CN1780915A

CN1780915A - 组织特异性启动子

Info

Publication number: CN1780915A
Application number: CNA2004800114007A
Authority: CN
Inventors: M·赫尔茨贝里
Original assignee: SweTree Technologies AB
Current assignee: SweTree Technologies AB
Priority date: 2003-04-28
Filing date: 2004-04-20
Publication date: 2006-05-31
Also published as: EP1618200A1; KR20060013380A; AU2004235272A1; US20070180580A1; SE0301233D0; ZA200508665B; CA2522929A1; JP2007528701A; BRPI0409871A; WO2004097024A1

Abstract

公开了组织特异性启动子(SEQ ID.NO.1－5)，其优选在木本植物的木质部组织中表达。这些启动子用于，例如，特异性调节木质部组织中的基因表达和改变植物中木质部的特性。采用这些启动子可生产显示修饰的木质部特性的转基因植物。

Description

组织特异性启动子

本发明涉及基因技术领域，特别是在任何植物的木质部发育过程中驱动基因表达的启动子，尤其是在木本植物的形成层区中。本发明使得可获得这样的启动子及其应用。

发明背景

植物的木质部形成是很重要的发育过程，且其对于具有经济价值的纤维生产也很重要。树木中木材的形成是这个过程中具有非常重要的经济价值的一个实例。这是从最初的细胞***到细胞扩展和造成细胞凋亡区的次生壁形成所经历的一系列确定发育事件后的结果。从维管形成层产生木材，所述维管形成层是经历导致细胞原生质体自溶的终末分化的侧生分生组织。

本发明人在实现本发明的研究中采用杨树(Poplar)，它是很好的已建立的多年生木本植物模型。它具有小的基因组，只比另外一个常用的模型拟南芥(Arabidopsis)的基因组大大约五倍。进一步地，杨树是广泛用于进一步遗传学中的物种。杨树和拟南芥在种系发生上很接近，且可获得超过100000条的杨树ESTs与拟南芥基因组的全部序列组合，使得联合这两种模型对于研究木质部的分化是最好的选择。

基因何时和何处具有活性对于其功能是很重要的。一个调节水平是控制转录起始。主要(但并不是排他性的)位于编码序列上游(5’)的顺式作用DNA元件控制基因的转录表达。当在育种和产品开发中采用基因技术和GMOs(基因修饰生物)作为工具时，有两个基本部分：给出所需效果的基因；和顺式作用的DNA调控序列，其决定了何时、何处及基因产物表达的水平。也可在例如转录物稳定性、翻译起始和翻译进程、蛋白活性等水平发生调节。存在具有在不同和特定阶段的木质部形成过程中驱动其表达的启动子的基因。在基因修饰木质部特性和改变产生的木质部的量时，这些启动子对于特异性指导任何基因的作用是关键的。可获得的启动子的数目是有限的，这意味着在研究和控制木质部形成中调节和精细调节基因表达时，新的启动子具有重要意义

高等物种细胞发育过程中特定进程的修饰不仅在改善树木的特性时，而且在其他具有商业使用价值纤维的植物中也有重大的商业利益。因此需要例如用于这种修饰的启动子的新工具。

现有技术

Fredrik Sterky等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998(95)，13330-13335)和Magnus Hertzberg等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001(98)14732-14737)公开了两种杨树物种的大规模基因发现项目的结果，包括来源于欧洲山杨×美洲山杨(Populus tremula L.×tremulodes Michx.)和毛果杨(Populus trichocarpaTrichobe.′)的木材形成组织的5629条ESTs。这些ESTs代表两个cDNA文库中3719个独特的转录物，其中已推定2245个这些转录物的相应功能。作者声明提供的EST数据对于鉴定参与植物中次生木质部和韧皮部形成的基因有价值，但是没有提供如何进行鉴定的具体指导。

在现有技术(Hertzberg等)中，采用cDNA微阵列分析2995条ESTs的杨树unigene集合来进行确定的木质部发生阶段cDNA的转录谱分析。

然而，为了使Sterky等和Hertzberg等***息的实际应用成为可能，则需要新的方法。

U.S.2002138870 A1涉及同时运用多种基因转化植物的方法，该基因来源于苯基丙烷(phenylpropanoid)途径，包括4CL、Cald5H、AldOMT、SAD和CAD基因及其组合，以产生各种显示改变的农学性状的转基因植物。通过定向整合到植物基因组中的特定基因和所选择的基因组合来调节植物的农学性状。U.S.2002138870论述了需要采用组织特异性启动子，例如，限定转基因在发育的木质部中表达的启动子。

通常，有用的新启动子仍尚待鉴定。现在需要解决的一个具体问题是如何鉴定潜在的最重要的基因和其相应的启动子，以及如何使这些基因和启动子与细胞的具体发育特性相关联。另一个问题是克隆所有相关的顺式作用转录控制元件，以使得克隆的DNA片段以需要的特定表达模式驱动转录。

具体的问题是鉴定特异性启动子，其涉及植物中不在其他植物组织中表达的特定细胞类型、发育阶段和/或功能。

发明概述

本发明通过制备可获得的分离核酸序列提供解决上述问题的方法，每个序列包括在植物木质部形成组织中特定表达的启动子序列，所述序列选自SEQ IDNOs 1到5、SEQ ID NOs 1到5的功能同源序列和与SEQ ID NOs 1到5至少90％同源的序列。

序列显示在附图和所附的序列表中，采用指定的软件(Patentln 3.1)制备。

进一步地，本发明使得可获得转基因植物，其生产方法，和这种植物的种子和幼苗，以及在植物木质部中表达特定基因的方法，和核酸构建体，其如所附权利要求中所定义的，在此引用作为参考。

