CN1771258A - 稻新基因osisap1赋予对应激的耐受性及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从稻中获得的新基因OSISAP1的鉴定、分离、表征和应用，及其相应的新的蛋白序列。本发明也涉及过表达稻中编码锌指应激相关蛋白的新基因OSISAP1的方法，在转基因植物***中赋予对盐、冷和干旱应激的耐受性。本发明还涉及具有包括新基因OSISAP1的基因组的转基因植物、植物组织和植物种子以及生产该植物和植物种子的方法。

Description

稻新基因OSISAP1赋予对应激的耐受性及其方法
发明领域
本发明涉及从稻中获得的新基因OSISAP1的鉴定、分离、表征和应用，及其相应的新的蛋白序列。本发明也涉及过表达稻中编码锌指应激相关蛋白的新基因OSISAP1的方法，在转基因植物***中赋予对盐、冷和干旱应激的耐受性。本发明还涉及具有包括新基因OSISAP1的基因组的转基因植物、植物组织和植物种子以及生产该植物和植物种子的方法。
背景和现有技术参考
高等植物为固着生物体，它们扎根在土壤中且不能离开周围的环境条件。它们经受着寒冷的冬季、炎热干燥的夏季、淹没它们的洪水、土壤的盐度以及使它们脱水的干旱。但是，植物数百万年来一直如此，它们能够通过利用一系列的进化机制抵御应激来适应这样的环境。它们甚至进化或者限制其生命周期为服从生长的几个月，或它们在这些月中完成生殖期，且进入为克服应激期而限制新陈代谢的时期。由于不断增加的世界人口和污染，环境条件正迅速改变。对食品需要和消费者选择的增加使农作物植物在其并非天然适应的，导致多种应激区域种植成为必要。
所有形式的应激对植物发育和产量有负面影响。植物通过降低叶子生长和抑制细胞***及增殖而对盐分作出反应。根细胞渗透压的降低导致植物对水吸收的抑制和脱水。随后，过度的盐分累积导致组织、器官和最终整株植物的死亡。寒冷应激阻碍植物生长，带来细胞自溶和衰老，以及对花诱导、花粉生成和萌芽产生有害效应。寒冷和干燥应激损害了细胞膜。氧化应激针对膜、蛋白和DNA。
植物的发育和存活被环境条件的改变即温度的浮动、水的缺乏、盐度、洪水、金属毒性和机械损伤等不断挑战。为了克服这些灾祸，植物引发复杂的生理和分子反应。应激被感知并通过信号分子链传导，最终影响应激诱导基因的调控元件启动包括转录因子、酶、分子伴侣、离子通道和运输分子等不同种类蛋白的合成或改变其活性。这种受一组基因调控的级联事件以及它们复杂的调控帮助***克服不利的条件。根据一些估计，植物拥有大约25,000到55,000种基因(Kamalay和Goldberg，1980，1984；The Arabidopsis Genome Initiative，2001；Burr，2002；Goff等人，2002；Yu等人，2002)。其中许多为在所有组织中表达的“管家基因”，而其它的为组织特异性的或受环境因素调控。为了理解植物发育的过程和它们对环境应激的反应，需要了解关键基因的功能和它们在生命周期的不同阶段的调控(Ausubel，2002；Ronald & Leung，2002)。传统的突变遗传学和相应基因的克隆以及新方法如差异筛查、差减杂交、差异显示、微阵列分析和反向遗传学，已经用于克隆这类基因并定义它们的功能(Brent，2000；Tyagi和Mohanty，2000；Aharoni和Vorst，2001)。
稻为最重要的食品农作物以及单子叶***模型(Khush，1997；Tyagi等人，1999；Cantrell和Reeves，2002)。然而，为了跟上不断增长的世界人口的步伐，稻的生产在未来25年中应当增长60％。将由于生物和非生物环境因素的损失减少到最小不仅可以帮助提高净产量，还可以在边缘和非耕种地带扩大稻的栽培(Khush，1999；Tyagi和Mohanty，2000)。因此，植物的生产必需表现出对多种非生物应激的耐受性/抵抗力。因此稻的功能基因组是重要的研究领域，由此定义了植物发育和存活中涉及的新基因的功能。与环境应激反应相关的基因的发现提供了使稻和其它农作物具有更好的耐受性/抵抗力的基因工程新靶标。因此，需要分离和鉴定稻的新基因并鉴定这些新基因的不同功能。采用不同的筛查策略来分离以器官特异性方式表达或应激诱导的优良的印度稻中的基因(Oryza Sativa L.var.Pusa Basmatil)。在本发明中，我们描述了新基因OSISAP1的识别、分离、鉴定和应用，该基因编码一种在不同器官中差异表达或由几种应激诱导的锌指蛋白。因此本发明也涉及一种过表达稻的编码锌指应激相关蛋白的新基因OSISAP1的方法，在转基因植物***中赋予对盐、寒冷和干旱应激的耐受性。本发明还涉及具有包括新基因OSISAP1的基因组的转基因植物、植物组织和植物种子以及生产该植物和植物种子的方法。
发明目的
本发明的主要目的是在稻的不同器官中应激诱导的新基因的鉴定、分离、表征和应用。
本发明的另一目的是分离、鉴定和应用稻(Oryza Sativa)中的OSISAP1 DNA序列并确定为SEQ ID NO：1。
本发明的另一目的是推导来自SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列OSISAP1的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的多肽。
本发明的另一目的是构建一种在组成性CaMV 35S启动子的调控下的含有稻OSISAP1 DNA序列的植物重组载体，以向多种植物中导入。
本发明的又一目的是提供一种用所述的植物重组载体DNA转化植物，从而生产表现出对多种非生物应激的耐受性增强的转基因植物。
另一目的是提供一种通过导入新基因OSISAP1 DNA而改良烟草和其它植物而提高对多种非生物应激的耐受性的方法。
另一目的是提供一种改良烟草和其它植物的方法从而提高对寒冷应激的耐受性。
另一目的是提供一种改良烟草和其它植物的方法，从而提高对干旱应激的耐受性。
另一目的是提供一种改良烟草和其它植物的方法，从而提高对盐应激的耐受性。
本发明的另一目的涉及具有包括导入的SEQ ID NO：1所示的稻OSISAP1 DNA序列的基因组的转基因植物、植物组织、植物种子及其后代。
