CN1778925A - 植物表皮毛特异表达启动子 - Google Patents

Abstract

本发明提供了植物表皮毛特异表达启动子元件－棉花GaRDL1启动子，含GaRDL1启动子元件的构建物和载体，以及它们的用途。本发明的GaRDL1启动子可用于棉纤维和腺毛次生代谢基因工程。

Description

植物表皮毛特异表达启动子

技术领域

本发明属于植物生物工程和植物改良基因工程领域。具体地说，本发明涉及新的植物表皮毛特异表达启动子GaRDL1的序列及其表皮毛特异表达相关的顺式调控元件。本发明还公开了GaRDL1启动子的用途，尤其在棉纤维和腺毛次生代谢基因工程中的应用。

背景技术

植物表皮毛是单细胞水平上研究细胞分化、极性生长和形态建成的一个模式***(Hulskamp，2004，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.5，471-480)。植物表皮毛分为腺毛和非腺毛，主要的功能是保护植物，如抵御虫害、减少蒸发、提高抗冻力和防紫外线等(Marks等，1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48，137-163)。其中，棉纤维和腺毛还具有重要的经济价值(Wilkins等，2000，Crit.Rev.Plant Sci.19，511-550；Wagner等，2004，Ann.Bot.(Lond)93，3-11)。

棉纤维是棉花种子的表皮毛，它是纺织工业最重要的天然纤维原料(Kim和Triplett，2001，Plant Physiol.127：1361-1366)。E6启动子是第一个分离到的棉纤维高表达启动子，但是E6启动子除了在棉纤维中优势表达外，在子房、花和叶中也有少量表达。E6启动子已用于改良棉纤维的基因工程(John和keller，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，12768-12773)。

我国是目前世界上最大的棉花生产和消费国家，但是我国迄今尚未在棉纤维上拥有具自主知识产权的启动子，这阻碍了我国改良棉纤维的基因工程研究。大约三分之一的维管植物具有腺毛。植物腺毛分泌丰富的代谢产物，如萜类、糖、多糖、吲哚、烟碱和脂肪酸等，这些代谢产物可吸引昆虫传粉、防止动物取食和赋予植物芳香味，以及用于医药等用途(McCaskill和Croteau，1999，NatBiotechnol.17，31-6；Wagner等，2004，Ann.Bot.93，3-11)。

基因表达的特异性决定于它的启动子的顺式调控元件。特异表达启动子是基因工程改良生物品质性状的基本元件。有了启动子，再连接上特定性状相关的基因，可以定向改变生物的品质性状。但是，迄今还没有植物表皮毛(棉纤维)特异表达的顺式调控元件的报道。

综上所述，为了改良棉纤维的品质性状和调控植物表皮毛次生代谢，本领域迫切需要开发新的更特异的植物表皮毛特异表达启动子。

发明内容

本发明的目的就是提供一种新的植物表皮毛特异表达启动子GaRDL1，及相关的植物表皮毛特异表达顺式调控元件。

本发明的另一目的是提供产生GaRDL1启动子的方法以及其应用，特别是在棉纤维和腺毛次生代谢基因工程中的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种启动子元件，它包括植物表皮毛特异表达启动子GaRDL1的核苷酸序列。

较佳地，所述的启动子元件包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种用于在植物表皮毛中特异性表达的构建物，它含有外源基因以及与该外源基因可操作地连接的上述的GaRDL1启动子元件。

在另一优选例中，所述的外源基因是MYB基因。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，该载体含有上述的GaRDL1启动子元件。较佳地，所述的载体是表达载体和质粒。

