CN1293196C - 具有副作用降低的特性的新型重组腺病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新型腺病毒载体，其通过抑制***腺病毒基因组中的外源启动子诱导腺病毒基因表达，能减轻体内施用该载体期间的炎症，还涉及一种生产该载体的方法，用于生产该重组腺病毒载体的一种细胞系，或应用该重组腺病毒载体的一种基因治疗方法。

Description

具有副作用降低的特性的新型重组腺病毒载体
技术领域
本发明涉及一种用于基因治疗的重组腺病毒载体，和生产该载体的方法。具体而言，本发明涉及一种新型重组腺病毒载体，其通过抑制***腺病毒基因组中的外源启动子诱导腺病毒基因表达，能减轻体内施用该载体后的炎症，还涉及一种生产该载体的方法，用于生产该重组腺病毒载体的一种细胞系，或应用该重组腺病毒载体的一种基因治疗方法。
背景技术
腺病毒载体是适用于动物细胞的极好的基因转移载体，因为它们具有较高的基因转移效率，使基因转移到未***细胞的能力，易于制备高效价的病毒原液，等等，其临床用途已尝试作为基因治疗的载体。当前广泛应用的腺病毒载体是复制缺陷型载体，其中腺病毒复制和所有腺病毒蛋白质表达必需的E1基因缺失，该载体被称为第一代腺病毒载体(有些还缺失E3基因)。
众所周知，由于第一代腺病毒载体缺乏E1基因，所以在不表达E1基因的正常细胞(如人类细胞)中没有任何腺病毒蛋白质表达。然而，最近的研究证明，当利用第一代腺病毒载体体内转移一种基因时，转基因的表达是暂时的，并且在基因转移部位发生炎症反应(Yang Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：4407-4411(1994)，Wilmott R.W.等人，Hum.Gene Ther.，7：301-318(1996))。
提出了下列假说，作为其原因的一种解释。在第一代腺病毒载体感染的细胞中，腺病毒早期基因(如E2A基因)由细胞产生的转录因子低水平表达，从而激活腺病毒主要晚期启动子(MLP)。之后，主要晚期蛋白质表达，针对它们的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)开始产生，CTL清除转移有外源基因的细胞。因此，这一理论是，通过腺病毒早期蛋白质的表达，腺病毒晚期蛋白质的表达是炎症反应和缺乏转基因持续表达的一个原因(Engelhardt J.F.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：6196-6200(1994)，Yang Y.等人，Nature Gnent.7：362-368(1994))。
根据这一假说，构建了多种改进的腺病毒载体，其中除E1基因之外，腺病毒复制必需的基因缺失，然后提供由来自产病毒细胞的基因编码的蛋白质，该病毒变得能够复制。例如，曾经报道E2A基因缺失的一种腺病毒载体(Zhou H.等人，J.Virol.，70：7030-7038(1996)，Gorziglia M.I.等人，J.Virol.，70：4173-4178(1996))，和E4基因(如E2A基因一样，它是一种早期基因)缺失的一种腺病毒载体(Krouglicak V.等人，Hum.Gene Ther.，6：1575-1586(1995)，Wang Q.等人，GeneTher.，2：775-783(1995)，Yeh P.等人，J.Virol.，70：559-565(1996))，等等。然而，对于E2A基因缺失的腺病毒载体，观察到延长转基因表达时间和减少炎症反应的极小影响(Morral N.等人，Hum.Gene Ther.，8：1275-1286(1997)，Lusky M.等人，J.Virol.，72：2022-2032(1998)，O’neal W.K.等人，Hum.Gene Ther.，9：1587-1598(1998))。此外，曾经报道在E4基因缺失的腺病毒中观察到适当的改进，但还不令人满意(Gao G-P.等人，J.Virol.，70：8934-8943(1996)，Wang Q.等人，GeneTher.，4：393-400(1997)，Dedieu J-F.等人，J.Virol.，71：4626-4637(1997))。
因此，提出一种依赖辅助病毒的腺病毒载体(HD载体)作为进一步改进的载体，其中除了末端反向重复序列(ITR)和包装信号外所有腺病毒基因都缺失，其复制依赖于辅助病毒(Kochanek S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：5731-5746(1996)，Parks R.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：13565-13570(1996))。这种HD载体也被称为gutted载体或gutless载体。据报道这种HD载体显示改良载体的作用，如转基因表达时间延长，炎症反应减少(Morsy M.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：7866-7871(1998)，Schiedner G.等人，Nature Gnet.18：180-183(1998)，Morral N.等人，Hum.Gene Ther.9：2709-2716(1998))。
然而，当这种HD载体在临床上用作药物时，存在载体产率低的重要问题。原因如下：第一，在HD载体的产生过程中，HD载体依赖于辅助腺病毒作为来源供应复制所需的所有蛋白质。根据使HD载体能够复制而始终保持恒定比例辅助病毒的生产原则，报道的每个细胞产生的HD载体的产量明显低于第一代腺病毒载体(Morsy M.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：7866-7871(1998)，Schiedner G.等人，Nature Gnent.18：180-183(1998))。而且，由于希望的HD载体总是污染用于生产的辅助病毒，必须根据病毒比重的微小差异，通过超速离心分离病毒，除去辅助病毒。有时通过超速离心纯化第一代腺病毒载体，但是其目的在于从腺病毒颗粒中除去污染蛋白质。另一方面，在HD载体的纯化过程中，不仅必须如上所述除去污染蛋白质，而且必须分离辅助病毒，因此一轮离心纯化的产量少于第一代腺病毒载体。如果辅助病毒没有完全除去，病毒安全性本身就是一个问题。而且，尽管第一代腺病毒载体也能通过可比超速离心法处理更大量病毒的柱层析法纯化(Huyghe B.D.等人，Hum.Gene Ther.6：1403-1416(1995))，但是由于HD载体必须除去辅助病毒，现有技术水平不能应用柱层析法。由于上述原因，在培养细胞产生和随后的纯化步骤中，HD载体的产率明显低于第一代腺病毒载体。因此，认为生产足够临床应用的HD载体极其困难，并且不切实际。
此外，病毒来源的启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子和劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子，已经广泛用于基因治疗的载体，包括腺病毒载体，因为它们的启动子活性是高水平的。然而据报道，为了由这些启动子体内长期表达希望的基因，需要腺病毒E4基因编码的蛋白质(Armentano D.等人，J.Virol.，71：2408-2416(1997)，Brough D.E.等人，J.Virol.71：9206-9213(1997))。基于持久启动子活性的观点，***来自病毒的高活性启动子的腺病毒载体必须采用结构类似于第一代腺病毒载体的载体。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种能够不依赖于辅助病毒复制的新型腺病毒载体，该载体具有在体内几乎不表达腺病毒蛋白质，因此不诱发炎症反应，并且能够持续表达转基因的特性。另外，本发明的一个目的在于在基因治疗中提供这种腺病毒载体。
关于在向个体动物施用E1基因缺失的第一代腺病毒载体时发生炎症反应的原因，本发明的发明者已经进行了广泛和深入的研究。结果发现，当第一代腺病毒载体感染不产生E1蛋白的细胞时，表达腺病毒蛋白质的机制不同于传统假说。于是发明的发明者解释，触发腺病毒蛋白质表达的不是通常认为的早期基因的表达，而是***腺病毒载体中的外源启动子。特别阐明了一种新的机制：外源启动子的特定成分(增强子等)作用于该启动子附近的腺病毒启动子，于是腺病毒基因得到表达。除此之外，我们还发现表达的主要腺病毒基因不是由公认的主要晚期启动子(MLP)调节并且编码六邻体等的主要晚期基因，而是含有独立启动子的蛋白IX基因。
蛋白IX不是腺病毒复制所必需的蛋白质，而是形成完整腺病毒颗粒所需的。因此，第一代腺病毒载体中仅蛋白IX基因缺失就不能产生发明者希望获得的正常的腺病毒载体。因此，发明者进一步进行了广泛和深入的研究，发现这一问题能用两种不同的方法解决。一种方法是将腺病毒载体的蛋白IX基因由正常位置重新定位到不受外源启动子作用的位置(称为蛋白IX重新定位的腺病毒载体)。另一种方法是从腺病毒载体中缺失蛋白IX基因，构建产生蛋白IX的新细胞系，由该细胞系产生蛋白IX基因缺失的腺病毒载体(蛋白IX缺失的腺病毒载体)。
此外，发明者的研究还证明，尽管由于外源启动子的作用诱导表达的腺病毒基因主要是蛋白IX基因，但是蛋白IVa2基因和L1基因也可能诱导表达。因此，蛋白IVa2基因和L1基因的启动子已经修饰而不受外源启动子作用的腺病毒载体，能够单独使用或与蛋白IX基因的修饰联合使用，作为不表达腺病毒蛋白质并且几乎不诱发炎症的载体。
本发明根据上述发现完成。
因此，本发明涉及：
1.一种重组腺病毒载体，其体内施用过程中的炎症减轻，该载体具有下列特征(1)-(4)：
(1)腺病毒基因组的E1A和E1B基因缺失；
(2)腺病毒基因组中***含外源启动子的外源基因；
(3)具有下列特征(A)和/或(B)：
(A)由外源启动子诱导表达的腺病毒基因组的基因从正常位置重新定位到不受外源启动子诱导表达的位置，或者该基因缺失；和
(B)由外源启动子诱导表达的腺病毒基因组基因启动子的核苷酸序列被置换，以致不受外源启动子的作用；和
(4)形成与腺病毒野生株具有相同特性的正常病毒颗粒，
2.一种根据上述1的重组腺病毒载体，其中腺病毒基因组的启动子是MLP和/或IVa2基因启动子，
3.一种根据上述1或2的重组腺病毒载体，其具有下列特征(5)-(8)：
(5)腺病毒基因组的E1A和E1B基因缺失；
(6)腺病毒基因组中***含外源启动子的外源基因；
(7)腺病毒基因组的蛋白IX基因从正常位置重新定位到不受外源启动子诱导表达的位置；和
(8)含有含量类似于腺病毒野生株的蛋白IX，形成正常的病毒颗粒，
4.一种根据上述1-3中任意一项的重组腺病毒载体，其中在腺病毒基因组的E1A和E1B基因缺失位点***含外源启动子的外源基因，
5.一种根据上述1-4中任意一项的重组腺病毒载体，其中腺病毒基因组除E1A和E1B基因之外的至少一种基因全部或部分缺失，
6.一种根据上述3-5中任意一项的重组腺病毒载体，其中腺病毒基因组除E1A和E1B基因和蛋白IX基因之外的至少一种基因全部或部分缺失，
7.一种根据上述1-6中任意一项的重组腺病毒载体，其中腺病毒基因组E3基因全部或部分缺失，
8.一种根据上述1-7中任意一项的重组腺病毒载体，其中腺病毒基因组E2A基因全部或部分缺失，
9.一种根据上述1-8中任意一项的重组腺病毒载体，该载体保留腺病毒基因组E4基因的至少一个ORF，
10.一种根据上述9的重组腺病毒载体，该载体保留腺病毒基因组E4基因的ORF3，
11.一种根据上述10的重组腺病毒载体，其中腺病毒基因组除E4基因ORF3之外的全部或部分ORF缺失，
12.一种根据上述3-11中任意一项的重组腺病毒载体，其中蛋白IX基因重新定位于距外源启动子18kb或更远的位置，
13.一种根据上述12的重组腺病毒载体，其中蛋白IX基因重新定位于腺病毒基因组的L3基因与E2A基因之间，
14.一种根据上述3-11中任意一项的重组腺病毒载体，其中蛋白IX基因重新定位于距外源启动子24kb或更远的位置，
15.一种根据上述14的重组腺病毒载体，其中蛋白IX基因重新定位于腺病毒基因组的E3基因缺失位点，
16.一种根据上述3-11中任意一项的重组腺病毒载体，其中蛋白IX基因重新定位于距外源启动子30kb或更远的位置，
17.一种根据上述16的重组腺病毒载体，其中蛋白IX基因重新定位于腺病毒基因组的E4基因上游区与3’端ITR之间，
18.一种根据上述1-17中任意一项的重组腺病毒载体，其中外源启动子含有来自哺乳动物和/或动物病毒的元件，
19.一种根据上述18的重组腺病毒载体，其中外源启动子含有CMV增强子，
20.一种根据上述19的重组腺病毒载体，其中该外源启动子是一种CMV启动子，
21.一种根据上述19的重组腺病毒载体，其中该外源启动子是一种CAG启动子，
22.一种根据上述18的重组腺病毒载体，其中该外源启动子是一种RSV启动子或一种SRα启动子，
23.一种根据上述18的重组腺病毒载体，其中该腺病毒是一种人类腺病毒载体，
24.一种根据上述23的重组腺病毒载体，其中该腺病毒是2型腺病毒或5型腺病毒，
25.一种根据上述1或2的重组腺病毒载体，其具有下列特征(9)-(11)：
(9)腺病毒基因组的E1A和E1B基因和蛋白IX基因缺失；
(10)腺病毒基因组中***含外源启动子的外源基因；和
(11)含有含量类似于腺病毒野生株的蛋白IX，形成正常的病毒颗粒，
26.一种根据上述25的重组腺病毒载体，其中腺病毒基因组E3基因全部或部分缺失，
27.一种根据上述25或26的重组腺病毒载体，其中在腺病毒基因组的E1A和E1B基因缺失位点或E3基因缺失位点***含外源启动子的外源基因，
28.一种根据上述25-27中任意一项的重组腺病毒载体，其中腺病毒基因组除E1A和E1B基因、E3基因和蛋白IX基因之外的至少一种基因全部或部分缺失，
29.一种根据上述25-28中任意一项的重组腺病毒载体，其中腺病毒基因组E2A基因全部或部分缺失，
30.一种根据上述25-29中任意一项的重组腺病毒载体，该载体保留腺病毒基因组E4基因的至少一个ORF，
31.一种根据上述30的重组腺病毒载体，该载体保留腺病毒基因组E4基因的ORF3，
32.一种根据上述31的重组腺病毒载体，其中腺病毒基因组除E4基因ORF3之外的全部或部分ORF缺失，
33.一种根据上述25-32中任意一项的重组腺病毒载体，其中外源启动子含有来自哺乳动物和/或动物病毒的元件，
34.一种根据上述33的重组腺病毒载体，其中外源启动子含有CMV增强子，
35.一种根据上述34的重组腺病毒载体，其中该外源启动子是一种CMV启动子，
36.一种根据上述34的重组腺病毒载体，其中该外源启动子是一种CAG启动子，
37.一种根据上述33的重组腺病毒载体，其中该外源启动子是一种RSV启动子或一种SRα启动子，
38.一种根据上述25-37中任意一项的重组腺病毒载体，其中该腺病毒是一种人类腺病毒载体，
39.一种根据上述38的重组腺病毒载体，其中该腺病毒是2型腺病毒或5型腺病毒，
40.一种来源于哺乳动物的细胞，其具有下列特征(12)-(13)：
(12)表达腺病毒的E1基因和蛋白IX基因；和
(13)能使根据上述25-39中任意一项的重组腺病毒载体繁殖，
41.一种根据上述40的细胞，其中腺病毒的蛋白IX基因的表达由外源启动子而不是该基因的原始启动子调节，
42.一种根据上述40或41的细胞，其进一步表达除腺病毒的E1基因和蛋白IX基因之外的至少一种腺病毒基因，
43.一种根据上述42的细胞，其表达腺病毒的E1基因、蛋白IX基因和E2A基因，
44.一种生产根据上述25-39中任意一项的重组腺病毒载体的方法，其中应用根据上述40-43中任意一项的细胞，
45.一种重组腺病毒载体，其体内施用过程中的炎症减轻，该载体具有下列特征(14)和(15)：
(14)腺病毒基因组的E1A和E1B基因缺失；和
(15)腺病毒基因组中***一种不诱导腺病毒基因表达的外源启动子，
46.一种根据上述45的重组腺病毒载体，其具有下列特征(16)-(18)：
(16)腺病毒基因组的E1A和E1B基因缺失；
(17)腺病毒基因组的蛋白IX基因在原始位置处保留；和
(18)腺病毒基因组中***一种不诱导蛋白IX基因表达的外源启动子，
47.一种根据上述45或46的重组腺病毒载体，其中在腺病毒基因组的E1A基因和E1B基因缺失位点***含外源启动子的外源基因，
48.一种根据上述45-47中任意一项的重组腺病毒载体，其中外源启动子不含CMV增强子，
49.一种根据上述45-48中任意一项的重组腺病毒载体，其中含外源启动子的外源基因以朝左的方向***，
50.一种根据上述45-49中任意一项的重组腺病毒载体，其中外源启动子是一种EF1α启动子，
51.一种重组腺病毒载体，其体内施用过程中的炎症减轻，该载体具有下列特征(19)-(21)：
(19)腺病毒基因组的E1A和E1B基因缺失；
(20)腺病毒基因组中***含外源启动子的外源基因；和