本发明的另一目的是提供一种用重组载体将所述DNA片段转化到植物基因组中来生产转基因植物的方法。
本发明的又一目的是提供对选自寒冷应激、干旱应激和盐应激的多种非生物应激耐受性增强的转基因植物。
本发明的又一目的是提供生产具有包括新基因OSISAP1 DNA的基因组的转基因植物、植物组织和植物种子。
本发明的又一目的是提供生产如稻、番茄、烟草等耐受非生物应激的植物的方法。
发明简述
本发明涉及从稻中获得的被几种应激条件诱导的新基因OSISAP1的鉴别、分离、表征和应用，及其相应的新的蛋白序列。
本发明的另一方面也涉及过表达SEQ ID NO：1所示的编码锌指应激相关蛋白的稻新基因OSISAP1的方法，在转基因植物***中赋予对盐、寒冷和干旱应激的耐受性。该方法涉及用在组成性启动子调控下的新基因OSISAP1来转化植物。尽管可以采用任意的转化方法，在该方法的优选具体实施方式中，用组成性启动子调控下的含有OSISAP1DNA序列(SEQ ID NO：1)的重组载体转化根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)宿主细胞并培养该细胞。根据现有技术中已知的良好建立的方法将转化的根癌农杆菌细胞用于转化植物细胞。作为在此举例说明该教导的特定实例，揭示了已经用稻新基因OSISAP1成功地转化了烟草。
转化的植物表现出对如寒冷、干旱和盐等多种非生物应激增加的耐受性。
本发明的另一方面也涉及具有包括新基因OSISAP1的基因组的转基因植物、植物组织和植物种子以及生产该植物和植物种子的方法。
本发明还涉及用新基因OSISAP1 DNA转化如稻、番茄等的植物的方法，以赋予对非生物应激的耐受性。
发明详述
相应地，本发明涉及一种从稻中获得的新基因OSISAP1(SEQ ID NO：1)及其相应的新的蛋白序列(SEQ ID NO：2)以及一种过表达所述的编码锌指应激相关蛋白的稻新基因OSISAP1的方法，赋予转基因植物***对盐、寒冷和干旱应激的耐受性。本发明进一步涉及具有包括新基因OSISAP1的基因组的转基因植物、植物组织和植物种子以及生产该植物和植物种子的方法。
导致耐受性的应激感知和信号传导涉及不同基因产物复杂相互作用。我们在此描述了无内含子的稻新基因(OSISAP1)的鉴别、分离、表征和应用，编码由不同类型的应激即寒冷、干燥、盐度、淹没、重金属以及损伤等早期诱导的锌指蛋白。该基因也被应激激素脱落酸诱导。转基因烟草中过表达该基因赋予了在籽苗阶段的对盐、寒冷和干旱应激的耐受性，这通过绿色籽苗的百分率、籽苗的鲜重、发育模式和叶绿素含量表现出来。因此，新基因OSISAP1(SEQ ID NO：1)是植物中一种重要的应激反应决定因素。
缩写脚注：
OSISAP1，印度稻亚种(Oryza sativa)应激相关蛋白基因；ABA，脱落酸；WT，野生型；BA，苯甲醇；DMSO，二甲基亚砜。
数据存放脚注：
OSISAP1 cDNA存放于GenBank数据库，登录号为AF140722，而基因组克隆的登录号为AY137590。
在文中出现的多种序列的在括号内给出的基因和登录号如下所列：
人AWP1(NM019006)；
小鼠AWP1(AJ251508)；
PVPR3(M75856)；
人ZNF216(AF062346)；
小鼠ZNF216(AF062071)。
附图简述
图1稻新基因OSISAP1核苷酸序列(SEQ ID NO：1)
图2 OSISAP1 cDNA的核苷酸(SEQ ID NO：1)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。终止密码子用星号标记。涉及A20型锌指形成的蛋白的N端保守半胱氨酸残基以及AN-1型锌指的C端半胱氨酸和组氨酸残基用黑体字显示。推定的N-豆蔻酰化(N-myristoylation)和PKC磷酸化位点用下划线表示。
图3稻籽苗的不同应激下的OSISAP1 DNA的表达模式：(a)寒冷，(b)膜流动性的化学调节剂，(c)盐和干燥，(d)淹没，(e)重金属，(f)机械损伤，以及(g)脱落酸(ABA)。在所有实例中用OSISAP1 cDNA作northern杂交的放射标记探针。所有实例中下图显示了为进行等量上样和鉴定RNA质量进行的溴化乙锭染色的rRNA。
图4通过置换1.87kb的gus片段而在载体pBI121中克隆OSISAP1 DNA来产生构建体pBISPAc。用组成性CaMV35S启动子驱动OSISAP1 DNA的表达。该构建体也含有npt11片段，用于植物筛选。这是植物重组载体pBISPAc的图示，未按比例显示。
图5推定转化株的Southern分析。
用EcoRI消化野生型和推定转化株的基因组DNA(10μg)，并用1.2％琼脂糖凝胶分辨(左图)。用放射性标记的全长OSISAP1 DNASouthern杂交后进行放射性自显影。用UT和UD标记的泳道分别代表未转化的野生型和未消化DNA。将25ng EcoRI消化的pBISAPc用作阳性对照，箭头显示杂交片段的预期大小(～1kb)。
图6在CaMV35S启动子的调控下过表达OSISAP1的不同转基因烟草家系的OSISAP1表达水平的确定。用不同转基因系的10μg总RNA进行Northern分析(SAPcL8，SAPcL9，SAPcL11，SAPcL22和SAPcL43)，UT是未转化烟草对照。下图显示了为进行等量上样和RNA质量鉴定的显著的核糖体RNA条带。
图7寒冷应激对野生型(WT)和OSISAP1过表达的转基因系(SAPcL8，SAPcL9，SAPcL11，SAPcL22和SAPcL43)烟草籽苗的影响。(a)21天大小的籽苗在8±1℃下培育15天并转移到培养室条件。15天寒冷应激的恢复后记录寒冷应激籽苗的鲜重。同时记录同样年龄的未应激籽苗的鲜重并作为对照。两组试验的绝对差异列于每一栏的顶端。(b)21天的未转化(WT)籽苗和OSISAP1过表达系在8±1℃应激15天，然后移回MSH恢复。拍摄恢复15天后的WT和5株转基因系的代表籽苗的照片。