在本发明的第四方面，提供了一种在植物表皮毛中特异性表达外源基因的方法(也是一种产生转基因植物的方法)，它包括步骤：

(a)提供一构建物，所述构建物含有外源基因以及与该外源基因可操作地连接的所述的GaRDL1启动子元件，

(b)将步骤(a)中的构建物导入植物细胞，获得转化的植物细胞；

(c)将步骤(b)中转化的植物细胞再生成植株，从而使使外源基因在植物表皮毛中表达。

在本发明的第五方面，提供了一种植物表皮毛特异表达顺式调控元件，选自下组：

(a)L1 box调控元件，序列为SEQ ID NO：1中82-89位；

(b)MYB基序调控元件，序列为SEQ ID NO：1中103-108位。

在本发明的第六方面，提供了所述的GaRDL1启动子元件或上述植物表皮毛特异表达顺式调控元件的用途，它们被用于在植物表皮毛中特异性表达外源基因或用于改良棉纤维。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了GaRDL1启动子的序列(SEQ ID NO：1)。图中下划线的序列TGCATTTA、CAGTTG和TATAAAT分别是调控元件L1 box、MYB motif和TATA box。其中，GaRDL1启动子位于GaRDL1基因翻译起始位点ATG上游的-221～+81。L1 box和MYB motif的序列分别位于GaRDL1基因的-140～-133和-119～-114。

图2显示了GaRDL1基因在棉花中的表达特征。DPA代表开花后的天数(dayspost-anthesis)。His代表histone3基因。rRNA代表核糖体RNA。

图3显示了GaRDL1∷GUS在拟南芥中的表达特征。

图4显示了GaRDL1启动子对拟南芥腺毛次生代谢的影响。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次从亚洲棉(Gossypium arboreum)(也称为木本棉)中分离到一个植物表皮毛特异表达的启动子，命名为GaRDL1启动子。Northern杂交和RT-PCR分析的试验结果表明，GaRDL1是一个棉纤维特异表达的基因；GaRDL1∷GUS分析表明，GaRDL1是一个拟南芥表皮毛特异表达的启动子；接头扫描和点突变分析表明，L1 box和MYB基序元件是决定GaRDL1启动子在表皮毛中特异表达的顺式调控元件。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，术语“GaRDL1是Gossypium arboreum RD22-like 1的缩写。

如本文所用，术语“GaRDL1启动子”、“GaRDL1启动子区域”可互换使用，指具有GaRDL1启动子序列(SEQ ID NO：1)或其活性片段的多聚核苷酸。

如本文所用，术语“启动子”是指基因转录起始位点上游的一段序列。

如本文所用，术语“顺式调控元件”是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保守碱基序列。

如本文所用，术语“特异表达”是指基因在特定的时间和特定的组织表达。

如本文所用，术语“目的基因”是指基因工程中与特定品质性状相关的基因。

本发明涉及GaRDL1启动子及其多核苷酸变异体。这些多核苷酸变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或***，但不会从实质上改变该启动子的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上至GaRDL1启动子的全长。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离本发明的启动子的核苷酸序列。

本发明的GaRDL1启动子的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用棉花基因组DNA作为模板，扩增而得有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到本发明启动子(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的启动子元件。

本发明也涉及包含本发明启动子元件的构建物或载体，以及用所述构建物或载体转化或转导的宿主细胞(尤其是植物细胞)，以及由此产生外源蛋白和将转化的植物细胞再生成植株的方法。

适用于本发明的外源基因没有特别限制，几乎所有的外源基因都可用于本发明，尤其是与。代表性的外源基因的例子包括(但并不限于)：GaRDL1基因、MYB基因、GaMYB2基因(SEQ ID NO：4或6)、GFP基因等。将这些基因与本发明的GaRDL1启动子相连，形成含外源基因的构建物，然后将所述构建物用于基因治疗。

一类优选的外源基因是MYB基因。MYB基因是克隆棉纤维发育关键基因的焦点，一些自棉纤维中分离的MYB基因的表达特征和进化关系受到重视(Cedroni等，2003，Plant Mol.Biol.51：313-325)。

一种构建物的例子就是与GaRDL1启动子直接相连的外源基因。通常，GaRDL1启动子应位于外源基因的上游。

本发明中，含GaRDL1启动子元件的核苷酸序列可优选地***到载体，例如表达载体中。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：表达载体、克隆载体，例如适用于原核(如大肠杆菌等细菌)、真核(如酵母)、植物细胞中的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。在表达载体中，除了含有含有复制起点、GaRDL1启动子元件之外，还可含有标记基因和其他翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含GaRDL1启动子和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效地与待表达的外源基因相连接，以指导所述外源基因mRNA合成。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达外源蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

