CN1759177A - 腺病毒血清型34载体,核酸及其由此产生的病毒 - Google Patents

Abstract

腺病毒血清型的天然亲嗜性不同。已发现腺病毒的各种血清型至少其壳体蛋白(例如，五邻体和六邻体)、负责细胞结合的蛋白(例如纤维蛋白)以及腺病毒复制相关的蛋白不同。血清型之间亲嗜性和壳体蛋白的不同导致许多旨在通过壳体蛋白的修饰而重新控制腺病毒亲嗜性的研究。本发明绕过了对壳体蛋白修饰的需要，因为其提供了重组、复制缺陷的腺病毒血清型34(一种稀有的腺病毒血清型)，以及产生其他重组腺病毒的方法。另外还提供应用重组腺病毒递送和表达外源基因的方式。

Description

腺病毒血清型34载体，核酸 及其由此产生的病毒

相关申请的交叉引用

本申请要求2003年3月28日递交的美国临时专利申请60/458,825的权益。

发明背景

已在一些禽类和哺乳动物中鉴定的腺病毒是无囊膜的二十面体病毒；Horne etal.，1959 J.Mol.Biol.1：84-86；Horwitz，1990 InVirology，eds.B.N.Fields and D.M.Knipe，pps.1679-1721。第一个人腺病毒(Ads)是在40多年以前分离的。自此以后，超过100种不同的腺病毒血清型被分离，其感染不同的哺乳动物种类，其中51种是人源的；Straus，1984，In The Adenoviruses，ed.H.Ginsberg，pps.451-498，New York：Plenus Press；Hierholzer etal.，1988J.Infect.Dis.158：804-813；Schnurr and Dondero，1993，Intervirology；36：79-83；Jong et al.，1999 J Clin Microbiol.，37：3940-5。人血清型按照生物学、化学、免疫学和结构标准已被分类为6个亚属(A-F)，这些标准包括大鼠和恒河猴红细胞的血细胞凝集特性、DNA同源性、限制酶切割谱，G+C百分数含量以及致癌性；Straus，同前；Horwitz，同前。

腺病毒基因组已得到非常好的表征。其由大约36,000碱基对的线性双链DNA分子组成，尽管存在一些不同的血清型，但在腺病毒的基因组的整体结构中有一些共同的保守区，特定的功能位于相类似的位置。

腺病毒是递送外源基因的非常有吸引力的靶标。对于腺病毒的生物学已有非常好的理解。在具有免疫能力的人群中，尚未发现腺病毒与严重的人类病理有关。病毒在将其DNA导入宿主细胞方面是非常有效的，并且能够感染多种类型的细胞。而且，病毒能以较高滴度大量产生。此外，通过缺失病毒基因组的基本早期区域(E1)，可以使病毒复制缺陷；Brody et al，1994 Ann N YAcad Sci.，716：90-101。

作为疫苗和基因治疗目的的基因转移载体，复制缺陷型腺病毒已被广泛应用。这些载体在提供反式E1基因产物的细胞系扩增。当载体来自相同或非常相似的血清型时，补充反式基本E1基因产物是非常有效的。例如，E1-缺失的血清型C(Ad1，Ad2，Ad5和Ad6)，在含有和表达Ad5 E1区的293或PER.C6细胞生长良好。然而，293或PER.C6细胞Ad5 E1序列不能完全补充血清型C之外的所有血清型的复制。这可能是由于Ad5(血清型C)E1B 55K基因产物不能与非血清型C的E4基因产物功能性相互作用。尽管相互作用在同一亚组(subgroup)的成员内是保守的，但尚未发现其在亚型之间也是保守的。为了成功和有效的挽救(rescue)备选的、非血清型C的腺病毒，必须产生表达目的血清型E1区的细胞系。备选地，可以对可得到的表达Ad5E1的细胞系进行改进来表达Ad5E4(或Orf6)以及Ad5E1。这些另外的有时冗长和繁琐的工作阻碍了重组非血清型C腺病毒载体的产生。

在Ad5E1-表达细胞系(例如PER.C6或293)繁殖和挽救其他血清型的有效方式公开于悬而未决的U.S.临时申请(系列号60/405,182，2002年8月22日递交)。这一方法涉及将关键的E4区引入待繁殖的腺病毒。关键的E4区是互补细胞系的E1基因产物，尤其是E1B 55K区域的相同或高度相似血清型的病毒所固有的并包括至少编码E4 Orf6的核酸。

目前，来自亚组C，Ad5和Ad2的两个良好表征的腺病毒血清型是最广泛使用的基因递送载体。有必要开发备选的Ad血清型作为基因转移载体，因为普通人群中的中和抗体会限制同一血清型的引发剂量和再剂量。中和抗体的的流行因血清型不同而不同。一些血清型如Ad5的中和抗体很常见，而其他的抗体相对较少。此外，其他的血清型具有不同的亲嗜性，当用于疫苗或基因治疗目的时会导致激发过度免疫反应。

腺病毒血清型34，亚组B腺病毒最早在1972年分离，并于1975年将其作为已识别的参考菌株(J.C.Hierholzer etal.，1975 J.Clin.Microbiol.1：366-376)。已经讨论了通过参照马抗血清确定的其与46种其他人腺病毒的抗原关系；J.C.Hierholzer et al.，1991 Arch.Viral.121：179-197。可以得到Ad34的部分序列信息。有一些关于Ad34六邻体的序列的公开。Ad34六邻体的完整序列以及5′和3′侧翼序列(3358bp)已由Mukouyama保藏于GenBank(登录号AB052911)。在Takeuchi et al.，1999 J.Clin.Microbiol.37：3392-33949和GenBank(登录号QAB01842G)中公开了Ad34六邻体的部分序列(1449bp)。在Allard et al.，2001 J.Clin.Microbiol.39：498-505中公开了Ad34六邻体的部分序列(253bp)，其还保藏于GenBank(登录号AF161573)。Perera和Cardosa保藏了Ad34六邻体的两部分序列(571bp和301bp)，GenBank(登录号AJ272610和AJ250786)。Ad34纤维基因的序列由Arun，Mukouyama和Inada保藏于GenBank(登录号AB073168)。Ad34的病毒相关RNA区(VA RNA1&2)的序列(162bp)由Kidd et al.，1995 Virology 207：32-45，和GenBank(登录号U10677)公开。而且，Ad34的病毒相关RNA区的序列以及前-端蛋白和52/55K蛋白的(354bp)部分序列公开于Ma&Matthews，1996J.Virol.70：5083-99，和GenBank(登录号No.U52571)。Adhikary，Mukouyama和Inada公开了Ad34基因的L4100kDa，L4pVIII，E3 12.3kDa，E3 14.9kDa，E3gp18.5kDa，E3 20.3kDa，E320.5kDa，E3 10.2kDa，E3 15.2kDa1，E3 15.2kDa2，以及部分纤维序列(4828bp)并将序列保藏于GenBank(登录号AB079724)。病毒基因组的右端序列(1038bp)公开于Chen&Horwitz，1990 Virology 179：567-75，和GenBank(登录号M62712)。

