CN1754095A

CN1754095A - 用于生物芯片的芯片读出器及其相关方法

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Publication number: CN1754095A
Application number: CNA2003801098810A
Authority: CN
Inventors: F·苏萨丽娜; E·霍米亚科娃
Original assignee: IMSTAR Image et Modelisation Strategie Analyse et Realisation SAS
Current assignee: IMSTAR Image et Modelisation Strategie Analyse et Realisation SAS
Priority date: 2002-12-23
Filing date: 2003-12-23
Publication date: 2006-03-29
Also published as: FR2849196A1; AU2003303352A1; WO2004059302A1; JP2006511798A; EP1576357A1; US20070195321A1; FR2849196B1

Abstract

本发明涉及用于阅读和分析芯片的装置。本发明的装置包括工作台(11)，其用于接收要鉴别至少一种样本的芯片(12)；在芯片分子或细胞与其它分子反应之后激发它们的设备；以及阅读和分析受激发的分子的设备(14)。本发明的特征在于该装置还包括：用于控制前述工作台温度的单元(15)，所述控制单元与由多个沉积在工作台表面不同相对位点的多个帕尔帖类型加热/冷却元件组成的模块(111)相连；并且至少一个工作台温度传感器(112)也与所述控制单元相连。本发明还涉及相关的方法。

Description

用于生物芯片的芯片读出器及其相关方法

一般情况

一般地，本发明涉及芯片的阅读和解释，更具体的是涉及由信号产生分子，例如荧光团，所标记的，并且形成于构建这些芯片的分子与来源于生物或化学样本的分子或细胞之间的杂交的检测。

根据第一方面，本发明涉及阅读和分析芯片(或芯片读出器)的装置，其包括：

·用于接收打算鉴别至少一种样本的芯片的工作台，

·在与其它分子反应之后激发芯片的分子或细胞的装置，

·阅读和分析受到激发的分子的装置。

更具体地，本发明还提供了一种控制芯片温度的装置，这样就使其能够发展出涉及芯片温度变化的应用。

在具体应用中，芯片是DNA或寡核苷酸芯片，而温度的控制使其能精确限定在所述芯片上寡核苷酸探针的杂交温度。

本发明还涉及使用这样的读出器的方法，特别是用于检测基因突变。

定义

在介绍本发明的目的和特征之前，先定义一些将在本文中用到的术语。

术语“阵列，微阵列，芯片”，在本发明中是通用的，其指的是排列在固体支持物上特异位点中的细胞阵列或生物或化学分子的阵列(形成，例如，矩阵)。

分子或细胞通常结合至由聚合物所涂覆的固体支持物上的各个位点，并且排列从而使这些位点的每个都是与相应于其它位点的分子/细胞展示分子/细胞特异性相关的类型。

当阵列包含生物分子，例如核酸或肽时，其定义为生物芯片。

更精确地，当阵列包含脱氧核糖核苷酸时，其定义为DNA芯片或寡核苷酸芯片。

固体支持物选自由以下物质制成的固体支持物：玻璃、塑料、Nylon^、Kevlar^、硅树脂、硅，或其它多糖或杂多糖，例如纤维素。

优选的是玻璃。这种支持物可以是任何形式(扁平载波片、微珠，等等)，但是，根据优选实施例，支持物是平板，并且其包括扁平玻璃载波片。

当芯片在合适条件下与样本接触时，样本的特定组分有选择地与(并且特异地结合至)芯片的一个或更多分子/细胞反应。

此外，这些组分包含特定的标记(通称为荧光染料或分子——一般称为“荧光团”)而使其能够在样本与芯片接触之后检测组分的存在。这种检测要求，在荧光团的情况下，用控制了波长的光激发芯片。

术语“分子”在这里包括化学分子和生物分子。

对于生物应用，“生物分子”优选的是核酸，更优选的是单链寡核苷酸。

对于化学应用，可以是针对生物分子的化学配体。

术语“核酸，核酸探针，核酸序列，多核苷酸，寡核苷酸，多核苷酸序列，核苷酸序列，寡核苷酸序列”，在本说明书中是通用的，指的是修饰或未修饰的核苷酸精义链，使其能限定核酸片段或区域，包含或不包含变性核苷酸，并且可以对应于双链DNA，单链DNA，PNA(“肽核酸”)或LNA(对应于“锁定的核酸”)以及所述DNA的转录产物，例如RNA。

术语“探针，寡核苷酸探针或寡核苷酸”在这里指的是功能性或非功能性寡核苷酸，其将被沉积(或“点样”)并且通过共价键直接或间接经过位点水平上的间隔化合物结合到固体支持物。

这样点样的寡核苷酸能通过一个或更多化学键类型的方式结合到样本中存在的互补序列的靶核酸(即，互补的寡核苷酸或多核苷酸)，通常是通过互补碱基配对形成氢键。

优选地，所述探针是单链DNA和RNA，优选为DNA，其大小为10至7000碱基(b)之间，优选为10至1000b之间，10至500b之间，10至250b之间，10至100b之间，10至50b之间或10至35b之间。

所点样的寡核苷酸探针可以是化学合成的，从生物样本纯化的，或者，更常见的，通过重组DNA技术从天然和/或纯化的多核苷酸中产生的。

例如，探针可以通过聚合酶链式反应(PCR)或RT-PCR(伴随聚合酶链式反应的反转录)而产生。

术语“位点”对应于芯片上分子被结合的点。

相同分子的几个复制本优选位于一个位点。

位点通过它们相对于芯片上的参考点的X-和Y-坐标来限定。

一个位点可以，例如，对应于具有一直径的圆环，或对应于一个孔，或平行六面型凝胶垫(被称为凝胶垫)，其中该圆环直径取决于平板限定的区域内的所点样溶液液滴的体积。

术语“样本”对应于生物的溶液，生化或化学分子或对应于细胞组，其被预想为具有一定的特性。

在本发明的优选应用中，样本是包含至少一种从生物来源获得的寡核苷酸的溶液。

样本可以来源于从各种组织或细胞的活的或死的来源。

生物样本的例子包括体液，例如血液(特别是白血球)，尿液，唾液，***，或者***分泌物，皮肤，以及细胞例如发根囊泡细胞，从正常或病理内部组织来的细胞，特别是来自肿瘤的，来自绒毛膜组织的细胞，羊膜细胞，胎盘细胞，胎儿细胞以及脐带细胞。

术语“标记”或“信号产生标记”指的是能够直接或间接与样本中的生物，生化或化学分子相关联的标记，为了随后检测的目的，它采用例如那些根据本发明的读出器的阅读方式。

信号产生标记优选地选自酶，染料，半抗原，例如生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或异羟洋地黄毒甙元(digoxygenin)的配体，或发光剂。

优选地，根据本发明的信号产生标记是一种荧光剂，根据激发能的来源其能分为放射发光，化学发光，生物发光以及光照发光(包括荧光和磷光)。

优选地，根据本发明的信号产生标记是一种荧光剂。

术语“荧光”一般是指一种例如荧光素的基质的特性，基质在受到光源以称为激发波长的给定波长激发时会产生光，并且所发出的光具有更高的波长，被称为发射波长，其能采用光子传感器检测，提供信号，当将信号结合起来时能够构建芯片的杂交信号的图像。