图8脱水应激对野生型(WT)和OSISAP1过表达的转基因系(SAPcL8，SAPcL9，SAPcL11，SAPcL22和SAPcL43)的烟草籽苗的影响。(a)在0.3M或0.4M甘露醇中生长的8天的籽苗的相对鲜重。相对于未应激籽苗的鲜重显示鲜重，列出两组试验的绝对差异。(b)在0.3M(上图)或0.4M(下图)甘露醇中生长8天后拍摄的WT和5株转基因系的代表籽苗。
图9盐应激对野生型(WT)和OSISAP1过表达的转基因系(SAPcL8，SAPcL9，SAPcL11，SAPcL22和SAPcL43)的T1后代的烟草籽苗的影响。(a)21天大小的籽苗在250mM NaCl中进行4天盐应激，接着转移回MSH中恢复。恢复8天后，对保持绿色的WT和转基因系进行计数。两组试验的绝对差异列于每栏的顶端。(b)21天大小的籽苗用250mMNaCl进行4天应激，接着转移回MSH中恢复。恢复8天后，拍摄WT和5株转基因系的代表籽苗的照片。
序列表的序列简述
SEQ ID NO：1稻编码锌指应激相关蛋白的新基因OSISAP1。
SEQ ID NO：2 OSISAP1的推导的氨基酸序列。
本发明以识别稻的新基因和调控元件的观点起始。除了几种开始分离的基因之外，一个基因成为本研究的主要目标。从稻中分离的新基因OSISAP1(SEQ ID NO：1)是由多种应激诱导的，编码一种新的应激相关蛋白。
在本发明的一个具体实施方式中，提供了识别和分离在一定发育阶段期间在稻特定器官中差异性表达的基因。在这一指示下，采用多分支策略。除了反相northern和差异筛选，为了分离差异表达基因，进行了随机选择cDNA克隆的northern筛查。在实验室中在Lambda ZAP载体(Stratagene，USA)中构建来自不同组织，即7天的稻籽苗的授粉前或受精后阶段的花序和根的3个cDNA文库。根cDNA文库以低密度在NZY培养基中铺板，并挑取单独的噬菌斑。在单独克隆去除后，重组噬菌体克隆被转变为具有克隆cDNA***物的噬菌粒。这些***物通过用EcoRI和XhoI限制性消化进行检验，所述消化从载体骨架中释放***片段。接着将cDNA克隆***物用作放射性标记的探针与从7天的籽苗的根或芽和授粉前的花穗中分离的总RNA制备的northern印迹进行杂交。用标准引物对表现出器官特异性或差异表达的克隆进行测序。将部分cDNA序列用于在GenBank数据库中检索与已知条目的同源性。采用这一策略，从根cDNA文库中鉴别了3个差异表达克隆，其中之一为OSISAP1，编码一种新的应激相关蛋白。与芽相比，在根和授粉前阶段的花穗中检测出高水平的OSISAP1 mRNA。本发明中对该克隆在分子水平进行了详细表征。
cDNA序列和推导多肽的分析
最初采用标准的载体特异性引物从两端对cDNA进行测序。为测序两条链，用内部限制性内切酶位点对cDNA进行亚克隆。最后采用Clustal方法(用于进行多个序列对比)对序列进行对比，出现了一段844bp的组合(assembled)cDNA序列，命名为OSISAP1(SEQ ID NO：1)(图1)并以登录号AF140722递交到GenBank。用标准方法将cDNA翻译为in silico，共有3个读码框架。由产生长的连续的以蛋氨酸起始的氨基酸序列的位置选择+1开放读码框架，cDNA具有19bp的聚腺苷酸尾巴。当不考虑聚腺苷酸尾巴时，cDNA的GC含量为57.2％。开放读码框架以UGA终止密码子结束。开放读码框架编码具有164氨基酸(SEQ ID NO：2，图2)的蛋白质，预期分子量为17.6.kDa。它表现出与几种锌指蛋白的同源性，包括人和小鼠PRK1相关蛋白 AWP1(Duan等人，2000)， PVPR3(Sharma等人，1992)，人和小鼠锌指蛋白 ZNF216(Scott等人，1998)，Xenopus泛素(ubiquitin)样融合蛋白， XLULFP和 AFULFP(Linnen等人，1993)和海鞘后期终端标志(ascidian posterior end mark)( PEM6)蛋白(Satou和Satoh，1997)。所有这些蛋白在zf-AN1区域都表现出与OSISAP1(SEQ ID NO：2)的同源性，该区域出现在蛋白的羧基末端，在氨基酸100和164(图2)之间延伸。
它具有共有序列Cx2-4Cx9-12Cx2Cx4Cx2Hx5HxC，其中x代表任意氨基酸。然而，发现了几种其它的氨基酸在这一结构域无变化。保守半胱氨酸和组氨酸残基可以形成单个锌指。朝向氨基端有4个半胱氨酸残基(位于氨基酸22、26、38和41，图2)在OSISAP1(SEQ ID NO：2)、AWP1(Acc no.NM019006，AJ251508)和ZNF216(Acc no.AF062346，AF062071)之间是保守的，这一区域类似于A20(细胞死亡的抑制剂)样锌指，其在A20中介导自我结合(De Valck等人，1996)。OSISAP1与人转录因子 NFκBp65亚基的共有序列有40个氨基酸(56-96)的一段也有大约51％的一致性(Ruben等人，1991)。同源性朝向人蛋白质的C末端，在370到410氨基酸之间。
预期的类似OSISAP1的蛋白质也在其它植物种类中发现，如鼠耳芥属(Arabidopsis)和李鼠(Prunus)，但这种相似性主要是由于保守锌指。OSISAP1(SEQ ID NO：2)序列表现出与PVPR3(Acc.no.M75856)(菜豆(Phaseolus vulgaris)发病相关蛋白)锌指最大的一致性(79％一致性)。蛋白没有信号序列，可能是一种可溶性的细胞内蛋白。该蛋白富含丙氨酸(14.02％)和脯氨酸(10.98％)，有17个酸性氨基酸和34个碱性氨基酸，使它成为一种预计pI值为8.64的碱性蛋白。氨基酸序列在氨基酸位置30处具有潜在的蛋白激酶C磷酸化位点，以及在氨基酸位置132处有N-豆蔻酰化(N-myristoylation)位点(图2)。通过Southern分析确定OSISAP1(SEQ ID NO：1)是一种单拷贝基因。
稻基因组DNA文库
