，所述抗体包括抗细胞外受体区的抗体，或抗受体配体的抗体(例如，抗配体的受体结合位点的抗体)。通过给药表达这类抗体的载体，可以抑制配体与受体结合，从而阻断经由该受体传递的信号。尤其，本发明载体所携带的抗体优选是对疾病或损伤具有治疗效果的抗体。关于携带抗体基因的基因导入载体已有多篇报道。几乎所有这些报道都旨在靶向这些载体。已报道的、以靶向为目的、携带抗体基因的基因导入载体使用的病毒例如：逆转录病毒(Somia，N.V.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(16)7570-7574(1995)；Marin，M.et al.，J.Virol.70(5)2957-2962(1996)；Chu，T.H.& Dornburg，R.，J.Virol.71(1)720-725(1997)；Ager，S.et al.，Hum.Gene Ther.7(17)2157-2167(1997)；Jiang，A.et al.，J.Virol.72(12)10148-10156(1998)；Jiang，A.& Durnburg，R.Gene Ther.6(12)1982-1987(1999)；Kuroki，M.et al.，Anticancer Res.20(6A)4067-4071(2000)；Pizzato，M.et al.，Gene Ther.8(14)1088-1096(2001)；Khare，P.D.et al.，CancerRes.61(1)370-375(2001))，腺病毒(Douglas，J.T.et al.，Nat.Biotechnol.14(11)1574-1578(1996)；Curiel，D.T.Ann.NY Acad.Sci.886 158-171(1999)；Haisma，H.J.et al.，Cancer Gene Ther.7(6)901-904(2000)；Yoon，S.K.et al.，BiochemBiophys.Res.Commun.272(2)497-504(2000)；Kashentseva，E.A.et al.，Cancer Res.62(2)609-616(2002))，腺伴随病毒(AAV)(Bartlett，J.S.et al.，Nat.Biotechnol.17(4)393(1999)，MVA(Paul，S.et al.，Hum.Gene Ther.11(10)1417-1428(2000))，及麻疹病毒(Hammond，A.L.J.Virol.75(5)2087-2096(2001))。几乎所有例子都是使用单链抗体(scFv)，其中大多数是靶向癌细胞。通过用本发明的载体制备包膜表面包含所述抗体的副粘病毒，还可以构建感染特定细胞的靶向载体。例如，通过携带编码抗促炎细胞因子(如白细胞介素-6(IL-6)或成纤维细胞生长因子(FGF))的抗体，本发明的载体可以用作靶向类风湿性关节炎(RA)等自身免疫病和癌症的载体。我们非常希望用表达***基因或癌症疫苗蛋白的这些靶向载体来治疗癌症。

但是，本发明载体的优势还在于，它们除了可以进行上述靶向以外，还具有其它用途。例如，本发明提供编码抗体的副粘病毒载体，其中所述抗体对疾病或损伤具有治疗效果。例如，为了治疗癌症，携带抗-erbB-2抗体的scFv基因的腺病毒载体可以用作内抗体(intrabody，一种在细胞内发挥作用的抗体)(Kim，M.et al.，Hum.Gene Ther.8(2)157-170(1997)；Deshane，J.et al.，Gynecol.Oncol.64(3)378-385(1997))，到目前为止已进行到临床研究阶段(Alvarez，R.D. & Curiel，D.T.Hum.Gene Ther.8(2)229-242(1997)；Alvarez，R.D.et al.，Clin.Cancer Res.6(8)3081-3087(2000))。在将scFv基因携带在腺病毒载体中用于同样的癌症治疗方面，已有关于同样的抗-erbB-2抗体作为分泌型抗体、而不是作为内抗体的报道(Arafat，W.O.et al.，GeneTher.9(4)256-262(2002))；关于抗-4-1BB(T细胞活化分子)抗体的报道(Hellstrom，Y.Z.et al.，Nat.Med.8(4)343-348(2002))；以及关于抗-CEA(癌胚抗原)抗体的报道(Whittington，H.A.et al.，Gene Ther 5(6)770-777(1998))，等等。这些载体主要利用scFv。用本发明载体构建的编码这些抗体的副粘病毒可以用作能体内给药以便进行医学治疗的病毒载体。由于本发明的载体不掺入宿主染色体并因此具有安全性，还由于它们可以在数日到数周的时间内表达所携带的基因，它们可以用于治疗各种疾病和损伤。本发明载体的优秀在于，它们不仅可以如上述携带scFv，还可以同时携带H链基因和L链基因，从而表达多聚体如Fab，F(ab’)2，或完整(全长)抗体，而且它们因此可以产生包含多条链的抗体复合体。编码组成Fab，完整抗体(全长抗体)，其片段等等的H链和L链的载体预计比表达scFv的载体具有更好的治疗效果。

本发明的载体除了涉及上述癌症治疗以外还涉及多种应用。例如，关于除癌症以外的疾病，已有抗REV，抗gp120或抗整合酶的HIV治疗的报道，它们利用的是：逆转录病毒载体(Ho，W.Z.et al.，AIDS Res.Hum.Retroviruss 14(17)1573-1580(1998))；AAV载体(Inouye，R.T. et al.，J.Virol.71(5)4071-4078(1997))，SV40(BouHamdan，M.et al.，Gene Ther.6(4)660-666(1999))；或质粒(Chen，S.Y.et al.，Hum.Gene Ther.5(5)595-601(1994))。上述所有实例都是利用scFv。关于其它感染性疾病，已有将完整抗-狂犬病毒抗体携带在狂犬病毒疫苗株中的报道(Morimoto，K.et al.，J.Immunol.Methods 252(1-2)199-206(2001))，以及将抗-新培斯病毒抗体的H链和L链分别携带在不同的新培斯病毒载体中的报道(Liang，X.H.Mol.Immunol.34(12-13)907-917(1997))。上述后两种情况都在病毒载体中成功携带了完整抗体，并分泌出大量活性病毒。但是，上两篇报道涉及单克隆抗体制备***，根本不涉及给药这些载体来治疗感染性疾病。而且，从安全性等角度考虑，实际治疗中体内给药(临床应用)上述载体不能指望所述抗体局部高表达。相反，本发明的载体具有适用于抗体生成和基因治疗两方面的优点。特别是，本发明的载体对人不具有致病性，因此尤其可以作为载体携带对人类非常安全的用于基因治疗的抗体基因。预计局部给药本发明的载体进行治疗，可以在体内(临床应用)中获得局部高表达。

特别适于从本发明载体进行表达的抗体是那些抗细胞内信号传递相关分子以及抗细胞外信号传递相关分子的抗体。当然，本发明优选采用抗抑制神经生存和分化或轴索伸长的配体和受体的抗体。这类信号分子包括NOGO等神经轴索伸长抑制物。表达抗神经轴索伸长抑制物的抗体的载体使得有可能对神经损伤进行新的基因治疗。

很多组织在损伤后仍具有自我再生能力，神经***也是如此，末梢神经的轴索(axon)在切断或磨损等损伤后能延伸并再生。但是，脑和脊髓等中枢神经***的神经细胞未显示损伤后轴索伸长，也不具有再生能力(RamonyCajal S，New York：Hafner(1928)；Schwab，M.E.and Bartholdi，D.Physiol.Rev.76，319-370(1996))。但是，已经证实，即使是中枢神经***在移植到末梢组织后也显示轴索伸长(David，S.and Aguayo，A.J.Science 214，931-933(1981))，因此假设，中枢神经***的神经细胞天生具有再生轴索的能力，但中枢神经***的环境抑制了轴索伸长，即中枢神经***中存在抑制神经细胞再生(轴索伸长)的因子。

实际上，NOGO已被鉴定为神经轴索伸长抑制物(Prinjha，R.et al.，Nature 403，383-384(2000)；Chen，M.S.et al.，Nature 403，434-439(2000)；GrandPre，T.et al.，Nature 403，439-444(2000))。现有三种已知的Nogo同工型：Nogo-A(Ac.No.AJ242961，(CAB71027))，Nogo-B(Ac.No.AJ242962，(CAB71028))，和Nogo-C(Ac.No.AJ242963，(CAB71029))，预计它们是剪接变体。神经轴索伸长抑制活性以最大的NOGO，Nogo-A(分子量约250kDa)为最强，活性位点预计是所有三种同工型共有的胞外区66个氨基酸(GrandPre，T.et al.，Nature 403，439-444(2000))。因此，编码与Nogo-A，Nogo-B或Nogo-C结合的抗体的副粘病毒载体可以优选用于促进神经形成。已知IN-1是抗-NOGO单克隆抗体。根据报道，IN-1可以在体外中和少突胶质细胞(oligodendrocyte)和髓磷脂(myelin)对轴索伸长的抑制作用(Caroni，P.and Schwab，M.E.Neuron 1，85-96(1988))。在一种诱导了脊髓机械损伤的大鼠体内模型中，将IN-1给药到受损部位导致该受损部位5％的轴索伸长，使功能显著恢复(Bregman，B.S.et al.，Nature 378，498-501(1995))。因此，抗具有中枢神经轴索伸长抑制活性的体内因子的中和抗体很有可能在中枢神经***神经细胞再生中有效。除NOGO以外，具有类似活性(神经轴索伸长抑制活性)的已知因子包括semaphorin，ephrin，slit等(semaphorin：Genbank Ac.Nos.NM_006080(蛋白：NP_006071)，L26081(AAA65938)；ephrin：Ac.Nos.NM 001405(NP_001396)，NM_005227(NP_005218)，NM_001962(NP_001953)，NM_004093(NP_004084)，NM_001406(NP_001397)；slit：Ac.Nos.AB017167(BAA35184)，AB017168(BAA35185)，AB017169(BAA35186))(Chisholm，A.and Tessier-Lavigne，M.Curr.Opin.Neurobiol.9，603-615(1999))。即使具有不同作用，抗这些因子的抗体也可以使中枢神经***中一般认为不具有再生能力的轴索伸长。因此，这些抗体不仅可以象IN-1显示的那样应用于脊髓损伤，而且可以应用于多种神经变性疾病。

此外，抗以下物质的抗体也是有用的：具有与NOGO同样的神经轴索伸长抑制活性的髓磷脂-相关糖蛋白(MAG)(ACCESSION NM_002361(NP_002352)，NM_080600(NP_542167)，Aboul-Enein，F.et al.，J.Neuropathol.Exp.Neurol.62(1)，25-33(2003)；Schnaar，R.L.et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.845，92-105(1998)；Spagnol，G.et al.，J.Neurosci.Res.24(2)，137-142(1989)；Sato，S.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.163(3)，1473-1480(1989)；Attia，J.et al.，Clin.Chem.35(5)，717-720(1989)；Quarles，R.H.，Crit Rev Neurobiol 5(1)，1-28(1989)；Barton，D.E.et al.，Genomics 1(2)，107-112(1987)；McKerracher，L.et al.(1994)Identification of myelin-associated glycoprotein asa major myelin-derived inhibitor of axonal growth.Neuron 13：805-811；Mukhopadhay，G.et al.(1994)A novel role for myelin associated glycoprotein asan inhibitor of axonal regeneration.Neuron 13：757-767；Tang，S.et al.(1997)Soluble myelin-associated glycoprotein(MAG) found in vivo inhibits axonalregeneration.Mol Cell Neurosci 9：333-346；Nogo受体，它是NOGO和MAG的共同受体(Nogo-66受体)(ACCESSION NM_023004(NP_075380，Q9BZR6)，Josephson，A.，et al.，J.Comp.Neurol.453(3)，292-304(2002)；Wang，K.C.，et al.，Nature 420(6911)，74-78(2002)；Wang，K.C.，et al.，Nature 417(6892)，941-944(2002)；Fournier，A.E.，et al.，Nature 409(6818)，341-346(2001)；Dunham，I.，et al.，Nature 402(6761)，489-495(1999)；Strausberg，R.L.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26)，16899-16903(2002)；GrandPre，T.etal.，Nature 417(6888)，547-551(2002)；Liu，B.P.et al.，Science 297(5584)，1190-1193(2002)；Woolf，C.J.and Bloechlinger，S.，Science 297(5584)，1132-1134(2002)；Ng，C.E.and Tang，B.L.，J.Neurosci.Res.67(5)，559-565(2002))，对轴索伸长具有抑制作用的硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)等位于胶质周边的细胞外基质(Rudge，JS，Silver，J.(1990)Inhibition of neuriteoutgrowth on astroglial scars in vitro.J Neurosci 10：3594-3603；McKeon，RJ，etal.(1999)The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan areexpressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar.J Neurosci 19：10778-10788；Smith-Thomas，LC et al.(1995)Increased axon regeneration inastrocytes grown in the presence of proteoglycan synthesis inhibitors.J Cell Sci108：1307-1315；Davies，SJA，et al.(1997)Regeneration of adult axons in whitematter tracts of the central nervous system.Nature 390：680-683；Fidler，PS et al.(1999)Comparing astrocytic cell lines that are inhibitory or permissive for axongrowth：the major axon-inhibitory proteoglycan is NG2.J Neurosci19：8778-8788)，尤其NG2(Levine，JM et al.(1993)Development anddifferentiation of glial precursor cells in the rat cerebellum.Glia 7：307-321)，neurocan(Asher，RA et al.(2000)Neurocan is upregulated in injured brain andin cytokine-treated astrocytes.J Neurosci 20：2427-2438；Haas，CA，et al.(1999)Entorhinal cortex lesion in adult rats induces the expression of the neuronalchondroitin sulfate proteoglycan neurocan in reactive astrocytes.J Neurosci 19：9953-9963)，phosphacan(McKeon，RJ et al.(1999)The chondroitin sulfateproteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes inthe chronic CNS glial scar.J Neurosci 19：10778-10788)，以及versican(Morven，C.，et al.，Cell Tissue Res(2001)305：267-273)(Genbank Ac.Nos.NM_021948(protein NP_068767)，NM_004386(protein NP_004377))(McKerracher，L.and Ellezam，B.(2002)Putting the brakes on regeneration.Science 296，1819-20；McKerracher，L.and Winton，MJ(2002)Nogo on the go.Neuron 36，345-8)。

