CN1763197A - 新的植物衰老特异性基因及其启动子 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分离自拟南芥的新基因，该基因表现出衰老特异性表达的活性。本发明还涉及调节所述基因表达的启动子。所述基因连同所述启动子可用于在分子水平以对环境友好的方式控制植物的衰老。
Description
技术领域
本发明涉及来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的新的衰老特异性基因及其启动子。更具体地，本发明涉及以对环境友好的方式控制植物衰老的植物衰老特异性基因，以及用于调节植物衰老特异性基因表达的启动子。
背景技术
生物的生命，例如，出生、衰老、疾病和死亡，是生命科学最令人感兴趣和最重要的课题。在生命过程中，衰老是生物发育和最终死亡的一个自然部分。因此，为了延缓活生物的衰老这一终极目的，导致衰老的原因和衰老的控制机理无论是过去还是现在一直是全世界范围内活跃而广泛的研究课题。但是，直至目前还没有获得令人瞩目的结果。
对植物和动物中与衰老相关的基因的控制机理的研究正在进行中。高等植物的衰老是程序性细胞死亡过程的一部分，在发育的最后一个阶段在所有的植物组织包括叶子和花朵中都观察到了这种衰老，而且这种衰老在局部发生以防止外来攻击。曾有报道，植物衰老受到激素如乙烯、脱落酸和细胞***素等的控制，而且也受到糖代谢的调节。
随着对衰老的分子机理的揭示，与诱导或延缓植物衰老相关的基因会引起植物产业极大的关注。例如，当导入与植物衰老相关的基因后，如玫瑰、康乃馨等开花植物或如水稻、小麦、大麦等粮食作物的寿命可得到延长。也就是说，可以以对环境友好的方式延缓植物衰老。为了这些目的，应用拟南芥展开了对与植物衰老相关的基因和用于调节所述基因表达的启动子的活跃研究。
公开出版的韩国专利No.10-2004-0023252涉及由突变株分离的SOR9基因的发明，采用活化标签法则可发现，SOR9突变株与抑制激素诱导的叶子衰老的ore9-1突变株相比，其叶子衰老速度更快。
由于与衰老相关的基因与植物的发育和生长有关，因此在研究中碰到了很多困难。并且在植物转化中最常用的CaMV(花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus))35S启动子不适用于植物衰老的研究。
直到近来，已知可利用化学药品或激素等人为处理而使基因短暂表达的基因启动子才被用于与衰老相关的基因的转化研究中。但是，化学处理对植物本身产生不良影响，并且仅能对与衰老相关的基因的功能进行猜测。而且，化学药品不能持久地固定在植物内，这一关键缺陷限制了它们的实际应用。
由于这种限制，因而需要一种对植物衰老具有特异性的基因启动子。1995年，有人报道了一种调节SAG12(与衰老相关的基因12)的启动子，所述SAG12与拟南芥的衰老相关。而且，迄今为止，仅发现包括SEN4在内的几种基因受到这种与衰老特异性调节相关的启动子的调控(Gan S和Amasino RM，1995，通过自身调节细胞***素的生成量抑制叶片衰老，Science，270：1986～1988；Noh YS和Amasino RM，1999；负责SAG12衰老特异性表达的启动子区域的确定，Plant Mol Biol(植物分子生物学)，41：181～194)。
因此，对于下述启动子的需求日渐增加，该启动子在无需外界帮助的条件下即可对衰老表现出自动调节反应，利用该启动子，不仅可以在不影响植物的发育和生长的条件下在短期内对与衰老相关的基因的功能进行有效地分析，而且能够以对环境友好的方式永久地对植物进行转化。
发明内容
为了获得本发明，发明人对与植物衰老相关的基因的控制机理进行了深入和全面的研究，结果发现了一种新的基因，该基因在一种新的启动子的控制下、在水杨酸存在时高度表达，因而，所述新基因连同所述启动子能够以对环境友好的方式来控制植物的衰老。
因此，本发明的一个目的是提供一种表现出植物衰老特异性表达的新基因和一种能够诱导所述基因表达的启动子。
本发明的另外一个目的是提供含有所述植物衰老特异性基因和所述启动子的重组载体，以及用所述重组载体转化的转基因植物品种。
根据本发明的一个方面，上述目的可以通过提供植物衰老特异性基因来实现，所述基因含有SEQ ID NO：1核苷酸序列或与SEQ ID NO：1实质上同源的核苷酸序列。
根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供一种启动子来实现，所述启动子能够在植物中诱导衰老特异性基因的表达，所述启动子含有SEQ ID NO：2核苷酸序列或与SEQ ID NO：2实质上同源的核苷酸序列。
根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供含有所述启动子核苷酸序列的重组载体来实现。
根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述重组载体转化的微生物来实现。