附图简述

本发明将在下面的说明书、实施例和附图中更详细描述，其中：

图1显示基因组步移片段的共有序列。1a)LMX2 A014P10U；1b)LMX3A044P26U；1c)LMX4 A050P49U；1d)LMX5 A055P19U；le)LMP1 A001P79U，相应于序列SEQ ID NO 1-5。

下划线的序列＝启动子序列(GUS构建体的部分)

斜体字序列＝来源于EST的序列

ATG(粗体)＝潜在的翻译起始密码子

图2显示杂交白杨茎的横断面，用Toulidine蓝染色。横断面下面的黑线条指示样品的位置。

图3显示来源于已克隆启动子的5个ESTs的表达模式。这相应于各自启动子产生的主要表达。

图4显示不同植物组织中所选择基因表达水平的RNA印迹分析的结果：

泳道1：顶枝：大约1cm的顶部茎尖。

泳道2：叶脉：收集自老叶的主脉。

泳道3：延长的茎：顶枝下的节间，到茎的第8节。去除所有的叶和芽。

泳道4：老叶：尺寸大约15cm的健康叶。去除叶柄和主脉。

泳道5：韧皮部：收集15cm的茎块。将这些块通过刮去木质部和内层树皮用于制备韧皮部和木质部。

泳道6：根：没有任何根毛的2-3cm的根尖顶端部分。

泳道7：嫩叶：尺寸小于12cm的叶子。去除叶柄和主脉。

泳道8：木质部：如收集茎块那样收集组织(见泳道5)，刮去木材边沿。

说明

定义

在本说明书中，术语“木质部”，如在木质部形成组织中，是指包括传导植物大部分的水和矿物质的所有维管组织。木质部基本的传导细胞是管胞和导管分子，或导管分子。两者都是延伸的细胞，其成熟时具有次生壁和缺少原生质体。木质部组织也包含储存多种物质的薄壁组织细胞。

术语“维管形成层”是指包括***产生次生木质部和次生韧皮部的维管分生组织母细胞。

术语“木材”或“木材形成细胞”是指包括其代谢事件和进程参与维管分生组织和所有其最终产物发育的所有细胞。术语“木材”也用于大多数一般的意义，包括针叶材和阔叶材。

术语“木材形成特性”包括生物学的、化学的和生理学的特性，例如并不限于细胞伸长、细胞扩展、细胞凋亡、碳水化合物组成、纤维长度、纤维厚度和其他纤维特性。

“同源性”在此用作序列之间相似性的衡量；两个序列之间的序列同源性越大，则杂交程度越高。本领域技术人员采用已知的方法可测定杂交体形成。

本发明中，包括共享至少90％、优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、以及最优选至少99％同源性的序列。

“功能性同源”是指可能与公开的序列共享较低结构同源性，但是在体内，在健康或患病的生物中显示同源性功能的序列，例如，编码具有相似细胞功能的相同或高度相似的蛋白。本发明包括与公开的序列功能性同源的序列。

本说明书上下文中的“互补”是指两个核苷酸之间精确配对的能力。

进一步地，本发明上下文中，“杂交”是指互补的核苷或核苷酸碱基之间的氢键，其可为沃森-克里克(Watson-Crick)、Hoogsteen或反Hoogsteen氢键。因而互补和杂交是用于表示互补或精确配对的充分程度的术语，从而使寡核苷酸和DNA或RNA靶之间发生稳定和特异的结合。

反义化合物是当化合物与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能而导致丧失实用性时能特异杂交的，且在需要进行特异性结合的条件下存在充分程度的互补性以避免反义化合物和非特异性靶序列之间的非特异性结合。

术语“在严格条件下杂交”是指本领域技术人员已知的温度和缓冲液标准。参见，例如，Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular cloning：Alaboratory manual，2nd版，Cold Spring Harbour Laboratory Press，USA(1989)。

“功能性***”或“可操作地***”表示将序列以一定方向、一定位置和当采用这种启动子时使得所述序列正确表达的方式***到宿主基因组中。

上下文中所用的“调节”是指增强(刺激)或降低(抑制)基因的表达。本发明上下文中，增强是基因表达的优选调节形式，并且mRNA是优选的靶。

发明详述

选择发育阶段特异表达的基因用于鉴定指导木质部形成组织中特定细胞基因表达的启动子。克隆和分析时，这些启动子都显示是组织特异的。拥有这些启动子，使得驱动木质部发育特定阶段中的任何目的基因的表达以及影响木质部(木材)的产生和特性成为可能。改变表达的方法包括目的基因的异位表达和超表达、反义调节、RNA干扰、基因沉默、使用核酶等。

从木质部形成组织内区域制备文库，其代表下述区域：细胞***(A)，细胞扩展(ABC)；次生壁形成(CDE)；细胞凋亡(E)。见附图2。

从茎的形成层区域的切向截面(tangential section)制备组织样品。平行收集手工横切面以使得能够进行每个样品的准确位置和组织含量的后期鉴定。单个切片尺寸为30μm×2mm×20mm，相应的新鲜重量为约0.5mg。如附图2所示将不同发育区的切片收集在一起。根据细胞的径向直径和解剖学特性选择不同区域。在这些区域中，基因谱显示很高程度的组织特异性。

本发明公开了基因启动子和其用途，所述启动子通过cDNA微阵列分析表征进行鉴定，选自大量序列，存在于形成层内未分化的分生细胞至成熟的导致细胞进入程序性细胞死亡或细胞凋亡的木质部分子。