在应用本发明的启动子时，如果在载体中***增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得表皮毛改变的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

本发明的显著优点在于：GaRDL1启动子具有极高的植物表皮毛表达的特异性，因此在棉纤维和腺毛次生代谢基因工程中具广阔的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆实验手册(Molecular cloning：A laboratorymanual，3rd ed.，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，2001)和植物分子生物学实验手册(Plant Molecular Biology-A Laboratory Mannual，Clark等，Springer-Verlag，1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1GaRDL1启动子的分离

棉花DNA提取采用冷酚法。2g材料(亚洲棉(Gossypium arboreum)的棉纤维)，在液氮中磨成粉末，转移到50ml离心管中，加入8ml提取缓冲液(1M Tris·HCl，50mM EDTA，1％SDS，pH9.0)和等体积的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，震荡混匀，冰上放置1小时，每隔10分钟混匀一次。4℃，13000g离心20分钟。重复酚∶氯仿∶异戊醇抽提2～4次，最后用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次。取上清夜，加入1/2体积的高盐溶液(0.8M柠檬酸钠，1.2M NaCl)和1/2体积异丙醇，混匀，-70℃放置1小时。4℃，13000g离心20分钟。以下根据提取DNA和RNA而采取相应的操作。去上清液，用1ml 70％乙醇清洗沉淀2次，室温吹20分钟，沉淀溶于1ml无菌水。4℃，13000g离心10分钟。取上清液，加5～10μl RNase(10mg/ml)，37℃，30分钟。

用以下引物RDL1-P-F5’-AATTAGTTATGTTTGGTAAATGAATTTG-3’(SEQ ID NO：2)和RDL1-P-R5’-CTAGAACAG GAGTGACTAATTCTA-3’(SEQ ID NO：3)。PCR反应条件：94℃预变性5分钟；然后94℃预变性30秒钟，60℃复性30秒钟，72℃延伸30秒钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。亚克隆后经测序确认序列是否正确。

测序结果如SEQ ID NO：1和图1所示，它包含的多核苷酸序列全长为302个碱基，其中下划线的序列TGCATTTA、CAGTTG和TATAAAT分别是调控元件L1 box(L1盒)、MYB motif(MYB基序)和TATA box(TATA盒)。

用上述相同方法抽提棉花的各种组织的DNA，用相同引物进行常规的RT-PCR。还用基于SEQ ID NO：1的探针进行Northern杂交分析。结果表明GaRDL1是一个棉纤维特异表达的基因(图2)。

实施例2载体构建和农杆菌转化

根据载体多克隆区域、GaRDL1启动子和目的基因的限制性酶切位点的分布情况，确定融合片段***载体的酶切位点，然后采用PCR方法将酶切位点引入GaRDL1启动子和目的基因。经酶切和连接，热激法转化大肠杆菌，PCR法鉴定阳性克隆，测序验证。

根据外源基因GUS基因的全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物(对应于最前20bp和最后20bp)，经PCR扩增后得到GUS序列，然后与GaRDL1启动子直接相连(位于启动子下游)。然后将该DNA序列(GaRDL1∷GUS序列)克隆至中间载体pBluescript(购自Stratagene公司)，进一步克隆到双元表达载体pBI121(购自Clontech公司)，在保证阅读框的前提下鉴定好的表达载体，在将其转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中，获得阳性克隆，用于转化棉花和拟南芥等植物。