在了解了每一种因子的作用以后，可以选出更适用于每一种神经变性疾病的配体，并且可以将抗所述因子的抗体应用于具体的神经变性疾病。

例如，在考虑用携带这些抗体基因的副粘病毒载体治疗脊髓损伤时，可以采用将所述载体直接给药到受损部位的方法。由于载体表达水平非常高，还可以预计将它们给药到靠近受损部位的脊髓腔中的可能性。此外，轴索受损变性后，需要数日的时间才能进入再生期，因此有充裕的时间来考虑是否给药。此外，由于变性伴有的炎症反应在损伤后很快变得活跃，故极有可能在损伤数日后，具体是损伤3-10日后，实际给药病毒载体。还有可能考虑联合使用不仅携带抗神经轴索伸长抑制因子中和抗体的基因、而且携带轴索伸长积极促进因子的基因的载体，蛋白或具有类似活性的化合物。胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)等神经营养因子可以用作轴索伸长促进因子。

本发明还涉及编码下述多肽的副粘病毒载体，所述多肽包含编码抑制免疫反应的抗体可变区。本发明人发现，载体自身固有的免疫原性可以通过在该载体中携带抑制免疫反应的抗体的基因而减弱。例如，可以利用表达抗免疫细胞协同刺激因子或其受体的抗体的载体，来抑制该协同刺激因子引起的信号传递，从而抑制免疫***活化和实现该载体中所携带的基因的长期表达。这种经修饰的载体尤其可在将基因导入活体时用作载体。被这类抗体抑制的靶分子包括任何传递免疫活化信号的所需信号分子，可以是生长因子或细胞因子等体液因子，或它们的受体。

已知针对病毒的活体防御机制是复杂而多重的。这种重要***是活体防御所必需的，但在利用病毒载体进行基因治疗时却是最好能避免的。这类机制之一是，被RNA病毒感染产生的双链RNA所活化的干扰素调节因子3(IRF-3：Lin，R.et al.，Mol.Cell.Biol.18(5)2986-2996(1998)；Heylbroeck，C.et al.，J.Virol.74(8)3781-3792(2000)，Genbank Ac.No.NM_001571(protein NP_001562))，双链RNA活化的蛋白激酶(PKR：Der，S.D.& Lau，A.S.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92，8841-8845(1995)；Dejucq，N.et al.，J.Cell.Biol.139(4)865-873(1997)，Genbank登录号AH008429(protein AAF13156))等等，活化下游转录因子，加速干扰素(IFN)等的表达。例如，通过携带内抗体(intrabody)等能抑制IRF-3或PKR活性、且为细胞内有功能形式的抗体的基因的载体，有可能对天然免疫反应进行部分地抑制，以便能通过持续感染而持续表达所携带的基因。实际上，在表达高水平的反义PKR而抑制PKR活性的细胞中，脑心肌炎病毒至少在体外水平显示持续感染(Yeung，M.C.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(21)11860-11865(1999))。Toll-样受体(TLR)家族中的TLR-3已显示能识别双链RNA，通过病毒感染诱导天然免疫(Alexopoulou，L.et al.，Nature 413，732-738(2001))。TLR-4也显示通过呼吸道合胞病毒感染而参与相同的免疫诱导(Haynes，L.M.et al.，J.Virol.75(22)10730-10737(2001))。有可能抗TLR-3或TLR-4(TLR-3：GenbankAc.No.NM_003265(protein NP_003256)；TLP-4：Genbank Ac.No.AH009665(proteinAAF89753))的中和抗体也对病毒载体的持续基因表达有贡献。

同样，也有可能应用以减弱病毒载体的免疫原性为目的、在器官移植中尝试的方法。即为了外周免疫耐受的目的而在载体中携带抗体基因。有人提出以下的T细胞活化模型(Schwartz，R.H.et al.，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.2，605-610(1989))：静止期T细胞的活化需要来自T细胞受体(TCR)，抗原，以及组织相容性复合体(MHC)的信号，还需要第二协同刺激信号。当在缺乏第二信号的情况下发生抗原刺激时，T细胞的不活化可以诱导免疫耐受。如果能以这种方式在病毒载体感染的细胞中诱导免疫耐受，就可以在不抑制其它免疫反应的同时避免对病毒载体产生免疫反应。这是理想的方法。CD28已被鉴定为T细胞协同刺激因子(登录号J02988(proteinAAA60581)，AF222341(AAF33792)，AF222342(AAF33793)，和AF222343(AAF33794))，它与抗原呈递细胞表面的CD80(登录号NM 005191(NP_005182))和CD86(登录号U04343(AAB03814)，NM_006889(NP_008820))相互作用可放大来自TCR的刺激，通过产生IL-2等进一步活化T细胞。另一方面，CTLA-4(细胞毒T淋巴细胞抗原4：CD152)(登录号L15006，(AAB59385))以高亲和力结合与CD28共有的配体(CD80，CD86)，发挥抑制T细胞的作用(Walunas，T.L.et al.，Immunity1(5)405-413(1994))。PD-1L及其受体PD-1已知是同样的活化配体(PD-1：Genbank Ac.No.U64863(protein AAC51773)，PD-1L：AF233516(protein AAG18508；在本说明书中它们统称为PD-1))(Finger，L.R.et al.，Gene 197，177-187(1997)；Freeman，G.J.et al.，J.Exp.Med.192，1027-1034(2000))。据说，T细胞表面的淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)(登录号Y00057(CAA68266))与抗原呈递细胞表面的细胞间粘附分子-1(ICAM-1：CD54)(登录号J03132(AAA52709)，X06990(CAA30051))结合，同样参与协同刺激。根据以上描述，携带抑制CD28的抗体、模拟CTLA-4活性的抗体、和/或抑制LFA-1与ICAM-1结合的抗体的基因的病毒载体预计可以使受染细胞获得外周免疫耐受，并实现长期基因表达或多重给药。实际上，对器官移植病例的研究显示，短期给药相应抗体可以诱导出免疫耐受。例如，关于利用能抑制协同刺激因子CD28结合的抗-CD28抗体的效果(Yu，X.Z.et al.，J.Immunol.164(9)4564-4568(2000)；Laskowski，I.A.et al.，J.Am.Soc.Nephrol.13(2)519-527(2002))，关于利用具有抑制T细胞活化功能的CTLA-4自身与IgG1·Fc结合形成的蛋白(CTLA4-Ig)的效果(Pearson，T.C.et al.，Transplantation 57(12)1701-1706(1994)；Blazzer，B.R.et al.，Blood 85(9)2607-2618(1995)；Hakim，F.T.et al.，J.Immunol.155(4)1757-1766(1995)；Gainer，A.L.et al.，Transplantation 63(7)1017-1021(1997)；Kirk，A.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(16)8789-8794(1997)；Comoli，P.et al.，Bone Marrow Transplant27(12)1263-1273(2001))，以及关于利用能抑制LFA-1与ICAM-1结合的抗体的效果(Heagy，W.et al.，Transplantation 37(5)520-523(1984)；Fischer，A.etal.，Blood 77(2)249-256(1991)；Guerette，B.et al.，J.Immunol.159(5)2522-2531(1997)；Nicolls，M.R.et al.，J Immunol.164(7)3627-3634(2000)；Poston，R.S.et al.，Transplantation 69(10)2005-2013(2000)；Morikawa，M.etal.，Transplantation 71(11)1616-1621(2001)；Da Silva，M.et al.，J.Urol. 166(5)1915-1919(2001))都有报道。而且，利用与CD28和CTLA-4结构和功能类似的、最近鉴定的诱导型协同刺激因子(ICOS：Wallin，J.J.et al.，J.Immunol.167(1)132-139(2001)；Sperling，A.I.& Bluestone，J.A.Nat.Immunol.2(7)573-574(2001)；Ozkaynak，E.et al.，Nat.Immunol.2(7)591-596(2001)；Ac.No.AJ277832(CAC06612))进行同样的研究，确认了抗-ICOS抗体的效果(Ogawa，S.et al.，J.Immunol.167(10)5741-5748(2001)；Guo，L.et al.，Transplantation73(7)1027-1032(2002))。利用病毒载体的方法已有报道，携带CTLA4-Ig基因的腺病毒载体在器官移植中的应用已有研究(Pearson，T.C.et al.，Transplantation 57(12)1701-1706(1994)；Li，T.S.et al.，Transplantation 72(12)1983-1985(2001))。

上述以器官移植中外周免疫耐受为目的的方法，也可以在利用病毒载体进行基因导入时作为诱导免疫耐受的有效方法，通过在病毒载体中携带相应抗体基因(或CTLA4-Ig)可以实现长期基因表达或反复给药。在这一方面，关于腺病毒载体的报道表明，将携带CTLA4-Ig基因的腺病毒载体与携带另一种标记基因(lacZ)的载体一起给药，可以抑制免疫反应并延长标记基因的表达(Ali，R.R.et al.，Gene Ther.5(11)1561-1565(1998)；Ideguchi，M.etal.，Neuroscience 95(1)217-226(2000)；Uchida，T.et al.，Brain Res.898(2)272-280(2001))。在这种简单***中，免疫耐受仅用CTLA4-Ig基因和另一载体中携带的标记基因来检查。关于在同一载体中携带这两种基因，用抗体基因抑制另一种协同刺激因子，或者具体是副粘病毒载体的效果等没有报道，也根本没有详细的检查。在本发明中，可以使用抗上述各种信号分子的抗体的基因，而且可以从单个载体表达多个基因，如诱导免疫耐受的抗体基因，以及治疗基因(或标记基因)。特别是，通过用抗体基因抑制T细胞活化的协同刺激因子的作用，可以，例如，构建局限于给药部位、能长期表达作用于免疫***的基因的载体，也可以反复(多次)给药。

携带抗这些因子或受体的抗体基因的副粘病毒载体可以用作另外携带治疗基因的治疗载体。或者将这类副粘病毒载体与另一种携带治疗基因的载体一起给药可以长期表达治疗基因和/或反复给药。任何疾病都可以作为基因治疗的目标。与用每一种治疗基因进行基因治疗一致的治疗方法可以用作给药本发明载体的方法。

本发明编码诱导免疫耐受的抗体的载体与不编码该抗体的对照载体相比，活体给药后基因表达持续性出现升高。基因表达持续性可以通过，例如将本发明的载体和对照载体以相同滴度给药相同部位(例如，左右对称的部位)，以刚刚给药后的水平为100，测量相对表达水平的经时变化来评价。例如，可以测量，给药后相对表达水平降低到50，30，或10所需的时间；或在预定时间之后的相对表达水平。本发明的载体与对照相比，表达水平的持续性出现统计学显著的升高(例如，5％以上的显著性水平)。统计学分析可以用，例如t检验来进行。

与此同时，通过给药抗协同刺激信号分子的抗体，或CTLA-4或其片段，可以使载体的基因表达持续性进一步延长。可以用抗上述CD28，CD80，CD86，LFA-1，ICAM-1(CD54)，ICOS等的抗体作为抗协同刺激信号分子的抗体。这类抗体片段可以按照，例如“Japanese Biochemical Society，ed.，NewBiochemical Experiment Manual 12，Molecular Immunology III，pp 185-195(Tokyo Kagaku Dojin)”和/或“Current Protocols in Immunology，Volume 1，(John Wiley & Sons，Inc.)”所述来制备。抗体片段可以通过，例如，用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶等蛋白酶消化抗体而获得。或者，可以通过分析可变区的氨基酸序列，将这些序列表达为重组蛋白来制备这些片段。抗体还可以包括人源化抗体和人抗体。抗体可以用蛋白A层析柱，蛋白G层析柱等通过亲和层析纯化。任何所需多肽都可以用作CTLA-4或其片段，只要它们包含CTLA-4的CD80/CD86结合位点，并与CD80和/或CD86结合而抑制与CD28的相互作用；但优选使用，例如IgG(例如，IgG1)Fc片段与CTLA-4胞外区融合形成的可溶性多肽。这些多肽和抗体可以通过冻干而配制成药物制剂，或者与所需可药用承运体，具体是生理盐水或磷酸盐缓冲液(PBS)等配制成水性组合物。本发明涉及包含这些多肽或抗体以及本发明载体的基因转导试剂盒。这些试剂盒可以用于延长载体给药后的表达期，尤其是用于延长反复给药的载体的基因表达期。

为了制备本发明的载体，可以在哺乳动物细胞中，在有包含副粘病毒基因组RNA的RNP重建所必需的病毒蛋白(即N，P，和L蛋白)存在的条件下，转录本发明编码副粘病毒基因组RNA的cDNA。病毒RNP可以通过产生负链基因组(即与病毒基因组相同的反义链)或正链(编码病毒蛋白的有义链)来重建。优选通过产生正链来提高载体重建的效率。RNA末端优选尽可能正确反映天然病毒基因组3’-前导序列和5’-尾随序列的末端。例如，为了正确调节转录产物的5’-端，可以利用T7 RNA聚合酶的识别位点作为转录起始点，在细胞中表达RNA聚合酶。例如，为了调节转录产物的3’-端，可以在转录产物的3’-端编码自我切割型核酶，以便用该核酶正确切割3’-端(Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997；Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16：578-587；and Yu，D.et al.，1997，Genes Cells 2：457-466)。

可以按照例如Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997；Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16：578-587；Yu，D.et al.，1997，Genes Cells 2：457-466中记载方法，如下构建带有外来基因的重组仙台病毒载体。