疫苗和基因治疗领域将大大得益于关于其他腺病毒血清型，尤其是例如Ad34的其他知识，Ad34在人群中的代表性不是很好。尤其感兴趣的是基于其他腺病毒血清型的重组腺病毒载体以及获得这些重组腺病毒载体的方式。该领域的这一需要通过关于基于腺病毒血清型34的本申请的公开得到了满足。

发明概述

本发明涉及血清型34，一种稀有的腺病毒血清型的重组、复制缺陷的腺病毒载体以及产生基于其他血清型的重组腺病毒的方法。另外，还提供了利用重组腺病毒递送和表达外源基因的方式。因而，本发明包括血清型34的重组、复制缺陷的腺病毒载体，其包括一或多个可操作连接于调控序列的转基因，所述调控序列促进各自转基因的有效表达。这样的重组腺病毒血清型34载体施用于宿主，无论单独施用还是以组合方式和/或引发加强方案施用，都会导致整合的转基因的有效表达并且有效诱导能特异识别所施用的特别抗原(例如HIV)的免疫应答。此外，重组病毒应当规避对在人群中更容易出现(例如Ad5和Ad2)的腺病毒血清型的既存免疫。因此，所公开的方法提供诱导针对特定目的抗原(例如HIV)的免疫应答增强的方式。从而，所获得的免疫应答应当对以前未感染的个体提供预防效应和/或通过降低已感染的个体体内的病毒载量水平而提供治疗效应，从而延长感染的无症状期。

附图简述

图1描述用于得到pAd34ΔE1ΔE4AdSOrf6的同源重组方案。

图2描述用于得到pMRKAd34ΔE1ΔE4Ad5 Orf6的同源重组方案。

图3A-1到3A-9描述野生型腺病毒血清型34的核酸序列(SEQID NO：1)。Ad34的ATCC产品编号是VR-716。

图4描述用MRKAdS和Ad34载体在恒河短尾猿表达SEAP的时间过程。数据代表几何群体方式。

图5以表的方式描述用表达HIV-1 gag的MRKAd5和Ad34载体诱导的T细胞应答。数据以每百万PBMC点形成细胞的数量表示(SFC/10⁶PBMC)。″a″代表具有10-aa重叠并包括完整HIV-1 CAM 1gag的20-mer肽库。

图6以表的方式描述周12时，在Ad34-免疫的短尾猿中CD4+和CD8+Gag-特异T细胞的水平。″a″代表具有10-aa重叠并包括完整HIV-1 CAM 1 gag的20-mer肽库。

图7描述优化的人HIV-1 gag开放读框的核酸序列(SEQ ID NO：3)。

图8描述编码gag表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：4)。图的各个区域如下：(1)编码人巨细胞病毒的立即早期基因启动子的核酸序列的第一下划线区域；(2)没有下划线的小写字母的第一区域，该区域的DNA片段含有适宜的限制酶位点；(3)含有HIV-1 gag编码序列的大写区域；(4)没有下划线的小写字母的第二区域，该区域的DNA片段含有适宜的限制酶位点以及(5)第二下划线区域，该区域含有编码牛生长激素多聚腺苷酸化信号序列的核酸序列。

图9描述编码SEAP表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：5)。该图的各个区域如下：(1)编码人巨细胞病毒的立即早期基因启动子的核酸序列的第一下划线区域；(2)没有下划线的小写字母的第一区域，该区域的DNA片段含有适宜的限制酶位点；(3)含有人胎盘SEAP基因编码序列的大写区域；(4)没有下划线的小写字母的第二区域，该区域的DNA片段含有适宜的限制酶位点；以及(5)第二下划线区域，该区域含有编码牛生长激素多聚腺苷酸化信号序列的核酸序列。

图10A-1到10A-47描述pMRIAd5 HIV-1 gag载体的核酸序列(SEQ ID NO：6[编码]和SEQ ID NO：7[非编码])。

图11A-1到1 1A-10描述野生型腺病毒血清型35的核酸序列(SEQ ID NO：13)。Ad35的ATCC产品编号是VR-718。

图12以表的方式描述用外源Ad34引发/Ad35加强方案在短尾猿诱导的T细胞应答。″a″代表具有10-aa重叠并包括完整HIV-1 CAM 1gag的20-mer肽库。

图13以表的方式描述周28时，在Ad34引发/Ad35加强的短尾猿中CD4+和CD8+Gag-特异T细胞的水平。″a″代表具有10-aa重叠并包括完整HIV-1 CAM 1 gag的20-mer肽库。

发明详述

稀有腺病毒血清型比更常利用的腺病毒血清型(例如，腺病毒血清型2和5)具有固有的优势，因为既存免疫不可能限制它们向靶标位点的有效递送和外源基因的表达。不同腺病毒血清型由于各自的不同壳体结构也具有不同的亲嗜性，因而表现出靶向不同组织的潜力，并且当用于疫苗或基因治疗时可能导致激发过度免疫应答。然而，当使得这些稀有的腺病毒血清型复制缺陷时，其在现有的腺病毒繁殖细胞系中的繁殖和挽救将会变得困难。