在本发明所采用的荧光团中包括但不尽于：

·异硫氰酸酯荧光素(FITC)[最大吸收波长：494nm/最大发射波长：517nm]；

·得克萨斯红(TR)[最大吸收波长：593nm/最大发射波长：613nm]；

·花青素3(Cy3)[最大吸收波长：554nm/最大发射波长：568nm]；

·花青素5(Cy5)[最大吸收波长：652nm/最大发射波长：670nm]；

·花青素5.5(Cy5.5)[最大吸收波长：675nm/最大发射波长：694nm]；

·花青素7(Cy7)[最大吸收波长：743nm/最大发射波长：767nm]；

·Bopidy 630/650[最大吸收波长632nm/最大发射波长658nm]；

·Alexa 488(495/519)；

·Alexa 350(347/422)；

·梅红(rhodamine red)染料(570/590)。

术语“反应”指的是发生在与芯片上位点相关联的分子和样本的分子之间的化学或生物反应(例如，杂交)。

术语“杂交”指的是涉及沉积的(或点样的)寡核苷酸和来源于生物样本的靶序列之间通过互补碱基对结合的反应。

从杂交形成的杂交体或二倍体被称为杂交复合物或杂交二倍体。

杂交复合物可以是互补复合物也可以是错配复合物。

就是说，互补复合物是一种在点样的寡核苷酸和样本的靶序列之间没有错配的杂交复合物。

具有错配的复合物是在点样的寡核苷酸和样本的靶序列之间至少存在一个错配的杂交复合物。

术语“特异性杂交”指的是在严格条件下，并且当序列存在于复杂DNA或RNA环境时仅在特异核苷酸序列上结合到形成的二倍体或杂交的核酸分子。

一种“互补寡核苷酸”是一种探针，其序列与特异靶序列完全互补(在本文中，术语“匹配”将被用来指代这种类型的完美配对)。

展示“错配”的探针指的是一种或多种其序列与特异靶序列不完全互补的探针。

虽然错配可以出现在展示错配探针的任何地方，但是末端错配是更加不理想的，因为它们对靶序列上的杂交具有更低的影响。

就是说，探针通常具有的错配位于探针中心或中心的边缘，从而错配具有在杂交条件下使与靶序列形成的二倍体不稳定的更大的变化。

术语“二倍体”或“杂交”对应于双链DNA片段。要看到的是这样的二倍体是通过寡核苷酸(排列在芯片上位点内的分子)与要鉴别的样本的单链片段杂交获得的。

术语“阅读”通常指的是包括通过一种或更多合适的传感器借助检测标记而收集反应后分子的应答的过程。

这种阅读具体可以是光阅读，但是，作为替代，也可以是通过收集例如放射辐射的信号的阅读。

要注意的是，在本文中，芯片“读出器”的定义不仅指这种简单阅读过程，因为它还包括对“阅读”信号的分析。

发明内容

“光源”方面

上述芯片读出器的类型是已知的。

这样的读出器使其能在芯片分子与样本分子反应之后收集所述分子对给定激发的应答。

这种应答的收集使其能识别对所述激发反应特异的标记，其可以特别是集中在给定波长的照明(光激发)。

芯片，优选为平板的形式，位于工作台上，可以沿着三个纵、横和垂直轴x、y和z移动，因而连续地在芯片的各个位点上接受激发辐射，并且具有观测这些位点的设备。

芯片可以直接放置在工作台上或者放置在连接到工作台的处理腔室中(例如，杂交小室)。

这些读出器包括激发设备，其一般以光源形式存在(大约从几百平方微米至几平方毫米)，使其能够以控制波长的光谱照明芯片的分子或细胞，因而使与分子结合的信号产生标记(优选为荧光标记)激发。

这些照明设备一般以灯(典型的是氙灯或汞灯)或一个或更多激光二极管的形式存在。

氙灯提供了一种连续和相等的光谱，覆盖大多数常用标记的激发波长。

然而，这些灯的局限是与针对各种标记的激发线相关的能量水平可能太低以至于不能产生充足的理想激发线。

至于汞灯，它们提供一定波长的光谱展示线(最大能量)。

因此，这样的灯能够充分激发在对应于这些线的波长为可激发的荧光标记。

然而，汞灯的激发线不包括通常用于激发这些读出器应用中所使用的激发荧光团(可以是Cy5或Cy7类型或者另一不能被广谱灯有效激发的荧光团)的特定波长。这对汞灯构成了相当大的局限。

作为灯的替代，已知实现读出器照明的设备是一种或多种给定波长的激光器。

“红”激光器，非常普通并且不是很贵，这样构成了实用和可获得的解决方案用于激发标记，例如花青素5或花青素7。然而，当要激发的标记在位于蓝光或接近蓝光范围的紫外光的波长具有反应活性(例如，激发FITC类型的标记)时，必需要利用不太常见类型的激光器，其导致成本上相当大的缺点。

这样就显现出用于为读出器产生照明的设备的已知方案的局限性。

本发明的目的之一是使其能避免照明设备的相关局限。

“温度控制”方面

此外，对于许多应用，例如，芯片上的寡核苷酸杂交反应或酶反应，有利的是采用读出器监控这些反应的参数，这些参数是芯片温度函数。

提供温度控制的读出器工作台的操作是已知的。这样读出器的例子见于文件US6329661。

因此结合温度控制的工作台与芯片读出器的方式能够通过输送给定的信息部分而控制工作台的温度。

本发明的另一目的是改进这种装置。

具体地，本发明的目的是能够在用于观测预想参数的最佳温度条件下自动阅读芯片。

为了实现上述目的，根据第一方面，本发明提供了一种用于阅读和分析芯片的装置，其包括：

·用于接收打算鉴别至少一种样本的芯片的工作台，

·在其与其它分子反应之后激发芯片的分子或细胞的设备，

·阅读和分析受激发的分子的设备，

其特征在于该装置还包括：

·控制所述工作台温度的单元，所述控制单元被连接至由多个帕尔帖类型加热/冷却元件以相对于工作台表面上各个位点排列所组成的模块(111)，

·并且至少一个工作台传感器(112)也被连接至所述控制单元。

优选，但不限于，该装置的各部件如下：

·灯是汞灯，

·激光器是辐射集中在大约635nm波长的激光器，

·读出器包括几个激光器，

·激光器集中在相同的波长，

·激发设备包括至少一个激光器，与扫描其光束的模块相关联从而激发待分析的分子，

·读出器包括两个激光器和模块，模块用于扫描两个激光器并在两个垂直方向上控制两个独立的分子扫描，

·激发设备包括至少一个激光器组件，其包括辐射受光纤导向的激光器，

·激发设备包括两个同样的激光器组件，

·激发设备包括一个固定的激光器，其发射光束朝向两个顺序安装的连续的，并且其移动受控沿着两个不同的方向进行的镜组件，

·两个镜组件的移动是受控的，因而产生能跟随芯片上的任何预定序列的光束，

·激发设备包括灯和激光器，它们的辐射采用相同的光学通道，因为摇摆镜能够围绕两个位置之间的轴旋转因而使这两个辐射的其中之一直射入芯片，

·光学***被***灯和待激发的分子之间，而激光器激发则发生对分子的直接照明，

·所述光学***包括窄带激发光滤光器和窄带发射光滤光器，以及光束分离器，

·读出器还包括激发控制单元，与每个激发设备相连从而控制其功能，

·所述激发控制单元能够选择性地控制采用灯和至少一个激光器同时或连续照明分子，或者是采用灯和至少一个激光器对分子的独立激发。

本发明还提供了用于阅读和分析芯片的装置，其包括：

·用于接收要鉴别至少一种样本的芯片的工作台，

·在与其它分子或细胞反应之后，激发芯片的细胞或分子的设备，

·阅读受到激发的分子或细胞的设备，

其特征在于该读出器还包括温度控制单元。

优选，但不限于，该装置的各部件如下：

·工作台包括与所述温度控制单元相连接的温度传感器。

·读出器包括与工作台相关联并且要控制工作台温度的加热/冷却模块，所述加热/冷却模块与温度控制单元相连接。

·读出器还包括包含微处理器并且与温度控制单元和阅读设备相连接的处理设备。

·读出器包括存储分子对于作为温度的函数的激发设备的匹配和错配应答的参考曲线的设备。

·存储设备与根据所述参考曲线确定分子的匹配和错配融合温度的设备相连接。

·温度控制单元能够按照“静态”模式控制读出器的功能，即预先建立的作为温度函数的分子匹配和错配应答的参考曲线被所述温度控制单元用来建立能被传送的设定温度，从而控制所述工作台的温度。