(21)在外源启动子与腺病毒基因之间***具有抑制外源启动子诱导腺病毒基因表达的特性的碱基序列，
52.一种根据上述51的重组腺病毒载体，其中在腺病毒基因组的E1A基因和E1B基因缺失位点***含外源启动子的外源基因，
53.一种根据上述51或52的重组腺病毒载体，其中外源启动子含有CMV增强子，
54.一种药用组合物，它在体内施用过程中可减轻或不诱发炎症，含有一种选自上述1-39和45-53的重组腺病毒载体作为活性成分，
55.一种减轻体内施用过程中的炎症的方法，其中对哺乳动物施用一种选自上述1-39和45-53的重组腺病毒载体，
56.一种减轻体内施用过程中的炎症的基因治疗方法，其中对哺乳动物施用一种选自上述1-39和45-53的重组腺病毒载体，
57.一种选自上述1-39和45-53的重组腺病毒载体的用途，用于生产在体内施用过程中可减轻或不诱发炎症的药用组合物，
58.一种选自上述1-39和45-53的重组腺病毒载体的用途，用于生产在基因治疗中使用的药用组合物，它在体内施用过程中可减轻或不诱发炎症。
附图简述
图1是显示该实验使用的一种腺病毒载体的结构的示意图。图中，CAG代表CAG启动子，pA代表poly(A)序列，其上的箭头表示转录方向。Ad5基因组代表5型人类腺病毒基因组，lacZ代表大肠杆菌lacZ基因，Cre代表重组酶Cre基因，hGH代表人类生长激素的cDNA。
图2显示通过尾静脉注射腺病毒载体Ax1CAHGH或ΔE2A-CAHGH的C57BL/6小鼠(每组5只小鼠)血清GPT水平日变化的平均值。图中，●是注射1×109PFU腺病毒载体组，○是注射3×108PFU组，▲是注射1×108PFU组。
该实验以每组5只小鼠进行。在Ax1CAHGH 1×109PFU施用组和ΔE2A-CAHGH 3×108PFU施用组中，有一只小鼠的血清hGH水平明显低于(1/10或更低，数据未显示)其它4只小鼠。因此，对于这两组，在计算平均值时忽略该小鼠的值，显示每组4只小鼠的平均GPT值。
图3显示通过尾静脉注射不同结构的腺病毒载体或紫外线灭活的腺病毒颗粒的C57BL/6小鼠(每组5只小鼠)血清GPT水平日变化的平均值。图中，●是注射1×109PFU载体组，○是注射3×108PFU组，▲是注射1×108PFU组，Δ是注射3×107PFU组。盐水代表注射生理盐水组，紫外线灭活代表注射紫外线灭活的腺病毒颗粒组。
图4是一张照片，显示Northern印迹分析的结果。A549细胞或HepG2细胞用以下所示的每种腺病毒载体以moi＝100感染，24小时后由细胞制备RNA。各5μgRNA电泳后，通过Northern印迹分析检测(A)L3 RNA，(B)IVa2 RNA，和(C)pIX RNA。凝胶上的符号代表：Mock：假感染，lwl：Axlwl，CAwt：AxCAwt，HGH：Ax1CAHGH，ΔE2A：ΔE2A-CAHGH。凝胶右侧的箭头和数字显示希望的条带的位置和大小。
右侧标为Ad5的三个道是阳性对照。HepG2细胞用来自5型腺病毒野生株(Ad5-dlX：Saito I.等人，J.Virol.54：711-719(1985))、只缺失E3基因的病毒以moi＝10感染，24小时后制备RNA，并对图中所示的RNA进行电泳。
图5是一张照片，显示蛋白IX(pIX)基因的Northern印迹分析结果。A549细胞用AxCAwt或AdCMVlacZ以图中所示的moi感染，24小时后由细胞制备RNA。对各5μg RNA进行电泳，然后通过Northern印迹分析检测pIX RNA。图中缩写代表：Mock：假感染，CAG：AxCAwt，CMV：AdCMVlacZ。
右侧标为Ad5的三个道是阳性对照。A549细胞用Ad5-dlX(见图4)以moi＝10感染，24小时后制备RNA，对图中所示的RNA进行电泳。
图6是一张照片，显示pIX基因的Northern印迹分析结果。A549细胞用图中所示的每种腺病毒载体以moi＝30或100感染，24小时后由细胞制备RNA。对各5μg RNA进行Northern印迹分析以检测pIXRNA。
图7显示注射含有不同启动子的腺病毒载体的C57BL/6小鼠(每组5只小鼠)血清GPT水平日变化的平均值。图中，●是注射1×109PFU载体组，○是注射3×108PFU组，▲是注射1×108PFU组。
图8是一张照片，显示应用抗pIX-融合蛋白(GST-pIX)抗血清的Western印迹分析的结果。用Ad5-dIX(见图4)以moi＝10感染A549细胞，大约1天后收获细胞，溶解于SDS样品缓冲液中。细胞裂解液或纯化的病毒颗粒(7.5×107PFU)在还原条件下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后用抗-pIX抗血清#1(抗-pIX)或免疫前血清(免疫前)进行Western印迹分析以检测pIX。图中缩写代表：Mock：未感染的细胞，Ad5：Ad5-dIX感染的细胞，病毒体：纯化的病毒颗粒。图右侧的数值是分子量标记物的分子量。用预染色的分子量标记物(GIBCO BRL，目录号10748-010)作为分子量标记物，并根据未染色的分子量标记物(New England Biolabs，目录号P7702S)的迁移率修正分子量。括号中的数值是未用未染色分子量标记物修正的值。
图9是一张照片，显示pIX的Western印迹分析的结果。用AxCAwt(moi＝100)、Awlwl(moi＝100)或Ad5-dIX(moi＝10)感染A549细胞，大约1天后收获细胞，溶解于SDS样品缓冲液中。待SDS-PAGE后，进行Western印迹分析以检测pIX。图中缩写代表：Ad5：Ad5-dIX感染的细胞，CAwt：AxCAwt感染的细胞，lwl：Awlwl感染的细胞，Mock：未感染的细胞。图右侧的数值是分子量(见图8)。
图10是显示蛋白IX重新定位的腺病毒载体、pIX缺失的腺病毒载体等的结构的示意图。图中，lacZ代表大肠杆菌lacZ基因的表达单元，pIX代表蛋白IX基因，psi代表包装信号，CAG代表CAG启动子，hGH代表人类生长激素cDNA，pA代表poly(A)序列。箭头表示每种基因的转录方向。
图11是显示构建粘粒载体pAxΔpIXcw和pAxΔpIXCAHGH的方法的示意图。图中，空框表示5型人类腺病毒基因组，细线部分表示大肠杆菌来源的DNA序列。限制酶上的数值表示5型人类腺病毒中每种限制酶识别位点处的核苷酸数。APR代表氨苄青霉素抗性基因，ori代表大肠杆菌复制起点，COS代表λ噬菌体的COS位点。
图12是一张照片，显示表达pIX的细胞系的蛋白IX基因的Northern印迹分析结果。将表达pIX的细胞系的4个克隆(#2，#5，#6，#10)传代培养至第30代，每5代由细胞系制备RNA，并进行N0rthern印迹分析。图中，P1、P5、P10、P15、P20、P25和P30表示传代数。左侧三个道是阴性对照和阳性对照。Mock代表由不含病毒的293细胞制备的RNA，8hr和24hr代表用Axlwl以moi＝10感染293细胞8小时(8hr)和24小时(24hr)后制备的RNA。
图13是一张照片，显示表达pIX的细胞系的pIX的Western印迹分析结果。将表达pIX的细胞系的4个克隆(#2，#5，#6，#10)传代培养至第25代，溶解于SDS样品缓冲液中。在SDS-PAGE后，进行Western印迹分析检测pIX。右侧三个道是阴性对照和阳性对照。详见图12。用未染色的分子量标记物(New England Biolabs，目录号P7702S)作为分子量标记物。
实现本发明的最佳模式
以下将更详细地说明本发明。
根据本发明，第一次揭示了在体内施用重组腺病毒载体后发生的炎症是由外源启动子引起的。特别是第一次阐明，原来不应表达的腺病毒基因组的基因由于外源启动子的作用而表达，来源于腺病毒的表达蛋白质引起炎症。
因此，为了减轻体内施用腺病毒载体后的炎症，显然应当在适当时修饰重组腺病毒载体的基因组结构，以使腺病毒基因的表达不受外源启动子作用的影响。因此，本领域技术人员能利用标准重组DNA技术对重组腺病毒载体的基因组结构进行修饰，以使腺病毒基因的表达不受外源启动子作用的影响。
根据本发明，本发明的重组腺病毒载体包括重组腺病毒载体的基因组结构已经修饰，使得腺病毒基因的表达不受外源启动子影响的任何载体。
本发明的重组腺病毒载体的优选实施方案包括具有下列特征(1)-(4)的载体：
(1)腺病毒基因组的E1A和E1B基因缺失；
(2)腺病毒基因组中***含外源启动子的外源基因；
(3)具有下列特征(A)和/或(B)：
(A)由外源启动子诱导表达的腺病毒基因组的基因从正常位置重新定位到不受外源启动子诱导表达的位置，或者该基因缺失；和
(B)由外源启动子诱导表达的腺病毒基因组基因启动子的核苷酸序列被置换，以致不受外源启动子的作用；和
(4)形成与腺病毒野生株具有相同特性的正常病毒颗粒。
在此使用时，用于构建本发明的重组腺病毒载体的腺病毒是一种利用动物作为天然宿主的病毒，特别是，优选使用利用人作为宿主的人类腺病毒，更优选地使用C亚组的人类腺病毒，如2型或5型人类腺病毒。在本说明书中，为了显示一种基因在腺病毒基因组中的位置，可以使用图距单位(下文称为m.u.；1 m.u.＝约360个碱基对)，其值基于5型腺病毒。该腺病毒基因组的结构已知，例如，2型人类腺病毒基因组的完整核苷酸序列已经在GenBank中登记(保藏号J01949)，5型人类腺病毒基因的完整核苷酸序列已经在GenBank中登记(保藏号M73260)。
在上述(1)中，腺病毒的E1A和E1B基因缺失是指这两种基因的全部或部分碱基不存在，如果缺失导致不产生功能性E1A蛋白和E1B蛋白，则不具体限制缺失范围。此外，尽管蛋白IX基因存在于与E1B基因部分完全重叠的位置，但E1B基因的缺失通常不包括蛋白IX基因的缺失。E1A和E1B基因缺失的例子包括5型腺病毒的1.3-9.3m.u.的缺失(E1A基因的全部和E1B基因的大部分缺失；Trapnell B.C.，Advanced Drug Delivery Reviews，12：185-199(1993)，Elsevier SciencePublishing B.V.)。根据基础教材如《分子克隆：实验室手册》，T.Maniatis等人编写，第二版(1989)，冷泉港实验室，本领域技术人员可容易地实现这种缺失。
根据本发明，E1A和E1B基因可以简单地通称为E1基因或E1区。
在上述(2)中，外源启动子是腺病毒原始启动子之外的启动子，外源基因是进行转录的核苷酸序列，包括启动子、编码蛋白质的基因、poly(A)序列等。当进行基因治疗时，外源基因是指表达用于治疗所述疾病的蛋白质的基因。例如，通过向市售的不同表达载体中***编码希望的蛋白质的基因，能容易地构建外源基因。向腺病毒基因组中***构建的外源基因也可根据参考文献所述的周知的方法进行(GrahamF.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：8802-8806(1994)，Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1320-1324(1996)等)。外源基因优选地***上述E1基因缺失位点中。
在上述(3)中，由外源启动子诱导表达的腺病毒基因组的基因是指腺病毒基因组的一种基因，其转录通过外源启动子中特定组分的作用发生。具体包括蛋白IX基因、蛋白IVa2基因和L1基因等。
在上述(3)之(A)中，由外源启动子诱导表达的腺病毒基因组的基因可以从正常位置重新定位到不受外源启动子作用的位置，或者该基因可以缺失，以防止该基因在体内施用后表达。具体例子包括蛋白IX基因。因此，能够达到减轻体内施用后炎症的本发明的目的。当基因如上缺失时，必须预先向细胞中导入已经缺失的基因，并且应当在允许重组腺病毒载体复制形成正常病毒颗粒的细胞中表达该基因。
尽管下文更详细地描述了基因重新定位或缺失的具体例子，构建基本上不同的重新定位或缺失的重组腺病毒载体，通过如实施例5所述研究在体内施用后是否发生炎症，或者通过如实施例6所述的Northern印迹分析等，评价哪种重新定位或缺失能够满足本发明的目的。
上述(3)之(B)的基因的具体例子包括主要晚期启动子(MLP)和/或IVa2基因启动子。通过置换腺病毒基因组启动子中的碱基，使其不受外源启动子的影响，以至不影响其原始功能，能够防止体内施用后在该腺病毒基因组启动子控制下的基因表达。因此，能够达到减轻体内施用腺病毒载体后的炎症的本发明的目的。参照下列实施例，本领域技术人员在适当时能够进行特定碱基置换。因此，可以构建具有不同碱基置换的重组腺病毒载体，通过如实施例5所述研究在体内施用后是否发生炎症，或者通过如实施例6所述的Northern印迹分析，评价哪种碱基置换能够满足本发明的目的。
如以上(3)之(A)和(B)所述的腺病毒基因重新定位、缺失和置换的具体方法可由本领域技术人员进行，根据基本教材，如《分子克隆：实验室手册》，T.Maniatis等人编写，第二版(1989)，冷泉港实验室，或用于重组腺病毒构建的已知技术(Graham F.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：8802-8806(1994)，Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1320-1324(1996)等)，等等。
在上述(4)中，与腺病毒野生株具有相同特性是指在病毒颗粒的组成比，如病毒颗粒的蛋白质和物理化学性质，以及细胞感染性的保持等方面，具有与野生株几乎相同的特性。
在上述本发明的重组腺病毒载体中，上述E1A和E1B基因之外的腺病毒基因组的至少一种基因可能进一步全部或部分缺失。具体而言，E3基因、E2A基因和/或E4基因可能全部或部分缺失。在此使用时，当E4基因缺失时，优选地缺失但保留E4基因的至少一个ORF。特别是，优选地至少保留ORF3。下文将详细说明这些缺失。
本发明的重组腺病毒载体的优选实施方案包括具有下列特征(5)-(8)的载体：
(5)腺病毒基因组的E1A和E1B基因缺失；
(6)腺病毒基因组中***含外源启动子的外源基因；
(7)腺病毒基因组的蛋白IX基因从正常位置重新定位到不受外源启动子诱导表达的位置；和
(8)含有含量类似于腺病毒野生株的蛋白IX，形成正常的病毒颗粒。
下面将以具有这些特征的重组腺病毒载体为例，详细解释这些特征。
上述(6)的外源基因优选地***E1基因缺失位点。更优选地，外源基因***病毒基因组的1.3-11.2m.u.已经缺失的位点，和E1基因和蛋白IX基因全部缺失(由于重新定位)的位点。
上述(7)的腺病毒蛋白IX(下文称为pIX)是构成腺病毒病毒体壳体的九个六邻体的一种次要成分，与病毒体的热稳定性和能够包装的病毒基因组的大小有关。蛋白IX不是腺病毒复制必需的成分，但锁定pIX的病毒体倾向于热不稳定(Colby W.W.等人，J.Virol.39：977-980(1981))，只能包装大小约为野生株90％的基因组DNA(Ghosh-Choudhury G.等人，EMBO J.6：1733-1739(1987))。因此，形成正常的病毒颗粒需要pIX。
在上述(7)中，腺病毒基因组的蛋白pIX基因从正常位点重新定位到不受外源启动子诱导表达的位置是指，在蛋白IX基因最初存在于野生型腺病毒基因组中的位点，即5型人类腺病毒基因组中9.7-11.2m.u.的位点(Maat J.等人，Gene 10：27-38(1980))，不存在蛋白IX基因，蛋白IX基因存在于腺病毒基因组的其它任何位点。此外，蛋白IX基因不受外源启动子诱导表达是指蛋白IX基因的转录不由外源启动子诱导。在下文中，蛋白IX基因重新定位于其中的腺病毒载体可以称为“蛋白IX基因重新定位的腺病毒载体。”
在上述(7)中，不具体限制蛋白IX基因重新定位的位点，只要蛋白IX基因不受外源启动子诱导表达，并且在载体复制循环中蛋白IX的表达不被明显抑制。然而，优选地蛋白IX基因重新定位于距外源启动子几十个kb的位置，和容易进行外源基因克隆的位置。此位置的一个优选例子是，距外源启动子约18kb或更远的位置，具体例子包括腺病毒基因组L3基因与E2A基因之间的位置(日本未审查专利文本(Kokai)号-308585)。另一个优选例子是，距外源启动子约24kb或更远的位置，具体例子包括腺病毒基因组E3基因的缺失位点。此外，另一个优选例子是，距外源启动子约30kb或更远的位点置，具体例子包括腺病毒基因组的E4基因上游区与3’端ITR(末端反向重复序列)之间的位置(Saito I.等人，J.Virol.54：711-719(1985))。从蛋白IX基因的正常位置缺失和上述位置的重新定位通过标准重组DNA技术和周知的上述重组腺病毒构建技术容易进行。构建的蛋白IX重新定位的腺病毒载体是否满足本发明的目的能如下评价：如实施例5所述研究在体内施用后是否发生炎症，如实施例6所述的Northern印迹分析，等等。
在上述(8)中，含有含量类似于腺病毒野生株的蛋白IX的病毒颗粒是指一种腺病毒颗粒，它含有与野生型腺病毒颗粒所含蛋白IX几乎相同比例的蛋白IX。此外，正常病毒颗粒是指保持细胞感染力的腺病毒颗粒，其热稳定性和能够包装的基因组DNA的大小与野生型腺病毒几乎相同。