申请人最近已成功地挽救和繁殖一种稀有的复制缺陷的血清型-腺病毒血清型34，亚组B腺病毒，此处阐明了腺病毒在递送和表达外源转基因方面的有效功能。

因此，本发明涉及适于在基因治疗或疫苗接种中应用的血清型34重组腺病毒载体。野生型腺病毒血清型34的核酸序列(SEQ ID NO：1)在图3A-1到3A-9中阐明，尽管如本领域技术人员所知晓的那样，任何功能同源物或腺病毒血清型34的不同菌株均可以用于按照本发明的方法中。已注意到Ad34序列在一些区域是不同的。以下位点仅是可在Ad34观察到的序列变异的取样：(1)在SEQ ID NO：1的碱基对10640周围，序列gtgagtccta(SEQ ID NO：8)之后的一系列13(″13″)而非12(″12″)″T″；(2)在SEQ ID NO：1的碱基对15372周围，序列ccgcactttct(SEQ ID NO：9)之后的一系列15(″15″)或17(″17″)而非16(″16″)″A″；(3)SEQ ID NO：1的碱基对17325周围，序列attgacattgg(SEQ ID NO：10)之后的一系列13(″13″)而非12(″12″)″A″；以及(4)SEQ ID NO：1的碱基对25717周围，序列ggagga(SEQ ID NO：12)之后的序列cagtctggagga(SEQ ID NO：11)被删除。通过本领域公认的生物学、化学、免疫学和结构标准来区别腺病毒血清型，这些标准包括大鼠和恒河猴红细胞的血细胞凝集特性、、DNA同源性、限制酶切割谱，G+C百分数含量以及致癌性；Straus，同前；Horwitz，同前。可以通过大量方法包括病毒DNA的限制酶谱；分析病毒DNA的迁移性；分析病毒体多肽电泳后在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的迁移性；已知序列尤其是来自壳体基因(例如，六邻体)的已知序列的序列信息比较，所述序列含有定义血清型的序列；将序列与来自ATCC的特定血清型的参照血清相比较。腺病毒血清型的SDS-PAGE分类在Wadell etal.，1980 Ann.N.Y Acad.Sci.354：16-42中讨论。腺病毒血清型的限制酶谱分类在Wadell et al.，Current Topics in Microbiology andImmunology 110：191-220中讨论。腺病毒血清型34，亚组B腺病毒最早在1972年分离，并于1975年将其作为已识别的参考菌株(J.C.Hierholzer etal.，1975 J.Clin.Microbiol.1：366-376)。在本领域中，已经讨论了通过参照马抗血清确定的其与46种其他人腺病毒的抗原关系；J.C.Hierholzer et al.，1991 Arch.Viral.121：179-197。

按照本发明的腺病毒血清型34载体在E1至少部分缺失并缺乏(或基本缺乏)E1活性，使得载体不能在目的宿主中复制。优选地，E1区完全缺失或失活。腺病毒可以在E3和其他早期区域含有另外的缺失，虽然当E2和/或E4缺失时，E2和/或E4互补细胞系可以用来产生重组的复制缺陷的腺病毒载体。

本发明方法中使用的腺病毒载体可以用已知的技术进行构建，如Hitt etal.，1997″Human，Adenovirus Vectors for Gene Transfer intoMammalian Cells″Advances in Pharmacology 40：137-206中所述，此处将其完整引用作为参考。通常，产生含有外源目的核酸的质粒或穿梭载体，所述核酸含有与特定目的腺病毒同源的序列。穿梭载体和病毒DNA或含有克隆的病毒DNA的第二质粒共转染到宿主细胞，在其中发生同源重组并导致异源核酸整合到病毒核酸。优选的穿梭载体和克隆的病毒基因组含有腺病毒和质粒部分。对于用于复制缺陷载体构建的穿梭载体，腺病毒部分通常含有非功能或缺失的E1和E3区以及基因表达盒，侧接适宜的限制位点。穿梭载体的质粒部分通常含有在原核启动子控制下的抗生素抗性标记。可以使用氨苄抗性基因、新霉素抗性基因以及其他药用可接受的抗生素抗性标记。为了辅助原核生物发酵中核酸的高水平产生，对于穿梭载体来说含有原核复制原点且具有高拷贝数是非常有利的。大量商业可利用的原核克隆载体都具有这样的优势。优选将非必须DNA序列去除。还优选载体不能在真核细胞中复制。这可以最小化核酸疫苗整合到受体基因组的危险。当希望将核酸的表达限制到特定组织类型时，可以利用组织特异的启动子或增强子。

穿梭载体和野生型腺病毒34病毒DNA的同源重组(Ad34骨架载体)导致腺病毒前质粒的产生(参见，例如pAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6、pMRKAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6、pAd34ΔE1gagΔE4Ad50rf6，以及pAd34ΔE1SEAPΔE4Ad50rf6)。线性化时，前质粒能在PER.C6^细胞或其他E1-互补细胞系中复制。一旦复制完成，就可以收获感染细胞和培养基。

为了产生足够量的腺病毒，通常需要包装细胞。包装细胞应当含有特定目的腺病毒产生所需要的元件。优选包装细胞和载体不含有重叠元件，其通过重组将导致有复制能力的病毒。适于重组Ad34E1-缺失载体繁殖的特定细胞例子表达腺病毒34或另一血清型B的早期区域1(E1)。备选地，可利用表达腺病毒E1和E4区域的繁殖细胞系(特别是，E4开放阅读框6(″ORF6″))，其来自与Ad34相同的血清型但不同的亚组(例如，Ad5 E1和E4)；参见，例如Abrahamsen et al.，1997 J Virol.8946-8951，以及U.S.Patent No.5,849,561。另外，细胞系可以用来从Ad34表达E1B以及从不同亚组的血清型表达(1)E1A或(2)E1A和E1B。在2002年8月22日递交的同时待审的U.S.临时申请系列号60/405,182中公开了其他腺病毒血清型有效增殖和挽救的策略。该方法基于将与互补细胞系表达的E1基因产物，尤其是E1B相同或高度相似的血清型的E4区(或其部分，包括E4ORF6)整合到腺病毒载体基因组.实施例1-4通过Ad5E4区域的整合及其在PER.C6细胞(表达Ad5E1的细胞)的繁殖阐明该方法的有效性。野生型腺病毒血清型5的序列是已知的并在本领域中描述；参见Chroboozek et al.，1992 J.Virol.186：280，此处完整引用作为参考。E4区或含有ORF6的部分不是关键的。关键的步骤是确保提供了启动子或基因是策略地排列以便其使载体固有的启动子(例如，E4启动子)失控。载体固有的E4区可以被替换、缺失或保持完整。因此，该方法适于用于本发明的腺病毒载体的增殖和挽救。