本发明使得可获得包括植物木质部形成组织中特异性表达的启动子序列的分离的核酸序列，其中所述序列选自：SEQ ID NOs 1至5；包括所述序列SEQ IDNOs l至5中一个的序列；与SEQ ID NOs 1至5功能性同源的序列；或与SEQID NNOs 1至5中的一个显示至少90％同源性、优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、以及最优选至少99％同源性的序列。

上述定义并不互相排斥，而是可一起使用。例如显示较低同源性，例如80％同源或70％同源，但功能等同于这些序列的序列，也包括在这个定义中。本发明也包括能在严格条件下与这些序列中的至少一个杂交的序列。

本发明的一个方面是如上述定义的核酸序列，其中启动子序列在高等植物中表达。优选的所述植物是木本双子叶植物。植物的例子包括但不限于阔叶材物种，例如杨树、白杨、桦树、柳树、桉树、枫香(枫香树属(liquidamber))等等，和针叶材物种(针叶树)云杉、落叶松、铁杉和松树等等。其他目的植物是称为纤维植物的，例如，但不限于棉花、***、剑麻、亚麻等等。启动子可用于其他重要的经济植物，如小麦、玉米、马铃薯、油料种子油菜等等，以驱动维管发育过程中基因的表达。

本发明使得可获得显示与所述植物的野生型相比修饰的特性的转基因植物，例如，与野生型的所述植物相比具有修饰的木材形成特性、修饰的细胞凋亡特性、改变的生根特性、改变的开花或叶子模式等等，其中将上述序列的至少一个功能性***所述的转基因植物。

转基因植物优选为木本植物，更优选为木本双子叶植物。转基因植物的例子包括但不限于阔叶材，例如杨树、白杨、桦树、柳树、桉树、枫香(枫香树属)等等，以及针叶材+物种(针叶树)云杉、落叶松、铁杉和松树等。其他目的植物是所谓的纤维植物，例如，但不限于棉花、***、剑麻、亚麻等等。启动子可用于其他重要的经济植物，如小麦、玉米、马铃薯、油料种子油菜等等，以驱动维管发育过程中基因的表达。

本发明使得也可获得在植物特定区域，优选在植物的木质部中表达特异性基因的方法，其中使用至少一种上述序列，将其功能性***植物。因此，本发明使调节植物中木质部形成组织发育的进程成为可能，并且在特定的木本植物中使用如上定义的启动子。

本发明也包括其基因组上携带序列的本发明植物的植物繁殖产物，例如，种子、果实、植物插条和部分，例如原生质体、植物细胞、愈伤组织或根。

本发明也包括的中间体为含有上述定义的序列的核酸构建体。这种构建体优选包括选自质粒、粘粒、病毒或噬菌体的载体。

本发明也包括生产与所述植物的野生型相比显示修饰的木材形成和/或细胞凋亡特性的转基因植物的方法，其中将如上定义的启动子功能性***所述植物。

本领域的技术人员能够构建载体并设计重组基因表达的方案。

可选择或构建合适的载体，其含有合适的调控序列，包括启动子序列、翻译前导序列、终止子片段、多腺苷酸化序列、增强子序列、效应基因、标记基因和其他合适的序列。进一步的细节可参考，例如，Molecular Cloning：aLaboratory Manual：2^nd版，Sambrook等1989，Cold Spring Harbor LaboratoryPress。

许多已知的操作核酸的技术和方案，例如制备核酸构建体、诱变、测序、向细胞中导入DNA和基因表达以及蛋白质分析，在Ausabel等(Eds.)，CurrentProtocols in Molecular Biology，2^nd版，John Wiley & Sons，1992中有具体描述。

使用的选择遗传标记由赋予可选择的表型，例如对抗生素的抗性的嵌合基因组成。这种选择标记可包括卡那霉素、潮霉素、phosphoinotricin、chlorsulfron、甲氨喋呤、庆大霉素、壮观霉素、咪唑啉酮、d-氨基酸和草甘膦。

提供的本发明所述的核酸分子和载体可以是从其天然环境分离和/或纯化的基本上纯或均一的形式，或是不含目的或来源物种中除编码具有所需要功能的启动子的序列以外的核酸或基因。根据本发明的核酸可包括基因组DNA并且可以是全部或部分合成的。术语“分离”包括所有这些可能性。

用这些DNA片段转化植物，所述片段包含序列SEQ ID NO 1-5的至少一个、与所述序列中的一个功能性同源的序列、或与所述序列中的一个具有至少90％同源性的序列，可通过已知的植物遗传操作的标准技术制备转化的植物。采用任何合适的技术将DNA转化到植物细胞中，例如利用其天然的基因转移能力的土壤杆菌属(Agrobacterium)携带的无害的Ti质粒载体，粒子或微粒轰击、显微注射、电穿孔、直接的DNA摄取的其他形式、脂质体介导的DNA摄取。转化植物细胞的物理方法的综述见Oard，1991，Biotech.Adv.9：1-11。

转化后植物可例如从单个细胞、愈伤组织、叶盘，按照现有技术的标准再生。几乎任何植物都可以完全地从植物的细胞、组织和器官再生。可获得的技术的综述见Vasil等，Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，Vol I，II，和III，Laboratory Procedures and Their Applications，Academic Press，1984；Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，1989；或Clapham等，GeneTransfer by particle bombardment and Embryonic cultures of Picea abies and theproduction of transgenic plantlets。Scandinavian Journal of Forest research 15(2000)151-160。

转化技术的特定选择由转化某种植物物种的有效性和实施本发明的人员的经验和偏爱依据选择的特定方法来决定。对于本领域技术人员来说对将核酸导入植物细胞的转化***的特定选择，以及植物再生技术的选择，或转化植物的后期操作的技术选择对本发明而言都不是最重要的，或将限制本发明。