首先，制备包含所需外来基因的cDNA序列的DNA样品。优选此DNA样品在25ng/μl或更高的浓度可以通过电泳确认为单个质粒。下面是一个利用NotI位点将外来基因***编码病毒基因组RNA的DNA中的实例。当目的cDNA碱基序列中包含NotI识别位点时，优选事先用定点诱变法等改变碱基序列以除去该位点，但不改变所编码的氨基酸序列。目标基因片段通过PCR从所述DNA样品扩增并回收。通过在一对引物的5’区添加NotI位点，使扩增片段的两个末端都为NotI位点。引物中包括E-I-S序列或其片段，导致将外来基因***病毒基因组之后，在外来基因的ORF两侧，以及病毒基因ORF之间各有一个E-I-S序列。

例如，正向侧合成DNA序列在5’-末端包含任意两个或多个核苷酸(优选4个核苷酸，不包括GCG和GCC等来自NotI识别位点的序列，更优选ACTT)，以确保用NotI消化。在该序列的3’-末端添加NotI识别序列gcggccgc。另外，在3’-侧还添加任意9个核苷酸或9加6的倍数个核苷酸作为间隔臂序列。进一步地，还在3’-末端添加所需cDNA ORF的约25个核苷酸的序列，它从起始密码子ATG开始并包括ATG。优选地，从所需cDNA选取约25个核苷酸作为正向侧合成DNA的3’-末端，使最后一个核苷酸为G或C。

反向侧合成DNA序列在5’末端包含任意两个或多个核苷酸(优选4个核苷酸，不包括GCG和GCC等来自NotI识别位点的序列，更优选ACTT)。在该序列的3’-末端添加NotI识别序列‘gcggccgc’。另外，在3’-末端还添加oligo DNA***片段以调整长度。该Oligo DNA的长度如下设计：最终PCR扩增产物的NotI片段，包括添加的E-I-S序列，总链长为6的倍数个核苷酸(所谓“6的法则”；Kolakofski，D.，et al.，J.Virol.72：891-899，1998；Calain，P.and Roux，L.，J.Virol.67：4822-4830，1993；Calain，P.and Roux，L.，J.Virol.67：4822-4830，1993)。当在该引物中添加E-I-S序列时，在oligo DNA***片段的3’-末端添加：仙台病毒S序列的互补序列(优选5’-CTTTCACCCT-3’；SEQID NO：1)、I序列的互补序列(优选5’-AAG-3’)、E序列的互补序列(优选5’-TTTTTCTTACTACGG-3’；SEQ ID NO：2)；进一步在该3’-末端添加自所需cDNA终止密码子起反向计数的约25个核苷酸的互补序列，使其最后一个核苷酸为G或C，制得反向侧合成DNA的3’末端。

PCR可以利用Taq聚合酶或其它DNA聚合酶按常规方法进行。目的扩增片段用NotI消化，然后***pBluescript等质粒载体的NotI位点。所得PCR产物的碱基序列用测序仪确认，选出具有正确序列的质粒。质粒中的***片段用NotI切出，克隆至包含基因组cDNA的质粒的NotI位点。也可以不利用质粒载体，直接将所述片段***NotI位点，获得重组仙台病毒cDNA。

例如，重组仙台病毒基因组cDNA可以根据文献记载的方法构建(Yu，D.et al.，Genes Cells 2：457-466，1997；Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997)。例如，首先将带有NotI识别位点的18bp间隔臂序列(5′-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3′；SEQ ID NO：3)插到克隆化仙台病毒基因组cDNA(pSeV(+))中前导序列与N蛋白ORF之间，得到带有源自δ肝炎病毒反基因组链的自我切割型核酶位点的质粒pSeV18+b(+)(Hasan，M.K.et al.，1997，J.General Virology 78：2813-2820)。将外来基因片段***pSeV18+b(+)的NotI位点，能获得***了所需外来基因的重组仙台病毒cDNA。

按上述制备的重组副粘病毒基因组RNA的编码DNA，在上述病毒蛋白(L、P和N)存在的情况下，在细胞中转录，可以重建本发明的载体。本发明提供，用于制备本发明载体的、编码本发明载体中病毒基因组RNA的DNA。本发明还涉及编码载体基因组RNA的DNA用于制备本发明载体的用途。重组病毒可以按照公知的方法重建(WO97/16539；WO97/16538；Durbin，A.P.et al.，1997，Virology 235：323-332；Whelan，S.P.et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8388-8392；Schnell.M.J.et al.，1994，EMBO J.13：4195-4203；Radecke，F.et al.，1995，EMBO J.14：5773-5784；Lawson，N.D.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4477-4481；Garcin，D.et al.，1995，EMBO J.14：6087-6094；Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1：569-579；Baron，M.D.andBarrett，T.，1997，J.Virol.71：1265-1271；Bridgen，A.and Elliott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：15400-15404)。用这些方法能从DNA重建(-)链RNA病毒，包括副流感病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒和仙台病毒。本发明载体可以用这些方法重建。当病毒载体DNA中缺失F、HN和/或M基因时，无法形成感染性病毒粒子，但有可能将这些缺失基因和/或编码其它病毒包膜蛋白的基因导入宿主细胞并表达，从而能产生感染性病毒粒子。

具体地，所述病毒可以如下制备：(a)在表达N、P和L蛋白的细胞中转录编码副粘病毒基因组RNA或其互补链(正链)的cDNA，(b)从这些细胞或其培养上清中回收包含基因组RNA的复合体。为了进行转录，将编码基因组RNA的DNA连接到适当启动子的下游。如此转录的基因组RNA在有N，L和P蛋白存在的情况下复制形成RNP复合体。然后，在有M、HN，和F蛋白存在的情况下，形成包裹在包膜中的病毒粒子。例如，可以将编码基因组RNA的DNA连接到T7启动子的下游，然后通过T7 RNA聚合酶转录成RNA。除了包含T7聚合酶识别序列的启动子以外，可以利用其它任何所需的启动子。或者，也可以用体外转录的RNA转染细胞。

从DNA起始基因组RNA转录所必需的T7 RNA聚合酶等酶类，可以通过例如，转导能表达它们质粒载体或病毒载体，或者将其基因掺入细胞染色体以便能诱导它们的转录，然后在病毒重建时诱导表达，来提供。基因组RNA以及病毒重建所必需的病毒蛋白，可以例如通过转导能表达它们的质粒来提供。在供给这些病毒蛋白时，可以使用辅助病毒，例如野生型病毒或一些类型的突变副粘病毒，但这有可能导致混入这些病毒，因此并不优选这种方法。

将表达基因组RNA的DNA导入细胞的方法包括，例如：(i)制备能被目的细胞摄入的DNA沉淀的方法，(ii)制备包含带正电的DNA的复合体的方法，所述复合体适于被目的细胞摄入并且具有较低细胞毒性，和(iii)利用电脉冲在目的细胞膜上瞬时开孔的方法，孔的大小仅足以让DNA分子通过。

方法(ii)中可以使用各种转染试剂，例如DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN #301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Roche #1811169)等。方法(i)中，可以用磷酸钙进行转染，用这种方法导入细胞的DNA被吞噬体摄入，但已知足量的DNA也能被摄入细胞核中(Graham，F.L.and Van Der Eb，J.，1973，Virology 52：456；Wigler，M.and Silverstein，S.，1977，Cell 11：223)。Chen和Okayama研究了导入技术的最佳条件，他们报道说：(1)细胞和共沉淀物的温育条件为：2～4％CO₂，35℃，15～24hr，(2)环状DNA比线性DNA活性更高，和(3)当沉淀混合液中DNA浓度为20～30μg/ml时，可形成最佳沉淀(Chen，C.and Okayama，H.，1987，Mol.Cell.Biol.7：2745)。方法(ii)适于瞬时转染。已知更早的方法是配制具有所需DNA浓度比的DEAE-葡聚糖(Sigma #D-9885 M.W.5×10⁵)混合液进行转染。由于大多数复合体在内体中降解，可以加入氯喹来提高转染效力(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：3015)。方法(iii)被称为电穿孔方法，由于没有细胞选择性，它比方法(i)和(ii)应用更广。可通过最优化脉冲电流的持续时间、脉冲形式、电场强度(电极间空隙，电压)、缓冲液的导电性、DNA浓度和细胞密度使转染效力最大化。

在上述三种方法中，方法(ii)操作简单，并且能用大量的细胞检测大量样品，因此转染试剂适用于在重建载体时将DNA导入细胞中，转染试剂优选但不限于Superfect Transfection Reagent(QIAGEN，目录号301305)或DOSPER Liposomal Transfection Reagent(Roche，目录号1811169)。

具体地，可以按下述方法从cDNA重建病毒：

在24孔或6孔塑料板或100mm Petri培养皿中，用极限必需培养基(MEM)将猴肾细胞LLC-MK2培养至100％铺满，所述培养基含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素(100U/ml青霉素G和100μg/ml链霉素)。将表达T7聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3在1μg/ml补骨脂素存在的情况下于UV中暴露20分钟灭活，然后以2PFU/细胞的量感染细胞(Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8122-8126，1986；Kato，A.et al.，Genes Cells 1：569-579，1996)。可以适当调整补骨脂素的加入量和暴露于UV的时间长短。感染1小时后，将2-60μg(更优选3-20μg)编码重组仙台病毒基因组RNA的DNA和表达病毒RNP生成所必需的反式作用病毒蛋白的质粒(0.5-24μgpGEM-N、0.25-12μg pGEM-P和0.5-24μg pGEM-L)(Kato，A.et al.，GenesCells 1：569-579，1996)采用Superfect(QIAGEN)的脂转染方法等进行转染。编码N、P和L蛋白的载体的量优选比例为2∶1∶2；质粒的量优选调整为，例如，1-4μg pGEM-N，0.5-2μg pGEM-P，1-4μg pGEM-L。

转染的细胞在不含血清的MEM中培养，所述MEM根据需要，可以含有100μg/ml利福平(Sigma)和阿糖胞苷(AraC)，优选浓度为40μg/ml的阿糖胞苷(AraC)(Sigma)，以便将药物浓度调整至最佳，从而使痘苗病毒的细胞毒性最小而病毒的回收率最高(Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1：569-579)。转染后将细胞培养48-72hr，然后回收细胞，冻融三次使细胞破碎。用含RNP的细胞裂解物再度感染LLC-MK2细胞并培养。或者回收培养上清，将其添加到LLC-MK2细胞的培养液中，使其感染细胞并进行培养。转染可以如下进行：例如，与脂转染胺，聚阳离子脂质体等形成复合体，然后导入细胞具体地，可以使用各种转染试剂。例如，DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE和DOSPER(Roche #1811169)。为了防止在内体中降解，还可加入氯喹(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：3015)。在导入了RNP的细胞中，进行从RNP表达病毒基因和RNP复制的过程，使载体扩增。将所得病毒液稀释(例如，10⁶-倍)，再进行扩增，可以完全除去痘苗病毒vTF7-3。将扩增重复例如3次以上。所得载体可以在-80℃贮存。为了重建缺陷了包膜蛋白编码基因、不具有传播能力的病毒载体，可以用表达该包膜蛋白的LLC-MK2细胞进行感染，或者可以与表达该包膜蛋白的质粒一起感染。另一种方法是，将转染的细胞覆盖在表达该包膜蛋白的LLK-MK2细胞上层并进行培养，使缺陷型病毒载体繁殖(见WO00/70055和WO00/70070)。

回收的病毒的滴度可通过测定CIU(细胞感染单位)或血凝素活性(HA)来确定(WO00/70070；Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1：569-579；Yonemitsu，Y.& Kaneda，Y.，Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated genedelivery to vascular cells.Ed.by Baker AH.Molecular Biology of VascularDiseases.Method in Molecular Medicine：Humana Press：pp.295-306，1999)。携带GFP(绿色荧光蛋白)等标记基因的载体，可以利用所述标记作为指标，直接计数受感染的细胞来定量(例如，GFP-CIU)。如此测定的滴度可以用与CIU同等的方式进行处理(WO00/70070)。

对重建所用的宿主细胞无特殊限制，只要能重建病毒载体。例如，在仙台病毒载体等的重建中，可以使用来自猴肾的LLC-MK2细胞和CV-1细胞、来自仓鼠肾的BHK细胞、来自人的细胞等。通过在这些细胞中表达适当的包膜蛋白，可以获得包膜中包含这些蛋白的感染性病毒粒子。此外，为了获得大量仙台病毒载体，可以用从上述宿主获得的病毒载体感染受孕鸡卵，从而扩增该载体。已经开发了用鸡卵制备病毒载体的方法(Nakanishi，et al.，ed.(1993)，“State-of-the-Art Technology Protocol in NeuroscienceResearch III，Molecular Neuron Physiology”，Koseisha，Osaka，pp.153-172)。具体地，例如，将受精卵在孵化器中37-38℃培养9-12天以形成胚。将病毒载体接种到尿囊腔，进一步将该受精卵培养数日(例如3日)使病毒载体繁殖。可根据所用的重组仙台病毒的不同而改变培养时间等条件。然后，回收含有载体的尿囊液。可以用常规方法从尿囊液中分离和纯化仙台病毒载体(Tashiro，M.，“Virus Experiment Protocol，”Nagai，Ishihama，ed.，Medical ViewCo.，Ltd.，pp.68-73，(1995))。