·温度控制单元能够按照“动态”模式控制读出器的功能，即温度控制单元控制工作台上给定的温度变化，并且，在温度的这一变化期间：

≯阅读设备实时收集与芯片上各种位点相关联的分子对激发设备的激发做出的应答，并将所述应答传送给处理设备，

≯存储设备存储，针对芯片上每个点的，作为温度函数的分子应答的变化。

·读出器包括处理设备，其能在所述应答变化的存储末端建立针对每个分子的分子诊断状态。

·所述诊断状态是匹配/错配诊断。

此外，本发明还涉及使用这样的装置阅读芯片的方法。

这样的方法可以具体为芯片的寡核苷酸杂交的方法，其可以采用根据上述一个方面的读出器来实现，该方法包括以下步骤：

≯使对应于靶核酸的核酸探针与包含单链DNA片段的样本接触，从而通过形成二倍体实现特定探针与样本的所述单链DNA片段的选择性杂交。

≯阅读这样形成的二倍体，

该方法的特征在于，该方法包括由自动确定下面温度所组成的步骤：

≯针对每个处于“匹配”构象的靶核酸的融合温度，以及

≯针对每个处于“错配”构象的靶核酸的融合温度。

优选，但不限于，这样方法的各步骤如下：

·所述确定在“静态”模式中采用说明通过阅读分别对应于匹配和错配的二倍体所接收的信号中作为温度函数的变化的参考曲线来实现，

·该方法包括控制温度从而在对应于匹配和错配之间最大差别的温度进行杂交，

·该方法包括在先于阅读步骤之前的步骤期间产生所述参考曲线，

·该方法包括存储所述参考曲线，

·所述确定在“动态”模式中采用控制样本温度中给定的变化而实现，并且，在温度的这个变化中，执行以下步骤：

≯实时收集与通过激发设备激发的芯片上各种位点相关联的二倍体的应答，

≯对于每个二倍体，存储应答中作为温度函数的变化，

·该方法包括，对于每个二倍体，在应答中每个变化的存储末端建立二倍体的匹配/错配的诊断。

附图说明

本发明的其它优点和特点将通过以下结合实施例和附图的说明书显现出来，图例的含义如下：

·图1是根据本发明的读出器的原理图。

·图2包括：

≯在其上半部分，根据本发明读出器的工作台的原理图，详细展示了温度控制设备，

≯在其下半部分，代表的是温度可能的变化(以及具体显示温度的快速变化——大约为2.3℃/s——在根据本发明的装置中是可能的)，

·图3a至3b是示例完成这样的读出器的全部或部分激发光设备的四种变体的图，图3a还包括通过激发设备光源扫描芯片的示例，

·图4a和4b是与本发明分子杂交应用相关的图：

≯4a是由阅读设备接收的针对相同DNA序列的匹配构象和错配构象的作为温度函数的芯片所有点信号变化的示例，

≯图4b是完成本发明的“动态”模式的示例，在其中那些图4a类型的曲线是为几种DNA序列构建的，

·图5是将探针固定在具有醛基官能团的载波片上的反应图(来自TéléChem的超级醛基载波片)。醛基基团被共价结合到生物芯片的玻璃支持物上(长方形)。DNA分子的NH₂官能团攻击醛基基团从而形成共价键(中心图)。该键通过脱水反应而稳定(在略微潮湿的空气中干燥)，其结果导致形成希夫式(Schifff’s)碱基，

·图6示例了野生型寡核苷酸Q493X-Cy3和突变的寡核苷酸Q493X-Cy5混合物在包含各种以各种浓度(50，100和200μm)点样的并且随后以各种条件(低和高湿度)固定的相应探针的生物芯片上杂交的Cy3荧光。杂交在6×SSC，0.2％SDS，0.2mg/ml BSA中，在室温中进行12小时。寡核苷酸的浓度是0.5μm。杂交后的生物芯片在6×SSC，0.2％SDS中室温洗涤5分钟，随后是在2×SSC中室温洗涤2分钟，

·图7显示的是荧光信号的强度和信噪比，其对应于针对包含各种以各种浓度(50，100和200μm)点样的并且随后以各种条件(低和高湿度)固定的相应探针的芯片的寡核苷酸wtQ493X-Cy3和mutQ493X-Cy5的杂交溶液，

·图8代表了对应于Cy3标记的野生型寡核苷酸ΔF-508和Cy5标记的突变型寡核苷酸Q493X。

具体实施方式

参考附图1，根据本发明的读出器10如图所表示。

读出器10包括：

·接收芯片12的工作台11，

·激发设备13，

·阅读设备14(即观察芯片分子的设备，特别是对设备13发出的激发进行应答)，

·命令和控制设备。

工作台11

工作台11详细见于图2的上半部分。

这个工作台通常包括用于容纳芯片12的设备110。

这些设备可以包括腔室——例如，杂交小室。

工作台11与能够控制工作台温度的加热/冷却模块111相关联。

更加具体的，模块111包括多个帕尔帖效应加热/冷却元件。这些帕尔帖元件与工作台11的厚度融为一体。

这些帕尔帖元件的每一个相对位于工作台11表面上的点中——并且因而位于工作台所携带的芯片12上。

所述的点彼此相邻，并且结合起来覆盖了芯片的整个表面。

有利的是预先使这些点对应于芯片上将要接受探针的位点(见下文)。

而且，模块111与温度控制单元15相连，该单元产生设定温度并将其传送至模块111，因而后者根据取决于观察到的物理化学现象的温度变化率而调节工作台的温度。

更为具体的，控制单元针对模块111的每个帕尔帖元件产生单个设定温度。

这些帕尔帖元件非常精确——它们通常为设定温度提供大约为0.01℃的精确度。

由这些帕尔帖元件组合形成的模块111与热交换模块相关联，因而实现工作台11的加热/冷却。

这个热交换模块可以是空气或液体循环功能的。

这样就能够精细地控制工作台上任何位点的温度。

尤其是它能够通过这种方式确保在工作台11上的所有位点的温度严格相同。

基于帕尔帖元件对于设定温度的变化(升高或降低)非常敏感，这一点进一步得到提高。

这些元件因而能够精确地提供快速温度变化(典型地，精确度约为0.01℃，变化速率为每秒几度)。

这样就可以提供“快速”温度变化——每秒大约几度的变化，例如用于PCR类型的反应(聚合酶链式反应的缩合)。

它也可以提供“慢”变化(每分钟大约几度的变化——用于，例如，以解离为目的的DNA链融合类型的反应)。

为了能够提供这些各种类型的变化，至少一个相应的工作表被存储在单元15能够存取的该装置的存储器中(例如，将要描述的计算机17的存储器)。

要注意的是速率不仅取决于预定的反应类型，而且也取决于所采用的探针的类型，以及预定要鉴别的样本的类型。

基于此，相应的工作表也要考虑这些参数。

此外，装置的使用者能够进入与单元15和/或计算机17相连的合适的接口(键盘或其类似物)，作为与相应工作表相关联的程序的函数的参数(特别是，反应类型，探针，样本)将自动地选择要传送给模块111的设定温度变化。