实施例

1.实验体系

木质部发育是已经在几个体系中进行了研究的植物发育的专门形式，包括拟南芥属(Arabidopsis)和百日菊属(Zinnia)。然而杨树体系的体内研究比较好，因为杨树茎的高度组织化的结构使得能够对确定的发育阶段的特定组织进行精确和准确地采样。

次生木质部是高度组织化的，且不同细胞系的发育在空间上严格协调。本发明人已经采用冷冻切片机从形成层区域分离确定的发育阶段的不同组织，制备了新鲜重量为大约0.5mg的切向30μm冷冻切片。这种解剖技术制得的样品富含分化的特定阶段的细胞，如附图2所示。收集5个样品以包括木材形成的个体发育：A)分生细胞、B)早期扩展、C)晚期扩展、D)早期次生壁形成，和E)细胞成熟的后期阶段。

像其他的分生组织一样，维管形成层(附图2，A区)的主要功能是细胞***和设置分化的模式。但不像顶端分生组织，维管形成层含有两种形态学上不相同的原始细胞：轴向伸长的纺锤状原始细胞和等径射线原始细胞。两种原始细胞的平周***形成韧皮部和木质部分子的的径向细胞系。纺锤状原始细胞衍生物组成轴向细胞体系。在被子植物树木例如杨树的木材中，这由两种细胞类型组成：具有水分运输功能的导管分子和机械支持茎的纤维。射线原始细胞形成水平定向的射线细胞，其主要功能是平行运输韧皮部树液提供的碳水化合物和木质部树液提供的矿物质。当茎的直径加大时，需要更多的原始细胞。拟横向的垂周***形成纺锤状原始细胞，其导致子细胞的缩短。所以纺锤状原始细胞在形成层的分生组织中***和延长。

在细胞扩展区，形成层衍生物依据细胞的类型以不同极性扩展(附图2，B和C区)。发育中的纤维放射状地扩展，且通过尖端生长增加长度，而导管只在径向扩展。导管扩展快速，并且比纤维扩展更广泛，从而产生这些细胞形态上的特征。导管分化的进程也比同步化的纤维和射线的发育更快。因此导管已经在C区形成次生壁而在E区完成其成熟。在***和扩展的阶段中(A、B和C区)，需要在杨树中主要由纤维素、半纤维素和果胶组成的初生壁的持续生物合成。接触导管的纤维分子和射线细胞(接触射线)比不接触导管的纤维和射线细胞(分离射线)分化略快。因此，C区含有初生和初生+次生壁细胞类型的混合物。

一旦细胞扩展结束，次生壁就沉积在所有的木质部细胞(D区)内。这个发育阶段的一个特征是存在于初生壁中的纤维素微纤丝的随机组织化现在转变为次生细胞壁中高度组织化的螺旋状结构。次生壁的纤维素和半纤维素构架积累在几个壁层(S1、S2、S3)中，这可从纤维素微纤丝取向的程度识别。在次生壁增厚的最后阶段，纤维素和半纤维素网络中的间隙从细胞角落开始向内进行木质化。在次生壁形成过程中，木质部分子也广泛地雕刻以形成凹和孔的网络，其允许导管/导管和导管/射线接触。这种活性涉及初生壁的降解模式。在成熟过程结束时(E区)，纤维进入程序性细胞死亡，(在C和D区导管更早进入程序性细胞死亡)。相反，射线细胞持续木质化周围的细胞，并在边材中保持活性几年。

2.启动子克隆和测序

本发明人通过进行组织特异性转录物谱分析解决了鉴定组织特异性启动子的问题。通过冷冻切片使获得富含特异性细胞类型的样品成为可能。组织的构成性质和冷冻切片技术结合提供了富含特异细胞类型的样品，从而使得我们能进行组织特异性转录物谱分析。

本发明人克隆了杂种白杨(欧洲山杨×美洲山杨)中5个基因的5’上游序列。基于cDNA微阵列分析(Hertzberg等，2001 PNAS)，这些基因都在木质部(木材)形成的特定阶段表达。建立一系列选择标准以保证所要的结果。选择标准包括：EST必须在拟南芥蛋白质组(proteome)中具有BLASTX命中结果，表明EST含有完整的可读框(ORF)，这样才可能含有完整的转录物；EST必需具有基于cDNA微阵列数据(Hertzberg等)显示在目的区域清楚的差异表达的表达模式，以及也具有很强的杂交信号，表示启动子驱动强的EST表达。

5个基因I-V由下面表1列出的EST’s表示。在表中，也显示了用于克隆的启动子片段的名称，和启动子主要具有活性的区域。

表1.

GeneBankESTnr	内部ESTnr:	表达的区域	克隆启动子的名称	附图1中的基因编号
GeneBankESTnr	内部ESTnr:	表达的区域	克隆启动子的名称	附图1中的基因编号	AI162215	A014P10U	C-D	LMX2	1(图.1a)
AI163548	A044P26U	C-D	LMX3	2(图.1b)	AI162215	A014P10U	C-D	LMX2	1(图.1a)
AI163548	A044P26U	C-D	LMX3	2(图.1b)	AI163880	A050P49U	D-E	LMX4	3(图.1c)
AI164126	A055P19U	C-D	LMX5	4(图.1d)	AI163880	A050P49U	D-E	LMX4	3(图.1c)
AI164126	A055P19U	C-D	LMX5	4(图.1d)	AI161513	A001P79U	A-B	LMP1	5(图.1e)