例如，可以如下构建和制备F基因缺陷型仙台病毒载体(见WO00/70055和WO00/70070)。

<1>构建F基因缺失型仙台病毒基因组cDNA和F表达质粒

仙台病毒(SeV)的全长基因组cDNA，pSeV18⁺b(+)(Hasan，M.K.et al.，1997，J.General Virology 78：2813-2820)(“pSeV18+b(+)”也称“pSeV18⁺”)用SphI/KpnI消化，回收消化片段(14673bp)，将该片段克隆到pUC18，得到质粒pUC18/KS。在pUC18/KS上构建F基因缺失位点。F基因缺失通过联合应用PCR-连接反应来创建，结果除去F基因ORF(ATG-TGA＝1698bp)，与例如atgcatgccggcagatga(SEQ ID NO：4)连接，由此构建F基因缺失型SeV基因组cDNA(pSeV18⁺/ΔF)。用F基因上游引物对[正向：5’-gttgagtactgcaagagc/SEQ ID NO：5，反向：5’-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/SEQID NO：6]和F基因下游引物对[正向：5’-atgcatgccggcagatga/SEQ ID NO：7，反向：5’-tgggtgaatgagagaatcagc/SEQ ID NO：8]进行PCR，所得PCR产物在EcoT22I位点连接。按上述方法获得的质粒用SacI和SalI消化，回收含有F基因缺失位点的片段(4931bp)，将其克隆到pUC18，得到pUC18/dFSS。用DraIII消化该pUC18/dFSS，回收片段，用pSeV18⁺中包含F基因区域的DraIII片段置换，连接后得到质粒pSeV18⁺/ΔF。

将外来基因***例如pUC18/dFSS中F基因缺失部位的NsiI和NgoMIV限制酶位点。为此，例如，可以用尾部为NsiI的引物和尾部为NgoMIV的引物扩增外来基因片段。

<2>制备诱导SeV-F蛋白表达的辅助细胞

为了构建表达仙台病毒F基因(SeV-F)的Cre/loxP诱导型表达质粒，通过PCR扩增SeV-F基因，将扩增产物***为了能通过Cre DNA重组酶诱导基因产物表达而设计的质粒pCALNdLw(Arai，T.et al.，J.Virology 72，1998，p1115-1121)的唯一SwaI位点，由此构建质粒pCALNdLw/F。

为了从F基因缺失型基因组回收感染性病毒颗粒，建立表达SeV-F蛋白的辅助细胞株。可以使用例如SeV增殖中常用的猴肾细胞株LLC-MK2。在37℃和5％CO₂中用含有下列成分的MEM培养LLC-MK2细胞：10％热灭活胎牛血清(FBS)、青霉素G钠(50U/ml)和链霉素(50μg/ml)。由于SeV-F基因产物具有细胞毒性，用磷酸钙法(利用哺乳动物转染试剂盒(Stratagene))将为了能通过Cre DNA重组酶诱导F基因产物表达而设计的上述质粒pCALNdLw/F按公知的方案导入LLC-MK2细胞。

将质粒pCALNdLw/F(10μg)导入已在10cm培养皿中培养至40％铺满的LLC-MK2细胞中，然后用含10％FBS的MEM培养基(10ml)在37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时。24小时后将细胞剥下，悬浮于培养基(10ml)后，接种五个10ml培养皿，其中一皿为5ml、两皿为2ml、两皿为0.2ml，用含G418(Gibco-BRL)(1,200μg/ml)和10％FBS的MEM培养基(10ml)培养14天，每两天更换一次培养基，选出稳定的基因导入株。用克隆环回收上述培养基中生长的G418抗性细胞。回收的各克隆均在10cm培养皿中扩增到铺满。

在6cm培养皿中将细胞扩增到铺满，按照齐藤等的方法(Saito et al.，Nucl.Acids Res.23：3816-3821(1995)；Arai，T.et al.，J.Virol 72，1115-1121(1998))以例如moi＝3的腺病毒AxCANCre感染细胞，由此诱导F蛋白表达。

<3>F基因缺失型SeV病毒的重建和扩增

将上述导入了外来基因的质粒pSeV18⁺/ΔF用以下方法转染LLC-MK2细胞。将LLC-MK2细胞以5×10⁶个细胞/皿接种100mm的Petri皿。在用T7RNA聚合酶进行基因组RNA转录的情况下，将细胞培养24小时后，用经补骨脂素和长波长紫外线(365nm)处理20分钟的表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒(PLWUV-VacT7：Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986))，以moi约为2的水平，室温转染1小时。用例如装有5只15瓦灯泡的UV Stratalinker 2400(商品目录号400676(100V)，Stratagene，La Jolla，CA，USA)进行痘苗病毒的紫外线照射。将细胞用无血清MEM洗涤后，表达基因组RNA的质粒和分别表达副粘病毒N，P，L，F和HN蛋白的质粒用适当的脂转染试剂转染细胞。这些质粒用量的比优选按照上述顺序为6∶2∶1∶2∶2∶2，但不限于此。例如，表达基因组RNA的质粒以及表达N，P，L和F+HN的质粒(pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L和pGEM/F-HN；WO00/70070，Kato，A.et al.，Genes Cells 1，569-579(1996))分别以12μg，12μg，4μg，2μg，4μg和4μg/皿的量进行转染。培养数小时后，将细胞用无血清MEM洗两次，在含40μg/ml胞嘧啶β-D-***呋喃糖苷(AraC：Sigma，St.Louis，MO)和7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco-BRL，Rockville，MD)的MEM中培养。回收这些细胞，将细胞团悬浮于Opti-MEM(10⁷个细胞/ml)。将悬浮液反复冻融三次，与脂转染试剂DOSPER(Boehlinger Mannheim)(10⁶个细胞/25μl DOSPER)混合，室温放置15分钟后，转染上述克隆化的表达F的辅助细胞(10⁶个细胞/孔，12孔板)，用不含血清的MEM(含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)培养，回收上清。缺失了除F以外的基因(例如HN基因或M基因)的病毒可以用同样的方法制备。

在制备病毒基因缺陷型载体的情况中，例如，将在其载体基因组中缺失了不同包膜基因的两种或更多种不同载体导入同一细胞时，每种缺失的病毒蛋白通过另一载体的表达来提供。因此，这些载体可以互补蛋白缺失，导致产生感染性病毒颗粒，结果通过复制循环可以扩增这些病毒载体。换而言之，将两种或多种可以互补病毒蛋白缺陷的本发明载体同时混合接种，能以较低成本大量产生各种病毒基因缺陷型病毒载体的混合物。由于这些缺失病毒基因的病毒与未缺失病毒基因的病毒相比具有较小的基因组，它们可以携带较长的外来基因。此外，这些由于缺失病毒基因而缺乏增殖能力的病毒毒性大大减弱，并且在细胞外稀释后很难维持共感染状态，因此它们不会产生后代，在环境释放的管理方面较有利。例如，可以想到分别构建能彼此互补的编码抗体H链的载体和编码L链的载体，用它们进行共感染。本发明提供一种组合物，它包含，编码含有抗体H链可变区的多肽的副粘病毒载体，以及编码含有抗体L链可变区的多肽的副粘病毒载体。本发明还提供一种试剂盒，它包含，编码含有抗体H链可变区的多肽的副粘病毒载体，以及编码含有抗体L链可变区的多肽的副粘病毒载体。这些组合物和试剂盒可以用于通过同时感染而形成包含H链和L链的抗体。

当将传播型副粘病毒载体给药个体或细胞后，因治疗结束等原因必须限制该病毒载体的增殖时，也可以通过给药RNA-依赖性RNA聚合酶抑制剂，而仅仅特异性限制该病毒载体的增殖，但对宿主不造成损害。

根据本发明的方法，本发明的病毒载体可以以，例如，1×10⁵CIU/ml或以上，优选1×10⁶CIU/ml或以上，更优选5×10⁶CIU/ml或以上，更优选1×10⁷CIU/ml或以上，更优选5×10⁷CIU/ml或以上，更优选1×10⁸CIU/m或以上，更优选5×10⁸CIU/ml或以上的滴度释放到病毒生成性细胞的培养基中。病毒滴度可以用本说明书描述的方法测量，也可以用其它方法(Kiyotani，K.et al.，Virology 177(1)，65-74(1990)；WO00/70070)。

可以将回收的副粘病毒纯化使其达到基本纯。纯化方法包括过滤、离心分离和柱纯化等公知的纯化分离方法或上述方法的组合。“基本纯”是指病毒载体是其所在样品的主要成分，一般来说，当样品所含的全部蛋白(作为承运体和稳定剂加入的蛋白除外)中，来自病毒载体的蛋白比例为10％或以上，优选20％或以上，更优选50％或以上，优选70％或以上，更优选80％或以上，进一步优选90％或以上时，可以确定为基本纯的病毒载体。副粘病毒的具体纯化方法包括，采用纤维素硫酸酯或交联多糖硫酸酯的方法(特公昭JP62-30752、特公昭JP62-33879和特公昭JP62-30753)，以及吸附于含有硫酸岩藻糖的多糖和/或其分解产物上的方法(WO97/32010)。

在制备包含载体的组合物时，该载体可以根据需要与可药用承运体或赋形剂混合。“可药用承运体或赋形剂”是指可以与本发明载体一起给药，不明显抑制该载体的基因导入活性的材料。例如，该载体可以用生理盐水或磷酸盐缓冲液(PBS)等适当稀释，制成组合物。当载体在鸡卵中增殖时，“可药用承运体或赋形剂”可以包含尿囊液。另外，包含载体的组合物还可以含有去离子水和5％葡萄糖水溶液等承运体或赋形剂。进一步地，还可以含有植物油、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂和杀菌剂等。另外，可以添加防腐剂或其它添加剂。包含本发明载体的组合物可以用作试剂或药物。

载体的给药量因疾病、患者的体重、年龄、性别、症状、给药目的、给药组合物的形式、给药方法和导入的基因等而异，本领域技术人员可以适当决定。给药途径可以适当选择，例如，经皮，鼻腔内，经支气管，肌肉内，腹腔内，静脉内，关节内，脊髓腔内，或皮下，但不限于此。也可以局部给药或全身给药。载体的给药量优选为，在可药用承运体中优选约10⁵CIU/ml-约10¹¹CIU/ml，更优选约10⁷CIU/ml-约10⁹CIU/ml，最优选约1×10⁸CIU/ml-约5×10⁸CIU/ml。在人类中，单一剂量优选为2×10⁵CIU-2×10¹⁰CIU，可以给药一次或更多次，只要副作用在临床可接受的范围内。每天的给药次数也可照此办理。在用本发明载体制备蛋白制剂的情况中，该蛋白给药量可以是，例如10ng/kg-100μg/kg，优选100ng/kg-50μg/kg，更优选1μg/kg-5μg/kg。在除人类以外的其它动物的情况中，例如，可以根据目的动物与人的体重比或给药部位体积比(例如，平均值)换算上述给药量，然后按照该换算的给药量给药该动物。含有本发明载体的组合物的给药对象包括人、猴、小鼠、大鼠、兔、羊、牛和狗等所有哺乳动物。

附图说明

图1是核苷酸序列，它编码抗NOGO中和抗体的Fab(H链和L链)的NotI片段。蛋白编码序列用大写字母表示。此外，SeVE信号、间插序列和S信号的核苷酸序列用下划线-点状下划线-下划线表示。波状下划线表示产生与NotI相同的粘性末端的位点，该序列可以，例如，用于将H链和L链的编码序列克隆到不同载体的NotI位点中。

图2是构建图1所示Fab编码片段时用到的寡核苷酸。SEQ ID NO：12-42依次表示SYN80 F1-SYN80 R16。

图3示图2中寡核苷酸的设置。

图4显示传播型病毒(SeV18+IN-1)(A图)和传播能力缺陷型病毒(SeV18+IN-1/ΔF)(B图)的结构，它们都携带NOGO中和抗体的Fab基因。图中还显示了确认该病毒基因组的RT-PCR照片。

图5为照片，显示传播型病毒或F基因缺陷型病毒的Fab表达，这两种病毒都携带NOGO中和抗体的Fab基因。用携带GFP基因的传播型SeV载体作为阴性对照(NC)。图中显示了感染后2天(d2)或4天(d4)的抗体表达。

图6为照片，显示携带IN-1基因的SeV对抗q-pool活性的作用，该活性影响NIH-3T3细胞的形态。图中显示了每一种情况下开始培养的3天后(SeV感染的2天后)，NIH-3T3细胞的显微照片。(A)使用未经q-pool处理的平板；(B)使用经q-pool处理的平板；(C)使用经q-pool处理的平板，且细胞用MOI＝1的SeV18+GFP感染；(D)与(C)同一视野的GFP荧光照片，在(C)上重叠(指示SeV-感染细胞的比例)；和(E)使用经q-pool处理的平板，且细胞用MOI＝1的SeV18+IN1感染。

图7显示携带IN-1基因的SeV对NIH-3T3细胞增殖的作用。用Alamarblue根据线粒体活性来测量每一种情况下开始培养的3天后(SeV感染的2天后)NIH-3T3细胞的细胞数量比。(A)使用未经q-pool处理的平板；(B)使用经q-pool(1μg/cm²)处理的平板；(C)使用经q-pool(10μg/cm²)处理的平板；和(D)使用经q-pool(30μg/cm²)处理的平板，且细胞用MOI＝1的SeV18+IN1感染。

图8是一组照片，显示携IN-1基因的SeV抗q-pool活性的作用，所述活性影响大鼠后根神经节的神经细胞的轴突(neurite)伸展。图中显示了每种情况下在SeV感染36小时后(开始培养的60小时后)大鼠后根神经节的神经细胞的显微照片。(A)使用未经q-pool处理的平板，且细胞用SeV18+GFP以1×10⁵CIU/500μl/孔进行感染；(C)使用经q-pool处理的平板，且细胞用SeV18+GFP以1×10⁵CIU/500μl/孔进行感染；(B)和(D)分别是(A)和(C)的同视野的GFP荧光照片；(E)和(F)使用经q-pool处理的平板，且细胞用SeV18+IN1以1×10⁵CIU/500μl/孔进行感染。