而且，温度传感器112整合入工作台中，记录其有效温度并且将它传送至也与该传感器相连的温度控制单元15。

以这样的方式，芯片上位点的温度由温度控制单元15控制，并且芯片上位点的这一温度也被温度控制单元实时获知。

而且，可以相对于位点的组或者甚至相对于芯片上各个位点的每一个预设几个温度传感器112。

传感器112整合入工作台11中。

此外，如以后将要更详细表述的(特别是关于动态模式)，这(这些)温度传感器使得它能记录与装置的功能相关联的温度参数，并且能调节这种功能。

激发设备13

激发设备13包括两种类型的光源：

·广谱灯131——优选为汞灯，

·至少一个激光器132。

这个激光器按照能激发常用标记的波长发射，并且其激发光谱与灯131的发射光谱不一致。

在优选实施例中，灯是汞灯——其不能激发Cy5标记——激光器是常用的红激光器，其发出的射线集中在635nm，或者是其它能激发Cy5分子的激光器。

以这样的方式，所有常用的发光标记都能通过激发设备13而激发。

而且，激光器的利用不会显著增加读出器的***格，因为这种类型的激光器非常普通而且便宜。

激发设备13还包括针对每个类型光源的独立的电源1310，1320。

设备13还包括***灯131和工作台之间的光学***1311(因而在芯片的分子和灯之间)。

如图3a所示，这个光学***包括激发滤光器13111，和光束分离器13112，使其能够：

·使来自灯和来自滤光器13111的辐射直射向芯片，

·使来自芯片的对应于来自灯的(或来自激发设备的激光器的)激发的信号直射向阅读设备14。

特别的是，所述光学***还可以包括窄带激发光滤光器和窄带发射光滤光器(至少2个直至8个)以及光束分离器。

直射向芯片以及来自该芯片的辐射还可以通过物镜134。

激发设备13还可以包括干涉滤光器变化设备1312(见于图1)，其与滤光器13111和滤光器控制设备16相连。

因而可以理解，芯片的分子被来自灯的经过了光学***的辐射激发。

至于由来自激光器的辐射引起的芯片分子的激发，它是直接发生的，在激光器和芯片之间没有***任何元件。

在图3a所示的更为特别的变体中，激发设备包括两个激光器1321和1322。这两个激光器是相同的。

每个激光器与用于扫描生物芯片的模块(未示出)相关联。

当读出器仅仅包含一个激光器时，这个激光器本身还与在可参量排列的光束中实现这个功能的模块相关联。

为了有效覆盖对应于要鉴别的芯片上位点的视野，并且通过激光器均匀照明该视野，两个扫描模块在两个垂直方向上施加两个独立的分子扫描。

这种扫描类型在图3a的下半部分示例。

两个带13210和13220代表了两个激光器1321和1322的各自的光束。

这两个光束具有延长的交叉部分，两个光束的延长方向是垂直的。

这些方向中的每个可以在芯片上位点校准的两个方向之一上被调准，这些位点一般形成矩形矩阵。

每个光束通过与其相关联激光器的扫描模块而在视野120中移动，其方向为垂直于光束延长的方向。

图3b代表了完成激发设备13的激光器的第二种变体。这些激光器预定要用于激光器1321和1322的位置。

在这个变体中，激光器激发通过两个产生两个独立光束13210’和13220’的相同组件1321’和1322’而直射向芯片12。

这些组件之一，1321’所指示的，如图3b的上半部分所示例。

这种组件包括激光器13211’，其与输出透镜13212’相关联，该透镜使来自激光器的光流朝向光纤13213’。

这个光纤本身将辐射传送至另一个透镜，标号为13214’，其相对于芯片固定安装并且使光束13210’朝向它。

图3a的下半部分代表了两个光束13210’和13220’在芯片上的影响以及在这样被限定的照明范围1320上的影响。

因此激光器可以是偏中心的。

图3c代表了激光***的第三种变体，在其中至少一个固定激光器132″使其光束朝向顺序安装的两个连续镜组件，标号为1321″和1322″。

这些镜组件中的每个包括一个镜，其方向是由独立的压电调节器13210″，13220″来控制的。

更具体的，这样一来，每个镜沿着各自的轴移动，这些轴对应于芯片12的横向轴X，Y其中之一。

这样，来自两个镜的光束1320″在芯片上采用的通路13201″可以沿着轴X、Y跟随任意预定的序列。

此外，这种激光器***可以替代图3a中的激光器1321、1322。

最后，图3d示例了完成另一种激发设备13的变体，其对应于图3a所代表的设备的替代方式。

这个图3d代表汞灯131和激光器132。

激光器和灯每个都与各自的输出透镜相关联。

在这个变体中，来自激光器和来自灯的独立辐射采用相同的光学通路，由于能围绕位于两个位置之间的轴1300旋转的摇摆镜130因而使这两个辐射之一朝向系列透镜1301以及回转镜1302以便使辐射朝向光学组件134和芯片12。

镜130的摇摆控制设备可以控制任意序列，使其能够用两种类型辐射(激光器和灯)照明芯片，例如通过预定的频率在它的两个位置之间旋转。

特别的是，在上述所有变体中，激发设备可以包括一个激光器，或几个相同的激光器。

阅读设备14

阅读设备14包括光学***141，其用于获取芯片12的图像范围120，而且，能够用于该芯片通过工作台11的受控制的移动而相对于读出器的其余部分移动。

为了这种效果，阅读设备还包括记录设备，用于协调工作台11的移动。

因此光学***141包括第一探测光学组件1411，以及***这第一光学组件和CCD摄像机142之间的滤光器1412。

光学***141还包括滤光变化设备14120(见图1)，其与滤光器1412和滤光器控制设备16相连。

控制和命令设备

除了温度控制单元15和滤光器控制设备16已经介绍过之外，用于控制和命令读出器的设备包括，管理读出器所有元件功能的计算机17。

计算机与如下元件以这样一种方式相连以便将功能指令传送给它们并且/或者接收来自它们的信息：

≯电源1310和1320——在这方面，计算机执行激发控制单元的功能。特别是计算机可以选择控制：

采用灯和至少一个激光器同时照明芯片分子，

或者采用灯和至少一个激光器分别激发分子

≯温度控制单元15，

≯滤光器控制设备16，

≯以及伴随的其它控制和命令元件。

控制和命令读出器的设备还可包含：

·用于控制工作台11移动的单元18，其与该工作台和计算机17相连，

·控制摄像机142以及获取由该摄像机获得的图像的单元19，其能按照各种模式，其中包括用于跟随动态现象的实时模式，或者采用终止时间用于提高非常低强度的位点(杂交信号)的图像信噪比。