在上述蛋白IX重新定位的腺病毒载体中，E1A和E1B基因能够缺失，蛋白IX基因能够重新定位，而且腺病毒基因组的其它基因也能全部或部分缺失。具体而言，E3基因、E2A基因和/或E4基因可能全部或部分缺失。在此使用时，不具体限制“全部或部分”的长度，只要缺失不引起功能性蛋白质产生。腺病毒基因组(如上述E3基因、E2A基因和E4基因)的核苷酸序列在参考文献中已有描述(《腺病毒》，Ginsberg H.S.编写，1984，Plenum Press，纽约)，本领域技术人员能容易地进行从腺病毒载体中缺失这些基因的方法。
通过在上述基因中缺失E3基因的全部或一部分，能够***更长的外源基因。当E3基因全部或部分缺失时，不需要在重组腺病毒载体复制的细胞中表达E3基因。另一方面，当E2A和E4基因全部或部分缺失时，为了形成正常的病毒颗粒，必须导入先前缺失的基因，并使其在重组腺病毒载体复制的细胞中表达。
当E4基因缺失时，优选地保留E4基因的至少一个开放阅读框(ORF)。特别是，优选地保留E4基因的ORF3。在5型和2型腺病毒中，由于转录后的RNA剪切不同，E4基因编码七种不同的多肽，ORF3是这些多肽之一。在腺病毒的多个循环中，ORF3具有促进病毒基因表达和DNA复制的功能。另一方面，为使以下所述的一些CMV启动子的外源启动子在体内长期保留其启动子活性，E4基因的ORF3是必要的(Lusky M.等人，J.Virol.73：8308-8319(1999)，Yeew N.S.等人，Hum.Gene Ther.10：1833-1843(1999))。基于上述原因，优选地保留ORF3。
不具体限制产生本发明的蛋白IX重新定位的腺病毒载体的细胞系，只要它们表达E1基因，并且适于产生腺病毒载体，如来源于人胚胎肾细胞的293细胞(ATCC CRL-1573)。然而，如果在整合到细胞系染色体中的腺病毒DNA与载体基因组之间存在同源DNA序列，通过重源重组可能产生不希望的腺病毒。因此，为了产生这种腺病毒载体，优选地使用只含E1基因最小部分的细胞系，使得载体基因组与细胞系染色体之间尽可能不存在重叠DNA序列。一个实例是来源于人胚胎视网膜(HER)的PER细胞系(Fallaux F.J.等人，Hum.Gene Ther 9：1909-1917(1998))。除了E1基因之外，必要时也可使用表达其它腺病毒基因(如E2A基因)的细胞系。表达其它腺病毒基因的细胞系可以如下构建：例如，向合适的表达载体中***腺病毒基因，通过标准方法用这样构建的表达载体转染表达E1基因的细胞。
本发明的重组腺病毒载体的另一个优选实施方案是一种腺病毒载体，其基因组缺失El基因和蛋白IX基因，病毒颗粒中含有正常含量的蛋白IX。因此，包括具有下列特征(9)-(11)的重组腺病毒载体：
(9)腺病毒基因组的E1A和E1B基因和蛋白IX基因缺失；
(10)腺病毒基因组中***含外源启动子的外源基因；和
(11)含有含量类似于腺病毒野生株的蛋白IX，形成正常的病毒颗粒。
这种载体在下文中可称为“蛋白IX缺失的腺病毒载体。”
在上述(9)中，不具体限制蛋白IX基因缺失的范围，只要缺失不引起蛋白IX的部分肽或来源于蛋白IX基因的肽表达。优选地至少蛋白IX基因的全部编码区缺失。此外，更优选地病毒基因组的1.3-11.2m.u.缺失，并且E1基因和蛋白IX基因全部缺失。这些缺失能用标准重组DNA技术实现。
为了产生蛋白IX缺失的腺病毒载体，需要表达蛋白IX的细胞系，该细胞系在下文说明。
上述(10)中的外源基因优选地***E1基因缺失位点。更优选地，外源基因***病毒基因组1.3-11.3m.u.已经缺失的位点，即E1基因和蛋白IX基因全部缺失的位点。如同上述蛋白IX重新定位的腺病毒载体，在蛋白IX缺失的腺病毒载体中，腺病毒E3基因也能全部或部分缺失，也能向E3基因缺失位点***外源基因。
在上述(11)中，含有含量类似于腺病毒野生株的蛋白IX的病毒颗粒是指一种腺病毒颗粒，它含有与野生型腺病毒颗粒所含蛋白IX几乎相同比例的蛋白IX。正常病毒颗粒是指保持细胞感染力的腺病毒颗粒，它们在热稳定性和能够包装的基因组DNA的大小方面具有与野生型腺病毒几乎相同的特性。通过用蛋白IX缺失的腺病毒感染表达蛋白IX的细胞系，并使其复制，能够产生这种病毒颗粒。
对于本发明的蛋白IX缺失的腺病毒载体，E1A和E1B基因以及蛋白IX基因能够缺失，而且腺病毒基因组其它基因也能全部或部分缺失。特定缺失与上述蛋白IX重新定位的腺病毒载体相同，E3基因、E2A基因和/或E4基因能够全部或部分缺失。在此使用时，不具体限制进行缺失的“全部或部分”的长度，只要缺失不引起功能性蛋白质产生。腺病毒基因组(如上述E3基因、E2A基因和E4基因)的核苷酸序列在参考文献中已有描述(《腺病毒》，Ginsberg H.S.编写，1984，Plenum Press，纽约)，本领域技术人员能够容易地进行从腺病毒载体中缺失这些基因的方法。
通过在上述基因中缺失E3基因的全部或一部分，能够***更长的外源基因。当E3基因缺失时，不需要在重组腺病毒载体复制的细胞中表达E3基因。另一方面，当E2A基因和E4基因全部或部分缺失时，必须导入先前缺失的基因，并使其在重组腺病毒载体复制的细胞中表达。
当E4基因缺失时，优选地保留E4基因的至少一个开放阅读框(ORF)。特别是，优选地保留E4基因的ORF3。至于保留ORF3的优点，参见蛋白IX重新定位的腺病毒载体部分。
对于以本发明的蛋白IX重新定位的腺病毒载体和蛋白IX缺失的腺病毒载体为代表的本发明的重组腺病毒载体，为了表达希望的外源基因，如治疗基因，载体中必须含有外源启动子。对于外源启动子，只要在哺乳动物细胞中起作用，并且能够以希望的量表达希望的基因，能够不加限制地使用任何启动子，如动物病毒来源的启动子、哺乳动物细胞来源的启动子或这两种启动子的杂合启动子等。作为外源启动子的一个实例，由于在许多情况下希望高水平地表达治疗基因，优选地使用所谓的高表达启动子，如CMV启动子(Foecking M.K.等人，Gene 45：101-105(1986))和CAG启动子(Niwa H.等人，Gene 108：193-200(1991))等。CMV启动子包含巨细胞病毒(CMV)直接早期(IE)基因的增强子和启动子，CAG启动子包含CMV的IE增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、兔β-珠蛋白的剪接受体和poly(A)序列。因此，CMV启动子和CAG启动子都含有CMV的IE基因的增强子(Boshart M.等人，Cell 41：521-530(1985))。在此使用时，CMV的IE基因的增强子简称为“CMV增强子。”
在以下实施例中说明时，当使用CMV启动子和CAG启动子(它们均含有CMV增强子)之一时，注意到蛋白IX基因表达的诱导。另一方面，当使用EF-1α启动子(它不含CMV增强子)时，未发现蛋白IX基因表达的诱导。因此，应当理解，CMV启动子和CAG启动子共有的CMV增强子是引起腺病毒基因(如蛋白IX)表达诱导的因素。因此，认为CMV增强子作用于启动子，如蛋白IX基因，结果是蛋白IX等表达。
根据启动子活性强度，现在进行临床研究的几乎所有腺病毒载体都采用含有CMV启动子或CMV增强子的杂合启动子。因此，在临床应用中，可以十分有效地使用本发明的重组腺病毒载体，它们能减轻体内施用后的炎症。
除了上述含有CMV增强子的启动子之外，也能使用类似地来源于病毒的启动子，如SV40启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子(TakebeY.等人，Mol.Cell Biol.8：466-472(1988))。
不具体限制***本发明的腺病毒载体中的外源基因，可以使用编码如细胞因子、酶、受体、病毒结构蛋白等蛋白质的基因，编码反义RNA和核酶的基因等。
上述本发明的蛋白IX缺失的腺病毒载体甚至在表达E1基因但不表达蛋白IX的细胞系(如人胚胎肾细胞来源的293细胞)中也能够复制。但是，由于不表达蛋白IX的细胞系产生的蛋白IX缺失的腺病毒载体在病毒颗粒中不含希望含量的蛋白IX，所以不可能获得具有本发明目的特性的腺病毒载体。因此，为了产生本发明的蛋白IX缺失的腺病毒载体，需要至少表达E1基因和蛋白IX的特殊细胞系。也就是说，为了使本发明的蛋白IX缺失的腺病毒载体能够复制，使用具有下列特征(12)和(13)的哺乳动物细胞：
(12)表达腺病毒的E1基因和蛋白IX基因；和
(13)能使蛋白IX缺失的腺病毒载体繁殖。
作为构建表达蛋白IX的细胞系的一种方法，可以用含有蛋白IX基因的表达载体进一步转化表达E1基因的细胞系，如人胚胎肾细胞来源的293细胞(ATCC CRL-1573)，或者可以用含有E1基因的表达载体和含有蛋白IX基因的表达载体连续或同时转化不表达E1基因的细胞。然而，由于用含有E1A、E1B和蛋白IX基因全部1.3-11.2m.u.的DNA片段转化细胞不产生表达蛋白IX的细胞系，必须用在蛋白IX基因上游添加适当启动子的DNA片段转化。因为据报道，尽管***了含有全长蛋白IX基因的5型人类腺病毒位点1-4344处的核苷酸(LouisN.，Virology 233：423-429(1997))，但293细胞表达极少的蛋白IX(Krougliak V.等人，Hum.Gene Ther.6：1575-1586(1995))，而且，尽管***了含有全长蛋白IX基因的El基因，但其它细胞系表达极少的蛋白IX(Fallaux F.J.等人，Hum.Gene Ther.9：1909-1917(1998))。可以认为，这些细胞不表达蛋白IX的原因是，当E1B基因通过蛋白IX启动子转录时，蛋白IX基因的转录受到抑制(Vales L.D.，Genes Dev.3：49-59(1989))。
关于表达本发明的蛋白IX的细胞系，不具体限制用于表达蛋白IX的启动子，可以是外源启动子或蛋白IX基因的原始启动子。当使用外源启动子时，可以是组成型启动子或诱导型启动子，只要目的细胞系能够建立并保存，而且该细胞系中繁殖产生的蛋白IX缺失的腺病毒载体形成含有正常含量的蛋白IX的病毒颗粒。组成型启动子的实例包括CAG启动子、CMV启动子、EF-1α启动子、SRα启动子、SV40启动子、RSV启动子、腺病毒主要晚期启动子(MLP)等。诱导型启动子的实例包括金属硫蛋白基因启动子、小鼠乳腺癌病毒(MMTV)启动子等。此外，也能使用由四环素或蜕皮激素诱导组成型启动子表达的***。包括这种启动子的表达载体和表达诱导***可以购得，或者可从公开机构获得。商品能购自Invitrogen Inc.，Clontech Inc.等。
表达上述蛋白IX的细胞系能够如下构建：通过PCR方法克隆蛋白IX基因的编码区，将其***市售表达载体(例如pcDNA3.1(+)，Invitrogen Inc.)，然后导入人胚胎肾细胞来源的293细胞，使细胞表达蛋白IX。详见以下实施例。
此外，当腺病毒E1基因和蛋白IX基因之外的腺病毒基因进一步缺失的蛋白IX缺失的腺病毒载体将要复制时，有时可能需要进一步表达这种缺失基因的细胞系。例如，当腺病毒载体的E1基因、蛋白IX基因和E2A基因缺失时，使用表达这三种基因的细胞系。E2A基因能转导细胞，使之以类似于上述蛋白IX基因所述的方式表达。
本领域技术人员周知用上述细胞系构建重组腺病毒载体的方法，例如可以用COS-TPC法(Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：1320-1324(1996))进行构建。
因此，本发明的重组腺病毒载体的一个代表性实施方案是具有上述特征(1)-(4)的重组腺病毒载体，作为优选实施方案，说明了蛋白IX重新定位的腺病毒载体和蛋白IX缺失的腺病毒载体。上述之外的实施方案包括外源启动子已被修饰而不诱导腺病毒基因表达的重组腺病毒载体，或采用不诱导腺病毒基因表达的外源启动子的重组腺病毒载体。因此，本发明的重组腺病毒载体的另一个优选实施方案是具有下列特征(14)和(15)的重组腺病毒载体：
(14)腺病毒基因组的E1A和E1B基因缺失；和
(15)腺病毒基因组中***一种不诱导腺病毒基因表达的外源启动子。
在此使用时，“不诱导腺病毒基因表达的外源启动子”可以是至少不诱导蛋白IX基因表达的任何启动子。当使用这种外源启动子时，蛋白IX基因不需要上述重新定位和/或缺失，只需要位于腺病毒基因组的原始位置。通过构建***含外源启动子的外源基因的重组腺病毒载体，并如实施例5所述研究在体内施用后是否发生炎症，或如实施例6所述进行Northern印迹分析，能够评估哪种外源启动子不诱导蛋白IX的表达。这种外源启动子至少不含CMV增强子，特别是EF-1α启动子(Kim D.W.等人，Gene 91：217-223(1990))。关于EF-1α启动子不诱导蛋白IX表达并且不诱发炎症的事实，见以下的实施例8和9。
而且，含有不诱导蛋白IX表达的外源启动子(如EF-1α启动子)的表达单元优选地以朝左的方向***(E1基因转录的相反方向)。因为当表达单元以朝右的方向***时，由外源启动子开始的转录在正常位置不会终止，转录恐怕会延伸到蛋白IX基因。
此外，本发明的重组腺病毒载体的另一个实施方案是具有下列特征(19)-(21)的重组腺病毒载体：
(19)腺病毒基因组的E1A和E1B基因缺失；
(20)腺病毒基因组中***含外源启动子的外源基因；和
(21)在外源启动子与腺病毒基因之间***具有抑制外源启动子诱导腺病毒基因表达的特性的碱基序列。
在此使用时，“具有抑制外源启动子诱导腺病毒基因表达的特性的碱基序列”是指一种DNA序列，它具有抑制外源启动子中含有的增强子激活腺病毒基因组的启动子的活性。一个例子是以“scs”和“gypsy”为代表的隔离体(insulator)，它们最初是在果蝇(Drosophila)中发现的。隔离体是一种DNA序列，当它位于增强子与启动子之间时，能阻止增强子激活启动子(Chung J.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：575-580(1997)，Bell A.C.等人，Curr.Opin.Genet.Dev.9：191-198(1999))。
因此，在***到E1基因缺失位点的外源基因(含有增强子/启动子)的右侧(MLP侧)***一个隔离体的腺病毒载体不表达包括蛋白IX在内的腺病毒蛋白质，或者不诱发炎症，甚至在腺病毒基因组的原始位置处存在蛋白IX基因时仍然如此。
隔离体的具体实施方案除了上述“scs”和“gypsy”外，还包括位于鸡β-珠蛋白基因座5’HS4位点的约1.2kb的DNA片段(Chung J.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：575-580(1997))和人T细胞受体α/δ基因座的BEAD-1(Bell A.C.等人，Curr.Opin.Genet.Dev.9：191-198(1999))等。不具体限制***本发明的腺病毒载体的隔离体，也不限制所用DNA片段的来源和大小等，只要隔离体具有不使外源增强子/启动子诱导腺病毒基因表达的功能。关于***隔离体的腺病毒载体，曾经报道了一种***上述β-珠蛋白隔离体和诱导型启动子的腺病毒载体(Steinwaerder D.S.等人，Gene Ther.7：556-567(2000))、***牛生长激素转录终止信号中的隔离体和组织特异性启动子的腺病毒载体(Vassux G.等人，Gene Ther.6：1192-1197(1999))等。然而，它们均非用于抑制外源增强子/启动子引起的腺病毒基因表达，其目的在于抑制腺病毒增强子对外源启动子的激活。因此，对于两篇报道中的腺病毒载体，没有证据表明外源增强子/启动子引起的腺病毒基因表达受到抑制，因而这些报道本质上不同于本发明，本发明是为了抑制腺病毒基因表达和炎症的诱导，***隔离体。
下面解释了本发明的腺病毒载体的发明历史。说明了本发明的本质的历史，或第一代腺病毒载体引起的炎症起因于外源启动子对腺病毒基因表达的诱导这一发现。
在此使用时，第一代腺病毒载体是指腺病毒E1基因缺失的复制缺陷型腺病毒载体。第一代腺病毒载体只能在表达E1基因的细胞系(如293细胞)中复制。第一代腺病毒载体可能有或者可能没有E3基因的缺失。
为了证明“笫一代腺病毒载体引起的炎症是由E2A基因(是一种腺病毒早期基因)的表达引发的”这一传统假说——也在“现有技术”部分作了解释，发明者也构建了一种E2A基因缺失的腺病毒载体。由于发明者构建E2A缺失的腺病毒载体的方法已经在日本未审查专利文本(kokai)号8-308585中公开，此处只解释构建方法的概述。首先，我们构建了第一代腺病毒载体(图1，Ax2LD3LCAHGH)，其中在两个位点(腺病毒L3基因和E2A基因之间(61.5m.u.)和E3基因缺失位点(78.0m.u.))之间***一个loxP位点，该位点是P1噬菌体重组酶Cre的识别序列(Abremski K.等人，J.Biol.Chem.259：1509-1514(1984)，HoessR.H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1026-1029(1984))。通过用Ax2LD3LCAHGH和表达重组酶Cre的第一代腺病毒载体(图1，AxCANCre)共转染293细胞，产生了一种E2A缺失的腺病毒载体(图1，ΔE2A-CAHGH)，其中侧翼为两个loxP位点的E2A基因和L4基因被剪切。然后，通过氯化铯密度梯度超速离心，根据病毒颗粒的比重分离每种病毒，纯化E2A缺失的腺病毒载体，纯度为97-98％。向这种E2A缺失的腺病毒载体ΔE2A-CAHGH中***表达单元，使得人生长激素(hGH)能在上述CAG启动子控制下作为报道基因表达。而且还构建了含有相同表达单元的第一代腺病毒载体(图1，Ax1CAHGH)作为E2A缺失的腺病毒载体的对照载体。