根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述微生物转化的转基因植物来实现。
附图说明
图1是显示所述植物衰老特异性基因在各种植物组织中转录的RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)结果的照片。
图2是在衰老的植物组织中特异性表达的基因的全部核苷酸序列。
图3是具有诱导植物衰老特异性基因表达的功能的启动子的全部核苷酸序列。
图4显示了pBI101载体的示意图，所述载体包括左边界和右边界，该载体可用于所述诱导植物衰老特异性基因表达的启动子的克隆。
图5是显示衰老叶片中GUS的表达的显微照片，所述GUS与诱导植物衰老特异性基因表达的启动子相融合。
具体实施方式
拟南芥基因组DNA已经被完全测序。根据所公开的所述DNA序列，已经推测出有关的基因位点、重要结构域以及外显子和内含子的信息，而且这些信息可以自由获得。但是，拟南芥大部分基因的功能和特定结构域仍然没有得到揭示。
在本发明人进行的研究中，为了寻找与衰老相关的基因，用水杨酸处理拟南芥，其中水杨酸是一种在与应激相关的反应中扮演重要角色的植物激素。结果发现一种未知基因，该基因在用水杨酸处理后的表达升高，其被命名为AtCDCP1。
通过TAIR(拟南芥信息资源(The Arabidopsis InformationResource))的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)检索，结果检出与AtCDCPl几乎完全同源的基因(TAIR No.at4g34120)(见图2)。
推测该基因负责衰老特异性表达的调节，分离这一基因的推定的启动子，并对其碱基进行测序(见图3)。
为了检测这个推定的启动子是否能够诱导衰老特异性表达，将GUS基因与所述启动子连接，然后表达所述重组基因。结果观察到GUS只在衰老叶片中表达(见图5)。
因此可以确定，分离自拟南芥的本发明的新启动子几乎潜伏在正常组织中(即，在正常组织中几乎无活性)，但该启动子诱导衰老特异性表达，因此可将其以对环境友好的方式用于控制衰老。
在本发明中，与SEQ ID NO：1或SEQ IN NO：2实质上同源的核苷酸序列是指具有一个或多个核苷酸发生置换、变异、修饰、取代、缺失或增加，但仍具有相同的衰老特异性表达的活性的核苷酸序列。
另外，本发明涉及含有所述启动子的核苷酸序列的重组载体(见图4)和用所述重组载体转化的植物(见图5)。
可利用本领域技术人员已知的多种技术来制备含有本发明所述启动子的重组载体以及将所述重组载体导入植物。例如，可以使用农杆菌介导的转化技术(参考：Clough SJ和Bent AF，1998，浸花(Floral dip)：拟南芥农杆菌介导转化的简化方法(a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana)植物学报(Plant J)16：735-743)。
而且，本发明涉及SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的一套PCR引物，该引物用于扩增含有SEQ ID NO：2核苷酸序列的DNA片段。
根据以下实施例，可以更好地理解本发明，但所述实施例是为了解释本发明，而不是对本发明的限制。
实施例1新基因AtCDCP1的发现
当用与应激相关的植物激素水杨酸处理拟南芥时，诱导了一个以前未知的基因的过度表达，这个未知基因被称为AtCDCP1。
通过在TAIR资源库进行BLAST检索发现，基因TAIR No.at4g34120与AtCDCP1具有100％的同源性。
实施例2目标基因(TAIR No.at4g34120)的RT-PCR
利用RT-PCR来确认在TAIR资源库鉴别的AtCDCP1基因的开放阅读架(ORF)实际上是否在拟南芥中转录。
为进行RT-PCR，利用从拟南芥(哥伦比亚生态型)的每种组织如花朵、茎生叶、莲座叶、茎和根中提取的总RNA来合成cDNA，所述RNA的提取使用Nucleospin RNA植物试剂盒(Macherey-Nagel)来进行。
将4μg的总RNA、10mM的各种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)、100M的随机十核苷酸和无核苷酸酶的水组成的混合物在65℃温育5分钟，然后置于冰上。加入RT-PCR缓冲液、RNA酶抑制剂和0.1M的二硫苏糖醇(DTT)后，将所述混合物在42℃再温育2分钟。
然后，将所述混合物放回冰上，接着与200单位的反转录酶在42℃温育1小时，然后在70℃灭活15分钟，将反转录产物作为cDNA库(cDNApool)使用。以同样的方法，建立各组织的cDNA库。将它们用作RT-PCR的模板。