读出器的功能

根据本发明的读出器的结构在以上已经详细描述了。特定的方面，尤其是芯片分子的激发也已经说明。现在，将从温度控制的角度详细说明该读出器的功能。

更具体的，将在预定的本发明应用的基础上描述该功能，即芯片的寡核苷酸与来自生物样本的单链DNA片段的杂交。

然而，特异化的根据本发明的读出器也能被用于其它应用——例如，用于实现酶反应(特别是连接酶，PCR，简单寡核苷酸延伸，等类型)，用于筛选配体。

回到杂交应用，例如来自患者的生物样本，被研究以便检测其中特定的遗传特征。所寻找的特征可以是，例如，特异核酸序列，例如，CFTR基因中，可能存在的突变。

该方法开始是常规的，通过将对应于靶核酸的核苷酸所构成的核酸探针构建在芯片的各个位点上而制备芯片。

这些探针预定要与包含单链DNA片段的样本杂交。

而且，单链DNA片段是以已知方式获得的，特别是通过PCR扩增。它们与标记相结合从而在这些片段与芯片探针杂交之后，使其能被读出器的阅读设备检测。

所述探针随后与样本接触因而实现特定探针与样本单链DNA片段的选择性杂交，从而构建二倍体。

特别的是，不是所有的探针都与样本的DNA链杂交。

事实上，每个核酸探针将优先与其靶核酸杂交。

此外，一些探针对应于没有突变的核酸，而另一些则对应于包含给定突变的核酸。

在这个杂交步骤期间，为有效杂交的探针形成二倍体。

探针正确杂交意味着包含单链DNA片段的样本与所述探针的靶核酸相对应。

以这种方式杂交的探针因而在杂交步骤之后对应于“匹配”型二倍体。

而且，在杂交步骤之后，与样本的单链DNA片段没有杂交或杂交很差的探针对应于“错配”型二倍体或者甚至是非杂交的单链。

温度是这个杂交步骤的重要参数。

这是因为，对于每个靶核酸，存在着：

·针对处于“错配”构象中的二倍体的融合温度Tm1，以及

·针对处于“匹配”构象中的二倍体的融合温度Tm2。

融合温度对应于二倍体的一半的两条链彼此分离时的温度。

Tm1小于Tm2，如图4a所示。

此外，理想的是，对于给定的靶核酸，在对应于匹配和错配之间差别最大的温度进行杂交步骤。

这样，“匹配”和“错配”二倍体可采用芯片读出器的阅读设备有选择的鉴别。

这个理想温度介于Tm1和Tm2之间。

在已知杂交方法的情况中，通常需要重复几次杂交从而获得接近于这个理想温度的温度。

在本发明的情况中，温度的控制是通过温度控制单元15而进行的，从而避免了这一缺点。

更具体的，本发明的这一应用可按照两种模式实现：“静态”模式和“动态”模式。

在这两种模式中，以下温度可以自动被确定：

·处于“匹配”构象中的每个靶核酸的融合温度，以及

·处于“错配”构象中的每个靶核酸的融合温度。

静态模式

这种模式非常适合于探针对应于同样的靶核酸或靶核酸具有相似融合温度的芯片的情况。

在这种模式中，所述融合温度的确定是预先完成的，因此这些温度在完成鉴别之前就已知了。

这些温度可以让操作者知晓，他实现这一鉴别并且因而将设定温度输入装置(采用与计算机相连的接口，或者直接与单元15相连的接口)。

这些温度还可以被存储在读出器的存储器中，该存储器与所述单元15相连。

这样，芯片的温度被控制，因而可在匹配与错配之间差别最大的温度进行杂交。

特别的是，融合温度还可以通过读出器(见随后的动态模式)而确定，并且被存储用于完成静态模式。

在这样的融合温度的优先确定期间，参考曲线等价于图4a产生的那些。

因而能在阅读步骤之前形成参考曲线。

在这种情况下，读出器被用来记录在单元15控制的影响下温度连续变化时，探针对已知类型的单链片段(对应于没有突变，和有突变的靶核酸的片段)的应答。

此外，这些曲线可以被存储在，例如计算机17中。

动态模式

这种模式特别适合于这种情况的芯片，即其中的探针对应于具有非常不同融合温度的“匹配”构象的靶核酸。

在这种模式中，芯片的温度变化(例如，连续升高或连续降低)被控制，以通过各种探针的各种靶核酸的融合温度。

这种变化通过从单元15输送合适的信息至与工作台相关联的模块111的帕尔帖元件而获得。

在温度的这种变化期间：

·阅读设备14实时收集与芯片上各个位点相关联的二倍体在激发设备13激发下的应答，并将所述应答传送给计算机18。

·对于芯片上的每个位点，二倍体的应答作为温度函数的发展情况被存储在计算机18的存储器中。

此外，至少一个温度传感器112存在于工作台中使其能够：

·记录连续温度值的变化(这发生在工作台的各个位点——因此在芯片上——其中排列了各传感器112)。这使其能鉴别二倍体应答中作为温度函数的变化，

·控制工作台表面上的温度。在这方面，传感器112允许在简单的满足传送设定温度至加热元件的“盲”控制之外，进行温度的实际调节。

要强调的是，由于帕尔帖元件非常敏感并且可以进行快速温度变化，所以PCR类型的应用也是可预见的。

此外，将离散的帕尔帖类型加热/冷却元件与至少一个温度传感器结合使其能够：

·精细的控制温度在工作台所有位点的分布(以及在芯片上)，

·确保在简单控制之外进行真实调节。

这样，对于芯片上的每个位点，计算机构建了探针的作为温度函数的应答中变化的曲线，如图4b所示，其示例了四位点芯片的非常简单的情况(曲线1，2，3和4)。

探针成对分布，其中之一与没有突变的靶核酸相对应，另一个则与具有突变的相同靶核酸相对应。

因此每一对的两个探针的应答将对应于两条与图4a的参考曲线相似的曲线。

此外，通过分析每一对探针的曲线，它将能够确定“匹配”探针和“错配”探针。

对于这个效果，计算机包括了一个程序，一旦所述应答中的变化被存储，该程序就能建立针对芯片上每个位点的与该位点相关联的诊断状态。

实现本发明的实施例

根据本发明的芯片读出器能够阅读DNA芯片。因而本发明的目的还包括提供一种DNA芯片，其包括许多对应于或包含野生型或突变基因片段的寡核苷酸(或探针)，特别是人的CFTR基因(囊性纤维化贯通膜传导调节子)。这样的芯片尤其适用于检测人CFTR基因的突变并诊断囊性纤维化。

囊性纤维化是高加索人种中最常见的常染色体隐性疾病之一，在北美出生的每2000个人中就有一人受其影响(Boat等人，遗传疾病的代谢基础，6^th Ed.Pp 2649-1680，McGraw Hill，New York，1989)。

囊性纤维化与250kb长的并包含27个外显子的CFTR基因的突变相关联。由于该基因已经在1989年被鉴别，所以已经开展了很多基因分析以限定该基因的突变范围。所述突变有很多变体，并且超过850种突变已被鉴别。然而，有一种突变被发现存在于50％的患者中；它是Delta F508突变。而大多数其它的突变在患者中发生率很低(1—5％)。

这一发现揭示了研发可能的诊断检测的复杂性。因此一种诊断检测允许检测大约30种不同的突变，其采用试管配体反应(OLA，PerkinElmer)。

还有其它的涉及DNA芯片技术的方法被研发用于鉴别人CFTR基因的突变。这些记载见于美国专利US6027880；5837832；5972618；和5981178。然而，到目前为止，还没有一种检测能够在一样本中快速、有效而可靠地检测CFTR基因中最常见的突变。这是本发明提出的所要解决的问题，其通过研发用于检测人CFTR基因中突变的DNA芯片，该芯片可用于根据本发明的读出器。