通常，增殖细胞是来自视网膜或肾的人细胞，尽管任何能够表达合适的E1和/或E4区的细胞系都可用于本发明的。已表明胚胎细胞如羊膜细胞特别适于产生E1互补细胞系。可得到一些细胞系，包括但不限于PER.C6(ECACC保藏号96022940)，911，293，以及E1 A549。

本发明涉及在腺病毒E1互补细胞系产生重组、复制缺陷腺病毒血清型34的方法，其包括在腺病毒E1互补细胞转染重组、复制缺陷腺病毒血清型34载体并允许产生病毒颗粒。由此产生的颗粒形成本发明的另一方面。含有重组、复制缺陷腺病毒血清型34载体的宿主细胞形成本发明的另一方面；宿主细胞被定义为不包括转基因人的一群细胞。按照本发明的方法收获的重组、复制缺陷腺病毒也包括在本发明中。这些收获的物质可以在施用于宿主前被纯化、配制和贮存。

本发明的腺病毒载体非常适于进行目的蛋白的表达，尤其是当个体的免疫应答有效防止更通常施用的腺病毒血清型的施用或再施用时。从而，本发明的具体实施方案是重组的、复制缺陷的腺病毒血清型34载体，其包括异源目的核酸。目的核酸可以是基因或基因的功能部分。核酸可以是DNA和/或RNA，单链或双链，可以以表达盒的形式存在。核酸可以E1平行(5′到3′转录)或反向平行(相对于载体的骨架3′到5′方向转录)***。核酸可以进行密码子优化用于在希望的宿主表达(例如哺乳动物宿主)。异源核酸可以是表达盒的形式。基因表达盒通常含有(a)编码蛋白或目的抗原的核酸；(b)可操作连接于编码蛋白的核酸的异源启动子；和(c)转录终止信号。

在具体实施方案中，异源启动子被真核RNA聚合酶识别。适于本发明的一个启动子的实例是立即早期人巨细胞病毒启动子(Chapman et al，1991Nucl.Acids Res.19：3979-3986)。虽然本领域技术人员将明白任何能在目的宿主进行表达的启动子均可以用于按照本发明的方法中，但是用于本发明的启动子的进一步的例子是强免疫球蛋白启动子EF1α启动子，鼠CMV启动子，劳斯肉瘤病毒启动子，SV40早期/晚期启动子和β肌动蛋白启动子。启动子可以包含调控序列如Tet操纵子序列。当寻求基因转录抑制时，例如提供转录和表达调控潜力的序列是有用的。腺病毒基因表达盒可以包括转录终止序列，具体的实施方案如牛生长激素终止/聚腺苷酸化信号(bGHpA)或50个核苷酸的短的合成polyA信号(SPA)，定义如下：AATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTT-GGTTTTTTGTGTG(SEQ ID NO：2)。前导或信号肽也可以整合到转基因。在具体的实施方案，前导区源自组织特异血浆酶原激活蛋白，tPA。

异源目的核酸是编码免疫源和/或治疗蛋白的基因(或其功能相应部分)。优选的治疗蛋白是当施用于个体宿主时，能激发可检测的治疗效果的蛋白。

优选的免疫源性蛋白是能在个体激发免疫应答的任何蛋白。申请人在本发明的说明书中示例了在非人灵长类(恒河短尾猿)代表性免疫源性蛋白(HIV gag)的递送，尽管按照本发明此处公开的方法任何编码治疗或免疫源性蛋白的基因均可应用。已发现腺病毒血清型34载体诱导gag-特异T细胞的有效水平；图5。而且，结果表明所公开的载体的免疫能够激发HIV-特异CD4+和CD8+T细胞；图6。

因此，本发明一方面涉及携带HIV转基因的基于腺病毒血清型34的载体。在这些实施方案中，编码任何HIV抗原的核酸均可应用(具体实施例包括gag，pol，nef，gp160，gp41，gp 120，tat，和rev，以及上述基因的衍生物)。此处示例的实施方案应用编码密码子优化p55 gag抗原的核酸；参见图7(SEQ ID NO：3)。密码子优化的HIV-1 env基因公开于PCT申请PCT/US97/02294和PCT/US97/10517，分别在1997年8月28日(WO97/31115)和1997年12月24日出版。密码子优化的HIV-1 pol基因公开于U.S.申请系列号09/745,2219，2000年12月21日递交以及PCT申请PCT/USOO/34724，2也在2000年12月21日递交。密码子优化的HIV-1 nef基因公开于U.S.申请系列号09/738,782，2000年12月15日递交和PCT申请PCT/USOO/34162，也在2000年12月15日递交。

在含有HIV-1基因的重组、复制缺陷的Ad34载体的具体实施方案中，基因可以来源于HIV-1菌株CAM-1；Myers et al，eds.″HumanRetroviruses and AIDS：1995，IIA3-IIA19，此处完整引用作为参考。该基因与进化枝B(北美/欧洲)一致氨基酸序列非常相象。HIV基因序列可以基于HIV-1的各个进化枝；具体的例子为进化枝B和C。许多HIV菌株的基因序列可以从GenBank得到，HIV的原始、现场(field)分离物可从the National Institute of Allergy and InfectiousDiseases(NIAID)得到，NIAID已与Quality Biological(Gaithersburg，MD)签定合同使这些菌株可以得到。菌株还可以从瑞士日内瓦世界卫生组织(WHO)得到。选择合适的编码特异HIV抗原的核苷酸序列，或其免疫相关部分或修饰在本领域技术人员的能力范围内。此处定义的″免疫相关″指(1)关于病毒抗原，施用时蛋白能在个体内激发足够延迟病毒增殖和/或传播的可检测的免疫应答和/或减少病毒载量；或(2)关于核苷酸序列，序列能够编码上述蛋白。