为了分离基因组克隆来解开基因组水平的组织和鉴定OSISAP1的调控区域，制备了稻基因组DNA文库。用Lambda DASH II载体(Stratagene，USA)和暗中生长的稻(Pusa Basmati 1种)中分离的高分子量的(～100kb)基因组DNA制备基因组DNA文库。用1μg基因组DNA和不同浓度的四碱基限制性切割酶MboI建立实验性限制性消化30分钟，获得需要量的消化。选择给予23到9kb范围内的最大的基因组DNA成片条带(smear)且具有大约30％的未消化形式的DNA的酶浓度(0.25U/μl的MboI 0.75μl)。通过扩大反应而建立大范围的限制性消化。将大约100μg DNA消化25min，接着将DNA用酚-氯仿抽提进行纯化。将部分消化的DNA同未消化DNA一同在琼脂糖凝胶中分离。为了获得最适合与Lambda DASH II载体连接的片段(9-23kb)，采用消化DNA进行蔗糖梯度超速离心。大小分馏后，将CIAP处理和纯化的DNA在0.8％的琼脂糖凝胶中分离，选择并纯化9-23kb的大小范围内的DNA进行连接。与载体连接和包装入噬菌体颗粒后，将初级文库进行滴度测定。发现初级文库具有＞5×105pfu。接着通过用EcoRI消化几种随机选择的噬菌体克隆文库而确定文库中***片段的平均大小，计算***片段的平均大小为～17kb。
分离OSISAP1基因组克隆
为了分离OSISAP1的基因组克隆，用OSISAP1的全长cDNA作为放射性标记探针筛查在Lambda DASH II中制备的基因组文库。首轮筛查产生了两个阳性克隆。再通过两轮的筛查将其纯化。所有的铺板于第三轮的噬菌体均发出信号，表明它们是阳性和同源的。
基因组克隆的亚克隆和测序
将在Southern杂交中发出阳性信号的～6.0kb的EcoRI片段(消化的SAPg3E6)克隆入pBlueScript SK+(Stratagene，USA)，且将重组克隆命名为pBSSAPg3E6。采用全长OSISAP1 cDNA作为探针进行Southern杂交，以鉴定重组的lambda克隆内的DNA片段，这显示了一段2.9kb的Pstl片段，该片段显示与cDNA克隆的杂交。采用标准方法将2.9kb片段进行亚克隆和测序。序列分析显示读码框架没有中断，即没有内含子。用多序列对比的CLUSTAL方法对这些序列进行对比，且以登录号AY137590提交到GenBank。
根据Southern分析确定OSISAP1是一个单拷贝基因。然而，当印度稻(indica rice)数据库入主北京大学，基因组和生物信息学中心时，用OSISAP1编码区进行搜索，发现有两个毗连序列群(Contigs)具有与OSISAP1显著同源性的序列。毗连序列群46636显示出在核苷酸水平上97％的同源性，实质上代表同一基因。另一方面，毗连序列群10325显示出核苷酸水平上59％的同源性和推导的氨基酸水平上64％的同源性。仍然需要观察Pusa Basmati 1是否也具有在Southern杂交所采用的严格条件下没有被检测到的类似的基因。OSISAP1的基因组克隆的编码区域是连续的，没有内含子。转录起始位点作图为核苷酸G，在ATG上游126bp处。当in silico分析转录起始位点上游的基因组区域时，识别了几个涉及应激反应基因表达的顺式作用元件，如CRT/DRE、ABRE、HSE，创伤反应元件，GT盒，乙烯反应元件和GC基序(Thomashow等人，1999；Zhu等人，2002；Lescot等人，2002)。
OSISAP1是发育性调控的。OSISAP1基因实际上是在筛查差异表达的器官特异性基因过程中被鉴定的。发现它在成熟植物茎干、叶轴和授粉前花穗中以增高的水平表达。在受精后的花穗中表达水平较低。初期植物的根比成熟植物具有更高的转录丰度。然而，该基因的转录水平在成熟植物的叶中更高。
OSISAP1的应激诱导表达。OSISAP1可被一些非生物应激诱导。在对籽苗的寒冷处理1小时内，转录水平提高到很高的水平(图3a)，直到3小时水平持续增高，直到12小时几乎不受影响，其后降低。冷诱导的膜僵化(rigidification)被认为是植物感知寒冷的首要事件(rvar等人，2000；Sangwan等人，2001)。低温度下的膜僵化事件可以通过作为膜流化剂的苯甲醇(BA)预防，或可以通过在室温下用膜僵化剂，二甲亚砜(DMSO)而模拟生成。为了研究膜僵化对OSISAP1表达的作用，检测了BA和DMSO的效应。用不同浓度的BA处理9天大小的籽苗的叶子，并暴露于寒冷温度下。膜僵化抑制剂显著地降低了冷诱导的OSISAP1的聚积(图3b)。另一方面，用膜僵化剂DMSO处理籽苗显著地增加了OSISAP1在室温下的表达(图3b)。然而，在高浓度的DMSO下，诱导相对较少，可能是由于化学物质的毒性本性。在盐应激的情况下，转录水平在15分钟的早期达到高峰，1小时后降低(图3c)。然而，即便到24小时，mRNA水平也比对照高。在干燥应激中也观察到类似模式的转录聚积(图3c)。在淹没应激的情况下，观察到不同的诱导动力学(图3d)。在3小时内基因被强烈诱导，然后其mRNA水平显著降低到对照的水平。但是，mRNA水平在12小时再次达到高峰，且停滞直到36小时，其后表现出下降。还发现该基因对不同的重金属作出反应(图3e)。实质上，用铜、镉、锰或锌盐处理均导致3小时转录丰度的显著增高，在6小时明显下降。钙和锂盐对mRNA水平仅仅具有微小的效应。该基因也对机械损伤起反应(图3f)。该基因对1μM低浓度的ABA作出反应(图3g)；在用1μM的ABA处理籽苗30分钟后，OSISAP1的表达达到高峰。但是随着ABA浓度的增高，稳定状态的转录水平持续了更长的时间。
种质特异性表达
为了观察OSISAP1以种质特异性的方式对不同非生物应激的反应，获得了不同的非生物应激耐受或敏感种系。本研究采用了耐旱栽培植物Tulasi，对干旱敏感的Triguna，对盐敏感的Jaya和耐盐的Vikas。将Pusa Basmati 1作为敏感对照。在籽苗阶段将它们置于盐或干旱的应激下。在两种所评估的应激后，无法得出培养变种/品种的耐受性与OSISAP1转录诱导水平之间的显著的相关性。然而，我们发现所有的评估的稻的种质具有OSISAP1，且在所有的情况中，干旱和盐应激后该基因均被诱导。
在pBI121中克隆OSISAP1和转化烟草