图9是一组照片，显示携GFP基因的SeV载体对小鼠耳廓内(intra-auricular)给药后，源自GFP的荧光的经时变化。将携GFP基因的传播型SeV载体(SeV18+GFP：5×10⁶GFP-CIU/5μl)，或缺陷F基因的SeV载体(SeV18+GFP/ΔF：5×10⁶GFP-CIU/5μl)，经耳廓内途径给药小鼠，从外部经时观察GFP蛋白的荧光。

图10显示耳廓内给药方法的定量评价(1)。用携带萤光素酶基因的SeV载体评价：(A)给药滴度依赖性。将携带萤光素酶基因的传播型SeV载体(SeV18+Luci)以不同的给药滴度对小鼠耳廓内给药(5×10⁴，5×10⁵，5×10⁶CIU/5μl)，2天后切除耳廓(auricle)，经组织匀浆后检测萤光素酶活性(n＝3)。结果观察到依赖于给药滴度的萤光素酶活性改变。(B)经时变化。将SeV18+Luci(5×10⁶CIU/5μl)对小鼠耳廓内给药，在不同时间切除各只耳廓，组织匀浆后检测萤光素酶活性(n＝3)。

图11的照片和图表显示耳廓内给药方法的定量评价(2)。用携带GFP基因的SeV载体进行评价：将SeV18+GFP(5×10⁶GFP-CIU/5μl)对小鼠耳廓内给药，从外部经时观察GFP蛋白的荧光(n＝4)。(A)GFP荧光照片。(B)对GFP荧光强度的定量。用图像处理软件Adobe Photoshop提取绿色荧光，然后用图像分析软件NIH image定量荧光强度。

图12的照片和图表显示根据反复给药评价法评价的耳廓内给药的有效性。将SeV18+GFP/ΔF(5×10⁶GFP-CIU/5μl)对小鼠右耳廓给药(首次给药)，然后分别在1，2，4，6，8，28，和62天后将SeV18+GFP/ΔF(5×10⁶GFP-CIU/5μl)对小鼠左耳廓给药(二次给药)。在上述每一次给药后，经时检查GFP荧光强度的变化。(A)GFP荧光照片。(B)对GFP荧光强度的定量。

图13的照片显示耳廓内给药方法(1)感染的细胞的鉴定。将SeV18+GFP/ΔF(5×10⁶GFP-CIU/5μl)对小鼠耳廓内给药，感染2天后切除耳廓，制备冰冻切片，在荧光显微镜下观察GFP荧光(A)。同样的连续切片用抗-GFP抗体染色(C)。(B)显示将这些图像重叠的结果。

图14的照片显示耳廓内给药方法(2)感染的细胞的鉴定。将SeV18+GFP/ΔF(5×10⁶GFP-CIU/5μl)对小鼠耳廓内给药，感染2天后切除耳廓，制备冰冻切片，在荧光显微镜下观察GFP荧光(与图13的小鼠不同的小鼠)。

图15显示合成抗-CD28抗体基因片段(SYN205-13)所用的oligo DNA的设置。

图16显示携带抗-CD28抗体基因的SeV载体cDNA的构建。

图17的照片显示携带抗-CD28抗体基因的SeV载体(SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP)的病毒基因组经RT-PCR确认。

图18的照片显示携带αCD28基因的SeV载体(SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP)的抗体表达。

图19是一组照片，显示将携带抗-CD28抗体(αCD28cst)和GFP基因的SeV载体(SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP)对小鼠耳廓内给药后，源自GFP的荧光的经时变化。将5×10⁶GFP-CIU/5μl对小鼠耳廓内给药，从外部经时观察GFP蛋白的荧光，将其与SeV18+GFP/ΔF给药组的荧光进行比较。

图20是一组照片，显示将SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP对小鼠耳廓内给药并在感染初期联合给予CTLA4-Ig蛋白后，源自GFP的荧光的经时变化。将5×10⁶GFP-CIU/5μl对小鼠耳廓内给药，在给药的1小时和10小时后，腹腔内给药CTLA4-Ig蛋白(0.5mg/机体)。从外部经时观察GFP蛋白的荧光，将其与SeV18+GFP/ΔF给药组的荧光进行比较。

图21显示GFP-荧光强度的定量。在图19和20的荧光照片的基础上，用图像处理软件Adobe Photoshop提取绿色荧光，然后用图像分析软件NIHimage定量荧光强度。

图22是一组照片，显示由于GFP基因携带位置的差异导致由GFP产生的荧光强度的差异(体外确认)。用MOI＝3的SeV18+GFP/ΔF或SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP转染LLC-MK2细胞，经时观察GFP荧光。

实施本发明的最佳模式

下面参照实施例更详细说明本发明，但不应理解位本发明仅限于这些实施例。本文中引用的所有参考文献都是本说明书的一部分。

[实施例1]构建携带Fab基因的SeV载体

通过SeV载体在脊髓损伤部位的应用举例说明以抑制轴索伸长抑制物(如NOGO)为目的的治疗载体。由于已知IN-1(小鼠IgMκ型)是抗NOGO的中和抗体(Brosamle，C.et al.，J.Neurosci.20(21)，8061-8068(2000)等)，因此构建携带IN-1基因的传播型SeV载体。还构建了F-基因缺陷的SeV载体(传播能力缺陷型)。

1) 基因的全合成

为了构建携带IN-1的Fab(H和L链)基因的SeV载体，进行IN-1的Fab基因的全合成。根据IN-1的单链Fab片段的碱基序列(登录号Y08011；Bandtlow，C.et al.，Eur.J.Biochem.241(2)468-475(1996))设计序列，使得His-标签被除去，两个末端都包含NotI识别位点，并且H链(SEQ ID NO：10)和L链(SEQ ID NO：11)串联，它们之间夹着SeV EIS序列(图1；SEQ ID NO：9)。合成所用的oligo DNA的序列和名称见图2，它们的设置见图3。将NotI片段的全长设为6n(6的倍数)。

2) 构建携带IN-1(Fab)的SeV cDNA基因

将上述合成的NotI片段***pBluescript II KS(Stratagene，LaJolla，CA)。确认基因序列后，用NotI从该质粒中切出包含EIS的NotI片段，将其***编码传播型仙台病毒基因组的质粒(pSeV18+)(Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997；Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16：578-587；and Yu，D.et al.，1997，Genes Cells 2：457-466)和编码F基因-缺陷型仙台病毒基因组的质粒(pSeV18+/ΔF)(Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))的+18位点(NotI位点)，分别得到pSeV18+IN-1和SeV18+IN-1/ΔF。

3) 重建SeV(传播型：SeV18+IN-1)

按照Kato et al.(Kato，A.et al.，Genes Cells 1，569-579(1996))的报道进行病毒重建。将LLC-MK2细胞接种在直径100mm的平皿中，5×10⁶细胞/皿，培养24小时后，细胞用已被补骨脂素和长波长紫外光(365nm)处理了20分钟的表达T7聚合酶的重组痘苗病毒(PLWUV-VacT7：Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986))以MOI＝2在37℃感染1小时。细胞用不含血清的MEM清洗后，将pSeV18+IN-1，pGEM/NP，pGEM/P，和pGEM/L(Kato，A.et al.，Genes Cells 1，569-579(1996))分别以12μg，4μg，2μg，和4μg/皿的量悬浮在Opti-MEM(200μl)(Gibco-BRL，Rockville，MD)中。将其与相当于1μg DNA/5μl的SuperFect转染试剂(Qiagen，Bothell，WA)混合，室温静置15分钟，最后加入含3％FBS的Opti-MEM(3ml)，添加细胞进行培养。培养5小时后，细胞用不含血清的MEM清洗两次，并在含有40μg/ml胞嘧啶-β-D-***呋喃糖苷(AraC：Sigma，St.Louis，MO)和7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco-BRL，Rockville，MD)的MEM中培养3天(P0)。

回收细胞，并将沉淀悬浮在PBS(1ml/皿)中。冻融3次后，将上述裂解物以100μl/卵的水平接种10日龄受精卵，在35.5℃将这些卵持续翻转3天(P1)。这些卵在4℃静置4-6小时后，回收尿囊液，测定红细胞凝集活性(HA活性)，从而确定是否回收到病毒。

HA活性按照Kato et al.(Kato，A.et al.，Genes Cell 1，569-579(1996))的方法进行测量。即，病毒溶液用PBS在圆底96孔板上进行逐步稀释，制作50μl/孔的2倍稀释系列。用PBS将50μl保存血(Cosmo Bio，Tokyo，Japan)稀释到1％，将其与上述50μl病毒溶液混合，4℃静置30分钟，观察红细胞凝集，将凝集样品中最高的病毒稀释度判定为HA活性。将1HAU换算为1×10⁶病毒，以此计算病毒数。

将回收的P1尿囊液用PBS稀释10^-5-倍和10^-6-倍(当观察到HAU时)，或降低该稀释率(当没有观察到HAU时)。然后用它们以100μl/卵的水平接种10日龄受精卵，35.5℃孵育3天并翻转这些卵(P2)。回收尿囊液后，测定HA活性，以便确定是否回收到病毒。将回收的P2尿囊液稀释10^-5-倍和10^-6-倍，然后进行同样的操作(P3)。回收P3的尿囊液，测定HA活性。结果观察到HA活性升高，因此判断病毒重建是成功的。回收的尿囊液的HA活性值(HAU)见下表。P4样品滴度经计算为2⁹HAU(约5×10⁸CIU/ml)。

表1

样品SeV18+IN-1

P12²

P22¹⁰

P32⁸

P42⁹

(HAU)

4) 重建SeV(F基因-缺陷型：SeV18+IN-1/ΔF)

按照Li et al.(Li，H.-O.et al.，J.Virology 74.6564-6569(2000)，WO00/70070)的报道进行病毒重建。利用F蛋白辅助细胞重建F基因-缺陷型病毒。所述辅助细胞利用Cre/loxP表达诱导体系来制备。该体系使用pCALNdLw质粒，它被设计用于利用Cre DNA重组酶诱导基因产物表达(Arai，T.et al.，J.Virol.72：1115-1121(1988))。为了使***的基因表达，经上述质粒转化的细胞使用Saito et al.的方法(Saito，I.et al.，Nucl.Acid.Res.23，3816-3821(1995)，Arai，T.et al.，J.Virol.72，111135-1121(1998))，用表达Cre DNA重组酶的重组腺病毒(AxCANCre)感染。在SeV-F蛋白的情况下，将含有F基因的转化细胞称为LLC-MK2/F7，而经AxCANCre诱导后能够持续表达F蛋白的细胞称为LLC-MK2/F7/A。

F基因-缺陷型SeV(SeV18+IN-1/ΔF)如下重建：将LLC-MK2细胞接种在直径100mm的平皿中，5×10⁶细胞/皿，培养24小时后，细胞用PLWUV-VacT7室温感染1小时(MOI＝2)。细胞用不含血清的MEM清洗后，将pSeV18+IN-1/ΔF，pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L，和pGEM/F-HN分别以12μg，4μg，2μg，4μg，和4μg/皿的重量比悬浮在Opti-MEM中。将其与相当于1μg DNA/5μl的SuperFect转染试剂混合，室温静置15分钟，最后加入含3％FBS的Opti-MEM(3ml)，添加细胞进行培养。培养5小时后，细胞用不含血清的MEM洗两次，并在含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中培养。培养24小时后，在所述细胞上覆盖8.5×10⁶细胞/皿的LLC-MK2/F7/A细胞，在含有40μg/ml Arac和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中37℃再培养2天。回收细胞，将沉淀悬浮于Opti-MEM中(2ml/皿)，冻融三次，制得P0裂解物。另一方面，将LLC-MK2/F7/A细胞接种在24孔板中，当几乎融汇时，将这些细胞转移到32℃培养箱中培养1天。用SeV18+IN-1/ΔF的P0裂解物转染这些细胞(200μl/孔)，用不含血清但含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM在32℃培养。在P2阶段之后，用P1培养上清重复同样的培养直到P3阶段，并将LLC-MK2/F7/A细胞接种在6孔板中。

用HA活性确认病毒增殖后，在P1阶段之后的样品中观察到HA活性的升高。P3阶段第4天的样品滴度(P3d4)为2.7×10⁷CIU/ml。

5) 通过RT-PCR确认病毒基因组

利用QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN，Bothell，WA)从传播型病毒(SeV18+IN-1)液(P2样品)回收病毒RNA。利用配有Platinum TaqKit的Super Script One-Step RT-PCR(Gibco-BRL，Rockville，MD)进行一步RT-PCR。使用组合引物SYN80F12/SYN80R1进行RT-PCR。确认目的大小的基因被扩增，这表示该病毒基因携带IN-1基因(图4A)。

用F-基因缺陷型(SeV18+IN-1/ΔF)实施同样的方法。采用P3d4样品和引物组合SYN80F12/SYN80R1。在这种情况下，也确认目的大小的基因的扩增，其表明该病毒基因携带IN-1基因(图4B)。

6) 确认SeV所携带的基因的蛋白表达

由于IN-1是小鼠IgMκ型，其蛋白表达用Western印迹第二抗体：HRP-偶联的抗-小鼠IgG+IgM(山羊F(ab’)2抗-小鼠IgG+IgM(AM14074)：BioSource International)(无第一抗体)通过Western印迹来确认。