本发明包括如下的方法：(1)在个体进行治疗应答和(2)产生免疫应答(包括细胞介导的免疫应答)，其包括施用给按照本发明的个体重组腺病毒血清型34载体。本发明一方面涉及产生针对一或多个抗原(细菌，病毒(例如HIV)，或其他(例如癌症))的免疫应答的方法，其包括施用表达目的抗原的重组腺病毒血清型34载体。以这种方式施用的重组Ad34载体提供了增强的细胞介导的免疫应答，尤其是当给定宿主体内有针对更有代表性的腺病毒血清型(例如Ad2和Ad5)的既存免疫时。改进的疫苗施用效果应当是对以前未感染的个体的更低的传染率(或发生率)(即预防应用)和/或在感染的个体内，病毒/细菌/外源剂的水平下降(即治疗应用)。至于HIV适应症，改进的疫苗施用效果应当是对以前未感染的个体的更低的传染率(或发生率)(即预防应用)和/或在感染的个体内，病毒/细菌/外源剂的水平下降(即治疗应用)以便延长HIV感染的无症状期。重组Ad34载体的施用、细胞内递送和表达激发宿主CTL和Th应答。

因此，本发明涉及关于施用重组Ad34病毒载体(或其免疫源组合物，此处称为疫苗)以提供有效的免疫预防，防止暴露于病毒(例如，HIV)、细菌或其他剂之后的感染的建立，或者作为感染后治疗疫苗来减轻感染，从而导致更低的病毒/细菌/其他载量的建立以获得有益的长期的效果。

本发明的重组腺病毒血清型34载体可以单独施用或作为引发/加强施用方案的一部分。至少一种抗原(例如，HIV抗原)的引发剂量首先用重组腺病毒载体递送。该剂量有效地引发免疫应答以便在循环免疫***的随后识别中，免疫应答能够立即识别和应答宿主内的抗原。引发剂量之后给予加强剂量，其包括含有至少一种编码抗原基因的重组腺病毒载体。混合程式的引发和加强接种方案将导致增强的免疫应答，尤其是当存在抗载体的既存免疫时。引发-增强施用通常涉及引发受试者至少一次(通过病毒载体、质粒、蛋白等)，等预定的时间长度过去后加强(通过病毒载体、质粒、蛋白等)。通常使用多次引发，一般1-4次，尽管也可以更多。引发和加强之间的时间长度通常为4个月到1年，不过如本领域技术人员所知晓的也可以使用其他时间方案。

除单个蛋白或目的抗原被本发明的重组、复制缺陷腺病毒血清型34载体递送之外，两或多个蛋白或抗原也可以通过不同的载体或相同载体递送。多个基因/功能类似物可以被连接到适当的穿梭质粒以产生含有多个开放阅读框的前-腺病毒质粒。多个基因/功能类似物的开放阅读框可以被可操作连接于不同的启动子和转录终止序列。在其他实施方案中，开放阅读框可以被可操作连接于单个启动子，开放阅读框被内部核糖体进入序列(IRES；如WO 95/24485中所公开)可操作连接，或合适的其他备选以允许多个开放阅读框转录从而失控单个启动子。在一些实施方案中，开放阅读框可以通过逐步PCR或其他合适的将两个开放阅读框融合在一起的备选方法融合。然而，对于病毒载体的有效包装限制必须考虑。例如，已表明腺病毒5型显示出大约105％的野生型Ad5序列上部克隆能力限制。

引发-加强方案可以使用不同的腺病毒血清型。这样的方案的一个实施例是包括第一血清型的重组腺病毒载体的引发剂量，继之以含有第二和不同血清型的重组腺病毒载体的加强剂量，参见，例如，实施例6和图12和13。其中，一群猴在周0和4给予两剂量的基于Ad34的HIV gag载体，并在周24用基于Ad35的HIV gag载体加强。与加强施用时的水平相比，施用基于Ad35的载体导致T细胞应答的3倍增强。在一个备选的实施方案中，引发剂量可以包含不同的腺病毒载体的混合物，每个载体含有编码不同蛋白/抗原的基因。在这种情况下，加强剂量也将包含载体的混合物，其中每个载体含有编码不同蛋白/抗原的基因，条件是加强剂量施用重组病毒载体，其包含编码与引发剂量中递送的相同或相似抗原的遗传物质。这些多基因/载体施用程式可以进一步合并。施行包括来自特定抗原的多个但不同组分的合并方案也在本发明的范围内。

含有本发明的腺病毒载体的组合物，包括疫苗组合物是本发明的一个重要方面。这些组合物可以通过预防或治疗方式被施用于哺乳动物宿主，优选人宿主。潜在的宿主/疫苗包括但不限于灵长类，尤其是人和非人灵长类，并包括具有商业或家庭兽用价值的任何非人哺乳动物。含有重组腺病毒血清型34载体的组合物可以单独或与其他病毒或非病毒DNA/蛋白疫苗组合施用。它们也可以作为更广的治疗方案的部分施用。本发明还包括公开的重组腺病毒血清型34与其他治疗，例如HAART治疗(在重组HIV载体的情况下)联合施用的情况。

包括重组病毒载体的组合物可以含有生理可接受的组分，例如缓冲液、生理盐水或磷酸盐缓冲液、蔗糖、其他盐和聚山梨醇酯。在一些实施方案，制剂含有：2.5-10mM TRIS缓冲液，优选约5mM TRIS缓冲液；25-100mM NaCl，优选约75mM NaCl；2.5-10％蔗糖，优选约5％蔗糖；0.01-2mM MgCl₂；以及0.001％-0.01％聚山梨醇酯80(植物来源的)。PH范围应当在约7.0-9.0，优选约8.0。本领域技术人员知晓其他常规疫苗赋形剂也可以用于该配制中。在具体实施方案中，制剂含有5mM TRIS，75mMNaCl，5％蔗糖，1mM MgCl₂，0.005％聚山梨醇酯80，pH8.0。这样的制剂具有对于Ad5和Ad6的稳定性最适的pH和二价阳离子组合物并且最小化病毒吸附玻璃表面的可能性。其在肌内注射时不引起组织激惹。优选将其冷冻备用。

疫苗组合物中将被导入到疫苗接受体的病毒颗粒的量将依赖于所用的转录和翻译启动子的强度以及所表达的基因产物的免疫原性。通常，免疫或预防有效剂量的l×10⁷到1×10¹²颗粒和优选地约1×10¹⁰到1×10¹¹颗粒被直接施用于肌肉组织。皮下注射、皮内导入、透皮压入(impression)以及其他施用方式如腹膜内、静脉内或吸入递送也可以考虑。本发明的疫苗组合物的胃肠外导入同时或之后进行的白介素-12蛋白的胃肠外施用，如静脉内、肌肉内、皮下或其他施用方式也是有利的。