由于OSISAP1可被多种应激诱导，它被用于转化模型植物烟草，以对该新基因进行功能分析。为了在烟草中过表达稻新基因OSISAP1基因，在pBI121中克隆cDNA(Clontech，USA)。载体具有CaMV35S启动子，驱动gus基因的表达。为克隆OSISAP1 cDNA，gus基因被取代。开始，将载体用SacI消化，在gus的3′切割。在所有四种dNTPs的存在下，用T4 DNA聚合酶补平DNA的末端。接着用BamHI切割载体。这从载体主链中释放了gus基因。用凝胶抽取纯化载体，另一方面，首先用XbaI切割载有OSISAP1 cDNA的pBK-CMV，用T4 DNA聚合酶和所有四种dNTPs填平DNA末端，接着用BamHI消化。这释放了具有3′平端和5′末端具有BamHI的cDNA。将该片段与具有相容末端的pBI121连接。获得的载体pBISAPc具有CaMV35S启动子，驱动OSISAP1cDNA。选择性标记nptII，由nos启动子驱动。用EcoRI限制性消化与nos终止子一同释放cDNA，而BamHI线性化重组克隆，显示出克隆后恢复了位点。植物转化载体的完整构造在图4中以图形表示。
接着用化学转化将构建体转移至农杆菌(Agrobacterium)。通过质粒分离和限制性消化检测构建体的存在。将农杆菌中的构建体转移至烟草(Nicotiana tabacum var Xanthi)。在200mg/l卡那霉素的存在下，将再生的芽转移至含有同样浓度的卡那霉素的生根培养基，根发育后，将植物转移到罐中，在培养室中维持。
转基因的确认和转基因的表达
首先，对推定的转化株进行nptII实验，以在总蛋白质中检测采用的选择性标志物新霉素磷酸转移酶II的活性。将确认的转基因和非转化烟草分别用作阳性和阴性对照。8个转基因系(SAPcL1、SAPcL8、SAPcL9、SAPcL38、SAPcL22、SAPcL11、SAPcL44和SAPcL43)显示出nptII活性。
还通过Southern分析检测这些株系中转基因的存在(图5)。用EcoRI消化从推定的转化子中分离的基因组DNA。该酶在pBISAPc中的cDNA5′端和nos终止子3′端具有位点，用EcoRI消化后，与OSISAP1cDNA相应的～1kb的片段与nos终止子一同被释放。在阳性对照质粒和转基因系中(图5中以见头标示)检测到了与预期大小～1kb现应的条带，但是不存在于未转化对照和未表现出nptII活性的SAPcL35中。
用选择的5个家系进行Northern分析来确定转基因的表达水平(图6)。从叶子中分离RNA，并与作为放射性标记探针的全长OSISSAP1进行杂交。还应当注意来自野生型烟草的RNA不与OSISAP1探针杂交。
含有OSISAP1的转基因烟草籽苗对寒冷、盐和干旱应激的耐受性。分析5株含有pBISAPc和组成性表达OSISAP1的独立转基因系(SAPcL8、SAPcL11、SAPcL22、SAPcL9和SAPcL43)T1代的盐耐受性。为了分析应激耐受性，将转基因系在没有选择剂的培养基中培养。将不含转基因的对卡那霉素敏感的(分离，非转基因)籽苗从分析每个家系来评估应激耐受性的籽苗总数中排除。
也分析了5个含有OSISAP1基因的转基因家系(SAPcL8、SAPcL11、SAPcL22、SAPcL9和SAPcL43)的T1代的寒冷耐受性。表型上，应激后的转基因籽苗比较健康(图7a、b)。在转基因籽苗的情形中，第3或第4个叶子已经形成，而在WT中，只能观察到最先的两个叶子，(图7b)。15天的恢复后，对籽苗的鲜重的测量揭示了应激的转基因籽苗增加了67％到92％的鲜重，而与未应激籽苗相比，WT仅仅增加了35％的鲜重(图7a)，另外，在低温下转基因籽苗的鲜重总是大于WT籽苗。
对OSISAP1过表达系对干旱耐受性的评估揭示了在8天期间WT的萌芽(germination)百分比远远小于转基因系。在暴露于0.3M甘露醇第8天，只有60％的WT萌芽，而在所有的转基因系中，除了家系22中显示69％的萌芽外，均观察到90％或更多的萌芽。当在0.4M甘露醇中发育时，在WT中观察到41％的萌芽，而转基因系表现出69-92％之间的萌芽率。与WT相比，应激的转基因系的鲜重也显著增加，如在定量评估和质量上所反应的(图8a、b)。
为了确定OSISAPl过表达对转基因烟草的盐耐受性的效应，将转基因和未转化(WT)籽苗按照材料和方法中的描述培养。在暴露于应激的当天，没有观察到野生型(WT)和转基因籽苗的鲜重的显著差别(表1)。在4天的转移后，尽管WT和转基因系均开始萎黄，但转基因植物中大大减少，因为它们在应激后保留了更多叶绿素以及绿色(图9)。观察到了转基因系籽苗在应激下鲜重的高度显著性的改善。8天恢复后，应激WT植物的鲜重恢复到未应激植物的水平，尽管它们的叶绿素含量保持较低。8小时的应激恢复后，转基因籽苗的表现大大优于WT，且更快地恢复植物生长(图9a，b)。
对转化植物对多种应激的分析清楚地表明在例如寒冷、干旱和盐应激的多种应激条件下，与未转化植物相比，转化植物具有更好的生长和存活百分比。
有许多例子，其中在例如烟草或鼠耳芥属的模型植物中，检测了对植物分子生物学的研究和基因工程改变代谢途径及应激，接着在其它重要的农作物中显示产生了类似的表型。我们已经用新基因OSISAP1转化了稻和番茄，从而赋予对寒冷、干旱和盐应激的提高的耐受性(Mohanty等人，1999以及Jani等人，2002)。结果表明相对于未转化的对照而言，新基因OSISAP1(SEQ ID NO：1)赋予了转化植物对应激的增加的耐受性和生长优势。