AI163548 EST的表达模式是基于AI162928(A027P19U)的表达模式的，所述AI162928(A027P19U)是来源于相同基因的EST。

用RNA印迹分析对这些基因在植物不同部分的表达模式进行分析。数据表明基因LMX2-LMX5都主要在次生木质部中表达。LMP1基因具有更广泛的表达模式，但是正如微阵列分析所示的，其在含有维管形成层(3和5)的样品中具有最强的信号。这些结果表明这些基因主要在形成层细胞分化过程中表达，而不是在其他过程中表达，这是进行进一步研究和克隆这些基因的5’区域(启动子)的前提。

RNA印迹分析、材料和方法

采用基于CTAB的方法制备总的RNA(Plant Molecular Biology Reportervolume 11(2)1993)，以及随后采用QLAGEN Rneasy植物微型试剂盒纯化RNA。使用Ribo GreerRNA定量试剂盒(Molecular Probes Eugen，Oregon)测定RNA浓度并用琼脂糖凝胶分析检查RNA质量。从甲醛琼脂糖凝胶上分离不同样品的等量RNA(15μg)(Sambrook，J；Fritsch，E，Maniatis，T.，Molecular cloning：A laboratory manual，Cold Spring Harbour Press，New York，1989)。根据标准方法将RNA印迹至Hybond-N+滤器上，并使其UV交联至滤器上。从EST克隆回收EcoR1/Not1片段。用Ambion的Strip-EZ^TM DNA标记试剂盒标记片段。在65℃在Church缓冲液中进行杂交(Church，G.M.和Gilbert，W.GenomicSequencing，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81.1991-1995，1984)。然后将滤器用0.5％BSA，1mM EDTA，40mM NaHPO₄pH 7.2，5％SDS洗涤两次15分钟(于65℃)，再用1mM EDTA，40mM NaHPO₄pH 7.2，1％SDS洗涤4次5分钟。采用磷光成像仪(phosphoimager)(Molecular Imager system GS525)分析杂交结果。每个滤器最多使用两次，并在再检测之前用Strip-EZ^TM DNA试剂盒的方案脱色(strip)。

启动子克隆和植物转化

采用Clontech的通用GenomWalker^TM试剂盒根据产商的建议克隆上游基因组DNA序列。构建和使用8个基因组步移文库。将最长的或在某些情况下将最特异性扩增的片段克隆进pGEM-T-easy载体(Promega)，然后测序。测序后将EST克隆和推测的翻译起始密码子(基于拟南芥蛋白质组的最佳blastx命中结果的起始密码子)在序列上作图(附图1，见序列1-5)。基于此，从杂种白杨基因组DNA通过PCR克隆推测的启动子，随后与pPCV812.km(R.Walden，C.Koncz，J.Schell.Methods in Plant Moll Cell Biol.1，175(1990))连接或pGWFS7(M.Karimi，D.Inze和A.Depicker.Trends in Plant Sciences 7(5)193-195，2002))连接，以制备转录启动子GUS报告构建体。考虑到5’端序列范围为从1093至1807bp，启动子片段从起始密码子上游10-50bp处至在5’尽可能远处进行设计。将这些构建体通过土壤杆菌转化入杂种白杨克隆T89，且生成转基因植物(Nilsson O.等，Spatial pattern of cauliflower mosaic virus 25S promoterluciferase expression in transgenic hybrid aspen trees monitored by enzymatic assayand non-destructive imaging.Transgenic research 1.209-220(1992))。生根后，将植物盆栽到50％的膨胀粘土(Leca attklinker，尺寸2-6mm)和50％的土壤(Weibulls kronmull，YrkesPlantJord)中，在温室中以18小时光照和6小时黑暗周期生长，其中采用Osram Powerstar HQI BT 400W灯作为补充光源。

GUS分析

为了使GUS报告基因的表达可视化，基本上根据Nilsson等(TheAgrobacterium rhizogenes rolB and rolC promoters，Physiologia Plantarum 100：456-462(1997))和Regan等(Accurate and high resolution in situ hybridization analysis ofgene expression in secondary stem tissues，Plant J.19，363-369(1999))在X-gluc中染色组织切片和部分。植物再生过程中启动子LMX5的最初结果显示维管相关的表达(在拟南芥和杂种白杨中)，且LMP1的结果显示在拟南芥中维管相关的表达和在杂种白杨中根-和顶端分生组织相关的表达。

这些结果表明顺式作用元件对于木质部相关的表达是必需的，这些构建体中都包括所述顺式作用元件，这并不是显而易见的，因此当这些序列的位置可在转录起始的上游(5’)和也可在3’时，是个令人惊奇的结果。

在前一年内，在更大的2-3m高的植物中进一步和更详细分析了Lmp1和Lmx5启动子，显示这两个启动子各自的高度特异性表达模式。在Lmp1 Gus品系的茎中Gus活性主要存在于形成层细胞+扩展的发育中的木质部，而在生产次生细胞壁的嫩细胞中程度少一些。Lmx5具有相反的表达模式，在产生次细胞壁的嫩细胞和在形成层和扩展的木质部细胞中较低表达。Lmp1和Lmx5都在所有的形成层和嫩次生细胞壁形成细胞中表达。

这两个启动子都在枯萎的顶端以及叶子和根的维管结构中具有活性。这些启动子都不在顶端分生组织中有任何表达，但两者都在嫩木质部中表达，特别是Lmp1，其在接近顶端分生组织的发育中的维管结构中表达。Lmx5也在发育中的维管结构中表达但是是在后期。