然后证实这样构建的E2A缺失的腺病毒载体缺失E2A基因。ΔE2A-CAHGH或Ax1CAHGH感染的A549细胞(人肺癌来源的细胞系)中E2A基因编码的DBP(单链DNA结合蛋白)的表达水平通过荧光抗体法比较，由于DBP的表达在ΔE2A-CAHGH感染的细胞中明显降低，证实了E2A基因的缺失。此外，L3基因(属于晚期基因)编码的六邻体(是病毒颗粒的一种主要结构蛋白)的表达水平类似地也用荧光抗体法比较，发现六邻体的表达在ΔE2A-CAHGH感染的细胞中明显降低。结果表明，传统假说“痕量表达的E2A基因激活腺病毒主要晚期启动子(MLP)，从而主要晚期蛋白得到表达”在这点上是正确的。
因此，研究了注射E2A缺失的腺病毒载体的动物的体内炎症反应是否降低。对小鼠静脉内注射ΔE2A-CAHGH或Ax1CAHGH，测定肝脏释放的酶GPT(谷丙转氨酶)的血清水平作为炎症指标。首先，为了证实每种腺病毒载体的感染效率，测定腺病毒载体施用3天后的血清hGH水平。因为两个腺病毒载体施用组的血清hGH水平没有显著性差异，证实了两种腺病毒载体对动物的感染效率没有差异。因此，用血清GPT水平作为指标评价E2A缺失的腺病毒载体，发现与施用Ax1CAHGH的小鼠一样，施用ΔE2A-CAHGH的小鼠血清GPT水平升高。而且某些小鼠在施用腺病毒载体后，以固定间隔制备肝切片进行组织分析。施用Ax1CAHGH的小鼠在施用5天或更多天以后，观察到炎症反应，如白细胞浸润肝脏，包括T细胞，和肝细胞的凋亡，在施用ΔE2A-CAHGH的小鼠中也观察到类似的炎症反应。因此，施用这两种腺病毒载体的小鼠在组织病理学上也没有差异。
上述结果表明，E2A基因的缺失对减轻炎症没有作用。因此，关于E2A缺失的腺病毒载体与第一代腺病毒载体在诱发炎症上没有差异的原因，考虑以下4种可能性：
1)除E2A基因之外的腺病毒基因(如E4基因)由细胞产生的因子直接激活，表达的腺病毒蛋白质自身诱导细胞介导的免疫，或者诱导另一种腺病毒蛋白质表达，该蛋白质诱导细胞介导的免疫，从而引起炎症；
2)用作报道基因的hGH蛋白诱导细胞介导的免疫，从而引起炎症；
3)***载体中的外源启动子(CAG启动子)作为表达腺病毒蛋白质的腺病毒启动子的增强子，该腺病毒蛋白质诱导细胞介导的免疫，从而引起炎症；和
4)不是在载体感染的细胞中从头合成的蛋白质，而是构成可侵入细胞的腺病毒颗粒的蛋白质本身诱导细胞介导的免疫，从而引起炎症。此外，腺病毒颗粒进入细胞本身也是一种刺激，诱发炎性细胞因子等的产生，从而引起炎症。
因此，为了阐明上述1)-4)中哪一个是E2A基因缺失的腺病毒载体不能减轻炎症诱发的可能的原因，用下列4种腺病毒载体研究了炎症的起因：
(a)表达hGH的第一代腺病毒载体(Ax1CAHGH：阳性对照)
(b)只***CAG启动子、不含hGH cDNA的第一代腺病毒载体(图1，AxCAwt：也***poly(A)序列)
(c)未***外源基因(如启动子)的第一代腺病毒载体(图1，Axlwl)
(d)紫外线灭活的腺病毒颗粒(Ax1CAHGH已灭活)。
对小鼠静脉内注射这4种载体，测定血清GPT水平。制备紫外线灭活的腺病毒颗粒的定义和方法细节在现有公开文本中已有描述(Brinstiel M.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6094-6098(1992)，Birnstiel M.L.等人，Virology 205：254-261(1994))，其定义简述如下。紫外线灭活的腺病毒颗粒是指这样的腺病毒颗粒：它们保留细胞感染力并且能侵入细胞，但是甚至在灭活前腺病毒能够复制的细胞中也不能复制，被灭活为***的外源基因不能表达的状态。
总结结果，用紫外线灭活的腺病毒颗粒处理的小鼠和用未***外源基因的Axlwl处理的小鼠，血清GPT水平根本未升高。另一方面，用只***CAG启动子的AxCAwt处理的小鼠，血清GPT水平升高到类似于表达hGH的Ax1CAHGH处理小鼠的程度。由于在AxCAwt处理的小鼠中也发生炎症，否定了2)的hGH蛋白是起因的可能性。此外，由于用紫外线灭活的腺病毒颗粒处理的小鼠不发生炎症，否定了4)的腺病毒颗粒是起因的可能性。此外，由于Axlwl处理的小鼠不发生炎症，否定了1)的原因单独引起炎症的可能性。因此，由于AxCAwt处理的小鼠发生程度上类似于Ax1CAHGH处理的小鼠的炎症，但Axlwl处理的小鼠不发生炎症，而AxCAwt与Axlwl结构的唯一不同是存在或不存在CAG启动子，因此揭示了第一代腺病毒载体引起炎症的原因是由3)中***载体中的CAG启动子引起的。
因此，鉴定了由CAG启动子诱导表达的腺病毒基因，即与炎症有关的腺病毒基因。用一种E2A缺失的腺病毒载体(ΔE2A-CAHGH)或上述(a)-(c)中的三种第一代腺病毒载体(Ax1CAHGH、AxCAwt、Axlwl)以较高的moi(感染复数)感染A549细胞(人肺癌来源的细胞系)或HepG2细胞(人肝癌来源的细胞系)，24小时后通过Northern印迹分析表达的腺病毒基因。研究其表达的腺病毒基因有下列8种基因：早期基因：E2A基因、E4基因；在主要晚期启动子(MLP)控制下的主要晚期基因：L1、L2、L3、L5；晚早期基因：蛋白IX、IVa2。希望的腺病毒，即由CAG启动子诱导表达并且与炎症有关的腺病毒基因的定义是：一种基因，如果向载体中***CAG启动子，该基因在E2A缺失的腺病毒载体(ΔE2A-CAHGH)感染的细胞中表达，程度类似于第一代腺病毒载体(Ax1CAHGH和AxCAwt)感染的细胞，但是在未***CAG启动子的第一代腺病毒载体(Axlwl)感染的细胞中其表达极少诱导。
首先，在研究E2A基因的表达后，证实了本发明使用的E2A缺失的腺病毒载体中E2A基因完全缺失，因为在ΔE2A-CAHGH感染的细胞中E2A基因极少表达，无论在其它3种第一代腺病毒载体感染的细胞中是否存在CAG启动子，基因表达程度几乎相同。同时，还揭示了CAG启动子不诱导E2A基因的表达。另一种早期基因——E4基因，在4种腺病毒载体感染的所有细胞中几乎程度相同地表达，从而也揭示了CAG启动子也不诱导E4基因的表达。
然后，研究了MLP控制的主要晚期基因的表达。对于HepG2细胞，在主要晚期基因中，3种基因(L2、L3和L5)的表达只在ΔE2A-CAHGH感染的细胞中降低，而对于A549细胞，ΔE2A-CAHGH感染的细胞和Axlwl感染的细胞中的表达明显降低。因此，不仅是在上述蛋白质水平上，而且在基因水平上，传统假说“E2A基因诱导主要晚期基因的表达”都得到证实，但是证明了CAG启动子不诱导这些主要晚期基因的表达。此外，L1基因的表达随所用细胞系的不同而不同。对于HepG2细胞，L1基因的表达只在ΔE2A-CAHGH感染的细胞中增强，未观察到CAG启动子诱导表达。另一方面，对于A549细胞，L1基因的表达只在Axlwl感染的细胞中降低，观察到CAG启动子诱导表达。
最后，研究了各自具有独特启动子的两种晚早期基因——IVa2基因和蛋白IX基因的表达。IVa2基因的表达模式随对于L1基因所用的细胞系的不同而不同。因此，对于HepG2细胞，所有4种腺病毒载体感染的细胞都以几乎相同的水平表达IVa2基因，而未注意到CAG启动子诱导表达。相反，对于A549细胞，IVa2基因的表达只在Axlwl感染的细胞中降低，注意到CAG启动子对表达的诱导。
另一方面，两种细胞系的蛋白IX基因表达获得相同的结果，在ΔE2A-CAHGH-、Ax1CAHGH-和AxCAwt-感染的细胞中，蛋白IX基因几乎程度相同地表达，但在Axlwl感染的细胞中表达极低。因此，对于蛋白IX基因，明显观察到CAG启动子对表达的诱导。
根据上述结果，证明了明显由CAG启动子诱导表达的腺病毒基因主要是蛋白IX基因。这强烈表明，蛋白IX基因的表达是体内施用第一代腺病毒载体时发生炎症的一个原因。
此外，根据上述结果，也证明了在某些细胞中，蛋白IVa2基因和L1基因的表达由CAG启动子诱导。由于蛋白IVa2基因含有独立的启动子，预计它由CAG启动子直接激活。然而，L1基因是主要晚期基因之一，受与其它晚期基因(如L3基因和L5基因)共有的MLP调节，不能认为CAG启动子只诱导L1基因的表达。然而，由于众所周知L2-L5基因只在感染晚期表达，而周知L1基因也在感染早期表达(Shaw A.R.等人，Cell 22：905-916(1980))，L1基因的表达只由CAG启动子诱导的原因可能是基于早期与晚期基因表达机制的不同。而且，由于据报道蛋白IX和蛋白IVa2都有激活MLP的作用(Lutz P.等人，J.Virol.71：5102-5109(1997)，Tribouley C.等人，J.Virol.68：4450-4457(1994))，可能是通过蛋白IX或蛋白IVa2间接激活MLP，而不是CAG启动子直接激活MLP。与蛋白IX基因表达的诱导相比，CAG启动子引起的蛋白IVa2基因和L1基因表达的程度较弱，但可能是通过与蛋白IX加合作用诱发炎症。
然后，研究了CAG启动子的哪种成分诱导包括蛋白IX基因在内的腺病毒基因表达。CAG启动子包含CMV的IE增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、兔β-珠蛋白的剪接受体和poly(A)序列。在本发明使用的腺病毒载体中，CAG启动子以朝左的方向(与E1转录相反的方向)***E1基因的缺失位点中(1.3-9.2m.u.)，CAG启动子的***方向与向右转录的蛋白IX基因(9.7-11.2m.u.)的方向相反。因此认为诱导蛋白IX基因表达的可能不是β-肌动蛋白启动子，而是CMV的IE增强子。于是，利用***含IE增强子部分(与CAG启动子的唯一共同成分)的CMV启动子的腺病毒载体(AdCMVlacZ)，研究了蛋白IX基因的表达。结果对于AdCMVlacZ感染的A549细胞，蛋白IX基因的表达水平几乎类似于只***CAG启动子的AxCAwt感染的细胞。因此，证实了CMV IE增强子(CMV增强子)诱导包括蛋白IX基因在内的腺病毒基因的表达。
为了进一步证实这一结果，利用***EF-1α启动子(不含CMV增强子)的腺病毒载体(AxEFlacZ-L)研究了蛋白IX的表达，发现在AxEFlacZ-L感染的细胞中蛋白IX基因根本不表达。另外用***CAG启动子和lacZ基因的腺病毒载体(AxCAlacZ-L)作为阳性对照，通过测定接受静脉内施用腺病毒载体的小鼠的血清GPT水平比较AdCMVlacZ和AxEFlacZ-L引起的炎症程度。结果证实，AdCMVlacZ处理的小鼠的血清GPT水平升高到等于或高于AxCAlacZ-L处理的小鼠的水平，而AxEFlacZ-L处理的小鼠的血清GPT水平升高极小。因此，不含CMV增强子的EF-1α启动子不能诱导蛋白IX的表达，表明在不诱导蛋白IX表达的腺病毒载体中不发生炎症。
综合以上一系列结果，本发明者发现了传统上不知的一个极其重要的新机制：第一代腺病毒载体引起的炎症是由于CMV增强子对腺病毒基因表达的诱导。
含有CMV增强子的启动子，如CMV启动子，由于高启动子活性，已经用于当前进行临床研究的多种腺病毒载体。例子包括：采用CMV启动子本身的载体：肿瘤抑制基因、表达p53的腺病毒载体(Clayman G.L.等人，J.Clin.Oncol.16：2221-2232(1998)，Swisher S.G.等人，J.Natl.Cancer Inst.91：763-771(1999))、表达白介素-2的腺病毒载体(Stewart A.K.等人，Gene Ther.6：350-363(1999))、表达血管内皮生长因子VEGF121的腺病毒载体(Rosengart T.K.等人，Circulation100：468-474(1999))；采用含CMV IE增强子的杂合启动子的腺病毒载体的例子包括表达囊性纤维化跨膜转导调节蛋白(CFTR)的腺病毒载体(Knowles M.R.等人，N.Eng.J.Med.333：823-831(1995)，Zuckerman J.B.等人，Hum.Gene Ther.10：2973-2985(1999))。
因此，发明者关于外源启动子诱导腺病毒基因表达引发炎症的发现不是一种只限于含CAG启动子的重组腺病毒载体的现象，而是适用于当前正在进行临床研究的其它许多腺病毒载体的广泛现象。因此，根据这一发现，预计修饰后不能诱导腺病毒基因表达的腺病毒载体可减轻施用后的炎症，从而持久表达治疗基因，有极高的使用价值。
此外，本发明关于外源启动子诱导腺病毒基因表达的发现可能不仅适用于含有CMV IE增强子的腺病毒载体而且适用于含有其它病毒启动子的腺病毒载体。这类启动子的例子包括RSV启动子、含有SV40早期基因增强子的启动子或SRα启动子等。
下面以蛋白IX重新定位的腺病毒载体和蛋白IX缺失的腺病毒载体为例，具体描述了实现本发明的方法。
首先描述了构建蛋白IX重新定位的腺病毒载体的方法。蛋白IX基因的核苷酸序列和位置在参考文献中有描述(Maat J.等人，Gene 10：27-38(1980))。不具体限制制备重新定位的蛋白IX基因的方法，可利用限制酶消化从含有蛋白IX基因的质粒或粘粒上酶切(Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1320-1324(1996))，但是为了便于随后的构建，优选地用PCR方法扩增。将要扩增的蛋白IX基因的范围优选地不仅含有蛋白IX基因的编码序列而且含有5’-非翻译区和3’-非翻译区。5’-非翻译区优选地含有蛋白IX基因的启动子区，一个例子含有5型腺病毒位点3525和其后的序列，更优选地位点3213和其后的序列。不具体限制3’-非翻译区的范围，只要它含有直到蛋白IX基因终止密码子的碱基序列，可以在紧接终止密码子之后添加另一种基因的poly(A)序列，或者可以采用蛋白IX基因的原始poly(A)序列。后者的一个例子是，优选地含有聚腺苷酸化信号和含poly(A)实际添加位点的可达位点4070的碱基序列，更优选地含有可达位点4076的碱基序列。不具体限制PCR引物的核苷酸序列，只要该序列能够扩增上述范围内的蛋白IX基因，但是为了便于在扩增后向质粒中克隆含有蛋白IX基因的DNA片段，优选地含有适当限制酶的识别序列。
含有PCR扩增的蛋白IX基因的DNA片段可以直接***腺病毒基因组的希望的位点，但是为了证实在PCR反应中核苷酸序列不含突变，首先将扩增的片段克隆到合适的质粒等中，然后优选地证实该核苷酸序列可以使用。不具体限制克隆扩增片段的质粒，例子包括pUC19等。
如上所述，重新定位蛋白IX基因的位点包括L3基因与E2A基因之间的位点，E3基因的缺失位点等，但是作为一个更优选的例子，以下描述了一种在E4基因上游区与3’端ITR之间重新定位的方法。构建蛋白IX基因重新定位于上述位点的腺病毒载体的一种方法是，用含有腺病毒基因组的质粒或粘粒载体转化一种细胞系，如293细胞，基因组结构中蛋白IX基因从原始位置(9.7-11.2m.u.)缺失，***E4基因上游区与3’端ITR之间，一步获得希望的重组腺病毒载体。然而，另一种方法使用两步法也是可能的，该方法首先构建一种重组腺病毒，其中蛋白IX保留于原始位置，也在E4基因上游区与3’端ITR之间***蛋白IX基因，然后删除原始位点的蛋白IX基因，构建蛋白IX基因重新定位的腺病毒载体。尽管后一种方法中包括多个步骤，但它肯定能获得目的重组腺病毒载体，因此是一种优选方法，这种构建方法包括两步，在下文详述。以下描述的构建重组腺病毒载体的方法是，用含有腺病毒基因组大部分和限制酶消化末端蛋白质-腺病毒DNA复合物(DNA-TPC)获得的DNA的粘粒载体转化293细胞等，然后通过粘粒载体与腺病毒DNA-TPC之间的同源重组获得目的重组腺病毒载体，其原理和步骤已在现有参考文献(Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1320-1324(1996))和专利(日本未审查专利文本(Kokai)号7-298877)中公开。