在6孔板上培养直至融汇的LLC-MK2细胞用MOI＝5的SeV18+IN-1或SeV18-IN-1/ΔF感染。感染2天或4天后回收培养上清，浓缩样品，用PAGE prep Protein Clean-Up and Enrichment Kit(Pierce)除去杂质。用携带GFP基因的传播型SeV载体在同样条件下感染，如上述回收培养上清，作为阴性对照(NC)。300μl培养上清经处理，回收40μl SDS-样品，加载样品10μl/泳道。结果见图5。在氧化条件下检测到约47kDa的带，在还原条件下检测到约30kDa的带。根据氨基酸序列来推测，H链的分子量是24.0kDa，L链的是23.4kDa。据此判断上述结果，在氧化条件下，H链与L链呈结合状态，在还原条件下，H链或L链呈解离状态，由此确认形成Fab。

[实施例2]携带IN-1基因的SeV的体外功能评价

已知IN-1是抗轴索伸长抑制物NOGO的中和抗体(Chen，M.S.et al.，Nature 403，434-439(2000))。因此，为了对携带IN-1的Fab基因的SeV进行功能评价，必需观察在抑制轴索伸长的条件下，即，在有轴索伸长抑制物的条件下，对轴索伸长的促进活性。含有抑制物的脊髓抽出液被称为q-pool，其按照Spillmann et al.的方法(Spillmann，A.A.et al.，J.Biol.Chem.273，19283-19293(1998))制备。从三只成年大鼠抽取脊髓，获得1.5mgq-pool。IN-1活性按照Chen的方法以及Spillmann et al.的方法(Chen，M.S.etal.，Nature 403，434-439(2000)；Spillmann，A.A.et al.，J.Biol.Chem.273，19283-19293(1998))进行评价。采用2种方法，评价小鼠成纤维细胞系(NIH-3T3)的扩散以及大鼠胚胎后根神经节(Dorsal root ganglion，DRG)原代培养物中的轴突伸长。

利用NIH-3T3进行评价时，首先将q-pool用PBS稀释并分配到96孔培养板中，约30μg/cm²，37℃保温2小时。板用PBS洗两次，然后用于细胞培养。在已用q-pool处理(或未处理)的96-孔板中接种NIH-3T3细胞，1×10³细胞/孔，用含10％FBS的D-MEM开始培养。1天后，用各种滴度的SeV感染这些细胞。感染2天后，观察形态并进行细胞计数。用Alamar Blue(BIOSOURCE InternationalInc.：California，USA)进行细胞计数。未经q-pool处理的平板中培养的细胞具有所谓成纤维细胞样的形态，而在经过q-pool处理的平板中培养的细胞可见到很多球形细胞(图6(B))。当用携带GFP基因的对照SeV载体(SeV18+GFP)感染经过q-pool处理的细胞时，同样观察到很多球形细胞(图6(C))。当用携带IN-1基因的SeV载体(SeV18+IN1)感染经q-pool处理的细胞时，培养体系中很少见到球形细胞，很多细胞是成纤维细胞样形态(图6(E))。这意味着，正如此前的报道所述，IN-1抑制NIH-3T3细胞形态改变的功能是由q-pool引起的，这表明SeV载体中所携带的IN-1基因具有此功能。另外，从细胞数(细胞增殖)的角度评价同样的体系。在未经q-pool处理或经过低浓度q-pool处理的平板中，仅仅在用高MOI(MOI＝3，10，和30)的SeV18+IN1感染的NIH-3T3细胞中观察到对细胞增殖的抑制效应(图7(A)-(C))。由于未在细胞中观察到明显的形态损伤，因此判定所观察到的是增殖抑制而非细胞损伤。虽然迄今为止没有这方面的报道，但有理由相信，当IN-1浓度极高时有可能出现这种活性。此外，这种增殖抑制效应未在高浓度q-pool处理的情况下观察到(图7(D))。也就是说，在这些情况下，q-pool抑制IN-1的活性，这进一步表明IN-1可以弥补对q-pool活性的抑制。

在评价IN-1活性的另一方法中，通过测定对大鼠DRG原代培养体系中轴突伸展的影响来进行评价。在这种情况下，也是首先将q-pool用PBS并分配在经过I型胶原蛋白包被的24-孔培养板(Asahi Technoglass，Chiba)中，约25μg/cm²，37℃保温2小时。板用PBS洗两次，然后用于细胞培养。从14日龄SD大鼠胚胎(Charles River Japan，Kanagawa)取出后根神经节，植入包含终浓度为100ng/ml的神经生长因子(NGF，Serotec Ltd，U.K.)和10％FBS的D-MEM中。开始培养24小时后，用SeV18+GFP或SeV18+IN1感染细胞，1×10⁵CIU/500μl/孔。感染36小时后，在显微镜下观察细胞形态。在未经q-pool处理的平板中，轴突伸展可见于被对照SeV即SeV18+GFP感染的细胞(图8(A))；在经过q-pool-处理的平板中，仅观察到非常有限的轴突伸展(图8(C))。图8(B)和图8(D)显示分别与图8(A)和图8(C)相同的视野的GFP荧光照片，可以观察到SeV18+GFP感染的程度。另一方面，在经过q-pool-处理的平板中，被SeV18+IN1感染的细胞可以观察到非常显著的轴突伸展(图8(E)和(F))。也就是说，从轴突伸展的角度确认了，IN-1可以抑制q-pool的轴突伸展抑制活性，并判断SeV载体中所携带的IN-1基因具有此功能。

[实施例3]评价载体表达持续性以及反复给药后的表达的体内评价体系

为了评价载体表达的持续性和反复给药的可能性，确立更有效且更可靠的体内评价体系很重要。本实施例公开了利用新开发的小鼠耳廓内给药的评价体系。结果表明，将携带GFP基因的传播型SeV载体(SeV18+GFP：5×10⁶GFP-CIU/5μl)或F基因-缺陷型SeV载体(SeV18+GFP/ΔF：5×10⁶GFP-CIU/5μl)对小鼠耳廓内给药，有可能非侵袭性地从外部观察受感染细胞中表达的GFP蛋白的荧光(图9)。这种评价体系为非侵袭性的，其能利用同一个体经时观察SeV载体-来源的蛋白(GFP)的表达，因此该体系非常适合评价基因表达的持续性。不仅如此，由于可以在同一个体中追踪经时变化，致使实验所用的动物个体数大大减少。作为实际上的经时变化，可以在给药的4天内观察GFP蛋白荧光，其在给药第2天达到峰值，在给药第5-6天基本消失(图9)。

为了判定GFP荧光的这些改变是否定量反映SeV的基因表达动力学，用携带萤光素酶基因的传播型SeV载体(SeV18+Luci：Yonemitsu，Y.et al.，Nat.Biotech.18，970-973(2000))进行同样的耳廓内给药。首先观察到，萤光素酶蛋白活性的改变取决于给药滴度(图10(A))。其次，定量了耳廓内萤光素酶蛋白表达的经时变化，从而确认，其表达水平在给药第2日为峰值，第4日略有下降，在给药第7和第11日几乎达到基线表达水平(图10(B))。在此情况下，同时进行给药携带GFP基因的相同类型SeV(SeV18+GFP)的实验，以便检测GFP荧光的经时变化。用图像处理软件Adobe Photoshop(Adobe Systems Incorporated，CA，USA)从GFP荧光照片中提取绿色荧光(图11(A))，然后用图像分析软件NIH image(National Institute of Health，USA)定量荧光强度(图11(B))。结果发现，萤光素酶活性的经时变化(图10(B))与荧光强度的经时变化(图11(B))高度相关。可见，GFP荧光的变化与萤光素酶活性的变化非常一致。因此判断，追踪GFP荧光强度的变化使得能够进行相对定量。

还进行了评价反复给药后表达的实验。对右耳耳廓给药SeV18+GFP/ΔF(5×10⁶GFP-CIU/5μl)并确认其表达后，将同样的SeV18+GFP/ΔF(5×10⁶GFP-CIU/5μl)在不同给药时间对左耳耳廓给药，检测是否表达(图12(A))。还是在该实验中，定量GFP荧光强度并显示之(图12(B))。右耳耳廓感染1日后和2日后，确认左耳耳廓感染和表达。但是，右耳耳廓感染4日后，左耳耳廓的感染程度大大减少，右耳耳廓感染6日后，左耳耳廓的感染几乎消失。右耳耳廓感染8日后，几乎不再有左耳耳廓感染，但感染62日后确认有轻度感染。这种现象被认为表明，该评价方法是检测SeV载体对免疫***影响的良好手段，同时也是评价反复给药后的表达的优良实验体系。

接下来，检查通过对小鼠耳廓内给药感染的细胞。将SeV18+GFP/ΔF(5×10⁶CIU/5μl)对小鼠耳廓内给药。感染2日后切除耳廓，制备冰冻切片，在荧光显微镜下观察GFP荧光，同时用抗-GFP抗体(Molecular Probes Inc.，Eugene OR，USA)染色。GFP荧光以及被抗-GFP抗体识别的阳性细胞都在真皮细胞中出现(图13)。检查其它个体的耳廓组织，观察到软骨膜周边(图14(A))，软骨膜附近的真皮(图14(B))，表皮附近的真皮(图14(C))等部位的感染；但没有真皮和弹性软骨感染。因此判断本给药方法所感染的细胞是耳廓真皮和软骨膜(含有成纤维细胞)。

[实施例4]构建携带抗-CD28抗体(αCD28)基因的SeV载体

T细胞活化通过抗原呈递细胞表面II类(或I类)MHC分子/抗原肽复合物与T细胞受体的反应(第一信号)以及通过CD80(CD86)与CD28(一种第二信号或协同刺激信号)等协同刺激信号的反应来诱导。如此活化的T细胞随后通过CD80(CD86)与CTLA-4等抑制性协同刺激分子的反应而变得镇静(mitigated)。对这些协同刺激信号的阻断已知可诱导外周免疫耐受。因此，为了在活体内长期表达治疗性SeV载体上携带的基因的产物，例示了携带有抑制协同刺激信号相关基因并诱导外周免疫耐受的抗体基因的载体。为了通过用抗CD28抗体抑制T细胞活化来诱导免疫耐受，构建了一种F基因-缺陷型SeV载体(传播能力缺陷型)，该载体携带抗CD28(αCD28)的单链抗体基因。

1) 基因的全合成

为了构建携带αCD28基因的SeV载体，进行该基因的全合成。根据Grosse-Hovest L.等报道的αCD28基因序列(DDBJ database数据库SYN507107)，进行αCD28(LV链和HV链的单链抗体)基因的全合成，使两个末端都包含XbaI位点。将该合成的XbaI片段(SEQ ID NO：43)(即SYN205-13；两端各有6个核苷酸包含XbaI位点；αCD28氨基酸序列见SEQID NO：44)引入pBluescript II SK+载体(pBluescript/αCD28)。该合成所用的oligo DNA的序列和名称如下，它们的设置见图15。此外，载体构建示意图见图16。另外还制备了一种DNA片段，其在小鼠抗体κL链信号肽(SEQ IDNO：46)与SeV的EIS序列之间包含XbaI位点，并且两端都有NheI/NotI位点。将该DNA片段的NheI位点与pGEM-4Z载体(Promega)的XbaI位点相连，构建出盒式质粒pGEM-4Zcst(SEQ ID NO：45，仅显示含EIS序列的NotI片段)。将包含pBluescript/αCD28的αCD28基因的XbaI片段引入pGEM-4Zcst载体的XbaI位点，构建出包含上述信号肽以及SeV的EIS序列的αCD28基因(αCD28cst基因)。如此获得的包含αCD28cst基因的NotI片段，其全长为6的倍数(6n)。

表2合成所用的oligo DNA的序列和名称

SYN205F01(SEQ ID NO：47)

TCTAGAGACATCGAGCTCACTCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGAGCCACCATCT

SYN205F02(SEQ ID NO：48)

AGGGCAGAGAGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGTGAGAGTGTTGAATATTATGTCACAAGTTTAATGCAG

SYN205F03(SEQ ID NO：49)

ATGTCACAAGTTTAATGCAGTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTTTGCTGC

SYN205F04(SEQ ID NO：50)

CCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGGAGGCGGCGGTTCTGGCGGTGGCGGAT

SYN205F05(SEQ ID NO：51)

CGGTTCTGGCGGTGGCGGATCAGGTGGCGGAGGCTCGCAGGTGAAACTGCAGCAGTCTGGACCTGGCCTG

SYN205F06(SEQ ID NO：52)

AGCAGTCTGGACCTGGCCTGGTGACGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACTTGTACTGTCTCTGGGTTTTC

SYN205F07(SEQ ID NO：53)

GACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAGCTGATGACACAGCCGTGTATTACT

SYN205F08(SEQ ID NO：54)

TGACACAGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGATAAGGGATACTCCTATTACTATTCTATGGACTACTGGGGC

SYN205R01(SEQ ID NO：55)

TCTAGACGAGGAGACAGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAGTAGTCCATAGAAT

SYN205R02(SEQ ID NO：56)

ACTTGGCTCTTGGAGTTGTCTTTGCTGATGCTCTTTCTGGACATGAGAGCCGAATTATAATTCGTGCCTC

SYN205R03(SEQ ID NO：57)

CGAATTATAATTCGTGCCTCCACCAGCCCATATTACTCCCAGCCACTCCAGTCCCTGTCCTGGAGACTGG

SYN205R04(SEQ ID NO：58)

GTCCCTGTCCTGGAGACTGGCGAACCCAGTGAACACCATAGTCGCTTAATGAAAACCCAGAGACAGTACA

SYN205R05(SEQ ID NO：59)

CCCCCTCCGAACGTGTAAGGAACCTTCCTACTTTGCTGACAGAAATACATTGCAACATCATCCTCGTCCA

SYN205R06(SEQ ID NO：60)

TGCAACATCATCCTCGTCCACAGGATGGATGTTGAGGCTGAAGTTTGTCCCAGACCCACTGCCACTAAAC

SYN205R07(SEQ ID NO：61)