根癌农杆菌的转化采用冻融法。单菌落LBA4404或GV3101(Invitrogen)，3mlLB培养基(25μg/ml利福霉素Rif和50μg/ml卡拉霉素Kan或庆大霉素Gen)，28℃，220rpm，过夜培养。2ml菌液，50ml LB培养基(25μg/ml Rif和50μg/mlGen)，28℃，220rpm，培养到OD₆₀₀＝0.5(约6小时)。在冰上放置30分钟，4℃，5000g离心5分钟。重悬于10ml 0.15M NaCl。4℃，5000g离心5分钟。重悬于1ml 20mM CaCl₂，50μl/管分装，液氮速冻，-70℃保存感受态细胞。混合含目的基因双元载体和50μl/管感受态细胞，在冰上放置30分钟，液氮速冻1分钟。在37℃水浴中5分钟使菌液融化，加1ml LB培养基，28℃，220rpm，培养2～4小时。取50～100μl涂LB培养基平板(25μg/ml Rif、50μg/ml Gen和50μg/ml卡拉霉素Kan或潮霉素Hyg)。

实施例3植物转化以及转基因后代的筛选

在本实施例中，以棉花和拟南芥的转基因为例，其他植物的转化可以此为参照。

a.棉花的转基因

采用农杆菌介导的方法转化棉花。

取5日龄的无菌苗下胚轴上部切段(0.5cm)预培养36小时。培养基：SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L。

下胚轴切段于农杆菌菌液(SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+乙酰丁香酮100μmol/L)中浸泡20分钟。

共培养3天。培养基：SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+乙酰丁香酮100μmol/L。

愈伤组织起始诱导25～30天。培养基：SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+Km50mg/L+头孢霉素(cef)300mg/L或MSB+2，4-D 0.1mg/L+IAA 0.1mg/L+ZT0.1mg/L+Km 50mg/L+cef 300mg/L。

胚性愈伤组织诱导及继代筛选，每15天增殖一次。挑选松软、淡绿色或灰色的愈伤组织用于胚性愈伤的诱导；挑选新鲜、黄色、致密、颗粒状的胚性愈伤组织继代增殖。培养基：SH或MSB(NH₄NO₃为0.3mg/L)+IAA0.5mg/L+KT0.5mg/L+Km75mg/L+Cef300mg/L。

胚状体形成和成熟。培养基：MSB(KNO₃加倍无激素)+Km 75mg/L+Cef 300mg/L。

胚状体(萌发)伸长、生长。培养基：MSB(无激素)+活性炭250mg/L+Km75mg/L+Cef 300mg/L。

胚状体真叶生长。培养基：MSB+IBA0.4mg/L+KT0.1mg/L+Km75mg/L+Cef300mg/L。部分成正常小植株；部分采取嫁接。

b.拟南芥的转基因

拟南芥植物的转化采用花芽浸泡法(floral dip)(方法按Clough和Bent，1998，Plant J.16，735-743进行)。含双元载体的单菌落GV3101(Invitrogen公司)，3ml LB培养基(25μg/ml Rif、50μg/ml Gen和50μg/ml Kan或Hyg)，28℃，220rpm，12小时。2ml菌液，50ml LB培养基(25μg/ml Rif、50μg/mlGen和50μg/ml Kan或Hyg)，28℃，220rpm，12小时。50ml菌液，250ml LB培养基(50μg/ml Gen和50μg/ml Kan或Hyg)，28℃，220rpm，12小时。4200rpm(2900g)，15分钟。菌体重悬于500ml含0.02％Silwet L-77的5％蔗糖溶液中。植株地上部分在菌液中浸泡5sec，平放于塑料盆内，保湿，避光，16～24小时。T0代种子在4℃春化2～4d，用20％漂水处理15分钟，无菌水清洗3～4遍。悬于0.5％的琼脂糖(55℃)，铺在0.6％琼脂的LB培养基(50μg/ml Kan或Hyg)，22℃，连续光照，约一周后，绿色抗性苗移栽到营养土(泥炭∶蛭石∶珍珠岩1∶1∶1)中生长。

结果表明，外源的GUS基因特异地在叶片和茎的表皮毛表达，使表皮毛呈现出蓝色(图3)。

实施例4转基因植物的分子生物学鉴定

在本实施例中，选取实施例3获得的拟南芥T3代纯合株系，采用抗生素筛选、PCR、GUS染色和Southern杂交分析等方法对转基因植株进行验证。

a.PCR分析

DNA提取方法和PCR反应条件见实施例1。引物为SEQ ID NO：2和3。

b.GUS染色分析

GUS染色液浸泡植物材料，37℃，12～24小时。70％乙醇脱色，样品在70％乙醇中保存。GUS染色液(100mM pH7.0磷酸缓冲液，50mM K₃[Fe(CN)₆]，50mMK₄[Fe(CN)₆]，10mM EDTA，1mM X-gluc，0.1％Triton X-100)。