粘粒载体pAx4w是这样一种载体，它含有5型腺病毒基因组的2.6-98.0m.u.(E3基因缺失)和2型腺病毒基因组的98.0-100m.u.，在E4基因启动子上游区与3’端ITR之间(99.3m.u.)含有一个限制酶SwaI位点作为克隆位点(Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1320-1324(1996)，在该参考文献中pAx4w描述为pAdex4w)。向pAx4w的SwaI位点***通过上述PCR方法制备的蛋白IX基因，获得粘粒载体pAx4pIX。另一方面，重组腺病毒载体Adex4SRlacZL是一种复制缺陷型腺病毒载体，它来源于5型腺病毒(E1A、E1B、E3基因缺失)，在与pAx4w相同的99.3m.u.位置处***大肠杆菌lacZ基因的表达单元。用限制酶AseI和EcoRI消化，在基因组右半段消化几次，由Adex4SRlacZL制备腺病毒基因组DNA，用从该DNA获得的DNA-TPC和粘粒载体pAx4pIX转化293细胞，然后产生重组腺病毒载体pAx4pIX，其中Adex4SRlacZL的大肠杆菌lacZ基因的表达单元已经替换为蛋白IX基因。pAx4pIX是一种重组腺病毒载体，它在两个位点处含有蛋白IX基因：蛋白IX基因的原始位点和E4基因上游区与3’端ITR之间。
然后说明了在蛋白IX基因原始位点处缺失的核苷酸序列的范围。蛋白IX基因向右转录，而蛋白IX基因的3’-非翻译区与向左转录的IVa2基因和E2B基因的3’-非翻译区部分重叠，因此蛋白IX基因的缺失范围必须是不影响IVa2基因和E2B基因功能的范围。以5型腺病毒为例，认为IVa2基因和E2B基因的聚腺苷酸化位点是位点4060处的基础，缺失范围必须在其左侧更远。不限制缺失范围，只要满足这一条件并且蛋白IX不表达，一个例子是从5型腺病毒的PvuII位点(Ad5：452-457)到AlwNI位点(Ad5：4048-4056)的缺失。含有缺失这段碱基的腺病毒基因组的载体能由粘粒载体pAxcw(日本未审查专利文本(Kokai)号8-308585，第15页，pAdexlcw与pAxcw相同)构建。pAxcw是一种粘粒载体，它含有5型腺病毒基因组的大部分，其中E1基因缺失(Δ454-3328)，以pAxcw作为原材料通过几步构建，能获得粘粒载体pAxΔpIXcw，它含有从PvuII位点到AlwNI位点缺失的腺病毒基因组。pAxΔpIXcw是这样一种载体，其中E1A、E1B和蛋白IX基因缺失(Δ454-4053)，缺失位点中***一个用于外源基因的克隆位点(ClaI和SwaI位点)。
用限制酶EcoT22I(在基因组左侧含有多个识别位点)消化由上述腺病毒Ax4pIX制备的基因组DNA，获得DNA-TPC，用该DNA-TPC和上述粘粒载体pAxΔpIXcw转化293细胞，能够获得蛋白IX基因重新定位的目的重组腺病毒载体pAxRpIXcw。该AxRpIXcw中没有***外源基因如启动子，***任一种外源基因的蛋白IX重新定位的腺病毒载体能够如下获得：使EeoT22I消化AxRpIXcw的基因组DNA获得的DNA-TPC与在粘粒载体pAxΔpIXcw的SwaI位点或ClaI位点***外源基因的粘粒载体同源重组。此外，***任何外源基因的蛋白IX重新定位的腺病毒载体也能如下获得：使EcoT22I消化Ax4pIX的基因组DNA获得的DNA-TPC与在粘粒载体pAxΔpIXcw的SwaI位点或ClaI位点***外源基因的粘粒载体同源重组。
如上所述，以5型腺病毒为例，说明了一种构建蛋白IX重新定位的腺病毒载体的方法。重新定位的蛋白IX基因不需要采用来自相同血清型腺病毒的基因，能采用另一种血清型的蛋白IX基因，只要该蛋白质在腺病毒复制循环中充分起作用。例如，2型蛋白IX基因重新定位于5型基本骨架的一种载体，或者相反，5型蛋白IX基因重新定位于2型基本骨架的一种载体。
然后说明了一种构建蛋白IX缺失的腺病毒载体的方法。为了构建这种载体，需要表达蛋白IX的细胞系，因此说明了一种构建表达蛋白IX的细胞系的方法。不具体限制向细胞中导入的蛋白IX基因的范围，只要它含有蛋白IX的编码区。含有蛋白IX编码区的DNA片段可通过限制酶消化从含有该基因的质粒等上切下，或者可以通过PCR方法制备。不具体限制用于表达蛋白IX的启动子，可以使用在动物细胞中组成型作用的启动子，或者可以使用诱导型启动子。此外，也可以使用蛋白IX基因的原始启动子。通过用含有蛋白IX基因表达单元的质粒转化任何细胞，能够获得表达蛋白IX的细胞系。然而，用于构建该细胞系的细胞优选地是表达腺病毒E1基因的细胞，该细胞能够高效产生E1基因缺失的第一代腺病毒载体。这种细胞的例子包括293细胞。而且，为了防止载体基因组与细胞基因组的同源重组产生复制型腺病毒(RCA)，优选地使用只导入E1基因所需最小区域的细胞系构建表达蛋白IX的细胞系。此外，首先由不表达E1基因的细胞构建表达蛋白IX的细胞系，然后用E1基因转化该细胞系，也能获得希望的细胞系。不具体限制细胞转化和目的细胞系选择的方法，可以使用能为蛋白IX缺失的腺病毒载体提供足量蛋白IX的任何细胞系。
其次，更加具体地说明了一种构建蛋白IX缺失的腺病毒载体的方法。如对于蛋白IX重新定位的腺病毒载体所述，蛋白IX基因的缺失范围可以是不影响IVa2基因和E2B基因功能并且不能使蛋白IX表达的任何范围，其例子包括上述PvuII位点(Ad5：452-457)到AlwNI位点(Ad5：4048-4056)的缺失。上述粘粒载体pAxΔpIXcw是一种对应于此范围腺病毒基因组缺失的载体。用限制酶如EcoT22I消化第一代腺病毒载体(如AxCAwt或Axlwl)的基因组DNA获得DNA-TPC，用pAxΔpIXcw和这种DNA-TPC转化上述表达蛋白IX的细胞系，能够获得蛋白IX缺失的目的腺病毒载体。这样构建的蛋白IX缺失的腺病毒载体AxΔpIXcw中未***外源基因如启动子。然而，类似于蛋白IX重新定位的腺病毒载体，***外源基因的蛋白IX缺失的腺病毒载体能够如下获得：使在粘粒载体pAxΔpIXcw的SwaI位点或ClaI位点***外源基因的粘粒载体与用EcoT22I等消化AxΔpIXcw的基因组DNA获得的DNA-TPC重源重组。此外，***外源基因的蛋白IX缺失的腺病毒载体也能如下获得：用EcoT22I消化第一代腺病毒载体(如AxCAwt和Axlwl)的基因组DNA获得的DNA-TPC与在粘粒载体pAxΔpIXcw的SwaI位点或ClaI位点***外源基因的粘粒载体同源重组。
如上所述，以5型腺病毒为例，说明了一种构建蛋白IX重新定位的腺病毒载体和蛋白IX缺失的腺病毒载体的方法。然而，本发明不限于5型腺病毒，适用于含有其它血清型的腺病毒骨架的任何腺病毒载体，包括2型腺病毒。
然后说明了一种含有本发明的重组腺病毒载体作为活性成分的药用组合物，和炎症减轻的一种基因治疗方法。如上所述获得的本发明的重组腺病毒载体是一种十分安全的载体，当对人施用时能够减轻炎症，并且能够作为药用组合物的活性成分用于多种疾病的基因治疗。当本发明的重组腺病毒载体作为药用组合物时，根据所治疗的疾病、靶器官等，能够恰当地选用体内或离体方法。在此使用时，体内方法是将用于基因治疗的药用组合物直接导入患者体内的方法，而离体方法是从患者中取出某些细胞，将上述药用组合物离体导入该细胞中，然后将细胞回输到患者体内的方法。
对于本发明的重组腺病毒载体，不具体限制体内施用途径，可以对患者器官(如肝脏、肺、肾、脑等)静脉内、动脉、皮下、经皮肤或肌内施用。也不具体限制用于体内施用的剂型，例如，当采用注射时，能够用标准方法准备注射。因此，在将本发明的重组腺病毒载体无菌溶解于合适的溶剂(缓冲液，如PBS、生理盐水、无菌水等)中后，可以填充到无菌容器中备用。需要时可以向这种药物制剂中添加常用的载体。
当在离体方法中使用本发明的腺病毒载体时，不具体限制使用的细胞，可以使用用于预期用途的任何细胞，如白细胞，如淋巴细胞，来自患者的不同肿瘤细胞，等等。
本发明的药用组合物用于患者的剂量可以根据所治疗的疾病、患者的年龄和体重等适当确定。通常每次施用约106-1014(PFU)，优选地约108-1012(PFU)本发明的重组腺病毒载体，或者连续几天，或者约一个月一次。
如上所述，当前正进行临床研究的腺病毒载体，已知有肿瘤抑制基因p53表达载体、白介素2表达载体、血管内皮生长因子(VEGF)121表达载体、囊性纤维化跨膜转导调节蛋白(CFTR)表达载体等。本发明的重组腺病毒载体能够代替常规腺病毒载体，作为能够减轻使用常规腺病毒载体引起的炎症的载体。
例如，使用肿瘤抑制基因p53表达载体的临床研究方案等在参考文献中已有描述(Roth J.A.等人，Hum.Gene Ther.7：1013-1030(1996))，因而按照该方案能够进行本发明的基因治疗。
本发明的重组腺病毒载体不仅可以用作人类基因治疗药物，而且可以用作向动物转移基因的载体。该方法可以按照上述人类基因治疗方法进行，如体内和离体方法。
也可参考许多已知的公开文本和以下所述的实施例。本发明的腺病毒载体的特征在于是一种能够减轻炎症的载体，具有甚至在用于动物时仍优于常规腺病毒载体的主要优点，因为在许多用途中，如制备疾病动物模型，人类疾病的治疗模型，基因的功能分析等，不需要考虑载体的副作用，如炎症。
下面将参照实施例更详细地说明本发明，但是应当指出，本发明决不限于这些实施例，可以进行本发明领域常用的改变。除非另外说明，这些实施例中处理噬菌体、质粒、DNA、多种酶、大肠杆菌、培养的细胞等的方法根据《分子克隆：实验室手册》，T.Maniatis等人编写，第二版(1989)，冷泉港实验室”所述的方法进行。
本发明实施例中使用的粘粒载体pAxCAwt(Kanegae Y.等人，Nucleic Acids Res.23：3816-3821(1995))和pAxcw(日本未审查专利文本(Kokai)号8-30858858，第15页，pAdexlcw与pAxcw相同)是含有5型腺病毒基因组中除腺病毒E1和E3基因之外的大部分的载体。此外，pAxCAwt在E1基因缺失位点还导入一个CAG启动子(Niwa H.等人，Gene 108：193-200(1991)，日本专利号2824434)，在该启动子与poly(A)序列之间有一个克隆位点。pAxcw只在E1基因缺失位点***一个ClaI位点和一个SwaI位点。用这些粘粒载体和腺病毒DNA-末端蛋白质复合物转化293细胞(ATCC CRL-1573)和通过同源重组(COS-TPC法)构建重组腺病毒载体的方法根据现有参考文献(Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1320-1324(1996))和专利(日本未审查专利文本(Kokai)号7-298877)进行。此外，除非另外说明，通过超速离心纯化腺病毒载体的方法(Kanegae Y.等人，Jpn.J.Med.Sci.Biol.47：157-166(1994))和应用293细胞通过有限稀释测定病毒效价的方法(日本未审查专利文本(Kokai)号7-298877)也根据现有的方法进行。
实施例1
表达人生长激素的腺病毒载体的构建
(1)人生长激素cDNA的克隆
为了通过PCR方法克隆人生长激素cDNA，进行下列方法。
由商品人垂体腺瘤来源的cDNA文库(CLONTECH)制备噬菌体DNA，用作PCR的模板DNA。设计PCR引物，在两端添加限制酶识别位点，5’端引物含有起始密码子和一个NheI识别位点，3’端引物含有终止密码子和一个SphI识别位点。每条引物的序列如下所示：
5′-端引物    5-TG GCTAGCTCACCTAGCGGCA ATGGCT-3′
                   NheI                 Met
(SEQ ID NO：1)
3′-端引物    5-CAG GCATGCCACCCGGGCAG CTAGAA-3′
                    SphI               终止
(SEQ ID NO：2)
用来源于上述cDNA文库的DNA作为模板，在标准PCR反应中使用聚合酶pfu(Takara Shuzo)，获得含有hGH cDNA的约700bp的扩增片段。用Klenow酶使扩增片段成为平端，***pUC19的HincII位点，获得质粒pUCHGH(3.4kb)。通过对pUCHGH的cDNA部分测序证实该序列与参考文献中所述的序列相同(Chen E.Y.等人，Genomics 4：479-497(1989))。
(2)表达人生长激素的重组腺病毒载体的构建
用NheI和BglI消化pUCHGH，使其成为平端，获得含有hGHcDNA编码区的约0.7kb DNA片段。将该cDNA片段***粘粒载体pAxCAwt的启动子与poly(A)序列之间的SwaI位点，获得粘粒pAx1CAHGH。
为了证实hGH的表达单元已经精确整合到粘粒pAx1CAHGH中，由pAx1CAHGH构建含有hGH的表达单元的质粒，使得在COS7细胞(猴肾来源的细胞系)中瞬时表达hGH蛋白。用NruI消化后使pAx1CAHGH自身连接，获得已经去除腺病毒DNA大部分的表达hGH的质粒Px1CAHGH(含有左端的约0.4kb)。然后通过DEAE-葡聚糖法用Px1CAHGH转染COS7细胞，两天后用ELISA法(PicoiaTMHGH板：Sumitomo Pharmaceuticals)测定条件培养基中hGH的浓度。在未导入质粒的COS7细胞的条件培养基中，hGH浓度低于检测限度，但在Px1CAHGH转化的COS7细胞的条件培养基中检测到1ng/ml或更高的hGH。此结果证实hGH的表达单元已经精确整合到粘粒pAx1CAHGH中。
最后，通过上述COS/TPC法，用粘粒pAx1CAHGH和腺病毒DNA-末端蛋白质复合物转化293细胞，获得表达hGH的重组腺病毒Ax1CAHGH (图1，E1基因和E3基因缺失)。
实施例2
表达hGH的E2A基因缺失的腺病毒载体的构建
(1)用于构建E2A缺失的腺病毒载体的重组腺病毒载体的构建
粘粒载体pAx2LD3LCAwt(日本未审查专利文本(Kokai)号8-308585第19页中的pAdex2LD3LCAwt，与pAx2LD3LCAwt相同)是上述粘粒载体pAxCAwt的衍生物。pAx2LD3LCAwt是在腺病毒L3基因与E2A基因之间(61.5图距单位)和E3基因缺失位点(78.0图距单位)***loxP位点的一种粘粒，loxP***位点之外的核苷酸序列与pAxCAwt相同。
用NheI和BglI消化实施例1中构建的质粒pUCHGH，使其成为平端，获得含有hGH cDNA编码区的约0.7kb DNA片段。该DNA片段***粘粒载体pAx2LD3LCAwt的启动子与poly(A)序列之间的SwaI位点，获得粘粒pAx2LD3LCAHGH。
腺病毒载体Adex2LD3LCANLacZ(图1，日本未审查专利文本(Kokai)号8-308585，第21页)是一种重组腺病毒，其中在与粘粒载体pAx2LD3LCAwt相同的位置***两个loxP位点，它表达大肠杆菌β-半乳糖苷酶。
为了构建Adex2LD3LCANLacZ的***基因由lacZ替换为hGH的重组腺病毒，根据现有方法(日本未审查专利文本(Kokai)号7-298877)进行下列方法。首先，由Adex2LD3LCANLacZ制备腺病毒DNA-末端蛋白质复合物，然后用EcoT221消化。用这种DNA-末端蛋白质复合物和粘粒pAx2LD3LCAHGH转染293细胞，获得含有hGH表达单元和两个loxP位点的重组腺病毒Ax2LD3LCAHGH(图1)。该Ax2LD3LCAHGH与实施例1构建的腺病毒载体Ax1CAHGH在结构上除表达单元之外均相同。
(2)E2A缺失的腺病毒载体的构建
为了构建通过重组酶Cre的作用从腺病毒载体Ax2LD3LCAHGH中删除侧翼为两个loxP位点的E2A基因和L4基因的重组腺病毒(E2A缺失的腺病毒载体)，进行下列方法。
首先，利用超速离心法(同上文)纯化腺病毒载体Ax2LD3LCAHGH和表达重组酶Cre的腺病毒载体AxCANCre(图1，Kanegae Y.等人，Nucleic Acids Res.23：3816-3821(1995))，利用293细胞通过有限稀释法(同上文)测定每种病毒的效价。
然后向胶原蛋白包被的225cm2培养瓶中几乎铺满的293细胞中加入含有3.0×107PFU/ml Ax2LD3LCAHGH(moi＝2)和1.5×107PFU/mlAxCANCre(moi＝1)的4ml培养基(含有5％FCS的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基：DMEM)，在37℃下感染两种病毒1小时。感染后，加入21ml含有5％FCS的DMEM培养基，在5％CO2存在下37℃培养。两天后，用细胞刮棒刮取附着于瓶底的细胞，将含有条件培养基的细胞悬液置于50ml离心管中，在4℃下以2500转/分(1130×g)离心5分钟，弃去上清液后，细胞级分在-80℃下冻存。
(3)E2A缺失的腺病毒载体的纯化
尽管在用上述Ax2LD3LCAHGH和AxCANCre共感染的293细胞中产生表达hGH的E2A缺失的目的腺病毒载体(ΔE2A-CAHGH：28.1kb)，但还存在Ax2LD3LCAHGH(34.4kb)和AxCANCre(34.7kb)，因而这三种病毒存在于一种混合物中(括号中的数字表示每种病毒的基因组大小)。因此，为了根据病毒比重的差异分离ΔE2A-CAHGH，进行以下氯化铯(CsCl)密度梯度超速离心，纯化E2A缺失的腺病毒载体。用于纯化的CsCl溶液均在50mM Hepes缓冲液(pH7.4)中制备，离心和超速离心在4℃下进行。