利用由TAIR资料库鉴定出的核苷酸序列，由目标基因的外显子区域合成RT-PCR引物。在下表1中给出对所述目标基因特异的RT-PCR引物。采用降落PCR方式，使用基因扩增PCR***2700(Gene AmpPCRSystem 2700)(Perkin Elmer，美国)，进行RT-PCR扩增。温度循环条件如下：95℃，2分钟；接着进行5个循环：95℃，40秒；退火温度以每次1℃从62℃到57℃进行步降，15秒；72℃，1分钟。然后进入标准PCR模式，在该模式中，温度循环条件如下：进行20个循环：95℃，40秒；57℃，15秒；72℃，1分钟；然后72℃，5分钟。
表1目标基因特异性的RT-PCR引物
| 5’CCT-CTA-CGT-CGG-TCG-ATG-ATG-CG(SEQ ID NO：3) | 23个碱基 |
| 5’CCA-TAT-GTC-TTA-CTG-ATC-AGT-TTC-TGT-AGT-TCG(SEQ ID NO：4) | 33个碱基 |
观察到作为内标的18s rRNA(Ambion)在各组织的cDNA库中具有同量表达。用目标基因特异性引物进行RT-PCR的结果在图1中显示。如图1所示，在花朵、茎生叶和莲座叶中观察到目标基因的高度表达。
实施例3衰老特异性基因(TAIR No.at4g34120)的启动子的鉴定
将目标基因(at4g34120)的启动子推定为对应于从at4g34110基因的3’TR(非翻译区)(正好在AtCDCP1基因(at4g34120)上游)到目标基因(at4g34120)的起始密码子(ATG)的1094个碱基对。
首先，从拟南芥中提取基因组DNA(gDNA)。设计SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的引物，使每条引物在5’末端具有HindIII、在3’末端具有BamHI(见表2)。使用具有校正读码活性的DNA聚合酶(pyrobest，TAKARA)，以gDNA为模板，配对所述引物，扩增推定的启动子区域。采用降落PCR方式，使用基因扩增PCR***2700(Gene AmpPCRSystem 2700)(Perkin Elmer，美国)，进行RT-PCR扩增，温度循环条件如下：95℃，2分钟；接着进行5个循环：95℃，40秒；退火温度以每次1℃从60℃到55℃进行步降，每个温度15秒；72℃，1.5分钟。然后进入标准PCR模式，在该模式中，温度循环条件如下：进行30个循环：95℃，40秒；55℃，15秒；72℃，1.5分钟；然后72℃，30秒。
表2用于克隆启动子的引物
| 5’-CTA-AAG-CTT-GTG-TTC-ACG-GAA-GAT-GAA-TTT-GAT-T-(SEQ ID NO：5) | 34个碱基 |
| 5’-CAT-CGA-TCC-ATT-CGC-TTA-TCC-TCT-GTT-ACT-CAC-AGA(SEQ ID NO：6) | 36个碱基 |
用专门的限制酶，酶切其末端后，将所述PCR产物克隆到pBI101载体。碱基测序发现目标启动子被正确分离(见图3)。
实施例4：目标启动子的克隆和衰老特异性表达
对于目标启动子的克隆，pBI101载体是一个双元载体，该载体能够用于植物转化，并且在左边界和右边界之间具有GUS(β-葡糖醛酸酶)报告基因(见图4)。首先，将该含有目标启动子的双元载体导入农杆菌(GV3101)。用这个农杆菌通过浸花法(flower dipping method)(Clough等，植物学报(Plant J.)，16(6)：735-743，1998)转化拟南芥。
经过对拟南芥转化株进行3次筛选，获得转基因T3株系。由于GUS具有将特殊底物(X-GlcA)水解为蓝色不溶于水的沉淀物的活性，因此将GUS(β-葡糖醛酸酶)用作报告物质(reporter)来确定GUS基因是否被导入目标植物组织，这是因为当GUS基因表达时，含有GUS基因的植物组织在X-GlcA缓冲液中变成蓝色。
没有观察到正常活叶片呈现蓝色，而只有衰老的(叶绿素缺乏)叶片高度表达GUS基因(见图5)。用高倍显微镜观察，发现目标启动子对衰老具有特异性。
如上所述，本发明提供新的AtCDCP1基因和新的启动子，所述基因表现出衰老特异性表达活性，所述启动子对衰老特异性表达进行调节。在所述启动子控制下，通过所述新基因的表达，可以不影响植物而在短期内有效地对植物中与衰老相关的基因的功能进行分析，而且能够以对环境友好的方式永久地对新品种进行转化。
序列表
<110>高丽大学校产学协力团
<120>新的植物衰老特异性基因及其启动子
<130>P11-040818-02
<150>KR10-2004-0069765
<151>2004-09-02
<160>6
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>1175
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>1
ctacctttgt ttcttctctc agatttcata aagaaaagat ttaatctttc attggaatct 60
gtgagtaaca gaggataagc gaatatgggt tcaatctctt tatccaattc tatgcccata 120