结果表明，外源的GUS基因特异地在叶片和茎的表皮毛表达(图3)。

c.Southern杂交分析

10μg DNA，选3～5种限制酶，完全酶切(过夜)。0.7％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后切去凝胶的无用部分。在变性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)中浸泡45分钟，温和摇动。去离子水漂洗，在中和液(1.5M NaCl，1M Tris·HCl，pH7.4)中浸泡45分钟，温和摇动。

采用毛细管转移法将DNA转移到尼龙膜Hybond-XL(Amersham-PharmaciaBiotech)，转移缓冲液为20XSSC(3M NaCl，0.3M柠檬酸钠)，转移时间为12-18小时。用6XSSC漂洗尼龙膜，夹在滤纸中间，压在玻璃板之间，80℃烘2小时。

25ng经割胶醇化的PCR产物，采用Primer-a-Gene Labeling System(Promega)标记探针。α-³²P-dCTP，50μl反应体系，37℃，1小时。采用QIAquick NucleotideRemoval Kit(QIAGEN)纯化探针。沸水浴中10分钟，放置冰上。

将尼龙膜放入杂交管中，加10ml预杂交液(50％甲酰胺，5XSSC，5XDenhardt，1％SDS，100μg/ml变性鱼精DNA)，42℃，2～4小时。加入变性的探针，杂交16～24小时。

去杂交液，在室温用含0.1％SDS的2XSSC洗膜2次，每次5分钟。在室温用含0.1％SDS的0.2XSSC洗膜2次，每次5分钟。在42℃用含0.1％SDS的0.2XSSC洗膜2次，每次15分钟。在室温用2XSSC洗膜2次。取出尼龙膜，滴干杂交液，用保鲜膜包裹，胶带固定，压增感屏和X-ray胶片，-70℃，2d。胶片用D-72液显影。

试验结果表明，转基因的拟南芥植株中的确转入了GaRDL1启动子序列，而对照的拟南芥植株则不含GaRDL1启动子序列。

实施例5对拟南芥表皮毛的植物基因工程改造

在本实施例中，按实施例3b中相同的方法转化拟南芥。不同点在于用植物表皮毛调控蛋白GaMYB2(一种棉花的MYB蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，基因组DNA序列如SEQ ID NO：4所示，cDNA序列如SEQ ID NO：5所示)的基因组序列(SEQ ID NO：4)替换GUS基因序列。

结果见图4。图4表明，转入拟南芥后，GaRDL1∷GaMYB2使野生型表皮毛减少。此外，GaRDL1∷GaMYB2完全互补拟南芥gl1突变体，使gl1无毛突变体的体毛恢复(图中GaRDL1简写为GL1)。这些结果表明，GaRDL1能用于在植物表皮毛中特异性表达外源基因或用于改良植物腺毛次生代谢。

实施例5表皮毛中特异表达的顺式调控元件的确定

用常规方法(Molecular cloning：A laboratory manual，3rd ed.，Sambrook)进行接头扫描和点突变分析，然后按实施例3b的相同方法测定突变后的GaRDL1启动子能够在拟南芥的表皮毛中表达GUS蛋白。

实验结果表明，(a)L1 box调控元件(序列为SEQ ID NO：1中82-89位)和(b)MYB基序调控元件(序列为SEQ ID NO：1中103-108位。)是决定GaRDL1启动子在表皮毛中特异表达的顺式调控元件。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                         序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>植物表皮毛特异表达启动子

<130>044447

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>302

<212>DNA

<213>棉花(Gossypium arboreum)