以下提供非限制性实施例来更好地阐释本发明。

实施例1

pAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6的构建

为了产生能在现有的C/Ad5 E1互补细胞系(293，PER.C6)增殖的基于E1-Ad34的载体，将Ad5 Orf6***到固有的E4区。为了构建Ad34前-腺病毒质粒，利用Ad34和Ad35之间的序列同源性。用纯化的野生型Ad34病毒DNA和适当构建的Ad35 ITR表达盒共转化BJ5183细菌导致因同源重组而产生的病毒基因组的环化。基于Ad34的preAd质粒的构建如下概述：

我们利用Ad35 ITR盒来构建pAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6(含有E1和E4缺失，而用Ad5 Orf6替换的Ad34前-Ad质粒)。我们预料Ad34和Ad35之间的序列同源性将允许同源重组的发生。构建的Ad35 ITR盒含有Ad35基因组的右端(bp 31599到31913和bp 34419到34793)和左端(bp4到456和bp3403到3886)序列(参见图11A-1到11A-10)，中间被含有细菌复制原点和氨苄抗性基因的质粒序列分隔。通过PCR产生4个片段并顺序克隆到pNEB193，产生pNEBAd35-4。接着产生通过PCR产生Ad5 Orf6开放阅读框并克隆到Ad35bp31913和34419之间，产生pNEBAd35-4Ad50rf6(ITR盒)。PNEB193是通常使用的商业可获得克隆质粒(New England Biolabscat#N3051S)，其含有细菌复制原点、氨苄抗性基因和多克隆位点，将PCR产物导入PNEB193中。ITR盒含有Ad35bp 457到3402的E1缺失，缺失部位含有单一Swa I限制位点，还含有从Ad35bp 31914到34418的E4缺失，将Ad5 Orf6以E4平行方向导入该缺失部位。在该构建体中，Ad50rf6的表达是Ad35 E4启动子驱动的。ITR盒中的Ad35序列(bp 31599到31913以及bp 3403到3886)提供与纯化的Ad34病毒DNA同源的区域，共转化到BJ 5183细菌(图1)后，将在其中发生细菌重组。设计ITR盒以含有位于病毒ITR末端的限制酶位点(PmeI)，从而消化将会从质粒序列释放重组Ad34基因组。通过限制酶分析筛选潜在的克隆，将一个克隆选定为pAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6。

实施例2

将pAd34AE1AE4Ad50rf6挽救入病毒

为了确定前-腺病毒质粒pAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6是否能被挽救成病毒并在组CE1互补细胞系中增殖，将质粒用Pme I消化并用磷酸钙共沉淀技术转染到T-25瓶中的PER.C6细胞(Cell PhectTransfection Kit，AmershamPharmacia Biotech Inc)。在进入细胞后，Pme I消化从质粒序列释放病毒基因组，允许病毒复制。转染后，观察到表明病毒复制和扩增正在发生的病毒病变效应(CPE)。转染后大约7-10天后，CPE结束时，收获感染细胞和培养基，冻融3次并将细胞残骸用离心沉淀。将大约1ml的细胞裂解物用于感染T-225瓶中的80-90％汇合的PER.C6细胞。一旦出现CPE，就收获感染细胞和培养基，冻融3次并将细胞残骸用离心沉淀。然后，将澄清的细胞裂解物用于感染2-层NUNC细胞工厂的PER.C6细胞。CPE结束后，用CsCL密度梯度超速离心纯化病毒。为了证实挽救病毒的基因结构，用链酶蛋白酶处理，继之以酚氯仿抽提和乙醇沉淀来提取病毒DNA。然后用HindIII消化病毒DNA，并用Klenow片段处理，用P33-dATP末端标记限制片段。然后用凝胶电泳对末端标记的限制片段进行大小分离并用放射自显影观察。将所得消化产物与其来源的相应前腺病毒质粒(在标记前已用PmeI/HindIII消化)的消化产物进行比较。观察到预期的大小表明病毒已被成功挽救。

实施例3将表达盒***pAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6

为了将gag或SEAP表达盒(分别参见图8和9)导入pAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6的E1区，再次使用细菌重组。将由以下组成的Gag表达盒：1)人巨细胞病毒立即早基因启动子，2)人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)gag(菌株CAM-1；1526bp)基因的编码序列，和3)牛生长激素多聚腺苷酸化信号序列，克隆至Ad35穿梭质粒的E1缺失，pNEBAd35-2(上述Ad35ITR盒的前体)，产生pNEBAd35CMVgagBGHpA。pNEBAd35-2从基因组的左端含有Ad35序列(bp4-456以及bp3403-3886)，在缺失位点bp456-3403之间具有单一SwaI位点。从前面构建的穿梭质粒通过EcoRI消化得到gag表达盒。消化后，将目的片段凝胶纯化，并用Klenow处理以得到钝端并克隆到pNEBAd35-2的SwaI位点。克隆步骤导致gag表达盒以E1平行的方向被***到bp456和3403之间的E1缺失。含有gag转基因的穿梭载体被消化以产生由gag表达盒组成的DNA片段，其中gag表达盒侧接Ad35bp 4到456以及bp 3403到3886，并在琼脂糖凝胶上电泳后纯化片段。用穿梭载体片段和用SwaI消化在E1区线性化的pAd34hE1SE4Ad50rf6共转化BJ 5183细菌，通过同源重组产生含有Ad34 gag的前病毒质粒pAd34ΔE1gagΔE4Ad50rf6。通过限制分析进行潜在克隆筛选。

通过相似的策略来产生含有SEAP表达盒的Ad34前-Ad质粒。在这种情况下将由以下组成的SEAP表达盒：1)人巨细胞病毒立即早基因启动子，2)人胎盘SEAP基因的，和3)牛生长激素多聚腺苷酸化信号序列，克隆到Ad35穿梭质粒pNEBAd35-2的E1缺失，产生，pNEBAd35CMVSEAPBGHpA。通过EcoRI消化，从前面构建的穿梭质粒得到SEAP表达盒。消化后，用凝胶纯化目的片段，用Klenow处理得到钝端并克隆到pNEBAd35-2的SwaI位点。然后将转基因重组到pAd34AE1AE4Ad50rf6，产生pAd34hE1SEAPSE4Ad50rf6，如同上面描述的gag转基因。