actcgacttc cactacttac atcactctat catcaaagct tccttccgat ttcttcttca 180
tctttctctc ttcttcctct ctctaatcgt cgtcgctcct ccactttttc accgtcaatc 240
accgtctctg ccttcttcgc tgctcctgcc agcgttaata ataataactc tgttccggca 300
aaaaatggag gttacacagt tggggatttc atgactccga gacagaattt gcacgttgtt 360
aagccctcta cgtcggtcga tgatgcgttg gaacttctgg ttgagaagaa agtcacggga 420
ttgcctgtaa ttgacgataa ttggacactg gttggtgttg tttctgatta cgatttgctt 480
gcattggact ccatctctgg tcgcagtcaa aatgatacaa acttgttccc tgatgtcgac 540
agtacctgga aaacgtttaa cgaactacag aaactgatca gtaagacata tggaaaagtt 600
gttggagact tgatgacacc gtctcctctc gttgtccgtg attctaccaa tttagaagat 660
gcagccaggt tgcttctgga aacaaagttc cgaagattac ccgttgttga tgctgatgga 720
aaactgattg ggatccttac aaggggaaac gttgtaaggg ctgcgctgca gatcaaacgg 780
gaaaccgaga actctacata gctaggaagc agcagtgatg gagcagatct gaatctgcca 840
tagttaatag cgaaatctat ttattccatt gatataagta tatatgtaac cattctctgt 900
caattttcgg ttttcagaag caatttttgt tactttagga gtaacatttc tcagactcgg 960
aactgaagac aaatggtata tttgatacat atatgtttat tgtagcacag gtctactctt 1020
atcaccaaga caaagactaa gcagaatcga actaattttc aatttcttac tgaggtcttt 1080
tcaatgaagc tattcaaatc gagaaacgaa gacccttttt tctccaccgc cggctttggc 1140
catcacagcc tcttctctgc catattctct gctta 1175
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<211>1094
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>2
gtgttcacgg aagatgaatt tgattaccaa taaggccaat gctggtgatc cccctctttg 60
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ttcttctctc agatttcata aagaaaagat ttaatctttc attggaatct gtgagtaaca 1080
gaggataagc gaat 1094
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>3
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<212>DNA
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>6
catggatcca ttcgcttatc ctctgttact cacaga 36
Claims (6)
1.分离的植物衰老特异性基因，该基因含有SEQ ID NO：1核苷酸序列或与SEQ ID NO：1实质上同源的核苷酸序列。
2.分离的启动子，该启动子能够在植物中诱导衰老特异性表达，其含有SEQ ID NO：2核苷酸序列或与SEQ ID NO：2实质上同源的核苷酸序列。
3.重组载体，其含有权利要求2所述的启动子核苷酸序列。
4.微生物，其采用权利要求3所述的重组载体进行转化。
5.转基因植物，其采用权利要求4所述的微生物进行转化。
6.一套PCR引物，其如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，该引物适用于扩增含有SEQ ID No：2核苷酸序列的启动子。
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