<400>1

aattagttat gtttggtaaa tgaatttgaa tacatgcacc accactctca atgctcaccc    60

acctaagccc atgacataaa ctgcatttaa gtgaaccagt ggcagttgga gccattatgt    120

tggttgaaaa atattgttgg cagtgttatt cagcagtact tgttctaagg ctcctactac    180

atttctcatt ataaatgtgg agaaatcttg ttctactttc cattccatgc aacactaact    240

tttagattcc ctttccattg cactgctctt tctttctata gaattagtca ctcctgttct    300

ag                                                                   302

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>棉花(Gossypium arboreum)

<400>2

aattagttat gtttggtaaa tgaatttg                                       28

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>棉花(Gossypium arboreum)

<400>3

ctagaacagg agtgactaat tcta                                           24

<210>4

<211>818

<212>DNA

<213>棉花(Gossypium arboreum)

<220>

<221>CDS

<222>(74)..(209)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(288)..(745)

<223>

<400>4

ccttcccttg tttctcacta atcatctctg tcttcccttc tcactctttg cctcttctca  60

ctgtcggcta ata atg gct cca aag aag gat gga gtg agc aaa agg gtt     109

               Met Ala Pro Lys Lys Asp Gly Val Ser Lys Arg Val

               1               5                  10

ttt aac aaa ggt tct tgg aca gct gag gaa gat aga aga ttg gct aaa    157

Phe Asn Lys Gly Ser Trp Thr Ala Glu Glu Asp Arg Arg Leu Ala Lys

        15                 20                  25

tat att gag att cat ggc gca aag aga tgg aaa aca atc gcc att aaa    205

Tvr Ile Glu Ile His Gly Ala Lys Arg Trp Lys Thr Ile Ala Ile Lys

    30                  35                 40

tca g gtaatttact ttctgttgaa gagaaactcc attttttgga gcattggaat       259

Ser

45

taacgggtta ttttgttttg atgtatag gt  ttg aat cga tgc ggc aag agt     310

                               Gly Leu Asn Arg Cys Gly Lys Ser

                                                50

tgc agg ttg aga tgg ttg aac tac ttg aga cct aac att aag aga ggc    358

Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro Asn Ile Lys Arg Gly

    55                  60                 65

aac ata tca gat gaa gaa gag gac tta att att agg ctt cat aaa ctg    406

Asn Ile Ser Asp Glu Glu Glu Asp Leu Ile Ile Arg Leu His Lys Leu

70                  75                 80                  85

ctg ggg aac agg tgg tct ttg att gct ggg aga ctt cca ggg cga aca    454

Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro Gly Arg Thr

                90                 95                  100

gac aat gaa att aag aac tac tgg aat tcc cat ttg agc aag aaa ata    502

Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His Leu Ser Lys Lys Ile

            105                 110                115

ata aac cat gat gtc aga aca gaa caa act tcc tcc tcg gaa caa att    550

Ile Asn His Asp Val Arg Thr Glu Gln Thr Ser Ser Ser Glu Gln Ile

        120                 125                130

gtg cct cac aaa gca tgg gaa act gtc cat atg gaa gaa gaa gag gta    598

Val Pro His Lys Ala Trp Glu Thr Val His Met Glu Glu Glu Glu Val

    135                 140                145

gta aaa gga agt gat gaa att gaa aac tct gaa ttc agc att gat gtg    646

Val Lys Gly Ser Asp Glu Ile Glu Asn Ser Glu Phe Ser Ile Asp Val

150                 155                160                 165

gac gaa ttc ttt gac ttc aca acg gaa ggt tgc ttt act ttg gat tgg    694

Asp Glu Phe Phe Asp Phe Thr Thr Glu Gly Cys Phe Thr Leu Asp Trp

                170                175                 180

gtg aat aag ttc ctt gaa ctt gat gat caa cag gat cca tta gca atg    742

Val Asn Lys Phe Leu Glu Leu Asp Asp Gln Gln Asp Pro Leu Ala Met

            185                 190                195

gta taataagttt gtaattaaca tgtttccttg gataaataaa taaagagatg         795

Val

ttctgagtct aaaaatggaa gat                                          818

<210>5

<211>198

<212>PRT

<213>棉花(Gossypium arboreum)