暴露于多种非生物应激后，大量的基因被诱导(Seki等人，2001)。这些基因以多种方式发挥作用来赋予植物应激耐受性(Ingram和Bartels，1996；Thomashow，1999；Hasegawa等人，2000b；Zhu，2002)。这些基因的表达模式通过体系的需要而控制，即在应激后不久，应激反应的早期阶段所需的基因被诱导，随后那些在动态平衡和恢复中需要的基因被诱导。Kawasaki等人(2001)比较了盐应激后对照的稻品种Pokkali(耐盐)和IR24(盐敏感)的基因表达特征。这种对盐的反应被归类为瞬时的(15分钟内)，早期(1小时)，早期恢复(3-6小时)和应激代偿(24小时后)，每个类别具有8-10个上调或下调基因。在本文中，OSISAP1基因(SEQ ID NO：1)在归入瞬时反应类别，因为该基因在暴露于应激的15分钟内被诱导高水平。其蛋白质产物(SEQ IDNO：2)可能在应激后很早就是必需的。这种基因表达的早期诱导也在RD29的干燥和盐诱导中(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，1993，1994)，COR47和ERD10的干燥诱导中(Welin等人，1994；Kiyosue等人，1994)，OSLEA3中的盐诱导(Moons等人，1997)以及RD22的干旱、盐或ABA诱导中观察到(Abe等人，1997)。OSISAP1蛋白(SEQ ID NO：2)与哺乳动物蛋白A20具有同源性(Opipari等人，1990)。A20的锌指结构域对二聚化作用是必需的(De Valck等人，1996)，且它通过抑制NF-κB介导的基因表达而抑制TNF诱导的凋亡(Cooper等人，1996；Heyninck等人，1999a，b；Beyaert等人，2000；Lademann等人，2001)。显示无论是否与其它的细胞蛋白结合，A20蛋白的锌指结构域对其抑制活性都是足够的(De Valck等人，1997；Lademann等人，2001)。还显示A20或即便培养细胞中的A20 C末端锌指结构域的过表达均可下调NF-κB的活性(Song等人，1996；Evans等人，2001)。高盐度应激导致细胞***的抑制和细胞死亡的加速(Hasegawa等人，2000)，而寒冷应激导致组织的萎蔫和变黄以及电解液泄漏(Tokuhisa和Browse，1999)。所有这些将最终导致细胞死亡。
OSISAP1基因的过表达可以帮助转基因植物避免萎黄和细胞死亡。应激植物具有较低水平的应激相关损伤且能够更快恢复。因此，尽管在两种不同的体系中，且两者之间仅存在一个共同的锌指基序，当过表达时，OSISAP1和A20具有类似的效果。蛋白OSISAP1的第二C末端锌指结构域与AN-1型锌指蛋白也表现出高度的同源性。PEM6、ZNF216、XLULFP和PVPR3这些蛋白还没有确定的功能。在适应寒冷期间一些亲水性多肽被诱导且在沸腾时保持可溶性(Hughes和Dunn，1996；Thomashow，1998)。具推测它们能够通过减轻与冷冻相关的脱水的有害效应而有助于提高寒冷耐受性。盐应激以及寒冷应激也导致细胞水平的脱水(Hasegawa等人，2000)。OSISAP1蛋白是亲水性的，且该特性也可能有助于提高转基因植物对盐和寒冷的耐受性。如本研究所显示的，已经发现一些其它的基因的过表达提供了籽苗的应激耐受性(Prndl等人，1998；Saijo等人，2000；Kim CK等人，2001；Piao等人，2001；Sun等人，2001；Tamminen等人，2001)。
总之，本发明从稻中鉴定和表征了一种新的锌指蛋白基因且揭示了一种新的盐、干旱和寒冷耐受性的决定因素，可以在其它农作物中用于改变应激耐受性。我们还注意到该蛋白可能在其它显示可诱导其表达的应激中也具有功能。
以下的实施例仅用于举例说明的目的，不应解释为对本发明范围的限定。
                    试验方法
植物材料和处理
按照前述的方法(Grover等人，1999)处理和培育稻(Oryza sativasubsp.indica var.Pusa Basmati 1)种子。培育7天后，将籽苗转移到含有浸水棉花的100ml烧杯中，而进行其它处理则采用含有需要的溶液的水。加入氯化钠至终浓度为200μM。将ABA(Sigma)溶解于DMSO中，制备10mM的原液，再进一步用水稀释。通过以～1cm的间隔在叶片边缘剪切来造成籽苗的损伤。为进行寒冷打击，将籽苗维持在5±1℃。通过将植物在棉纸(tissue paper)上干燥和将其包装在干燥的棉纸中保持需要的时间来模拟干旱。将在100ml烧杯中培育的籽苗保持淹没在2L玻璃烧杯的水中。将切割的9天大小的籽苗的叶片用5、10和15mM的苯甲醇(BA)在25℃处理3小时，然后在5±1℃下持续处理48小时(Sangwan等人，2001)。为用DMSO处理，在2、4和6％DMSO的存在下，将剪切的籽苗叶片在25℃持续6小时。
OSISAP1基因的克隆和序列分析
在Lambda ZAP表达载体中(Stratagene，USA)制备7天大小的稻籽苗的cDNA文库。从文库中挑选随机克隆并进行单个克隆分割，以获得重组pBK-CMV噬菌粒载体，如每个厂家的说明。将这些克隆用作放射性标记的探针与从稻植株的不同部分分离的总RNA杂交。鉴定并进一步表征一些在不同器官中差异表达的克隆。
采用标准引物从两端对其中之一的OSISAP1进行测序。为了获得全长序列，将cDNA用Sacl或Pstl进行消化且在pBlueScriptSK+中亚克隆。采用标准引物和标准方法对亚克隆进行测序。
为了分离OSISAP1的基因组克隆，采用Mbol消化基因组DNA，在λDASH II载体(Stratagene，USA)中制备稻基因组DNA文库。将cDNA用于产生放射性标记探针并筛查文库(Sambrook等人，1989)。通过3轮筛选纯化阳性噬斑，并对一段来自重组噬菌体克隆的5.5kb的含有该基因的亚克隆片段进行测序。通过采用设计的包含翻译起始位点的引物进行引物延伸分析来确定转录起始位点(Sambrook等人，1989)。
根据Sambrook等人1989年描述的标准方法进行质粒DNA的分离、限制性消化、DNA连接、PCR、琼脂糖和丙烯酰胺凝胶电泳、E.coli的转化和培养、不同DNA片段的测序。OSISAP1(SEQ ID NO：1)的cDNA为844bp，包括一段19bp的poly-A尾，编码164个氨基酸的蛋白质，具有17.6kDa的预期的分子量(SEQ ID NO：2)。
RNA印迹分析
根据Logemann等人(1987)的方法进行小的改良进行RNA提取。根据Grover等人(1999)的方法用20μg总RNA进行Northern分析。采用α32-P dATP标记的OSISAP1 cDNA作为探针。通过放射性自显影检测杂交。溴化乙锭染色的rRNA同样样本的条带作为总RNA数量和质量的对照。