1)融化冻存于-80℃的含ΔE2A-CAHGH的293细胞级分，悬浮于25ml 50mM Hepes缓冲液(pH7.4)中，细胞来自8个225cm2摇瓶。然后将细胞悬液置于200ml超声杯中，用密闭型超声仪(Cosmo Bio生产，UCD-200T型)超声处理(200W，3分钟(30秒×6次)，4℃)。将细胞匀浆转移到30ml离心管中，以10000转/分(11850×g)离心10分钟。对离心后的上清液进行三步超速离心。
2)为了浓缩细胞匀浆中的腺病毒，8ml比重为1.43的CsCl溶液置于用于Beckman转头SW28的超速离心管中，使上述1)制备的约25ml上清液在其上分层，以23000转/分(95400×g)超速离心约1.5小时。离心后，回收水相与CsCl相界面周围的含腺病毒的带(每管约2.5ml)，加入与回收的病毒溶液等量的饱和CsCl溶液。
3)在用于Beckman转头SW41的超速离心管中，下列溶液从底部连续分层。上述2)中制备的病毒溶液(约5ml)/比重为1.32的CsCl溶液(4.5ml)/比重为1.25的CsCl溶液(2.5ml)。以35000转/分(210000×g)超速离心3小时。通过超速离心，蛋白质在比重为1.25和1.32的CsCl溶液界面周围形成一条宽带，病毒在比重为1.32的CsCl溶液中部周围形成一条锐带，回收病毒带(每管约1.5ml)，加入与回收的病毒溶液等量的比重为1.36的CsCl溶液。
4)向用于SW41的超速离心管中加入3)中制备的约2ml病毒溶液和10ml比重为1.34的CsCl溶液，充分混合，以30000转/分(154000×g)超速离心约19小时。通过超速离心，根据每种病毒的比重，病毒带均被分离。由于Ax2LD3LCAHGH(34.4kb)和AxCANCre(34.7kb)有几乎相同的基因组大小，其比重几乎相等，超速离心后的病毒带重叠，而ΔE2A-CAHGH(28.1kb)比重小于这些病毒，通过超速离心在管的上部形成一条带。用注射器针头在超速离心管侧面穿一个洞，回收ΔE2A-CAHGH带。
5)最后，为了从病毒溶液中除去CsCl，使回收的病毒溶液对含有10％甘油的PBS(-)透析，获得最终纯化的ΔE2A-CAHGH产物。透析后的病毒等分后冻存于-80℃。
(4)E2A缺失的腺病毒载体的感染效价和纯度的测定
1)感染效价的测定
由于E2A缺失的腺病毒载体在293细胞中不能复制，所以不能象第一代腺病毒载体(E1基因缺失)那样，利用在293细胞中的复制作为指标，用标准方法测定其效价。于是，以报道基因产物hGH的量作为指标，比较效价已知的表达hGH的第一代腺病毒载体Ax1CAHGH与ΔE2A-CAHGH的hGH产量，测定ΔE2A-CAHGH的相对效价(感染效价)。
将要检测的腺病毒载体用含有2％FCS的DMEM培养基连续稀释，然后将50μl加入在96孔微孔板中培养的A549细胞(人肺癌来源的细胞系)中，37℃感染1小时。然后除去病毒溶液，细胞用培养基洗涤一次，加入100μl含2％FCS的DMEM培养基，培养2天。培养完成后，利用ELISA法(PicoiaTM HGH板：Sumitomo Pharmaceuticals)测定条件培养基中的hGH量。
首先，用第一代腺病毒载体Ax1CAHGH进行预检测，发现病毒感染期间在moi＝0.01-1的范围内，添加的病毒量与hGH产量相关，证实hGH的产量反映添加的病毒量。
因此，用效价已知的Ax1CAHGH(B批，效价3.0×1010PFU/ml)作为对照病毒，测定ΔE2A-CAHGH(第3批)的感染效价。感染中每种病毒的稀释比为30000、90000和270000倍，比较两天后hGH的产量。在任一稀释比，Ax1CAHGH(B批)的hGH产量都高于ΔE2A-CAHGH(第3批)，平均约1.1倍。因此，ΔE2A-CAHGH(第3批)的效价计算为3.0×1010PFU/ml×1/1.1＝2.7×1010PFU/ml(等价)。
根据该值计算ΔE2A-CAHGH(第3批)的总产量，来自48个225cm2摇瓶的293细胞产生4.7×1010PFU(等价)的病毒。而且，根据纯化病毒的260nm吸光度测定，ΔE2A-CAHGH的颗粒与噬斑形成单位(PFU)之比为63。
对另一批ΔE2A-CAHGH进行类似的测定，发现来自20个225cm2摇瓶的293细胞的ΔE2A-CAHGH(第2批)总产量为1.9×1010PFU(等价)病毒，颗粒与噬斑形成单位(PFU)之比为47。
2)纯度的测定
尽管E2A缺失的腺病毒载体通过超速离心纯化，但仍有纯化不能除去的第一代腺病毒载体(Ax2LD3LCAHGH和AxCANCre)的轻微污染。由于污染的第一代腺病毒载体能在293细胞中复制，利用293细胞通过标准方法(有限稀释法)测定的效价反映了污染的第一代腺病毒载体的量。因此，为了测定ΔE2A-CAHGH(第3批)的纯度，利用293细胞通过有限稀释法测定效价。ΔE2A-CAHGH(第3批)的效价是7.8×108PFU/ml，Ax1CAHGH(B批)的效价为4.4×1010PFU/ml，比例为1.8％。由于根据1)的结果，Ax1CAHGH(B批)的感染效价是ΔE2A-CAHGH(第3批)的1.1倍，修正该值，ΔE2A-CAHGH(第3批)的纯度计算为(1-0.018×1.1)×100＝98％。
通过类似的测定，另一批(第2批)ΔE2A-CAHGH的纯度为97％。
(5)E2A缺失的腺病毒载体的腺病毒蛋白表达降低的证实
对于用E2A缺失的腺病毒载体感染的细胞，用荧光抗体法测定E2A基因编码的DBP(单链DNA结合蛋白)和六邻体(腺病毒颗粒的一种主要结构蛋白)的表达是否降低。
向胶原蛋白包被的8孔培养片(Becton Dickinson，#40630)中培养的铺满的A549细胞中，加入100μl含ΔE2A-CAHGH或Ax1CAHGH的病毒溶液，这两种载体用含5％FCS的DMEM培养基稀释为moi＝100或10，在37℃下感染1小时。感染后，弃去病毒溶液，加入0.3ml含5％FCS的DMEM培养基，培养两天。两天后，弃去条件培养基，用PBS(-)洗涤细胞，加入0.4ml 2％低聚甲醛/PBS(-)，细胞在室温下固定10分钟，用PBS(-)洗涤两次。另外，用1mg/ml皂苷进行膜通透性处理(室温，30分钟)，之后对细胞进行DBP或六邻体检测。
为了检测DBP，在用10％正常山羊血清封闭载玻片后，兔抗-DBP肽(RPPTMEDVSSPSPSPPPPRAPPKKR；对应于DBP位点22-46的氨基酸残基)抗体和FITC-标记的山羊抗-兔抗体(JACKSON，#111-096-003)连续反应，用DAPI(4’，6-二氨基-2-苯基-吲哚)溶液进行核染色，在落射光荧光显微镜(Olympus BX-50)下检查。
为了检测六邻体，在用10％正常山羊血清封闭载玻片后，山羊抗-六邻体抗体(CHEMICON，AB-1056)和FITC-标记的兔抗-山羊抗体(Vector Laboratories，FI-5000)连续反应，用DAPI进行核染色，在落射光荧光显微镜下检查。
在ΔE2A-CAHGH感染的细胞中，DBP和六邻体的表达水平明显降低，用ΔE2A-CAHGH以moi＝100感染的细胞中DBP阳性和六邻体阳性细胞之比与用Ax1CAHGH以moi＝10感染的细胞几乎相同。因此，如开始时预期的那样，证实ΔE2A-CAHGH中腺病毒基因的表达降低。
实施例3
E2A缺失的腺病毒载体的炎症诱发作用的研究
为了确定腺病毒E2A基因的缺失是否导致炎症诱发作用降低，对小鼠注射表达hGH的E2A缺失的腺病毒载体(ΔE2A-CAHGH)或表达hGH的第一代腺病毒载体(Ax1CAHGH)，以血清GPT水平(谷丙转氨酶)为指标，比较两种腺病毒载体诱发炎症的作用。方法与结果如下所示。
(1)方法
使用的小鼠是C57BL/6小鼠(7周龄，雌性)。使用的腺病毒载体是ΔE2A-CAHGH(第3批)或Ax1CAHGH(C批)。腺病毒载体的剂量为1×109PFU、3×108PFU或1×108PFU(每组5只动物)，盐水稀释的腺病毒载体以每只小鼠0.2ml的量通过尾静脉施用。腺病毒载体施用3天前和3、5、7、10、14、21、28、35、42、49、56、63天后，用肝素化的血球压积管从***麻醉的动物的眼窝静脉部分采血。血液以10000转/分离心5分钟分离血清，贮存于-20℃直到使用。用转氨酶CII-试验Wako(Wako Pure Chemicals)通过POP-TOOS法测定血清GPT水平。
(2)结果
对C57BL/6小鼠施用腺病毒载体后以固定间隔测定的血清GPT水平的平均值示于图2中。为了证实每个处理组中载体的施用效率，也在腺病毒载体施用3天后和5天后测定血清hGH水平。在用相同剂量的腺病毒载体处理的组中，Ax1CAHGH处理组与ΔE2A-CAHGH处理组的血清hGH水平没有显著差异，证实这两种载体以相同的效率施用。
然后测定了血清GPT水平。对于ΔE2A-CAHGH处理的小鼠，血清GPT水平随腺病毒载体剂量升高而升高，与用第一代腺病毒载体处理的小鼠没有差异。此结果表明，腺病毒E2A基因的缺失不会导致减轻炎症诱发作用。
实施例4
紫外线灭活的腺病毒颗粒的制备
为了阐明对小鼠施用腺病毒载体时发生的炎症是否由腺病毒载体本身引起，用下列方法制备紫外线灭活的腺病毒颗粒。
向通过实施例2-(2)所述方法纯化的1.8ml表达hGH的腺病毒载体Ax1CAHGH(3.0×1010PFU/ml，1.4×1012颗粒/ml)中加入18μl33mg/ml 8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)(8-MOP的终浓度为330μg/ml)，然后按0.6ml等分到三个直径35mm的组织培养皿(Sumitomo Bakelite，目录号MS-10350)中。将培养皿置于冰上，置于配备有波长365nm的紫外灯(8瓦，5只灯)的紫外交联仪(1800型StratalinkerTM紫外交联仪，STRATAGENE)的紫外灯下5cm，使盖保持关闭。紫外线照射1小时(紫外线强度约为1.8kW)，每10分钟改变一次培养皿的位置。紫外线照射后，从培养皿中回收病毒溶液，为了除去8-MOP，对含10％甘油的PBS(-)透析过夜。最后，回收颗粒浓度为1.1×1012颗粒/ml的约1.7ml病毒溶液，贮存于-80℃。
通过上述处理灭活腺病毒载体用两种测定hGH产量和测定效价的方法证实。hGH产量的测定用以上实施例2-(4)所述的方法进行，不同之处在于在腺病毒载体感染1天后测定hGH的浓度。在紫外线灭活前用1×105颗粒/ml的腺病毒载体Ax1CAHGH感染的细胞的hGH产量约为0.2ng/ml，用1×1010颗粒/ml感染的细胞的产量约为28μg/ml。另一方面，对于上述灭活的腺病毒载体，在用1×1010颗粒/ml感染时，hGH的产量为0.4ng/ml。因而根据计算hGH的产量，证实灭活使腺病毒载体的感染力下降为1/105。效价测定也通过使用293细胞的标准方法进行。灭活前病毒的效价约为3×1010PFU/ml，而灭活后的效价低于2×103PFU/ml，因而病毒的效价下降为1/107或更低。
上述结果证实，本发明的接受紫外线照射处理的病毒(紫外线照射的腺病毒颗粒)被完全灭活。
实施例5
关于第一代腺病毒载体施用后炎症起因的研究
实施例3显示，甚至在对小鼠施用E2A缺失的腺病毒载体时，处理小鼠的血清GPT水平与用第一代腺病毒载体(Ax1CAHGH)处理的小鼠相比仍不降低。对于此结果的解释，考虑以下四种可能性：1)E2A基因的表达与炎症无关，2)作为报道分子的hGH蛋白是细胞介导的免疫的抗原，从而引起炎症，3)由外源启动子(CAG启动子)诱导表达的病毒基因产物作为细胞介导的免疫的抗原，4)不是在感染动物中从头合成的病毒蛋白，而是在病毒感染过程中进入细胞的病毒颗粒组成型蛋白，作为细胞介导的免疫的抗原。
于是，对小鼠施用不同结构的腺病毒，通过测定血清GPT水平作为指标，研究第一代腺病毒载体施用后炎症的起因。所用的腺病毒载体、实验方法和结果如下所示。
(1)腺病毒载体
使用的腺病毒载体如下所示。均为第一代腺病毒载体。
—表达hGH的腺病毒载体：Ax1CAHGH
—只***CAG启动子而不含hGH cDNA的腺病毒载体：AxCAwt(图1：也***poly(A)序列)(Kanegae Y.等人，Nucleic AcidsRes.23：3816-3821(1995))
—无外源基因(如启动子)***的腺病毒载体(只***限制酶SwaI位点)：Axlwl(图1：Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1320-1324(1996)，在该参考文献中描述为Adexlw)
—通过紫外线照射Ax1CAHGH灭活的病毒：紫外线灭活的颗粒(见实施例4)
该方法与实施例3所示基本相同。以下只描述了不同之处。
载体的剂量为1×109PFU、3×108PFU、1×109PFU或3×107PFU(每组5只动物)。由于不能根据PFU确定紫外线灭活的腺病毒颗粒的剂量，它们以颗粒数相同的量施用。
施用前3天及施用后第3、5、7、10(或11)、14、21、28天采血。
(3)结果
实验分开进行两轮。第一轮，比较Ax1CAHGH和AxCAwt(图3，上面的柱图)。第二轮，比较Ax1CAHGH、Axlwl和紫外线灭活的腺病毒颗粒(图3，下面的柱图)。在这两轮中，只施用用于稀释载体的盐水的组作为阴性对照。在图3中，盐水处理组的数据只来自第一轮，但在第二轮获得类似的结果。
在CAG启动子控制下表达hGH的腺病毒载体(Ax1CAHGH)处理组，和只含CAG启动子的腺病毒载体(AxCAwt)处理组，它们在血清GPT水平升高程度上有极小的差异。因此证明，报道基因hGH的表达与炎症无关。另一方面，未***外源基因的腺病毒载体(Axlwl)处理组，和紫外线照射的腺病毒颗粒处理组，血清GPT水平不升高。由于AxCAwt与Axlwl的结构差异只是存在或不存在CAG启动子和poly(A)序列，说明血清GPT水平升高的原因，即炎症的原因，是CAG启动子。
实施例6
由CAG启动子诱导表达的腺病毒基因的鉴定
对于第一代腺病毒载体，为了鉴定由CAG启动子诱导表达从而引发炎症的腺病毒基因，用以下所示的不同腺病毒载体感染第一代腺病毒载体在其中不能复制的细胞系(A549细胞或HepG2细胞)，并通过Northern印迹法分析表达的腺病毒基因。用于该研究的腺病毒载体是含CAG启动子的第一代腺病毒载体(Ax1CAHGH、AxCAwt)，不含外源启动子的第一代腺病毒载体(Axlwl)，和含CAG启动子的E2A缺失的腺病毒载体(ΔE2A-CAHGH)。在此使用时，目的腺病毒基因，即CAG启动子诱导其表达的基因，是在三种载体(Ax1CAHGH、AxCAwt、ΔE2A-CAHGH)感染的细胞中相同程度地表达，但在Axlwl感染的细胞中极少表达的腺病毒基因。方法与结果如下所示。
(1)方法
在25cm2培养瓶中几乎铺满的(约5×106个细胞)A549细胞(人肺癌来源的细胞系)或HepG2细胞(人肝癌来源的细胞系)用以含5％FCS的DMEM培养基稀释的各0.3ml腺病毒载体感染1小时(moi＝100)。感染后，弃去病毒溶液，加入5ml含5％FCS的DMEM培养基，细胞培养24小时。24小时后，弃去条件培养基，细胞用PBS(-)洗涤两次，然后用ISOGEN(Nippongene)洗涤，按照使用说明由每种病毒感染的细胞制备RNA。
用于Northern印迹分析的探针如下获得：以粘粒载体pAxcw(同上文)为模板，利用BcaBESTTM标记试剂盒(Takara Shuzo)以[α-32P]dCTP标记PCR扩增的DNA。用于PCR的引物序列如下所示(括号中的数值表示5型腺病毒的碱基数和序列数)
L1：5′-引物5′ACTGCGGCTAATGGTGACTGAGACA-3′(12，818-12，842/序列3)
3′-引物5′CGGCCGCGCGATGCAAGTAGTCCAT-3′(13，440-13，416/序列4)
L2：5′-引物5′AGCGGCGCGGAAGAGAACTCCAACG-3′(15，098-15，122/序列5)
3′-引物5′ATGCCCAGGGCCTTGTAAACGTAGG-3′(15，834-15，810/序列6)
L3：5′-引物5′GGGCTCCAGTGAGCAGGAACTGAAA-3′(21，735-21，759/序列7)
3′-引物5′-CTGCGCACTGTGGCTGCGGAAGTAG-3′(22，305-22，281/序列8)
L5：5′-引物5′-GACCCCTCACAGTGTCAGAAGGAAA-3′(31，484-31，508/序列9)
3′-引物5′-GCCAAACAGCCTTTAACAGCCAAAA-3′(32，378-32，354/序列10)
pIx：5′-引物5′-ATGAGCACCAACTCGTTTGATG-3′(3，609-3，630/序列11)
3′-引物5′-TGTTTTAAACCGCATTGGGAGGGGA-3′(4，035-4，011/序列12)