在杨树转基因的后期组织培养物中分析Lmx2、Lmx3和Lmx4。将这三个启动子克隆到pKGWFS7载体中。Lmx2在叶子茎和根的维管结构中表达。其也在根尖表达。在茎中，其看来主要在形成层一直到次细胞壁形成细胞中表达。Lmx3具有相似的表达模式，显著的差异是其不在根尖表达，而是在距离根尖约0,5至7mm的根的维管结构中表达。Lmx3也在顶端分生组织和嫩叶原基中表达，且随后在限于维管结构的叶子和初生茎发育中表达。Lmx4基因在组织培养物的嫩组织中较低表达，然而在维管结构中的表达清晰可见，特别是在分析样品的最老部分的维管结构中。虽然本发明已经关于构成本发明人所知的最佳模式的优选实施方案进行了描述，但应理解可以进行对于本领域普通技术人员显而易见的多种变化和修饰，而并不偏离由所附的权利要求阐明的本发明的范围。

参考文献

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Walden，R.，Koncz，C.，Schell，J.，Methods in Plant Moll Cell Biol.1，175(1990)

Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，1989

序列表

<110>SWETREE TECHNOLOGIES AB

HERTZBERG，Magnus

<120>组织特异性启动子

<130>MH52669

<150>SE0301233-3

<151>2003-04-28

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1093

<212>DNA

<213>欧洲山杨x美洲山杨(Populus tremula x tremuloides)

<400>1

atccctccta ttaaatccat ctaattgtat ggaaaggatg gatttataaa attacatagg 60

tttrcattga taatatttcc aatatttaaa attaaatggt catcatcatt cgattaattc 120

acaatattta gtcctgtcta atcatagaaa tcttgtctcc gtacatgaaa gttgattaaa 180

aataaataag ttattaatct tattagttaa tttgatgtat tgattcatga gtttagtaga 240

tttatccatc aaatctaata tgtatttttt tagtttttgg ttcattgatt tttctaattg 300

tttttttatt ttactatttt tcagtattgr attgtttaaa aaataaaatt tatagtttat 360

tttttttttc tatagagcta tcactatctc aataaatatc tttttagagt tggtgtttga 420

ttttgtaaac atcaaatttt atcataaaat taaataaaaa taatttataa aaacaacaaa 480

gtttaaacct attgaaatct ataacccaag tcacaaagtt accaaaactt atttaatttg 540

gtatcatctc aataataatt aaaaaattat tgttttaatt tttttttaaa tctatcatat 600

tttaactaat tatttaaatt atctttgaac ttattaaatt aaattrttca tgcttgttag 660

agaaaatatt ctactaataa ataacttttg tcatactaag tcatgaaaaa tgtgatcttt 720

aatgatacaa gaacagaagt ccaaaagcag ggggggtaaa gaaagggaga ggttgcctat 780

atatttgcct tacacttact ctacaaggaa ccttttgcac ctaatgagcg taataaatag 840

tatagcayga tagcaatagc acaatagctc agaaatgata tagcttctaa ctaatataga 900

agacaacacg agcccaagat gttagccctc caacttatgc caccctaacc tgcgtttata 960

ctctaaaaag ataaatgtag aaaaaaagtg aaaacctaac tgtacatggc tttagcttta 1020

ctcctactca aacagccata aaaaatccca aaacgaggcc tctaaaagtg tcctcatcat 1080

tctgttgctt cag 1093

<210>2

<211>1245

<212>DNA

<213>欧洲山杨x美洲山杨(Populus tremula x tremuloides)

<400>2

gaattcataa taattggatt ggacttgtct attttcttta gagatttatc aattgtgttt 60

tattttttaa catttattaa attaaatgga ctaggactat acatacctta tctatgatgt 120

atttagtatt gcgtttcaaa taggggttga ataaattttg aattttattt ctgtttaaaa 180

ttattttttt tatgttttca aatcgttttg atgtgctgat atcaaaaata attttgaaaa 240

aaatatatat tattttgatg tatttttgaa taaaaaatac tttgaaaaac aactggttat 300

tacagtctca aacactccta gtagtcttag gcatagttta aaactcagtc cgacctggcg 360

ggtcgacttg ggactggaac cgggccgagt taaagaaaaa aataaaaaaa gaaaaaactt 420

ggtgtgacct ggtgactcgg ttgacccaga tgcaacccat tgatttttgt tttttttaaa 480

ctaaaattac attgttttgc ttttttaaaa aaaaaaattg acccgtcaaa cctggtcaaa 540

acccggaatc gaggtcttgg accgggacgg gtctaaaaac tatgatcttt ggtcaatata 600

ttaagacaac aaggtcaaat taaagggtaa tcaaaggaga gttttttttt ggttggttgg 660

ttggttttgg acctaatcat acaatcataa aataatcatg gatcaaaatg taggtaattc 720

aatcatggtg tgtaatagat tttttatatg atcatgtgtc accagctagg tctttttcca 780

aaattctaac aagaggttgg tatatgtaat aaaattatct ttaaacagac acaacccaca 840

ccctctataa ttaatcttaa caacaagtta atataaaaca attttttttt tttgtctaaa 900

tatattttgc tgaygggtag catcccacca actatctggt gcagatagca actcaagtcc 960

ttcccaataa acacattttt ccatgattcc tttcacttca agtgacaact aaacgaagca 1020

aagcctcgtc aaattaaaaa aaaaaaaaaa agggttccga ataatcataa tgtggctttt 1080

gagtttgcca gtacctgtca tcgaccrgtt agcttcaacc tccgcaaaaa aacatacagc 1140

ttcgctataa aacaactcct tgtttattaa ttgttgtctt ccacrtctct caatctctct 1200

caaagaatcc ctttcttttt cctcaaaact caggggtcag tatct 1245

<210>3

<211>1133

<212>DNA

<213>欧洲山杨x美洲山杨(Populus tremula x tremuloides)