在植物中组成性表达的植物转化载体的构建
为了在烟草(Nicotiana tabacum var Xanthi)中过表达稻OSISAP1(SEQ ID NO：1)，将cDNA克隆在pBI121(Clontech，USA)中，替代gus基因。首先，将载体用SacI消化，在gus的3′切割。在所有四种dNTP的存在下，DNA的末端用T4 DNA聚合酶填平，接着将载体用BamHI切割，从载体主链中释放gus基因。通过凝胶抽提纯化载体。另一方面，首先用XbaI切割含有OSISAP1(SEQ ID NO：1)cDNA的pBK-CMV，将DNA末端用T4 DNA聚合酶和所有四种dNTP填平，接着用BamHI消化。这释放了具有3′平端和5′端具有BamHI的cDNA。将该片段与具有相容末端的pBI121连接。得到的具有驱动OSISAP1基因(SEQ ID NO：1)表达的CaMV35S启动子的载体pBISAPc在图4中表示。植物的选择性的标志为具有卡那霉素抗性的基因。接着通过化学转化将该构建体转移到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株LBA4404中。
植物转化
农杆菌属(Agrobacterium)介导的烟草(Nicotiana tabacum varXanthi)转化按照每一标准步骤进行(Gelvin等人，1994)。在200mg/1卡那霉素的存在下，将再生的幼芽转移到含有同样浓度的卡那霉素的生根培养基中。在根发育后，将植物转移到罐中并保持在培养室中。首先对推定的转化子进行nptII分析，以在总蛋白中检测所采用的选择标记，新霉素磷酸转移酶II的活性。以OSISAP1 cDNA作为放射性标记的探针，分别采用Southern(图5)和northern分析(图6)确定转基因在不同种系的整合和表达。采用Sambrook等人1989年描述的标准方法进行Southern和northern分析。将过表达OSISAP1的转基因系转移(propogated to)到T2代。
类似地，用标准方法和新基因OSISAP1进行稻转化。采用标准方法获得了过表达该基因的番茄植株。
转基因株对盐、寒冷和干旱应激的耐受性的分析
在层流罩超净台下，将野生型和转基因烟草的T1种子用70％乙醇持续搅拌下在离心管中进行表面消毒30秒处理后，用吸液管将乙醇除去。将种子浸入含有一滴吐温20的2％(v/v)的次氯酸钠溶液中5分钟，通过轻敲离心管而不时搅拌，随后用高压灭菌的Milli-Q水至少冲洗六次。将籽苗在含有半浓度MS培养基的不含糖和有机成分(MSH)的培养基中培养16天，在保持为25±1℃的培养室中，16h/8h的光照/黑暗循环下，由3个白色荧光灯管(Philips Champion 40W/54)和1个黄色荧光灯管(Philips Trulight 36W/82)提供的光(50-100μmolm-2s-1)对每一架照明。将16天大小的籽苗转移到新鲜的MSH中，在给与应激处理前使其再生长5天。
对于盐应激，将籽苗无菌地转移到浸湿了不含糖的半量MS基质的250mM NaCl溶液的8层棉纸上。将培养皿密封以防止蒸发。使其在上面给出的培养室条件下生长4天。随后将其用消毒蒸馏水轻轻冲洗，在消毒棉纸上吸收的过量的水，且放回不含糖的半量MS基质中。使其在培养室条件下生长，以进行恢复。在8天的盐应激后，测量WT(未转化对照)和转化株系的绿色籽苗的百分比和鲜重。
对于寒冷处理，将含有21天大小的籽苗的培养皿转移到维持在8±1℃的冷室中15天。接着将皿转移回培养室条件下恢复。在寒冷应激后使其恢复15天后测量WT(未转化对照)和转基因系的鲜重。所有的试验均重复多于2次，并给出两次具有变化的试验数据。
对干旱应激，将种子在0.3M和0.4M甘露醇中发芽，并在8天的期间内记录观察结果，在0.3M和0.4M甘露醇中发芽8天后测量WT(未转化对照)和转基因系的相对鲜重增长。
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                                  序列表
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<120>稻新基因OSISAP1赋予对应激的耐受性及其方法
<130>PCT011DU
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>844
<212>DNA
<213>稻
<400>1
gatctctcct gcaatcctca tcacacagca aacccaaacc gcgagcggaa tcctcagcct     60
gctgagagag cctgagacca agagggggat tcttttttgg ttattgacga tggcgcagcg    120
cgacaagaag gatcaggagc cgacggagct cagggcgccg gagatcacgc tgtgcgccaa    180
cagctgcgga ttcccgggca acccggccac gcagaacctc tgccagaact gcttcttggc    240
ggccacggcg tccacctcgt cgccgtcttc tttgtcgtca ccggtgctcg acaagcagcc    300
gccgaggccg gcggcgccgc tggttgagcc tcaggctcct ctcccaccgc ctgtggagga    360
gatggcctcc gcgctcgcga cggcgccggc gccggtcgcc aagacgtcgg cggtgaaccg    420
gtgctccagg tgccggaagc gtgtcggcct caccgggttc cggtgccggt gcggccacct    480
gttctgcggc gaacaccggt actccgaccg ccacggctgc agctacgact acaagtcggc    540