Iva2：5′-引物5′-AAGAACTTGGAGACGCCCTTGTGA-3′(4，554-4，577/序列13)
3′-引物5′-TGTGGGACCGCCTGGAACTGCTTG-3′(5，181-5，158/序列14)
E4：5′-引物5′-GGCAGTGGTCTCCTCAGCGA-3′(33，301-33，320/序列15)
3′-引物5′-TGAGGAAGTGTATGCACGTG-3′(33，800-33，781/序列16)
E2A：5′-引物5′-TGCTCAGGGCGAACGGAGTCAACTTTGGTA-3′(22，769-22，798/序列17)
3′-引物5′-GTATGCGGACGCAAGAGGAAGAGGAAGAGC-3′(23，584-23，555/序列18)
各5μgRNA进行1％琼脂糖凝胶电泳后，用毛细管转移法在尼龙滤纸(Hybond-N+，Amersham)上印迹，然后进行紫外线交联。用0.02％亚甲基蓝溶液使滤纸染色，证实28S和18S RNA的位置，加入50ml缓冲液A(0.5M Na2HPO4(pH7.2)7％SDS/1mM EDTA)，在65℃下预杂交2小时。然后向滤纸添加含有12.5ng 32P-标记探针的50ml缓冲液A，在65℃下杂交过夜。此外，还加入200ml缓冲液B(40mMNa2HPO4(pH7.2)/1％SDS)，在65℃下洗涤滤纸两次后，进行放射自显影。
(3)结果
Northern印迹结果示于图4A-C中，结果概述示于表1中。对于A549细胞，由腺病毒主要晚期启动子(MLP)控制的主要晚期基因(如含六邻体的L3基因)在Axlwl感染的细胞中的表达比在AxCAwt感染的细胞中明显降低，在ΔE2A-CAHGH感染的细胞中类似地降低(图4A)。此外，对于HepG2细胞，L3基因的表达只在ΔE2A-CAHGH感染的细胞中降低。尽管数据未显示，但其它主要晚期基因(如L2基因和L5基因)的结果类似于L3基因，对于这些晚期基因，没有注意到CAG启动子对表达的诱导。
尽管在ΔE2A-CAHGH感染的细胞中，E2A基因的表达自然降低，但是在Axlwl感染的细胞和AxCAwt感染的细胞中，E2A基因的表达没有差异，在这两种病毒感染的细胞中E2A基因以相似的水平表达。E4基因的表达在所有载体感染的细胞中都没有差异，E4基因在所有病毒感染的细胞中均以相似的水平表达(数据未显示)。因此证明，E2A基因的表达和E4基因的表达都不是由CAG启动子诱导的。
对于HepG2细胞，IVa2基因(是一种不受MLP控制的晚早期基因)的表达在Axlwl感染的细胞中和在AxCAwt感染的细胞中没有差异，在两种细胞中均程度相似地表达。另一方面，对于A549细胞，IVa2基因的表达只在Axlwl感染的细胞中降低(图4B)。
L1基因(受MLP控制的晚期基因之一)的表达也类似于IVa2基因，在HepG2细胞和A549细胞中结果不同(见表1)。
另一方面，蛋白IX基因(下文称为pIX基因，如IVa2基因一样，是一种不受MLP控制的晚早期基因)的表达在A549细胞和HepG2细胞中得到类似的结果。因此，pIX基因的表达在ΔE2A-CAHGH感染的细胞中不降低，只是在Axlwl感染的细胞中，表达明显降低(图4C)。
根据上述结果，在A549细胞中和HepG2细胞中显示与血清GPT水平改变类似的表达模式，即在AxCAwt-、Ax1CAHGH-和ΔE2A-CAHGH-感染的细胞中的表达几乎相同，而只在Axlwl感染的细胞中表达降低的基因，是pIX基因。这表明，由CAG启动子诱导表达并引发炎症的基因是pIX基因。
表1 Northern印迹结果
  基因   细胞系   Axlwl   AxCAwt   Ax1CAHGH   ΔE2A-CAHGH
  L1   A549HepG2   -+   ++   ++   +/--
  L2   A549HepG2   -+   ++   ++   --
  L3   A549HepG2   -+   ++   ++   --
L5 A549HepG2   -+   ++   ++   --
  E2A   A549HepG2   ++   ++   ++   --
  E4   A549HepG2   ++   ++   ++   ++
IVa2 A549HepG2 -+   ++   ++   ++
  pIX   A549HepG2   ++   ++   ++
  血清GPT水平的改变
实施例7
CMV启动子诱导pIX基因表达的证实
研究了pIX基因的表达是否由CMV启动子以类似于CAG启动子的方式诱导。用重组腺病毒AdCMVlacZ(Osada S.等人，Kidney Int.55：1234-1240(1999))作为一种***CMV启动子的重组腺病毒，其中在5型腺病毒的E1基因缺失位点以朝右的方向***一个CMV启动子和大肠杆菌lacZ基因。用实施例6所示的AxCAwt作为***一个CAG启动子的对照病毒。
以类似于实施例6所述的方法用AdCMVlacZ或AxCAwt感染A549细胞，24小时后回收RNA。然而，对于AdCMVlacZ，感染的moi为6或2，对于AxCAwt，moi为300或100。Northern印迹分析用实施例6所示的pIX探针进行。
结果示于图5中。在用AdCMVlacZ以moi＝6感染的细胞中，pIX基因以等于或高于用AxCAwt以moi＝100感染的细胞的水平表达。由于两种病毒感染时的moi不同，启动子的***方向不同，启动子距pIX基因的距离不同，所以CAG启动子和CMV启动子诱导pIX基因表达的强度无法比较。然而，在***CMV启动子的AdCMVlacZ感染的细胞中，pIX基因以较低的moi表达，因此揭示，pIX基因的表达也能由CMV启动子诱导。
实施例8
关于SRα启动子和EF-1α启动子是否诱导pIX基因表达的研究
研究了不含CMV启动子的外源启动子是否诱导pIX基因的表达。用于该研究的启动子是SRα启动子(Takebe Y.等人，Mol.Cell Biol.8：466-472(1988))和EF-1α启动子(Kim D.W.等人，Gene 91：217-223(1990))，和以朝左的方向***每种启动子和大肠杆菌lacZ基因的腺病毒载体(AxSRlacZ-L和AxEFlacZ-L)。用只***CAG启动子的腺病毒载体AxCAwt(见实施例5)和以朝左的方向***CAG启动子和大肠杆菌lacZ基因的腺病毒载体(AxCAlacZ-L)作为阳性对照。Saito等人(日本未审查专利文本(Kokai)号7-298877)公开了构建AxSRlacZ-L、AxEFlacZ-L和AxCAlacZ-L的方法，其中Adex1SRlacZ-L与AxSRlacZ-L，Adex1EFlacZ-L与AxEFlacZ-L，Adex1CAlacZ-L与AxCAlacZ-L分别相同。用未***外源启动子的腺病毒载体Axlwl(见实施例5)作为阴性对照。此外，再次研究了实施例7使用的含CMV启动子的腺病毒载体(AdCMVlacZ)。
用上述六种腺病毒载体(AxSRlacZ-L、AxEFlacZ-L、AxCAlacZ-L、AdCMVlacZ、AxCAwt、Axlwl)以moi＝30或100感染A549细胞，24小时后回收RNA，用pIX探针进行Northern印迹分析(方法详见实施例6)。
结果示于图6中。在用含CMV启动子的腺病毒载体(AdCMVlacZ)感染的细胞中，pIX基因确实表达，其表达量等于或高于用含CAG启动子的腺病毒载体(AxCAlacZ-L和AxCAwt)感染的细胞，用作阳性对照。
另一方面，在含EF-1α启动子的腺病毒载体(AxEFlacZ-L)感染的细胞中，根本未观察到pIX基因的表达。在含SRα启动子的腺病毒载体(AxSRlacZ-L)感染的细胞中，观察到pIX基因的表达。
上述结果证明，外源启动子引起的pIX基因的表达与启动子的特异性有关，存在根本不诱导pIX基因表达的外源启动子，如EF-1α启动子。此外也证明，诱导pIX基因表达的主要是CMV IE增强子，因为CAG启动子与CMV启动子的共同部分只是CMV IE增强子。
实施例9
关于含不同启动子的腺病毒载体诱发炎症能力的研究
为了证明外源启动子对pIX基因表达的诱导与对动物施用腺病毒载体时发生的炎症有关，对C57BL/6小鼠施用了实施例8使用的腺病毒载体中的4种载体(AxEFlacZ-L、AxCAlacZ-L、AdCMVlacZ和Axlwl)，并以血清GPT水平作为指标比较了炎症的程度。
腺病毒以1×109PFU(除了AdCMVlacZ之外)、3×108PFU和1×108PFU通过尾静脉施用(每组5只动物)，施用3天前和3、5、7、10、14、21、28、35天后采血，测定GPT水平。每种方法的细节按照实施例3所述的方法进行。
结果显示于图7中。在含CMV启动子的AdCMVlacZ处理的小鼠中，血清GPT水平升高超过含CAG启动子的AxCAlacZ-L处理的小鼠，炎症程度与实施例8所示的pIX基因表达量相关。另一方面，在含EF-1α启动子的AxEFlacZ-L处理的小鼠中，血清GPT水平几乎没有升高，与不含外源启动子的Axlwl处理的小鼠水平相同。
上述结果证明，pIX基因的表达与体内施用后的炎症直接相关，即不能诱导pIX基因表达的含有一种启动子的腺病毒载体也不能诱发炎症，外源启动子诱导pIX基因表达是炎症的原因。
实施例10
抗-pIX抗体的制备和蛋白IX的检测
(1)蛋白IX(pIX)基因的克隆
为了通过PCR方法克隆5型人类腺病毒(Ad5)pIX基因的编码区，进行下列方法。用上述粘粒载体pAxCw作为模板，用具有下列序列的引物进行PCR反应。设计5’-引物使之包含Ad5位点3585-3605的核苷酸序列和一个EcoRI识别位点，设计3’-引物使之包含Ad5位点4034-4015的碱基序列和一个XhoI识别位点。
5′-端引物
5’TA GAATTCTGTTTTGCAGCAGCCGCCGCC-3’(SEQ ID NO：19)
      EcoRI
3′-端引物
5′TA CTCGAGGTT TTAAACCGCATTGGGAG-3’(SEQ ID No.20)
      XhoI       终止
用Pfx DNA聚合酶(GIBCO BRL)进行PCR反应，扩增含有pIX基因编码区的470bp DNA片段。市售质粒载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen)在CMV启动子下游含有一个多克隆位点。用EcoRI和XhoI共消化PCR扩增的470bp DNA片段，然后***pcDNA3.1(+)多克隆位点的EcoRI位点与XhoI位点之间，获得一种表达pIX的质粒pCMV-IX(5.9kb)。通过对该pCMV-IX的含pIX基因编码区的部分测序，证实其序列与现有序列(GenBank：保藏号M73260)相同。
(2)pIX-融合蛋白的制备
制备pIX与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白，作为用来获得抗-pIX抗体的抗原。
1)pIX-融合蛋白的表达质粒的构建
用EcoRI和XhoI共消化质粒pCMV-IX，获得含有pIX基因的470kb DNA片段。构建用来在大肠杆菌中表达GST-融合蛋白的市售质粒载体pGEX-5X-1(Amersham Pharmacia Biotech)在GST的C端含有一个多克隆位点。于是，将由pCMV-IX获得的470bp DNA片段***pGEX-5X-1多克隆位点的EcoRI位点与XhoI位点之间，获得表达GST-pIX的质粒pGST-IX(5.4kb)。
2)pIX-融合蛋白的制备
用质粒pGST-IX转化大肠杆菌JM109株。由于转化子表达的GST-pIX是可溶的，所以按照用于包涵体蛋白质的纯化方法纯化GST-pIX。首先，在40ml LB培养基中37℃过夜培养转化的大肠杆菌，之后加入800ml LB培养基，再培养1小时。加入IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)(终浓度为0.2mM)培养6小时后，收集细胞。细胞用PBS洗涤，悬浮于20ml含有溶菌酶(1mg/ml)的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.0)/1mM EDTA/100mM NaCl)中，室温温育20分钟，然后加入1ml含10％去氧胆酸钠的裂解缓冲液裂解细胞。然后向裂解液中加入100μl 1M MgCl2溶液、100μl 1M MnCl2溶液和20μl DNase I溶液(70U/μl)，在37℃下温育15分钟，之后离心(11850×g)15分钟。离心后，弃去上清液，沉淀用20ml含0.5％Triton X-100/10mM EDTA的裂解缓冲液洗涤两次，然后将沉淀悬浮于1ml PBS中。溶液中加入等量的6M尿素，室温温育1小时，之后离心(11850×g)15分钟。离心后，弃去上清液，沉淀悬浮于2ml PBS中。溶液中加入6ml 8M盐酸胍(终浓度为6M)，离心(11850×g)15分钟后，回收上清液。用该上清液作为纯化的GST-pIX，制备抗-pIX抗体。
(3)抗-pIX抗体的制备
用含有6M盐酸胍的纯化GST-pIX免疫兔(日本白兔)。
免疫和采血参见Asahi Techno Glass Corporation。用0.2-0.4mg抗原(GST-pIX)免疫两只兔子，每两周5次。第四次免疫一周后，部分采血，用ELISA法证实抗GST-pIX抗体的效价充分提高，第五次免疫一周后，采集全血获得抗血清(#1和#2)。
然后通过Western印迹分析证实，该抗血清可与pIX反应。用下列两种样品作为含有pIX的阳性对照。一种是用来源于5型腺病毒野生株(Ad5-Dix：Saito I.等人，J.Virol.54：711-719(1985))的病毒以moi＝10感染A549细胞约一天后回收的细胞，其中只有E3基因缺失，另一种是纯化的腺病毒颗粒。用未用腺病毒感染的A549细胞作为阴性对照。
每种样品都在还原条件下进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后印迹到硝酸纤维素膜(Hybond ECL，AmershamPharmacia Biotech)上。该膜用5％脱脂奶封闭，加入1000倍稀释的抗血清或免疫前血清，在4℃下温育过夜。洗涤该膜后，加入辣根过氧化物酶偶联的F(ab’)2片段猴抗-兔Ig抗体(Amersham PharmaciaBiotech，目录号NA9340)，室温温育1小时。另外，在洗涤该膜后，加入化学发光检测试剂(ECL Plus检测试剂，Amersham PharmaciaBiotech)，使该膜暴露于X-射线胶片。
在两种抗血清中，例如，抗血清#1的结果显示于图8中。当使用免疫后的抗血清时，在加样Ad5-dIX感染的细胞和纯化病毒颗粒的道中清楚地检测到对应于pIX的分子量的约14kDa带，而在加样未用病毒感染的A549细胞的道中未检测到这条带。另外，当使用免疫前血清时，在任何道中根本未检测到这条14kDa带。#2抗血清获得类似的结果，数据未显示。上述结果证实，用这些抗血清检测到的14kDa带来源于pIX。因此，在下列实验中用这些抗血清作为抗-pIX抗体。
(4)由CAG启动子诱导表达的pIX的检测
在实施例6-8中，通过Northern印迹分析证明CAG启动子诱导pIX RNA的表达。因此，通过Western印迹分析研究了pIX的表达是否不仅能在RNA水平上诱导，而且能在蛋白质水平上诱导。
用只***CAG启动子的腺病毒载体AxCAwt(见实施例5)或无外源启动子***的腺病毒载体Axlwl(见实施例5)以moi＝100感染A549细胞，一天后收集细胞。用Ad5-dIX以moi＝10感染并在一天后回收的A549细胞作为阳性对照。在类似于上述(3)所述的方法中，进行Western印迹分析以用抗-pIX抗体(#1)检测pIX。如图9所示，在AxCAwt感染的细胞以及Ad5-dIX感染的细胞中检测到14kDa的pIX。另一方面，在Axlwl感染的细胞中根本未观察到这条14kDa带。这证实，CAG启动子也在蛋白质水平上诱导pIX的表达。
实施例11
pIX重新定位的腺病毒载体的构建
pIX重新定位的腺病毒载体通过下列步骤(1)-(3)构建：
(1)在E4基因上游区与3’端ITR之间***pIX基因的重组腺病毒载体(Ax4pIX)的构建
为了克隆包含5型人类腺病毒(Ad5)全长pIX基因的区域，进行下列方法。用含有5型腺病毒基因组除E1基因和E3基因外的大部分的粘粒载体pAxcw(同上文)作为模板，用下列引物进行PCR反应。向每条引物中添加限制酶识别位点。
5′-端引物
5′-CCT GAATTC  GTACTGAAATGTGTGGGCGTGGCTTA-3′
        EcoRI    RsaI
                     (SEQ ID NO：21)(Ad5：3513-3536)
3′-端引物
5′-CCT GGATCC  GTAC  ATTAATTGCTTGATCCAAATCCAAACAG-3′
        BamHI    RsaI   AseI