CFTR芯片的特性

本发明提供了寡核苷酸或DNA芯片(CFTR芯片)的阵列用于检测人CFTR基因的突变。该阵列包括固相支持物，有多个不同的寡核苷酸(探针)以所述寡核苷酸与互补寡核苷酸或多核苷酸有效杂交的方式(即，与存在于要检测的生物样本或取自其中的靶寡核苷酸或多核苷酸)结合在该支持物上，并且在这样的方式中所述寡核苷酸在各个位点具有不同的核苷酸序列结合至所述固相支持物，以便寡核苷酸具有与在所述固体支持物的特异位点的互补靶寡核苷酸或多核苷酸有效杂交的特异核酸序列。

所述阵列的特征在于它包括至少一对，至少两对，至少三对，至少四对，至少五对寡核苷酸，至少6对，至少7对，至少8对，至少9对，至少10对，至少15对寡核苷酸，每对寡核苷酸由对应于或包含野生型(wt)CFTR基因的寡核苷酸片段的寡核苷酸以及对应于或包含突变(mut)CFTR基因寡核苷酸片段的寡核苷酸以及与突变和野生型CFTR基因形成“错配”二倍体的阴性对照寡核苷酸(cont)所组成。

产生了两组大约为20nt(取决于碱基组成)和15nt长度的探针。

优选地，所述组(野生型/突变/对照)选自以下组中：

SET No.1：(这组没有对照探针)

TAGGAAACACCAAAGATGATATTT(SEQ ID N°1)24mer

CATAGGAAACACCAATGATATTTT(SEQ ID N° 2)24mer

SET NO.2：

AGGAAAACTGAGAACAGAATG(SEQ ID N°3)21mer

AGGAAAACTAAGAACAGAATG(SEQ ID N°4)21mer

AGGAAAACTTAGAACAGAATG(SEQ ID N°5)21mer

SET No.3：

ACCTTCTCCAAGAACTATATTG(SEQ ID N°6)/22mer

ACCTTCTCAAAGAACTATATTG(SEQ ID N°7)22mer

ACCTTCTCTAAGAACTATATTG(SEQ ID N°8)22mer

SET No.4：

TTCTTGCTCGTTGACCT(SEQ ID N°9)/17mer

TTCTTGCTCATTGACCT(SEQ ID N°10)17mer

TTCTTGCTCCTTGACCT(SEQ ID N°11)17mer

SET No.5：

TCGTTGACCTCCACTCA(SEQ ID N°12)/17mer

TCGTTGATCTCCACTCA(SEQ ID N°13)17mer

TCGTTGAACTCCACTCA(SEQ ID N°14)17mer

SET No.6：

ACCTTCTCCAAGAAC(SEQ ID N°15)/15mer

ACCTTCTCAAAGAAC(SEQ ID N°16)15mer

ACCTTCTCTAAGAAC(SEQ ID N°17)15mer

SET No.7：

CTTGCTCGTTGACCT(SEQ ID N°18)/15mer

CTTGCTCATTGACCT(SEQ ID N°19)15mer

CTTGCTCCTTGACCT(SEQ ID N°20)15mer

SET No.8：

TCGTTGACCTCCACT(SEQ ID N°21)/15mer

TCGTTGATCTCCACT(SEQ ID N°22)15mer

TCGTTGAACTCCACT(SEQ ID N°23)15mer

No.1的一对能检测最普通的CFTR基因突变，即位于外显子10中的delta F508突变。这个突变对应于检测3碱基对(AGA编码)，其结果导致CFTR蛋白缺失氨基酸508。

SET No.2能检测CFTR基因外显子10中的突变Q493X。这个突变对应于在位置493的G→A的替换，其结果导致出现无义突变。

SET No.3和6能检测CFTR基因外显子11中的突变G542X。这个突变对应于在位置542的C→A的替换，其结果导致出现无义突变。

SET No.4和7能检测CFTR基因外显子11中的突变R553X。这个突变对应于在位置553的G→A的替换，其结果导致出现无义突变。

SET No.5和8能检测CFTR基因外显子11中的突变G551D。这个突变对应于在位置551的C→T的替换，其结果导致在位置551以天冬氨酸替代甘氨酸。

优选地，本CFTR芯片至少包括上述五对寡核苷酸。根据本发明的CFTR芯片特征在于组成它的寡核苷酸在处于双链形式时具有相似的融合温度，并且优选介于大约55至85℃，大约65至75℃，优选大约70℃范围(在1MNaCl中)。这样，序列的寡核苷酸：

任选地，根据本发明的CFTR芯片还包含阴性对照寡核苷酸，即与所有要研究的靶形成错配杂交的探针。

要在带有错配和没有错配的杂交之间获得好的区别，固定在固体表面上的寡核苷酸序列的选择非常重要。这样，探针的设计非常重要，以便避免通过固定的探针形成第二分子内结构和形成分子间复合物的可能性，因为这些结构极大降低靶和探针杂交的效率，以及具有或没有错配杂交之间的区别。这样，通过选择寡核苷酸的核酸序列，尤其是其长度和碱基组成，和/或通过施加额外的核酸以便修饰Tm或形成分子内结构和分子间复合物的可能性，从而达到对寡核苷酸特性的要求。这些很难满足的要求证明本发明步骤的优势。

根据本发明的CFTR芯片，由寡核苷酸探针涂覆，其特征在于所述寡核苷酸探针被沉积形成位点，其平均直径介于20μm至500nm之间，优选介于50μm至200μm之间。

每个寡核苷酸探针的位点中心之间的距离是可变的，并且取决于芯片，但是它们被限定以便不影响在两个相邻位点上的杂交反应。然而，这个距离优选介于50μm至80μm之间，1000μm至2500μm之间，或100μm至500μm之间。在每个位点，优选沉积相同寡核苷酸的多份拷贝。这样，每个位点优选地包含至少1个，至少2个，或通常至少16个同样的寡核苷酸。

根据本发明的芯片上的位点数量是可变的，并且取决于在固体表面上点样的寡核苷酸对的数量。优选地，它是中间密度阵列，即具有限定数量的位点。这样，所述位点的数量为至少2个/cm²，至少4个/cm²，至少6个/cm²，至少8个/cm²，至少10个/cm²，至少50个/cm²，至少100个/cm²，至少500个/cm²，至少1000个/cm²，至少10000个/cm²，至少50000个/cm²，或至少100000个/cm²。

根据本发明的CFTR芯片的固体支持物选自由玻璃，塑料，Nylon^，Kevlar^，硅树脂，硅或多聚糖制成的固体支持物。优选地，固体支持物是玻璃载波片，更优选的是玻璃显微载波片。

优选的是，载波片采用醛基功能化。对于商业可得到的例子是2D玻璃载波片。根据本发明的芯片优选来自2D-微阵列或3D-微阵列类型。根据第一实施例，它是2D-芯片，其中根据本领域人员已知的方法，探针优选地通过氨基和醛基化学功能团结合。这样，未修饰的DNA和氨基修饰的DNA可以分别通过共价键在这些基质上杂交。