CAGACCCACTGCCACTAAACCTGGCAGGGACCCCAGATTCTACGTTGGATGCAGCAAAGATGAGGAGTTT

2)构建携带αCD28基因的F基因-缺陷型SeV cDNA(pSeV18+αCD28cst/ΔF-GFP)

确认上述构建的NotI片段基因序列后，从该质粒中切出该NotI片段，将其***携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的F基因-缺陷型SeV cDNA(pSeV18+/ΔF-GFP)(Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))的+18位点(NotI位点)，得到pSeV18+αCD28cst/ΔF-GFP。

3) 重建携有αCD28基因的F基因-缺陷型SeV (SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP)

SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP如下重建：将LLC-MK2细胞接种在直径100mm的平皿中，5×10⁶细胞/皿，培养24小时后，细胞用PLWUV-VacT7室温感染1小时(MOI＝2)。细胞用不含血清的MEM清洗后，将pSeV18+αCD28cst/ΔF-GFP，pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L，和pGEM/F-HN分别以12μg，4μg，2μg，4μg，和4μg/皿的重量比悬浮在Opti-MEM中，然后与相当于1μgDNA/5μl的SuperFect转染试剂混合，室温静置15分钟，加入含3％FBS的Opti-MEM(3ml)，添加细胞进行培养。培养5小时后，细胞用不含血清的MEM洗两次，然后在含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中培养。培养24小时后，在所述细胞上覆盖8.5×10⁶细胞/皿的LLC-MK2/F7/A细胞，在含有40μg/ml Arac和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中37℃再培养2天。回收细胞，将沉淀悬浮于Opti-MEM中(2ml/皿)，冻融三次，制得P0裂解物。另一方面，将LLC-MK2/F7/A细胞接种在24孔板中，当几乎融汇时，将这些细胞转移到32℃培养箱中培养1天。用SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP的P0裂解物转染这些细胞(200μl/孔)，用不含血清但含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM在32℃培养。在P2阶段之后，用P1培养上清重复同样的培养直到P3阶段，并将LLC-MK2/F7/A细胞接种在6孔板中。

第5天的P3病毒滴度(P3d5)为7×10⁶CIU/ml。

4) 通过RT-PCR确认病毒基因组

利用QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN，Bothell，WA)从F基因-缺陷型SeV，SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP的病毒液(P3样品)回收病毒RNA。利用配有Platinum Taq Kit的Super Script One-Step RT-PCR(Gibco-BRL，Rockville，MD)进行一步法RT-PCR。使用组合引物F6(5’-acaagagaaaaaacatgtatgg-3’)/R199(5’-GATAACAGCACCTCCTCCCGACT-3’)(分别为SEQ ID NOS：62和63)作为引物对进行RT-PCR。确认目的大小的基因被扩增，这表示该病毒基因携带αCD28cst基因(图17)。

5) 确认SeV所携带的基因的蛋白表达

在6孔板上培养直至融汇的LLC-MK2细胞用MOI＝1的SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP感染，用1ml无血清MEM在37℃有5％CO₂的情况下进行培养。感染1天后更换MEM，4天后回收培养上清作为样品。用携带GFP基因的F基因-缺陷型SeV载体(SeV18+GFP/ΔF)在同样条件下感染并回收培养上清，作为阴性对照(NC)。用PAGE prep Protein Clean-Upand Enrichment Kit(Pierce)将300μl培养上清浓缩为40μl，作为SDS-PAGE电泳样品，加载5μl/泳道，进行Western印迹。另一方面，为了进行考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue，CBB)染色，用同样的方法将600μl培养上清浓缩为40μl，加载10μl/泳道进行试验。用抗-小鼠Ig，辣根过氧化物酶-偶联的全抗体(来自绵羊)(Amersham Bioscience)作为Western印迹检测所用的抗体。图18显示了结果。测出约29kDa的泳带，与从氨基酸序列预测的分子量一致。

[实施例5]评价携带抗-CD28抗体基因的SeV的体内表达持续性

作为对携带抗-CD28抗体(αCD28cst)基因的F基因-缺陷型SeV(SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP)进行功能评价的一个环节，评价其体内表达持续性。此时，持续性的差异用携带GFP基因但不携带抗-CD28抗体基因的F基因-缺陷型SeV(SeV18+GFP/ΔF)作为对照进行检测。并且，由于感染初期αCD28cst蛋白不表达(或非常少地表达)，为了弥补该阶段这种蛋白的表达，在SeV给药的同一天还给予CTLA4-Ig蛋白，并评价该体系，其中所述CTLA4-Ig蛋白预计具有与αCD28cst蛋白同样的功能。CTLA4-Ig蛋白可以商购(Ancell Corporation)，但这次所用的蛋白是用此前报道的方法制备的(Iwasaki，N.et al.，Transplantation 73(3)334-340(2002)；Harada，H.et al.，Urol.Res.28(1)69-74(2000)；Iwasaki，N.et al.，Transplantation 73(3)334-340(2002)；Glysing-Jensen，T.et al.，Transplantation 64(12)1641-1645(1997))。

表达持续性用实施例3所述的小鼠耳廓内给药的方法来评价。将包含GFP基因的SeV载体对小鼠耳廓内给药，可以非侵袭性地从外部观察到受感染的细胞中所表达的GFP蛋白的荧光。该体系允许用同一个体经时观察SeV载体-来源的蛋白(GFP)的表达，因此它非常适合评价基因表达的持续性。将携带GFP基因的F基因-缺陷型SeV载体(SeV18+GFP/ΔF：5×10⁶CIU/5μl)或携带抗-CD28抗体基因以及GFP基因的F基因-缺陷型SeV载体(SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP：5×10⁶ CIU/5μl)对小鼠耳廓内给药，经时观察GFP蛋白表达。而且，两个给药组中的一些小鼠在用SeV感染的1小时和10小时后腹腔注射CTLA4-Ig蛋白，0.5mg/机体(每组n＝2)。首先确认，携带用于抑制协同刺激因子的抗体基因(本例中为αCD28cst)的SeV载体即使在体内也具有感染性(图19)。与SeV18+GFP/ΔF相比，可以观察到GFP表达水平有差异，其解释如下。就持续性而言，SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP给药组与对照组相比，可以观察到GFP蛋白的持续性，但非常微弱。也就是说，在SeV18+GFP/ΔF给药组，直到给药5天后都能观察到明显的GFP表达，但给药6天后观察到表达突然消失，几乎没有GFP表达。而在SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP给药组，减少趋势是微弱的并且是缓慢的，并且即使在给药6天后也观察到GFP的荧光(图19)。SeV感染当天给药CTLA4-Ig蛋白的效果被清楚地显示出来。在给予CTLA4-Ig蛋白后，SeV18+GFP/ΔF给药组和SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP给药组都观察到GFP表达增加。而且在SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP给药组，甚至在感染6天后都观察到比较清楚的GFP荧光(图20)。用图像处理软件Adobe Photoshop(Adobe SystemsIncorporated，CA，USA)从GFP荧光照片中提取绿色荧光，并用图像分析软件NIH image(National Institute of Health，USA)定量荧光强度。图21显示了结果。在给予CTLA4-Ig蛋白的情况下，随着GFP表达的增加，SeV携带αCD28cst基因对来自该SeV所携基因的蛋白(此时为GFP)的效果尽管轻微，但仍得到确认。这些结果证实了抑制协同刺激活性对SeV感染及其持续性的效果，表明确实存在这一方面。此外，即使用单独的SeV载体感染对表达持续性仅有非常弱的影响，这些结果也表明，通过同时给予预计在SeV感染初期具有相同机制的蛋白，有可能延长表达持续性。

SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP给药组比SeV18+GFP/ΔF给药组的GFP蛋白荧光弱，这通过下述体外体系进行确认。用SeV18+GFP/ΔF或SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP以MOI＝5感染LLC-MK2细胞，在荧光显微镜下经时观察GFP表达(图22)。感染16小时后，在被SeV18+GFP/ΔF感染的细胞中观察到GFP，但在被SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP感染的细胞中未观察到。经过确认，在被SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP感染的细胞中在感染24小时后观察到GFP荧光的表达，但荧光一直很微弱，且表达水平也低于被SeV18+GFP/ΔF感染的细胞。已知SeV基因组中所携带的基因的表达量差异存在极性效应(Glazier，K.et al.，J.Virol.21(3)，863-871(1977)；Homann，H.E.et al.，Virology 177(1)，131-140(1990))。即，由于RNA聚合酶的重起(restart)效率并不高，故基因越接近所述基因组的3’-端，其表达水平越高，基因越接近5’-端，其表达水平越低。实际上，有人通过在不同位置携带同样的标志基因，证明了这种极性效果，同时还提出了关于控制表达水平的设计(Tokusumi，T.et al.，Virus Res 86，33-38(2002))。本例检测中所用的GFP基因携带在SeV18+GFP/ΔF中的3’-端，SeV18+αCD28csst/ΔF-GFP中缺陷F基因的位置，因此SeV18+GFP/ΔF的GFP蛋白量较高而SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP的蛋白量相对较低。但是，由于预计这两种载体也同样表达其它SeV蛋白(约为相同的量)，因而想到引起免疫原性的蛋白的表达水平大致相同，并且仅有测试蛋白(GFP)在被SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP感染的细胞中减少。根据上述结果，用耳廓内给药体系在SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP给药组中确认的基因表达的略微延长表明，实际的延长效果比从GFP观察结果预测的更强。

产业实用性

本发明提供了表达含有抗体可变区的多肽的副粘病毒载体。本发明的载体适于作为基因治疗载体对活体进行体内给药或回体给药。具体地，表达抗神经伸长抑制物的抗体片段的载体可用于神经损伤的基因治疗。此外，本发明表达抑制免疫活化信号传递的抗体的载体允许基因从该载体长期表达并进行反复给药。

序列表

<110>株式会社载体研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)

<120>编码抗体的副粘病毒载体及其应用

<130>D3-A0203P

<150>JP 2002-161964

<151>2002-06-03

<160>63

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>10

<212>DNA

<213>仙台病毒

<400>1

ctttcaccct 10

<210>2

<211>15

<212>DNA

<213>仙台病毒

<400>2

tttttcttac tacgg 15

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>间隔臂序列

<400>3

cggccgcaga tcttcacg 18

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>间隔臂序列

<400>4

atgcatgccg gcagatga 18

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于扩增仙台病毒基因组片段的引物

<400>5

gttgagtact gcaagagc 18

<210>6

<211>42

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于扩增仙台病毒基因组片段的引物

<400>6

tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc 42

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于扩增仙台病毒基因组片段的引物

<400>7

atgcatgccg gcagatga 18

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于扩增仙台病毒基因组片段的引物

<400>8

tgggtgaatg agagaatcag c 21

<210>9

<211>1550

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>编码抗体IN-1的V区的基因片段

<220>

<221>CDS

<222>(18)..(749)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(801)..(1505)

<223>

<400>9

gcggccgccg tacggcc atg aaa aag aca gct atc gcg att gca gtg gca 50

Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala

1 5 10

ctg gct ggt ttc gct acc gta gcg cag gcc gaa gtt aaa ctg cat gag 98

Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Glu Val Lys Leu His Glu

15 20 25

tca ggg cct ggg ctg gta agg cct ggg act tca gtg aag ata tcc tgc 146

Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys

30 35 40

aag gct tct ggc tac acc ttc act aac tac tgg cta ggt tgg gta aag 194

Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys

45 50 55

cag agg cct gga cat gga ctt gag tgg att gga gat att tac cct gga 242

Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly

60 65 70 75

ggt ggt tat act aac tac aat gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg 290

Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu

80 85 90

act gca gac aca tcc tcc agc act gcc tac atg cag ctc agt agc ctg 338

Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu

95 100 105

aca tct gag gac tct gct gtc tat ttc tgt gca aga ttt tac tac ggt 386

Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Phe Tyr Tyr Gly

110 115 120

agt agc tac tgg tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggc acc acg gtc acc 434

Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

125 130 135

gtc tcc tca gca aag acc act cct ccg tct gtt tac cct ctg gct cct 482

Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro

140 145 150 155

ggt tct gcg gct cag act aac tct atg gtg act ctg gga tgc ctg gtc 530

Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val

160 165 170

aag ggc tat ttc cct gag cca gtg aca gtg acc tgg aac tct gga tcc 578

Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser

175 180 185

ctg tcc agc ggt gtg cac acc ttc cca gct gtc ctg caa tct gac ctc 626

Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu

190 195 200

tac act ctg agc agc tca gtg act gtc ccc tcc agc acc tgg ccc agc 674

Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser

205 210 215

gag acc gtc acc tgc aac gtt gcc cac ccg gct tct agc acc aaa gtt 722

Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val

220 225 230 235

gac aag aaa atc gta ccg cgc gac tgc taaccgtagt aagaaaaact 769

Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys

240

tagggtgaaa gttcatcgcg gccgtacggc c atg aaa caa agc act att gca 821

Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala

245 250

ctg gca ctc tta ccg tta ctg ttt acc cct gtg aca aaa gcc gac atc 869

Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Asp Ile

255 260 265

gag ctc acc cag tct cca gca atc atg gct gca tct gtg gga gaa act 917

Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ala Ala Ser Val Gly Glu Thr

270 275 280

gtc acc atc aca tgt gga gca agt gag aat att tac ggt gct tta aat 965

Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala Leu Asn

285 290 295

tgg tat cag cgg aaa cag gga aaa tct cct cag ctc ctg atc tat ggt 1013

Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly

300 305 310 315

gca acc aac ttg gca gat ggc atg tca tcg agg ttc agt ggc agt gga 1061

Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

320 325 330

tct ggt aga cag tat tct ctc aag atc agt agc ctg cat cct gac gat 1109

Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro Asp Asp

335 340 345

gtt gca acg tat tac tgt caa aat gtg tta agt act cct cgg acg ttc 1157

Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro Arg Thr Phe

350 355 360

gga gct ggg acc aag ctc gag ctg aag cgc gct gat gct gca ccg act 1205

Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr

365 370 375

gta tcc atc ttc cca cca tcc agt gag cag tta aca tct gga ggt gcc 1253

Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala

380 385 390 395

tca gtc gtg tgc ttc ttg aac aac ttc tac ccc aaa gac atc aat gtc 1301

Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val

400 405 410

aag tgg aag att gat ggc agt gaa cga caa aat ggc gtc ctg aac agt 1349

Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser

415 420 425

tgg act gat cag gac agc aaa gac agc acc tac agc atg agc agc acc 1397

Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr

430 435 440

ctc acg ttg acc aag gac gag tat gaa cga cat aac agc tat acc tgt 1445

Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys

445 450 455

gag gcc act cac aag aca tca act tca ccc att gtc aag agc ttc aac 1493

Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn

460 465 470 475

agg aat gag tgt tagtccgtag taagaaaaac ttagggtgaa agttcatgcg gccgc 1550

Arg Asn Glu Cys

<210>10

<211>244

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>免疫球蛋白IN-1重链

<400>10

Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala

1 5 10 15

Thr Val Ala Gln Ala Glu Val Lys Leu His Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Phe Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr

115 120 125

Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys

130 135 140

Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln

145 150 155 160

Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser

195 200 205

Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys

210 215 220

Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val

225 230 235 240

Pro Arg Asp Cys

<210>11

<211>235

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>免疫球蛋白IN-1轻链

<400>11

Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr

1 5 10 15

Pro Val Thr Lys Ala Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met

20 25 30

Ala Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu

35 40 45

Asn Ile Tyr Gly Ala Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser

50 55 60

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile

85 90 95

Ser Ser Leu His Pro Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val

100 105 110

Leu Ser Thr Pro Arg Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

115 120 125

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

130 135 140

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

165 170 175

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

180 185 190

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

195 200 205

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

210 215 220

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

<210>12

<211>68

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>12

cggaattcgc ggccgccgta cggccatgaa aaagacagct atcgcgattg cagtggcact 60

ggctggtt 68

<210>13

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>13

tgcagtggca ctggctggtt tcgctaccgt agcgcaggcc gaagttaaac tgcatgagtc 60

agggcctggg 70

<210>14

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>14

tgcatgagtc agggcctggg ctggtaaggc ctgggacttc agtgaagata tcctgcaagg 60

cttctggcta 70

<210>15

<211>60

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>15

actgcagaca catcctccag cactgcctac atgcagctca gtagcctgac atctgaggac 60

<210>16

<211>60

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>16

gtagcctgac atctgaggac tctgctgtct atttctgtgc aagattttac tacggtagta 60

<210>17

<211>60

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>17

aagattttac tacggtagta gctactggta cttcgatgtc tggggccaag gcaccacggt 60

<210>18

<211>60

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>18

cgggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcaatct gacctctaca 60

<210>19

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>19

cctgcaatct gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc 60

cagcgagacc 70

<210>20

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>20

gcacctggcc cagcgagacc gtcacctgca acgttgccca cccggcttct agcaccaaag 60

ttgacaagaa 70

<210>21

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>21

gccgacatcg agctcaccca gtctccagca atcatggctg catctgtggg agaaactgtc 60

accatcacat 70

<210>22

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>22

agaaactgtc accatcacat gtggagcaag tgagaatatt tacggtgctt taaattggta 60

tcagcggaaa 70

<210>23

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>23

taaattggta tcagcggaaa cagggaaaat ctcctcagct cctgatctat ggtgcaacca 60

acttggcaga 70

<210>24

<211>72

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>24

accgctcgag ctgaagcgcg ctgatgctgc accgactgta tccatcttcc caccatccag 60

tgagcagttaac 72

<210>25

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>25

ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 60

taccccaaag 70

<210>26

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>26

gaacaacttc taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca 60

aaatggcgtc 70

<210>27

<211>79

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>27

caagagcttc aacaggaatg agtgttagtc cgtagtaaga aaaacttagg gtgaaagttc 60

atgcggccgc aagcttggg 79

<210>28

<211>80

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>28

tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag acatcaactt cacccattgt 60

caagagcttc aacaggaatg 80

<210>29

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>29

gacagcacct acagcatgag cagcaccctc acgttgacca aggacgagta tgaacgacat 60

aacagctata 70

<210>30

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>30

gtgaacgaca aaatggcgtc ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct 60

acagcatgag 70

<210>31

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>31

ttactgtcaa aatgtgttaa gtactcctcg gacgttcgga gctgggacca agctcgagcg 60

gaagcttggg 70

<210>32

<211>80

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>32

atctggtaga cagtattctc tcaagatcag tagcctgcat cctgacgatg ttgcaacgta 60

ttactgtcaa aatgtgttaa 80

<210>33

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>33

ggtgcaacca acttggcaga tggcatgtca tcgaggttca gtggcagtgg atctggtaga 60

cagtattctc 70

<210>34

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>34

gcactattgc actggcactc ttaccgttac tgtttacccc tgtgacaaaa gccgacatcg 60

agctcaccca 70

<210>35

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>35

agaaaaactt agggtgaaag ttcatcgcgg ccgtacggcc atgaaacaaa gcactattgc 60

actggcactc 70

<210>36

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>36

agcaccaaag ttgacaagaa aatcgtaccg cgcgactgct aaccgtagta agaaaaactt 60

agggtgaaag 70

<210>37

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>37

tgactctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg acctggaact 60

ctggatcccg 70

<210>38

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>38

gtctgtttac cctctggctc ctggttctgc ggctcagact aactctatgg tgactctggg 60

atgcctggtc 70

<210>39

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>39

tggggccaag gcaccacggt caccgtctcc tcagcaaaga ccactcctcc gtctgtttac 60

cctctggctc 70

<210>40

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>40

gaggtggtta tactaactac aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca 60

catcctccag 70

<210>41

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>41

aaagcagagg cctggacatg gacttgagtg gattggagat atttaccctg gaggtggtta 60

tactaactac 70

<210>42

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建Fab基因片段的合成寡核苷酸

<400>42

tcctgcaagg cttctggcta caccttcact aactactggc taggttgggt aaagcagagg 60

cctggacatg 70

<210>43

<211>753

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>抗-CD28ScFv抗体基因(SYN205-13)

<400>43

tctagagaca tcgagctcac tcagtctcca gcttctttgg ctgtgtctct agggcagaga 60

gccaccatct cctgcagagc cagtgagagt gttgaatatt atgtcacaag tttaatgcag 120

tggtaccagc agaagccagg acagccaccc aaactcctca tctttgctgc atccaacgta 180

gaatctgggg tccctgccag gtttagtggc agtgggtctg ggacaaactt cagcctcaac 240

atccatcctg tggacgagga tgatgttgca atgtatttct gtcagcaaag taggaaggtt 300

ccttacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac ggggaggcgg cggttctggc 360

ggtggcggat caggtggcgg aggctcgcag gtgaaactgc agcagtctgg acctggcctg 420

gtgacgccct cacagagcct gtccatcact tgtactgtct ctgggttttc attaagcgac 480

tatggtgttc actgggttcg ccagtctcca ggacagggac tggagtggct gggagtaata 540

tgggctggtg gaggcacgaa ttataattcg gctctcatgt ccagaaagag catcagcaaa 600

gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa atgaacagtc tgcaagctga tgacacagcc 660

gtgtattact gtgccagaga taagggatac tcctattact attctatgga ctactggggc 720

caagggacca cggtcactgt ctcctcgtct aga 753

<210>44

<211>247

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>由SYN205-13编码的抗-CD28 ScFv片段

<400>44

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr

20 25 30

Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Asp Glu Asp Asp Val Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

115 120 125

Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Pro Ser Gln Ser

130 135 140

Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr Gly

145 150 155 160

Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu Gly

165 170 175

Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser

180 185 190

Arg Lys Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys

195 200 205

Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

210 215 220

Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

245

<210>45

<211>131

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>pGEM-4Zcst中包含EIS序列的NotI片段

<400>45

gcggccgcca aagttcaatg gattttcagg tgcagatttt cagcttcctg ctaatcagtg 60

cctcagtcat aatgtccaga ggatctagac cgtagtaaga aaaacttagg gtgaaagttc 120

atcgcggccg c 131

<210>46

<211>22

<212>PRT

<213>鼠(Mus musculus)

<400>46

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Ile Met Ser Arg Gly

20

<210>47

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸

<400>47

tctagagaca tcgagctcac tcagtctcca gcttctttgg ctgtgtctct agggcagaga 60

gccaccatct 70

<210>48

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸

<400>48

agggcagaga gccaccatct cctgcagagc cagtgagagt gttgaatatt atgtcacaag 60

tttaatgcag 70

<210>49

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸

<400>49

atgtcacaag tttaatgcag tggtaccagc agaagccagg acagccaccc aaactcctca 60

tctttgctgc 70

<210>50

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸

<400>50

ccttacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac ggggaggcgg cggttctggc 60

ggtggcggat 70

<210>51

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸

<400>51

cggttctggc ggtggcggat caggtggcgg aggctcgcag gtgaaactgc agcagtctgg 60

acctggcctg 70

<210>52

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸

<400>52

agcagtctgg acctggcctg gtgacgccct cacagagcct gtccatcact tgtactgtct 60

ctgggttttc 70

<210>53

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸

<400>53

gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa atgaacagtc tgcaagctga tgacacagcc 60

gtgtattact 70

<210>54

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸

<400>54

tgacacagcc gtgtattact gtgccagaga taagggatac tcctattact attctatgga 60

ctactggggc 70

<210>55

<211>53

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸

<400>55

tctagacgag gagacagtga ccgtggtccc ttggccccag tagtccatag aat 53

<210>56

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸

<400>56

acttggctct tggagttgtc tttgctgatg ctctttctgg acatgagagc cgaattataa 60

ttcgtgcctc 70

<210>57

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸

<400>57

cgaattataa ttcgtgcctc caccagccca tattactccc agccactcca gtccctgtcc 60

tggagactgg 70

<210>58

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸

<400>58

gtccctgtcc tggagactgg cgaacccagt gaacaccata gtcgcttaat gaaaacccag 60

agacagtaca 70

<210>59

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸

<400>59

ccccctccga acgtgtaagg aaccttccta ctttgctgac agaaatacat tgcaacatca 60

tcctcgtcca 70

<210>60

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸

<400>60

tgcaacatca tcctcgtcca caggatggat gttgaggctg aagtttgtcc cagacccact 60

gccactaaac 70

<210>61

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸

<400>61

cagacccact gccactaaac ctggcaggga ccccagattc tacgttggat gcagcaaaga 60

tgaggagttt 70

<210>62

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成引物F6

<400>62

acaagagaaa aaacatgtatgg 22

<210>63

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成引物R199

<400>63

gataacagca cctcctcccg act 23

Claims

1.一种副粘病毒载体，其编码包含抗体可变区的多肽。

2.权利要求1的副粘病毒载体，其中所述副粘病毒是仙台病毒。

3.权利要求1的副粘病毒载体，其中所述多肽是分泌型多肽。

4.权利要求1的副粘病毒载体，其中所述载体编码包含抗体H链可变区的多肽和包含抗体L链可变区的多肽。

5.权利要求4的副粘病毒载体，其中所述包含抗体H链可变区的多肽和包含抗体L链可变区的多肽彼此相连形成Fab。

6.权利要求5的副粘病毒载体，其中至少一种抗体可变区源自抗配体或受体的抗体。

7.权利要求6的副粘病毒载体，其中所述抗体与抑制神经细胞生存或分化或轴索伸长的蛋白质结合。

8.权利要求7的副粘病毒载体，其中所述抗体是抗NOGO抗体。

9.权利要求6的副粘病毒载体，其中所述抗体是抗与免疫信号传递相关的受体或其配体的抗体。

10.权利要求9的副粘病毒载体，其中所述抗体是抗表达在T细胞或抗原呈递细胞表面的受体或其配体的抗体。

11.权利要求10的副粘病毒载体，其中所述受体或其配体是T细胞或抗原呈递细胞的协同刺激信号的信号传递分子。

12.权利要求11的副粘病毒载体，其中所述信号传递分子是选自CD28，CD80，CD86，LFA-1，ICAM-1(CD54)，PD-1，或ICOS的分子。

13.权利要求9的副粘病毒载体，其中所述载体还编码另一种外来基因。

14.制备包含抗体可变区的重组多肽的方法，包括以下步骤：

(a)将权利要求1的病毒载体导入哺乳动物细胞；和

15.一种多肽，由权利要求14的方法制得。

16.促进神经形成的方法，包括将权利要求7的载体送达需要形成神经的部位。

17.治疗脊髓损伤的方法，包括将权利要求7的载体送达损伤部位。

18.抑制免疫反应的方法，包括给药权利要求9所述载体。

19.权利要求18的方法，还包括给药抗体或给药CTLA-4或其片段的步骤，所述抗体抗与免疫信号传递相关的受体或其配体。

20.增强载体的基因表达的方法，所述增强基因表达通过使该载体持续进行基因表达和/或通过重复给药该载体来实现，所述方法包括给药权利要求9所述载体。

21.权利要求20的方法，还包括给药抗体或给药CTLA-4或其片段的步骤，所述抗体抗与免疫信号传递相关的受体或其配体。

22.一种载体组合物，所述载体的表达持续性延长，所述组合物包含权利要求9的载体和可药用承运体。

23.一种基因导入试剂盒，包含(a)权利要求9的载体和(b)抗与免疫信号传递相关的受体或其配体的抗体，或CTLA-4或其片段。