ggcaagggac gccatcgcca gggacaaccc ggtggtgcgc gcggccaaga tcgttaggtt    600
ctgagaggca aacaaaatta aaaaaaaaat ctactgtttt agcaagaaat ggagaaaaaa    660
attgggaatt gaaggtgtgg atgttattat tatgctgttc tcttctcgca attgtttttc    720
cctttttatt ctttttaatt gcaaacggga ggataagtgg tggaaaagga atagtgtaac    780
aataatggtg atgtgaggtg gttgagggaa aaagaatcga agaacaaaaa aaaaaaaaaa    840
aaaa                                                                 844
<210>2
<211>164
<212>PRT
<213>稻
<400>2
Met Ala Gln Arg Asp Lys Lys Asp Gln Glu Pro Thr Glu Leu Arg Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Ile Thr Leu Cys Ala Asn Ser Cys Gly Phe Pro Gly Asn Pro
            20                  25                  30
Ala Thr Gln Asn Leu Cys Gln Asn Cys Phe Leu Ala Ala Thr Ala Ser
        35                  40                  45
Thr Ser Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ser Pro Val Leu Asp Lys Gln Pro
    50                  55                  60
Pro Arg Pro Ala Ala Pro Leu Val Glu Pro Gln Ala Pro Leu Pro Pro
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Glu Met Ala Ser Ala Leu Ala Thr Ala Pro Ala Pro Val
                85                  90                  95
Ala Lys Thr Ser Ala Val Asn Arg Cys Ser Arg Cys Arg Lys Arg Val
            100                 105                 110
Gly Leu Thr Gly Phe Arg Cys Arg Cys Gly His Leu Phe Cys Gly Glu
        115                 120                 125
His Arg Tyr Ser Asp Arg His Gly Cys Ser Tyr Asp Tyr Asn Ser Ala
    130                 135                 140
Ala Arg Asp Ala Ile Ala Arg Asp Asn Pro Val Val Arg Ala Ala Lys
145                 150                 155                 160
Ile Val Arg Phe

Claims (17)

1.分离的稻OSISAP1的DNA片段，其中该DNA片段包括根据SEQID NO：1的序列。
2.多肽，由含有权利要求1的SEQ ID NO：1编码的SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。
3.分离的重组植物载体，在5’到3’转录方向包括：
在植物中发挥功能的启动子；
含有SEQ ID NO：1的OSISAP1序列；以及
在植物中发挥功能的转录终止子。
4.根据权利要求3的分离的重组植物载体DNA，其中DNA为质粒。
5.根据权利要求3的分离的重组植物载体DNA，其中启动子为花椰菜花叶病毒35S。
6.根据权利要求3的分离的重组植物载体DNA，其中转录终止子为nos终止子。
7.在植物中提高应激耐受性的方法，所述的方法包括用权利要求3的重组载体转化所述的植物，以产生转化的植物。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述的用于转化的植物选自烟草、稻和番茄植物。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述的方法提供具有对寒冷应激提高的耐受性的转化植物。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述的方法提供具有对干旱应激提高的耐受性的转化植物。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述的方法提供具有对盐度应激提高的耐受性的转化植物。
12.由权利要求7的方法生产的转基因植物，其中所述的转化植物表现出对寒冷应激提高的耐受性。
13.由权利要求7的方法生产的转基因植物，其中所述的转化植物表现出对干旱应激提高的耐受性。
14.由权利要求7的方法生产的转基因植物，其中所述的转化植物表现出对盐度应激提高的耐受性。
15.由权利要求12的转基因植物生产的种子。
16.由权利要求13的转基因植物生产的种子。
17.由权利要求14的转基因植物生产的种子。
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