<400>3

atcagcgcat caaaattatc taaaaacatt aaaagtatat taatttcaag aaaaaaaata 60

aaaaaattta aaaaaaattt acaaataaat ttaaaattca aatacaaaac agattgatat 120

agaatttact attaattata cctctataag cagagacata atattctctt ttgagaaaca 180

aaatattatt ataattgata ttccaacaaa aaaacaaatc aatctcttta ttttagaaag 240

taaaataact tataattgtt cataattgtt tgtagatgga cgtcatgttt gtcgggggta 300

gacgccctct tggttaaaat aaaataaaaa aataattttc taatcttatc caaaatttgt 360

aacctctgyc aactgaaata tagtattctt agaattgata ttttaaatga aatccaaatg 420

cttagaattt attttagcca tgttgatgag aaagtcaagc accccattaa ataaaataaa 480

ataaaataaa aaattacaag gtaattatgc acctagaaat ttttattttt ttaatataat 540

aatacccctt tctgactgga aaaggctgcg aggttgtcat tcacacaaca aatatcagct 600

atttcaggat ccatcgcagt actcgcaatc ttcacattta gcaaaatcag agcagcgtat 660

gccctgtttt tttcaccttt ttatcgcact aatcctagag acgaacagtg tttattgttt 720

ttctcttaat atttgacctt ttcacttatt ygaaaagtca aatgttaatt tccaccgagc 780

tttatcctgt aaatagcgtg tttaatgcca gctgtaaata agatagatga tcgattttgt 840

atttacattc tcttatctta gacggaaagt tattaaaaaa ataaaataaa atagaaacct 900

acctaagatg tgaactcttg gcgtctctag ctgtttctgt ctctagaaca acctctacga 960

gtatagccga agcatatcct agcaagcttg aaccatatct actacctccc tccccgctat 1020

atatatataa accactcttc ttcctagaaa aaaaataacc ctcgatcttt ctttcttgtg 1080

cttatgttga ttttgtttga ttttcatata tcatgagcaa tataccaaga tct 1133

<210>4

<211>1807

<212>DNA

<213>欧洲山杨x美洲山杨(Populus tremula x tremuloides)

<220>

<221>misc_feature

<222>(616)..(616)

<223>未知氨基

<400>4

gatgcaaaag ctggaatgag aatgcgctaa atgcgaaaag acagagagag cgaataaatc 60

gtgcaaaaaa aggagtgggg tgggtaacgg gttgagctag aagaagaaaa gggacaagtg 120

cactttagga ggggggcaac cagagcgtag atgataatgg ttcatgtgga aacaacacac 180

atgagcagtt ggtgagaact tgaatgaacc ctaacagccc aaccaaaccc ggagccaccc 240

ttaccgaacc accacttcta aaagtacacc atgccttttt cttgagcytg gttgcacagg 300

gtgccrggtg gggttgtttc gttttgggta atcatgcgat agtttaaata cctttgcgat 360

aatcatatca atggygactt ttaagcacat gttaggtgct cggttcttat ctaaacatgg 420

acatggcmac aagagttaat gctaaaataa tatacgtaca tacctgtgaa tgaatcgtcg 480

ctgtcttctg attatggctt caaattaata tgcagataaa caagtgtcga tttttcagtg 540

aagattttat gaaagtgccc gttctcctta agattacctg tgaatgaatc atccctgtca 600

ggctgatcct gggtgntttt tccccatgrt gttcggaaga tataattata taaatgatgg 660

aatttacatg aaataagttt cagtacattc ttagcagaaa agcaatatcg acgaagacaa 720

atgatgctgt ttaagacaaa ctggggtaat atcaatttac tagtaagaga tttgkctgct 780

tttcttaatt ctcaagaaac ttycactaaa atgcacagcc atgttaaaca atttacgttc 840

aacttaaaaa ctaaaactgc aggatgggta gctatccaag aatgattaat aaacgatttt 900

aacaaagaac tacgtttttt gtaaacttaa ttttgatggg catgtagtta acaagtattt 960

gtcattgatc aattcaagag ccatgtctgc atcataattg tgggagtgga ggaggctttt 1020

gttgctaggg aaggaatgcc ttcttagttc atggctttgg acttcggaca aggagcgcat 1080

agaatggggt taccattttt gaaaaaaatt acatttgaac cctccaacta ttatcatgta 1140

tgtttaatct acaatcctcg tccgctagaa gaagtttggg ttcaaagtca tccgctcaat 1200

gtaaaccatg gagaggcagg gactaattga aaatagtatg ttagttggag ggtctgcatg 1260

tattatgtcc aaacattctc ttattattcc tgtatcatct ctgagaaatt catccgaaaa 1320

taataaaaca aaatggcctt ttttaaaaaa agaagctgat gcataggata ccaaaagcgc 1380

cttgtccatt aggagcgtca gactttgaaa ataagaccaa taattccctg taagctatca 1440

tctcatcttt tattttgttt gaacttgtag acgtaggctt taagcgttcc atgatgttca 1500

gtcacatgtt gctgtctact tgattatgga atttaattca ttcggctcat aagaagataa 1560

aaggattatg acgttgaaga actctggtca ctccttactt acggtcacat aaaaacgatg 1620

catctttccc caccaaccat cttcaagtga acccactttc ccttgcatta ggtaaggagt 1680

atgggttaag tcatcttcat gaaattagtc ccctagtgga gctaattcta ctcactccat 1740

atttactcat tccactatat aacgccctca acgaccatcc tcaaagcaac ccaaacacct 1800

tcttctc 1807

<210>5

<211>1494

<212>DNA

<213>欧洲山杨x美洲山杨(Populus tremula x tremuloides)