将所有前-Ad挽救成病毒并扩增以如上所述制备CsCl纯化的贮备物。

实施例4 pMRKAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6的构建

为构建完全由Ad34序列构成的前-Ad质粒，制备Ad34 ITR盒。所制备的Ad34 ITR盒含有被含有细菌复制原点和氨苄青霉素抗性基因的质粒序列分隔的Ad34基因组的右(bp 31584到31895和bp 34409到34772)和左端(bp 4到456和bp 3402到3885)序列。通过PCR产生这4个片段并顺序克隆到pNEB193，产生pNEBAd34-4。接着，通过PCR产生Ad5 Orf6开放读框并克隆到Ad34的bp31895和34409之间，产生pNEBAd34-4Ad50rf6(ITR盒)。PNEB 193是通常使用的商业可获得的克隆质粒(New England Biolabs cat#N3051S)，其含有细菌复制原点、氨苄抗性基因和可导入PCR产物的多克隆位点。ITR盒含有从Ad34bp 457到3401的E1序列缺失，缺失部位含有单一Swa I限制位点，以及Ad34bp 31896到34408的E4缺失，按照E4平行方向向其中导入Ad5 Orf6。在该构建体中，Ad50rf6的表达被Ad34 E4启动子驱动。ITR盒的Ad34序列(bp31584到31895和bp 3402到3885)提供与纯化的Ad34病毒DNA同源的区域，在共转化到BJ5183细菌后，在其中可以发生细菌重组(图2)。还设计在病毒ITR的末端含有单一限制酶位点(PmeI)，以便消化将重组的Ad34基因组从质粒序列释放。通过限制酶分析筛选有效克隆并将一个克隆选择作为pMRKAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6。

实施例5体内研究

A.免疫

给予一组3只恒河短尾猿单次肌内注射两种载体之一：(1)10^11vpMRKAd5-SEAP(在2002年3月21日公开的PCT/USO1/28861的图10A-1到10A-45的MRKAd载体骨架中)；和(2)10^11vpAd34ΔE1SEAPΔE4Ad50rf6。恒河短尾猿的重量为3-10kg。在所有情况下，将每种疫苗的总剂量悬浮在1mL缓冲液中。将短尾猿麻醉(***/盐酸塞拉嗪)，将疫苗使用结核菌素注射器按照0.5ML的等份肌内递送到两侧的三角肌(Becton-Dickinson，Franklin Lakes，NJ)。在免疫过程中，在一些时间点，从采集的血样中制备外周血单核细胞(PBMC)。所有的动物关心和处理均按照Institutional AnimalCare and Use Committee根据Institute of Laboratory AnimalResources，National Research Council在Guide for Care and Use ofLaboratory Animals中的原则制定的标准进行。

B.SEAP分析

使用TROPIX磷光化学发光试剂盒(Applied Biosystems Inc)分析血清样品中的循环人分泌碱性磷酸酶((SEAP)水平。在96-孔白DYNEX平板中，将每种血清的双份5μL等分试样与45μl试剂盒提供的稀释缓冲液混合。用人胎盘碱性磷酸酶在10％天然猴血清中的系列稀释液(Catalog no.M5905，Sigma，St.Louis，MO)提供标准曲线。通过在65℃加热孔30分钟灭活样品中的内源SEAP活性。按照试剂盒中描述的方法确定样品中的酶SEAP活性。用DYNEX光度计记录化学发光读数(以相对光单位)。用对数-对数回归分析将RLU读数转换成ng/mL SEAP。

C.ELISPOT分析

按照以前描述的方法，略作改动，对恒河短尾猿进行IFN-γELISPOT分析(Allen etal.，2001 J.Virol.75(2)：738-749)。为了抗原特异刺激，从含有完整HIV-gag序列并具有10-aa重叠的20-aa肽制备肽库(Synpep Corp.，Dublin，CA)。向每个孔中加入50μL 2-4×10⁵外周血单核细胞(PBMCs)；用Beckman Coulter Z2颗粒分析仪，将其下限体积截留设置为80飞升(″fL″)，计数细胞。将50L培养基或gag肽库以每肽8μg/mL浓度加入到PBMC。将样品在37℃5％CO₂中孵育20-24hrs。从而形成点，并将平板用定做的成像仪和基于ImagePro platform(Silver Spring，MD)的自动计数子程序ImagePro platform(Silver Spring，MD)进行处理。将计数标准化为10⁶细胞输入。

D.细胞内细胞因子染色(ICS)

向完全RPMI培养基中的1ml 2×10⁶PBMC/mL(17×100mm园底聚丙烯管(Sarstedt，Newton，NC))加入终浓度为1ug/mL的抗-hCD28(克隆L293，Becton-Dickinson)和抗-hCD49d(克隆L25，Becton-Dickinson)单克隆抗体。对于gag特异的刺激，加入10ul肽库(0.4mg/mL每肽)。将管在37℃孵育1hr，之后加入20μL 5mg/mL布雷菲德菌素A(Sigma)。细胞在37℃5％CO₂中90％湿度下孵育16hrs。将4mL冷PBS/2％FBS加入每个管中，并将细胞在1200rpm沉淀10min。将细胞重悬于PBS/2％FBS并用一些荧光标记单克隆抗体：20μL每管抗-hCD3-APC，克隆FN-18(Biosource)；20uL抗-hCD8-PerCP，克隆SKI(Becton Dickinson)；和20uL抗-hCD4-PE，克隆SK3(Becton Dickinson)对表面标记进行染色。这一阶段的样品处理在暗处进行。将细胞洗涤并在750μL 1xFACS Perm缓冲液(Becton Dickinson)室温下孵育10min。将细胞沉淀并重悬于PBS/2％FBS和加入0.1μg FITC-抗-hIFN-γ，克隆MD-1(Biosource)。30min孵育后，将细胞洗涤并重悬于PBS中。用Becton Dickinson FACSCalibur仪的所有4色通道分析样品。为了分析数据，先将低侧和前向-分散淋巴细胞群开启；对于CD4+和CD8+群体和模拟管以及样品的gag-肽反应管使用细胞因子阳性事件的共同的荧光截留。