将介绍用于固定铵基修饰DNA的超醛基基质型载波片或用于固定未修饰DNA的超胺基基质类载波片(例如，注册商标为TeleChemArray IT的载波片)。

氨基修饰DNA在商业化的醛基功能化载波片上的固定原理见于图5。

图6和7示例了对该方案修饰的影响以便实现在高湿度下DNA与超醛基表面的耦合(湿度为在具有大约700cm3封闭塑料盘中，水半满)。

这种修饰提高了固定效率和信噪比。

根据第二实施例，芯片是水凝胶基的3D—芯片，例如3端连接的活性载波片(Motorola^TM)，其具有以下优点：(i)更高的探针固定效率，以及更好的杂交信号强度；(ii)在带有错配和没有错配的杂交之间更好的差别(Livshits and Mirzabekov，1996，DNA与凝胶固定的寡核苷酸杂交的动力学理论分析.Biophys.J.Nov.；71(5)2795-2801)。

优选地，上述的CFTR芯片的寡核苷酸以单链DNA形式通过寡核苷酸的末端之一被点样和结合至固体表面。优选地，它是3’-末端。

CFTR芯片的用途

过程

材料和方法：杂交条件

寡核苷酸和芯片的杂交

样本从包含以下的混合液中制备：

·采用Cy3荧光团标记的非突变(野生型或wt)寡核苷酸，以及

·采用Cy5荧光团标记的突变(或mut)寡核苷酸

其在芯片上被杂交：

AAATATCATCTTTGGTGTTTCCTA-Cy3(ΔF508-wt)

AAAATATCATTGGTGTTTCCTATG-Cy5(ΔF508-mut)

CATTCTGTTCTCAGTTTTCCT-Cy3(Q493X-wt)

CATTCTGTTCTTAGTTTTCCT-Cy5(Q493X-mut)

AATATACTTGGAGAAGGT-Cy3(G542X-wt)

ACCTTCTCAAAGTATATT-Cy5(G542X-mut)

AGGTCAACGAGCAAGAA-Cy3(R552X-wt)

AGGTCAATGAGCAAGAA-Cy5(R552X-mut)

TGAGTGGAGGTCAACGA-Cy3(G551D-wt)

TGAGTGGAGATCAACGA-Cy5(G551D-mut)

图8显示了对应于芯片上寡核苷酸ΔF508-wt，ΔF508-mut，Q493-wt和Q493-mut杂交的杂交图像。

观察到了所有突变的匹配/错配差别。

材料和方法：杂交条件

采用的是来自Metabion公司的3’末端标记的寡核苷酸。寡核苷酸的特质经过变性条件下20％聚丙烯酰胺凝胶被检验。

芯片上荧光团标记的寡核苷酸的杂交在2×SSC，0.2％SDS，0.2mg/ml BSA类型的溶液中，在室温下进行12小时。杂交室的体积为180μl，每种寡核苷酸的浓度为0.1μm。

芯片的杂交后在2×SSC，0.2％SDS溶液中，室温洗涤1分钟。

随后根据TeleChem方案通过在500×g离心1分钟来干燥芯片，并且随后被阅读。

一般，本发明的这种应用包括利用根据本发明的CFTR芯片，用于检测患者CFTR基因序列中可能存在的突变，优选采用根据本发明的读出器。

本方法的必要步骤如下：

· 靶多核苷酸或寡核苷酸的制备：

采用本领域技术人员常用的方法从生物样本中提取基因DNA，或信使RNA，或其片段。利用重组DNA技术，RNA任选的转换成cDNA(互补DNA)。这样，所分离的DNA随后被分成片段和/或通过PCR扩增，以便产生寡核苷酸片段。后者被标记，在采用根据常规方法的信号产生标记之前、期间或者之后。根据优选实施例，这样被分离的DNA采用针对要检测的CFTR基因范围的特异性引物通过PCR被扩增，利用标记的或修饰的核苷酸。这样标记的DNA，cDNA或RNA随后被变性以便获得单链分子。

·ssPCR产物的荧光标记

外显子10的ssPCR产物(长度大约400nt)采用Cy3或Cy5荧光标记被3’末端标记：

——将100pmol的ssPCR产物溶解在25μl溶液中(在水中1×TdT缓冲液，400pmol的Cy3—UTP(或Cy5-UTP))，

——加入10单位的TdT。

反应在37C下进行1小时。未结合的标记采用Qiagen^DyeEx^TMSpin Kit柱根据Qiagen方案消除。

· 靶DNA与芯片的寡核苷酸的杂交

这样标记和变性的DNA、cDNA或RNA随后被点样至芯片上，并且在限定的严格杂交条件下通过特异杂交与寡核苷酸探针适当结合。在清洗以去除过量标记的DNA、cDNA或RNA和/或那些非特异性杂交之后，所形成的二倍体采用根据本发明的读出器检测。

CFTR基因中突变的分析可以按照第一种方法实现，即比较CFTR生物芯片上野生型(wt)和/或突变靶寡核苷酸与采用荧光团标记的单一类型靶寡核苷酸的杂交信号的强度。第二种方法采用在CFTR芯片上至少两种不同的，采用不同信号产生标记所标记的靶核苷酸的杂交，其中的寡核苷酸之一来自要检测的样本，另一个与参考寡核苷酸相对应(一般，寡核苷酸对应于野生型序列)。

杂交

在室温为大约20℃的情况下，在后文将限定的且不含甲酰胺的缓冲液中进行在所述靶核苷酸上的探针杂交。如果所用的杂交媒介中包含甲酰胺，本领域技术人员将不得不调整杂交条件。

优选地，用于根据本发明的所述CFTR芯片的杂交媒介包括至少6×SSC(1×SSC对应于0.15M NaCl+0.015M柠檬酸钠)，0.2％的十二烷基硫酸钠以及，任选地，0.2mg/ml的牛血清白蛋白。本领域的技术人员可以通过在杂交缓冲液中具有相似功能的化合物任意修订这些条件。例如可以想得到，用动物胶替代牛血清白蛋白，或用SSPE缓冲液替代SSC缓冲液(5×SSPE由750M NaCl，50mM磷酸钠，5mMEDTA组成，pH7.4)。

表述“允许靶核酸与所述寡核苷酸探针特异杂交的条件”优选指的是极为严格的条件，尤其是后文所定义的。“严格”条件是指在这些条件下探针将杂交在其靶序列上，但是不杂交在其它序列上。严格条件取决于序列，并且根据环境而不同。因子的变化可影响杂交的严格性。在这些之中，应该由基础组分，互补链的大小，有机溶剂的存在和碱基错配的长度来构成提及的表述。针对影响杂交的一般因素的讨论可见于WO 93/02216或者Ausubel等人(分子生物学常规操作，GreenePublishing Associates，Inc.and John Wiley and Sons，Inc.)。一般，所选择的严格条件为，例如，针对在限定的离子强度和pH的特异序列，温度比融合温度(Tm)低5℃。Tm是指50％的互补于靶序列的探针杂交至靶序列的平衡点的温度(在限定的离子强度，pH值以及核酸浓度的条件下)。通常，严格条件包括至少大约0.01M至1M的钠或其它的盐浓度，pH值为7.0至8.3，以及针对小探针(10至50核苷酸)的至少为大约30℃的温度。严格条件还可以通过加入不稳定试剂，例如甲酰胺或四烷基铵盐而获得。例如，5×SSPE(750M NaCl，50mM磷酸钠，5mM EDTA，pH7.4)和25-30℃的温度的严格条件是突变遗传因子特异探针杂交常用的条件。