                     (SEQ ID No.22)(Ad5：4076-4054)
用EcoRI和BamHI共消化含有PCR扩增的pIX基因的约0.6kbDNA片段，然后***市售质粒pUC19多克隆位点的EcoRI位点与BamHI位点之间，获得质粒pUCfpIX(3.3kb)。通过对该pUCfpIX含pIX基因的***部分测序，证实其序列与现有序列(GenBank：保藏号M73260)相同。
然后，为了构建在E4基因上游区与3’端ITR之间***pIX基因的粘粒载体，进行下列方法。粘粒载体pAx4w是一种含有5型腺病毒基因组的2.6-98.0m.u.(E3基因缺失)和2型腺病毒基因组的98.0-100m.u.的载体，在E4基因启动子上游区与3’端ITR之间(99.3m.u.)含有一个克隆位点，限制酶SwaI位点(Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1320-1324(1996)，在该参考文献中pAx4w称为pAdex4w)。用RsaI消化质粒pUCfpIX，获得含有pIX基因的约0.6kbDNA片段。将该0.6kb DNA片段***粘粒载体pAx4w的SwaI位点，获得粘粒pAx4pIXL和pAx4pIXR。在pAx4pIXL中pIX基因以朝左的方向***，在pAx4pIXR中pIX基因以朝右的方向***。
最后，为了构建在E4基因上游区与3’端ITR之间***pIX基因的重组腺病毒，进行下列方法。重组腺病毒载体Adex4SRlaczL(见Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1320-1324(1996)和图10)是一种复制缺陷型腺病毒载体，它来源于5型腺病毒(E1A基因和E3基因缺失)，在99.3m.u.位点以朝左的方向***大肠杆菌lacZ基因的表达单元。由Adex4SRlaczL制备腺病毒DNA-末端蛋白复合物(DNA-TPC)，然后用限制酶AseI和EcoRI共消化该DNA-TPC。由于在Adex4SRlaczL的基因组DNA中，在含有lacZ基因表达单元的右半段基因组中含有几个AseI和EcoRI位点，用这两种酶消化Adex4SRlaczL的DNA-TPC产生基因组右半段已经被消化的DNA-TPC。用这种限制酶消化的DNA-TPC和粘粒pAx4pIXL或pAx4pIXR转化293细胞。通过用限制酶BspEI和PmlI消化产生的重组腺病毒的基因组DNA，鉴定目的病毒克隆，并获得重组腺病毒pAx4pIXL或pAx4pIXR(图10)，其中Adex4SRlaczL的大肠杆菌lacZ基因的表达单元被替换为pIX基因。pAx4pIXL和pAx4pIXR是在两个位点(pIX基因的原始位点(9.7-11.2m.u.)和E4基因上游区与3’端ITR之间)处含有pIX基因的重组腺病毒。pAx4pIXL与pAx4pIXR的结构差异只是E4基因与ITR之间的pIX基因***方向，pAx4pIXL是pIX基因以朝左的方向***的重组腺病毒，而pAx4pIXR是pIX基因以朝右的方向***的重组腺病毒。
(2)含有E1A、E1B和pIX基因缺失的腺病毒载体基因组的粘粒载体(pAxΔpIXcw)的构建
为了构建含有5型腺病毒基因组左端17％(含pIX基因)的质粒，进行下列方法。上述粘粒载体pAx4w(图11)是一种含有5型腺病毒基因组除E1基因(Δ454-3328)和E3基因(Δ28592-30470)之外的大部分的载体。用HindIII和EcoRV消化pAxcw，用Klenow酶使其成为平端，之后自身连接，获得质粒pAx17cw(6.5kb：图11)。pAx17cw是含有5型腺病毒左端除E1基因之外的大约17％(1-453，3329-6241)的一种质粒。
为了由pAx17cw构建pIX基因缺失的质粒，制备下列三条DNA片段(a)-(c)：
(a)用SwaI和XhoI消化pAx17cw获得的，不含pIX基因的约4.0kb DNA片段，
(b)用AlwNI和XhoI消化pAx17cw获得的，对应于5型腺病毒基因组位点4054-5788的约1.7kb DNA片段，
(c)设计含有SwaI消化的片段-ClaI识别位点-SalI识别位点-NruI识别位点-AlwNI消化的片段的双链DNA片段，其通过磷酸化含有下列序列的合成DNA的5’端，然后使其退火获得：
(SwaI)
       ClaI  SalI  NruI  (AlwNI)
5′-AAATCGATT GTCGAC TCGCGA CAGACT-3′(SEQ ID NO：23)
3′-TTTAGCTAA CAGCTG AGCGCT GTC-5′   (SEQ ID NO：24)
连接上述三条片段(a)、(b)和(c)，获得质粒pAx17ΔpIXcw(5.8kb；图11)，其中E1A、E1B和pIX基因缺失(Δ454-4053)。
然后，为了构建粘粒载体pAx4w的BamHI位点与BstZ17I位点之间的序列已被替换为质粒pAx17ΔpIXcw的BamHI位点与BstZ17I位点之间的序列的粘粒载体，制备下列三条DNA片段(d)-(f)：
(d)用BamHI和BstZ17I消化pAx17ΔpIXcw获得的，含有一个SwaI识别位点的约2.2kb DNA片段，
(e)用BamHI和Csp45I消化pAxcw获得的，不含腺病毒基因组DNA的约10kb DNA片段，
(f)用Csp45I和BstZ17I消化pAxcw获得的，含有腺病毒基因组DNA的约30kb DNA片段。
连接上述三条片段(d)、(e)和(f)，获得粘粒载体pAxΔpIXcw(41.8kb；图11)，其含有E1A、E1B和pIX基因缺失的腺病毒基因组。
最后，为了构建在粘粒载体pAΔpIXcw的E1A、E1B和pIX基因缺失位点***人生长激素(hGH)表达单元的粘粒载体，进行下列方法：
用限制酶PmeI消化含有hGH表达单元(其中hGH DNA连接于CAG启动子下游)的粘粒pAx1CAHGH(实施例1)，获得含有hGH表达单元的约3.0kb DNA片段。将该DNA片段***粘粒载体pAΔpIXcw的SwaI位点，获得粘粒pAΔpIXCAHGH(44.8kb：图11)。
(3)蛋白IX重新定位的腺病毒载体的构建
为了通过(1)所述的重组腺病毒Ax4pIXL或Ax4pIXR与(2)所述的粘粒载体pAxΔpIXCAHGH之间的同源重组构建蛋白IX重新定位的腺病毒载体，进行下列方法。由Ax4pIXL和Ax4pIXR制备腺病毒DNA-TPC，然后用限制酶EcoT22I消化每种DNA-TPC。由于在Ax4pIXL和Ax4pIXR基因组DNA的左半段含有几个EcoT22I位点，EcoT22I消化产生基因组左半段已被消化的DNA-TPC。用EcoT22I消化的Ax4pIXR和粘粒pAxΔpIXCAHGH转化293细胞。通过用限制酶(XhoI、NruI、BspEI等)消化产生的重组腺病毒的基因组DNA，鉴定目的病毒克隆。结果能够获得pIX重新定位的腺病毒载体(AxRpIXRCAHGH，图10)，其中在pIX基因的原始位点(9.7-11.2m.u.)不含pIX基因，pIX基因重新定位到E4基因上游区与3’端ITR之间。类似地，用EcoT22I消化的Ax4pIXL和粘粒pAxΔpIXCAHGH的DNA-TPC转化293细胞，也能获得pIX重新定位的腺病毒载体(AxRpIXLCAHGH，图10)。AxRpIXRCAHGH与AxRpIXLCAHGH的结构差异只是pIX基因的***方向，AxRpIXRCAHGH是pIX基因以朝右的方向***的重组腺病毒，而AxRpIXLCAHGH是pIX基因以朝左的方向***的重组腺病毒。
实施例12
表达pIX的细胞系的构建
为了用于生产pIX缺失的腺病毒载体，转化293细胞，构建表达pIX的细胞系。
使用实施例10-(1)中构建的表达pIX的质粒pCMV-IX，用lipofection法(FuGENETM 6转染试剂：Roche Diagnostics Corp.)转化293细胞。由于pCMV-IX中已经***新霉素抗性基因，转化3天后将培养基替换为含有600μg/ml硫酸G418(遗传霉素：GIBCO BRL)的培养基，转化的细胞再培养13天后，克隆这些细胞。对G418抗性细胞系中的任意10个克隆，通过Northern印迹分析检测pIX基因的表达。结果证实，pIX基因在4个克隆中表达(#2、#5、#6、#10)。于是，为了检测这4个克隆中pIX基因表达的稳定性，将这4个克隆传代培养到第30代，期间每5代制备一次RNA，通过Northern印迹分析证实pIX基因的表达(图12)。结果证实，所有4个克隆，至少到第30代，pIX基因仍能稳定表达，但是不同克隆的pIX基因的表达量不同。
此外，利用第25代的细胞，在蛋白质水平上证实了pIX的表达，也用实施例10-(3)所述的Western印迹分析证实。在该实验和图12的实验中，用未***外源启动子的腺病毒载体Axlwl感染的293细胞作为阳性对照。甚至在用Axlwl感染不表达腺病毒E1A或E1B基因的细胞(如A549细胞)时，pIX在RNA水平(图4，图6)或蛋白质水平(图9)上几乎不表达。然而，当用Axlwl感染表达E1A和E1B基因的293细胞时，它们相当于E1基因缺失的第一代腺病毒载体的普通复制循环，表达足量的pIX。如图13所示，在蛋白质水平上证实所有4个克隆都表达pIX，但是表达量略低于Axlwl感染的293细胞的pIX表达量。
上述结果清楚地表明，获得了表达pIX的细胞系的4个克隆(#2、#5、#6、#10)，它们组成并且稳定地表达pIX。
实施例13
pIX缺失的腺病毒载体的构建
为了通过实施例5所用的腺病毒载体AxCAwt与pIX缺失的粘粒载体pAxΔpIXCAHGH之间的同源重组构建pIX缺失的腺病毒载体，进行下列方法：
由AxCAwt制备腺病毒DNA-TPC，然后用EcoT22I消化。用这种DNA-TPC和粘粒载体pAxΔpIXCAHGH转化293细胞或实施例12所述的表达pIX的细胞系。通过用限制酶(CIaI、NruI、SalI等)消化产生的重组腺病毒的基因组DNA，鉴定目的病毒克隆，并能获得pIX缺失的腺病毒载体AxΔpIXCAHGH(图10)。AxΔpIXCAHGH是一种来源于5型腺病毒的重组腺病毒，其中E1A、E1B和pIX基因缺失(Δ454-4053)，E3基因也缺失(Δ28592-30470)。
当通过转化表达pIX的细胞系获得pIX缺失的腺病毒载体时，表达pIX的细胞系用于病毒的大规模传代和制备。另一方面，当通过转化293细胞获得pIX缺失的腺病毒载体时，表达pIX的细胞系用于病毒的大规模制备。
然后纯化pIX缺失的腺病毒载体，制备病毒颗粒，利用抗-pIX抗体通过Western印迹分析证实病毒颗粒中存在正常含量的pIX蛋白。
实施例14
关于施用pIX重新定位的腺病毒载体和pIX缺失的腺病毒载体是否引发炎症的研究
为了证实pIX重新定位的腺病毒载体和pIX缺失的腺病毒载体的炎症减轻，如实施例3和5所述，通过测定血清GPT水平作为炎症的指标，进行体内实验。测试的腺病毒载体如下：
—表达hGH的pIX重新定位的腺病毒载体：AxRpIXRCAHGH、AxRpIXLCAHGH(实施例11)
—表达hGH的pIX缺失的腺病毒载体：AxΔpIXRCAHGH(实施例13)
—表达hGH的第一代腺病毒载体：Ax1CAHGH(实施例13)
—无外源基因***的第一代腺病毒载体：Axlwl(实施例5)
包括小鼠株和腺病毒载体剂量的实验方法根据实施例3所述的方法进行。
结果如实施例3和5所述，施用Ax1CAHGH的小鼠，血清GPT水平显著升高。然而，施用AxRpIXRCAHGH、AxRpIXLCAHGH和AxΔpIXCAHGH的小鼠，如同施用Axlwl的小鼠一样，血清GPT水平根本不升高。上述结果表明，甚至在体内施用时，pIX重新定位的腺病毒载体和pIX缺失的腺病毒载体几乎不引发炎症。
工业用途
本发明能提供高度安全的用于基因治疗的腺病毒载体，使病毒蛋白的表达受到抑制，炎症减轻。

Claims (33)

1.一种重组腺病毒载体，其体内施用过程中的炎症减轻，该载体具有下列特征(1)-(4)：
(1)腺病毒基因组的E1A和E1B基因缺失；
(2)腺病毒基因组中***含外源启动子的外源基因；
(3)具有下列特征(A)和/或(B)：
(A)腺病毒基因组的蛋白IX基因从正常位置重新定位到不受外源启动子诱导表达的位置；和
(B)由外源启动子诱导表达的腺病毒基因组MLP和IVa2基因启动子的核苷酸序列被置换，以致不受外源启动子的作用；和
(4)形成与腺病毒野生株具有相同特性的正常病毒颗粒。
2.根据权利要求1的重组腺病毒载体，其具有下列特征(5)-(8)：
(5)腺病毒基因组的E1A和E1B基因缺失；
(6)腺病毒基因组中***含外源启动子的外源基因；
(7)腺病毒基因组的蛋白IX基因从正常位置重新定位到不受外源启动子诱导表达的位置；和
(8)含有含量类似于腺病毒野生株的蛋白IX，形成正常的病毒颗粒。
3.根据权利要求1或2的重组腺病毒载体，其中在腺病毒基因组的E1A和E1B基因缺失位点***含外源启动子的外源基因。
4.根据权利要求1的重组腺病毒载体，其中腺病毒基因组除E1A和E1B基因之外的至少一种基因全部或部分缺失。
5.根据权利要求2的重组腺病毒载体，其中腺病毒基因组除E1A和E1B基因之外的至少一种基因全部或部分缺失。
6.根据权利要求1的重组腺病毒载体，其中腺病毒基因组E3基因全部或部分缺失。
7.根据权利要求1的重组腺病毒载体，其中腺病毒基因组E2A基因全部或部分缺失。
8.根据权利要求1的重组腺病毒载体，该载体保留腺病毒基因组E4基因的至少一个ORF。
9.根据权利要求8的重组腺病毒载体，该载体保留腺病毒基因组E4基因的ORF3。
10.根据权利要求9的重组腺病毒载体，其中腺病毒基因组除E4基因ORF3之外的全部或部分ORF缺失。
11.根据权利要求2的重组腺病毒载体，其中蛋白IX基因重新定位于距外源启动子18kb或更远的位置。
12.根据权利要求11的重组腺病毒载体，其中蛋白IX基因重新定位于腺病毒基因组L3基因与E2A基因之间。
13.根据权利要求2的重组腺病毒载体，其中蛋白IX基因重新定位于距外源启动子24kb或更远的位置。
14.根据权利要求13的重组腺病毒载体，其中蛋白IX基因重新定位于腺病毒基因组的E3基因缺失位点。
15.根据权利要求2的重组腺病毒载体，其中蛋白IX基因重新定位于距外源启动子30kb或更远的位置。
16.根据权利要求15的重组腺病毒载体，其中蛋白IX基因重新定位于腺病毒基因组的E4基因上游区与3’端ITR之间。
17.根据权利要求1的重组腺病毒载体，其中外源启动子含有来自哺乳动物和/或动物病毒的元件。
18.根据权利要求17的重组腺病毒载体，其中外源启动子含有CMV增强子。
19.根据权利要求18的重组腺病毒载体，其中该外源启动子是一种CMV启动子。
20.根据权利要求18的重组腺病毒载体，其中该外源启动子是一种CAG启动子。
21.根据权利要求17的重组腺病毒载体，其中该外源启动子是一种RSV启动子或SRα启动子。
22.根据权利要求17的重组腺病毒载体，其中该腺病毒是一种人类腺病毒载体。
23.根据权利要求22的重组腺病毒载体，其中该腺病毒是2型腺病毒或5型腺病毒。
24.一种重组腺病毒载体，其体内施用过程中的炎症减轻，该载体具有下列特征(14)和(15)：
(14)腺病毒基因组的E1A和E1B基因缺失；和
(15)腺病毒基因组中***EF1α启动子。
25.根据权利要求24的重组腺病毒载体，其具有下列特征(16)-(18)：
(16)腺病毒基因组的E1A和E1B基因缺失；
(17)腺病毒基因组的蛋白IX基因在原始位置处保留；和
(18)腺病毒基因组中***EF1α启动子。
26.根据权利要求24或25的重组腺病毒载体，其中在腺病毒基因组的E1A基因和E1B基因缺失位点***含EF1α启动子的外源基因。
27.根据权利要求24的重组腺病毒载体，其中以朝左侧的方向***含EF1α启动子的外源基因。
28.一种重组腺病毒载体，其体内施用过程中的炎症减轻，该载体具有下列特征(19)-(21)：
(19)腺病毒基因组的E1A和E1B基因缺失；
(20)腺病毒基因组中***含外源启动子的外源基因；和
(21)在外源启动子与腺病毒基因之间***具有抑制外源启动子诱导腺病毒基因表达的特性的隔离子碱基序列。
29.根据权利要求28的重组腺病毒载体，其中在腺病毒基因组的E1A基因和E1B基因缺失位点***含外源启动子的外源基因。
30.根据权利要求28或29的重组腺病毒载体，其中外源启动子含有CMV增强子。
31.一种药用组合物，它在体内施用过程中可减轻或不诱发炎症，含有一种选自权利要求1的重组腺病毒载体作为活性成分。
32.权利要求1的重组腺病毒载体的用途，用于生产在体内施用过程中可减轻或不诱发炎症的药用组合物。
33.权利要求1的重组腺病毒载体的用途，用于生产在基因治疗中使用的药用组合物，它在体内施用过程中可减轻或不诱发炎症。
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