E.结果

表达：对注射前后的血清样品分析循环SEAP活性，结果如图4所示。结果表明在10^11vp的相同高剂量水平，由其他的腺病毒血清型产生的SEAP蛋白的峰水平比MRKAd5所产生的低但在3倍的范围内(图4)。血清SEAP的水平在10天后剧烈下降，在15天时接近背景。这一结果强力表明基于Ad34的载体在肌内施用于灵长类动物后，在表达转基因方面是有效的。

免疫原性：针对20aa的肽库用INF-γELISPOT分析来定量针对HIV-1 gag的疫苗诱导的T-细胞应答，所述肽库包含完整蛋白序列。结果如图5所示；应答于肽库或模拟(无肽)对照的结果通过每百万外周血单核细胞(PBMC)的点形成细胞(SFC)数量来表示。

用表达gag的Ad34载体免疫在单剂量免疫后立刻诱导可检测水平的循环gag-特异T细胞。在周4给予第二剂量后应答增强。总之，对基于Ad34载体的应答略低于相同剂量的MRKAd5-gag诱导的应答。结果强力表明基于Ad34的载体能有效引发HIV-特异T细胞应答。

来自Ad34免疫动物的PBMC的IFN-γICS分析表明载体可诱导可检测水平的CD4+和CD8+HIV特异T细胞(图6)。

实施例6外源免疫

将一群3只猴子用10^11vp Ad34ΔElgagΔE4Ad5Orf6免疫(在周0和4)，然后在周24用10^10vp Ad35ΔElgagΔE4Ad50rf6加强。针对20aa的肽库用INF-γELISPOT分析来定量针对HIV-1 gag的疫苗诱导的T-细胞应答，所述肽库包含完整蛋白序列。结果如图12所示；应答于肽库或模拟(无肽)对照的结果通过每百万外周血单核细胞(PBMC)的点形成细胞(SFC)数量来表示。

用表达gag的Ad34载体免疫诱导的循环gag-特异T细胞水平在加强时降低至94-139 SFC/10^6 PBMC。用基于Ad-35的HIV载体外源免疫导致T细胞应答的3倍提高。

来自Ad34引发/Ad35加强的动物的PBMC在周28的IFN-γICS分析表明载体可诱导可检测水平的CD4+和CD8+HIV特异T细胞(图13)。

Claims (36)

1.重组腺病毒血清型34载体，其在E1至少部分缺失并且缺乏E1活性。

2.一群细胞，其包含权利要求1的重组腺病毒载体。

3.产生重组、复制缺陷的腺病毒颗粒的方法，其包括：

(a)将权利要求1的重组腺病毒载体转染到一群细胞；和

(b)收获所得重组、复制缺陷的腺病毒。

4.纯化的按照权利要求3的方法收获的重组、复制缺陷的腺病毒颗粒。

5.组合物，其包含按照权利要求4的纯化的重组腺病毒颗粒。

6.按照权利要求5的组合物，其包含生理可接受的载体。

7.重组腺病毒血清型34载体，其在E1至少部分缺失并且缺乏E1活性且含有异源核酸。

8.一群细胞，其含有权利要求7的重组腺病毒载体。

9.产生重组、复制缺陷的腺病毒颗粒的方法，其包括：

(a)将权利要求7的重组腺病毒载体转染到一群细胞；和

(b)收获所得重组、复制缺陷的腺病毒。

10.权利要求7的重组载体，其中载体含有基因表达盒，所述表达盒含有：

(a)编码蛋白的核酸；

(b)可操作连接于编码蛋白的核酸的外源启动子；和

(c)转录终止序列。

11.按照权利要求10的重组载体，其中基因表达盒被***E1区。

12.按照权利要求7的重组载体，其中异源核酸含有优化用于在人宿主表达的密码子。

13.按照权利要求7的重组载体，其在E1缺失含有异源核酸。

14.按照权利要求7的重组载体，其在E3至少部分缺失。

15.纯化的按照权利要求9的方法收获的重组、复制缺陷的腺病毒颗粒。

16.组合物，其含有纯化的按照权利要求9的重组腺病毒颗粒。

17.按照权利要求16的组合物，其含有生理可接受的载体。

18.实施异源核酸递送和表达的方法，其包括在施用异源核酸之前或之后用相同或不同的载体施用权利要求16的组合物。

19.按照权利要求18的方法，其中在组合物之前或之后用不同血清型腺病毒施用异源核酸。

20.按照权利要求16的组合物，其中异源核酸编码HIV抗原。

21.在个体产生针对HIV的细胞介导的免疫应答的方法，其包括给个体施用权利要求20的组合物。

22.按照权利要求21的组合物，其中HIV抗原是HIV-1 gag或其免疫学相关的修饰。

23.按照权利要求21的组合物，其中HIV抗原是HIV-1 nef或其免疫学相关的修饰。

24.按照权利要求21的组合物，其中其中HIV抗原是HIV-1 pol或其免疫学相关的修饰。

25.血清型34的重组腺病毒载体，其在E1至少部分缺失并且缺乏E1活性且含有HIV-1基因。

26.一群细胞，其含有权利要求25的重组腺病毒载体。

27.产生重组、复制缺陷的腺病毒颗粒的方法，其包括：

(a)将权利要求25的重组腺病毒载体转染到一群细胞；和

(b)收获所得重组、复制缺陷的腺病毒。

28.纯化的按照权利要求27的方法收获的重组、复制缺陷的腺病毒颗粒。

29.组合物，其含有纯化的按照权利要求28的重组腺病毒颗粒。

30.按照权利要求29的组合物，其含有生理可接受的载体。

31.实施HIV-1基因递送和表达的方法，其包括在施用HIV-1基因之前或之后用相同或不同的载体施用权利要求30的组合物。

32.按照权利要求31的方法，其中在组合物之前或之后用不同血清型腺病毒施用HIV-1基因。

33.在个体产生针对HIV的细胞介导的免疫应答的方法，其包括给个体施用权利要求29的组合物。

34.按照权利要求29的组合物，其中HIV抗原是HIV-1 gag或其免疫学相关的修饰。

35.按照权利要求29的组合物，其中HIV抗原是HIV-1 nef或其免疫学相关的修饰。

36.按照权利要求29的组合物，其中其中HIV抗原是HIV-1 pol或其免疫学相关的修饰。

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