<220>

<221>misc_feature

<222>(337)..(337)

<223>未知氨基

<400>5

tctgcttatg aatggcatgg acaacaagct ctgcattttc gcccatttgc accacaaaat 60

cgttgtgtga agatttttga agggcaccag cacaactttg aaaagaactt gtgaaaagat 120

agctggtcac cagatggaag caaggttact agtgcagatc gcatggctta tatatgaatc 180

tgtcaatgag tgtgtcttcc acctactgaa cctatctttg gatcatgcag cagcgacaaa 240

cagatttatc ttggggaaat ctgattacta ttttgtcagt ttgcttaaaa cgagttgtta 300

gtaacagtga ggatattycg gggcttgctt gtgagcnccc aacagaaaag attaaacagg 360

ttgtaatgga tactatgtta cattttactt aactttctca tatcctgctg acatgtttgc 420

agttcttttt tgcttgttgg cgatcctttt caactgaagt atgtacgcat gaatcaatta 480

gctcaaaatg tatgttcgag caatatgcct ggtgaatgtt tgttaagata cggaaaatta 540

agttactgaa cttgtactct ttgattttga aacaagtttc cgactatgtt cattgtccta 600

gcacggtgat attgatacgt cgaattttca actatttttg tcttgttttc aactatttct 660

gtcttgattt tcaaagtctt tttgaaaata aaaaacccaa aaatatgttt tcagtgtctt 720

gttagctaaa tctgttgtac aaccaagcct ccccgacttg ctttgtgaaa aagaaagatg 780

ggagctgggg gttttgtgtt gattatacaa aaccttacga gataactgat atacaagcaa 840

aaacaccctc atattattga atctgcgact tctacagttc atttctgagg aagaattagg 900

tgactacttt ctggactaga tatttccgtg ttcaatgcgt cgcaacaatt gatttgttgg 960

ctggattatg aacatgataa tcacactata gaaagacgac gattatattt caagctatgg 1020

acaatgatgt tacctgctcg aagatcaata cgcttgaagg ccaagatatg atcascaggt 1080

atgcaggcag tccagatggc ttcttgggat atgagcttca agattgttct tgaaaagaac 1140

caaataaatt gtaaaattct ctgggaatat ttttttgtaa aattatcagc attgctattt 1200

tttttttcaa attcatttaa atattgctat tgggttagta gttcagcgca attaacttag 1260

ctggcagtct ggcattagct tcaaatcata tcacaacgtt aaaagcagcc gttgcaacta 1320

gtcagcccac tagcatttgc tggtgaccaa tcagatcata aaaggaaaac tagccgttgg 1380

caaaccctct ttcaacggtc atctccctgc ttcatgatat atatgcttag atatcccagt 1440

atccccttca acaaattatc tcaatcttca aaacccagtc cccagttaca gcag 1494

Claims

1.一种包括在植物的木质部形成组织中特异性表达或具有活性的启动子序列的分离的核酸序列，其特征在于所述序列选自：

-SEQ 1D NO 1至5

-与SEQ 1D NO 1至5中任意一个功能性同源的序列

-与SEQ 1D NO 1至5中任意一个显示至少90％同源的序列。

2.根据权利要求1的核酸序列，其中所述的序列在植物木质部形成的特定阶段表达或具有活性。

3.根据权利要求1或2的核酸序列，其中所述启动子序列在植物中表达或具有活性。

4.根据权利要求1或2的核酸序列，其中所述启动子序列在木本植物或纤维植物中表达或具有活性。

5.根据权利要求1或2的核酸序列，其中所述启动子序列在木本植物中表达或具有活性，所述木本植物是双子叶植物。

6.根据权利要求1或2的核酸序列，其中所述启动子序列在植物中表达或具有活性，所述植物选自杨树、白杨、桦树、柳树、桉树、枫香(枫香树属)、云杉、落叶松、铁杉、松树、棉花、***、剑麻、亚麻、小麦、玉米、马铃薯和油料种子油菜。

7.一种与所述植物的野生型相比显示修饰的木材形成特性的转基因植物，其特征在于将权利要求1或2所述序列的至少一个功能性***所述的转基因植物中。

8.一种与所述植物的野生型相比显示修饰的细胞凋亡特性的转基因植物，其特征在于将权利要求1或2所述序列的至少一个功能性***所述的转基因植物中。

9.根据权利要求7或8的转基因植物，其中所述的转基因植物是木本植物或纤维植物。

10.根据权利要求7或8的转基因植物，其中所述的转基因植物选自杨树、白杨、桦树、柳树、桉树、枫香(枫香树属)、云杉、落叶松、铁杉、松树、棉花、***、剑麻、亚麻、小麦、玉米、马铃薯和油料种子油菜。

11.一种在植物的木质部中表达特异性基因的方法，其特征在于采用权利要求1或2中所述的至少一个序列。

12.一种生产转基因植物的方法，其特征在于将根据权利要求1所述的至少一个启动子功能性***所述植物中。

13.根据权利要求7至10中任意一项所述的转基因植物的繁殖材料，所述繁殖材料的基因组中携带至少一个所述的序列。

14.根据权利要求13的繁殖材料，所述的繁殖材料选自种子、果实、植物的插条和部分，例如原生质体、植物细胞、愈伤组织或根。

15.包括权利要求1或2所述序列的核酸构建体。

16.根据权利要求15的核酸构建体，其中构建体包括选自质粒、粘粒、病毒或噬菌体的载体。

17.能够在严格条件下与权利要求1或2所述序列中的至少一个杂交的核酸序列。