<400>5

Met Ala Pro Lys Lys Asp Gly Val Ser Lys Arg Val Phe Asn Lys Gly

1               5                   10                 15

Ser Trp Thr Ala Glu Glu Asp Arg Arg Leu Ala Lys Tyr Ile Glu Ile

            20                 25                 30

His Gly Ala Lys Arg Trp Lys Thr Ile Ala Ile Lys Ser Gly Leu Asn

        35                 40                 45

Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro

    50                 55                 60

Asn Ile Lys Arg Gly Asn Ile Ser Asp Glu Glu Glu Asp Leu Ile Ile

65                  70                 75                  80

Arg Leu His Lys Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg

                85                 90                  95

Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His

            100                 105                110

Leu Ser Lys Lys lle Ile Asn His Asp Val Arg Thr Glu Gln Thr Ser

        115                120                 125

Ser Ser Glu Gln Ile Val Pro His Lys Ala Trp Glu Thr Val His Met

    130                 135                140

Glu Glu Glu Glu Val Val Lys Gly Ser Asp Glu Ile Glu Asn Ser Glu

145                 150                155                 160

Phe Ser Ile Asp Val Asp Glu Phe Phe Asp Phe Thr Thr Glu Gly Cys

                165                170                 175

Phe Thr Leu Asp Trp Val Asn Lys Phe Leu Glu Leu Asp Asp Gln Gln

            180                 185                190

Asp Pro Leu Ala Met Val

        195

<210>6

<211>597

<212>DNA

<213>棉花(Gossypium arboreum)

<400>6

atggctccaa agaaggatgg agtgagcaaa agggttttta acaaaggttc ttggacagct    60

gaggaagata gaagattggc taaatatatt gagattcatg gcgcaaagag atggaaaaca    120

atcgccatta aatcaggttt gaatcgatgc ggcaagagtt gcaggttgag atggttgaac    180

tacttgagac ctaacattaa gagaggcaac atatcagatg aagaagagga cttaattatt    240

aggcttcata aactgctggg gaacaggtgg tctttgattg ctgggagact tccagggcga    300

acagacaatg aaattaagaa ctactggaat tcccatttga gcaagaaaat aataaaccat    360

gatgtcagaa cagaacaaac ttcctcctcg gaacaaattg tgcctcacaa agcatgggaa    420

actgtccata tggaagaaga agaggtagta aaaggaagtg atgaaattga aaactctgaa    480

ttcagcattg atgtggacga attctttgac ttcacaacgg aaggttgctt tactttggat    540

tgggtgaata agttccttga acttgatgat caacaggatc cattagcaat ggtataa       597

Claims (10)

1.一种启动子元件，其特征在于，它包括植物表皮毛特异表达启动子GaRDL1的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的启动子元件，其特征在于，它包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.一种用于在植物表皮毛中特异性表达的构建物，其特征在于，它含有外源基因以及与该外源基因可操作地连接的权利要求1所述的启动子元件。

4.如权利要求3所述的构建物，其特征在于，所述的启动子元件包含SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列。

5.如权利要求3所述的构建物，其特征在于，所述的外源基因是MYB基因。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的启动子元件。

7.一种在植物表皮毛中特异性表达外源基因的方法，其特征在于，它包括步骤：

(a)提供一构建物，所述构建物含有外源基因以及与该外源基因可操作地连接的权利要求1所述的启动子元件，

(b)将步骤(a)中的构建物导入植物细胞，获得转化的植物细胞；

(c)将步骤(b)中转化的植物细胞再生成植株，从而使使外源基因在植物表皮毛中表达。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的启动子元件包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

9.一种植物表皮毛特异表达顺式调控元件，其特征在于，选自下组：

(a)L1 box调控元件，序列为SEQ ID NO：1中82-89位；

(b)MYB基序调控元件，序列为SEQ ID NO：1中103-108位。

10.如权利要求1所述的启动子元件或权利要求9所述的植物表皮毛特异表达顺式调控元件的用途，其特征在于，用于在植物表皮毛中特异性表达外源基因或用于改良棉纤维。

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