在极为严格条件下的杂交意味着选择温度和离子强度，以便维持两个互补DNA/DNA或RNA/DNA片段的杂交。通过示例，以上所述用于杂交步骤的为了限定杂交条件的极为严格的条件具有以下优点：DNA-DNA或DNA-RNA杂交分两步进行：(1)在包含5×SSC，50％甲酰胺，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，10×Denhardt’s，5％葡聚糖硫酸盐和1％鲑精DNA的磷酸缓冲液(20mM，pH7.5)中42℃预杂交3小时；(2)每序列在取决于探针大小的温度下(即，大于100核苷酸的探针，温度为42℃)杂交20小时，随后在2×SSC+2％SDS中20℃进行两次20分钟的洗涤，在0.1×SSC+0.1％SDS中20℃进行一次20分钟的洗涤。对于大小大于100核苷酸的探针，最后在0.1×SSC+0.1％SDS中60℃进行30分钟的洗涤。上述用于限定大小的多核苷酸的极为严格的杂交条件可以由本领域技术人员在用于更长或更短的寡核苷酸时进行调节，可参考Sambrook等人的描述(1989，分子克隆：实验室手册。2^nd Ed.Cold Spring Harbor)。

最后，杂交可以在更潮湿或更不潮湿的空气中进行。低湿度或高湿度的杂交条件使其能充分发挥杂交特异性。

严格性可以通过逐步提高严格条件而经验的确定，例如通过提高盐浓度，或者通过提高温度直至获得理想的特异性程度。本发明通过精确控制温度的提高而能够提高严格条件。

本发明还提供了用于诊断囊性纤维化的试剂盒，包含根据本发明的寡核苷酸阵列或CFTR芯片。用于检测样本中人CFTR基因中的突变或基因型的试剂盒或包的特征在于其包括根据本发明的CFTR芯片和，任选地，标记靶寡核苷酸或多核苷酸所需要的试剂。本发明的目的还包括利用根据本发明的寡核苷酸阵列或CFTR芯片诊断个体中的囊性纤维化。

本发明的目的还包括用于检测样本的CFTR基因中突变的方法，特征在于其包括如下步骤：

a)在允许这些靶核苷酸或把多核苷酸与所述寡核苷酸探针特异杂交的条件下，将取自怀疑存在突变的人CFTR基因中的包含靶核苷酸或多核苷酸的样本点样至采用根据本发明的寡核苷酸涂覆的芯片上；

b)在合适条件下洗涤来自步骤a)的芯片，以便去除没有被杂交捕获的样本核酸；并且

c)任选地采用根据本发明的读出器检测芯片上被杂交捕获的核酸。

本发明的目的之一还包括用于诊断个体中囊性纤维化的体外方法，其包括如下步骤：

(a)获得至少一个取自个体的CFTR基因的DNA片段；

(b)用信号产生标记来标记所述片段；任选地，使所述片段变性以便获得单链片段；

(c)使所述标记的片段与根据本发明的寡核苷酸阵列杂交；

(d)检测与所述阵列的一个或更多寡核苷酸特异杂交的DNA片段；

(e)任选地，确定在所述个体中CFTR基因突变的存在。

根据本发明的优选实施例，所述片段在步骤(b)中直接或间接地用根据本发明的信号产生标记进行标记；优选地，其为选自以下组的荧光标记：Cy3，Cy5，FITC，德克萨斯红(梅红)，Bodipy 630/650，Alexa 488，Alexa 350，等等。

根据第一实施例，由信号产生标记所标记的单一靶核苷酸在所述CFTR芯片上被杂交。

根据第二实施例，至少1个，至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个或至少10个由信号产生标记所标记的靶核酸在所述CFTR芯片上被杂交。

根据本发明的读出器事实上能够同时或在时间上分开的检测带有不同标记的杂交或二倍体。

Claims

1.一种用于阅读和分析芯片的装置，包括：

·用于接收要鉴别至少一个样本的芯片的工作台，

·在与其它分子反应之后激发芯片的分子或细胞的设备，

·阅读和分析受激发的分子的设备，

特征在于该装置还包括：

·用于控制所述工作台温度的控制单元，所述控制单元与由多个和工作台表面上各种位点相对排列的帕尔帖加热/冷却元件所组成的模块(111)相连，

·并且至少一个工作台温度传感器(112)也与所述控制单元相连。

2.如前述权利要求所述的装置，其特征在于激发设备包括广谱灯和至少一个激光器。

3.如前述权利要求之一所述的装置，其特征在于激光器是辐射集中在635nm等级波长的激光。

4.如前述权利要求之一所述的装置，其特征在于读出器包括几个激光器。

5.如前述权利要求所述的装置，其特征在于激光器集中在相同的波长。

6.如前述权利要求之一所述的装置，其特征在于激发设备包括至少一个与用于扫描其光束的模块相关联，以便激发待分析的分子。

7.如前述权利要求所述的装置，其特征在于读出器包括两个激光器以及用于在两个垂直方向中扫描两个激光器和控制两个独立的分子扫描的模块。

8.如权利要求1至5之一所述的装置，其特征在于激发设备包括至少一个激光器组件，激光器组件包括辐射受光纤引导的激光器。

9.如前述权利要求所述的装置，其特征在于激发设备包括两个相同的激光器组件。

10.如权利要求1至5之一所述的装置，其特征在于激发设备包括固定的激光器(132″)，其发射光束朝向两个顺序安装的连续的镜组件，镜组件的移动被控制沿着两个不同的方向进行。

11.如前述权利要求所述的装置，其特征在于两个镜组件的移动是受控的，因而产生的光束能跟随芯片上的任何预定序列。

12.如权利要求1至5所述的装置，其特征在于激发设备包括灯和激光器，灯和激光器的辐射采用相同的光学通道，摇摆镜(130)能够围绕两个位置之间的轴(1300)旋转因而使这两个辐射的其中之一直射入芯片。

13.如前述权利要求之一所述的装置，其特征在于一个光学***被***灯和待激发的分子之间，而激光器则发生对分子的直接照明。

14.如前述权利要求所述的装置，其特征在于所述光学***包括窄带激发光滤光器和窄带发射光滤光器，以及光束分离器。

15.如前述权利要求之一所述的装置，其特征在于读出器还包括激发控制单元，激发控制单元与每个激发设备相连从而控制其功能。

16.如前述权利要求所述的装置，其特征在于所述激发控制单元能够选择性地控制采用灯和至少一个激光器同时或连续照明分子，或者是灯和至少一个激光器对分子的独立激发。

17.一种用于阅读和分析芯片的装置，包括：

·用于接收要鉴别至少一种样本的芯片的工作台，

·阅读受到激发的分子或细胞的设备，

其特征在于该读出器还包括温度控制单元。

18.如前述权利要求所述的装置，其特征在于工作台包括与所述温度控制单元相连的温度传感器。

19.如前两个权利要求之一所述的装置，其特征在于读出器包括与工作台相关联的并且要控制工作台温度的加热/冷却模块，所述加热/冷却模块与温度控制单元相连接。

20.如前三个权利要求所述的装置，其特征在于读出器还包括包含微处理器并且与温度控制单元和阅读设备相连接的处理设备。

21.如前述权利要求所述的装置，其特征在于读出器包括存储作为温度的函数的分子对于激发设备的匹配和错配应答的参考曲线的设备。

22.如前述权利要求所述的装置，其特征在于存储设备与用于根据所述参考曲线确定分子的匹配和错配融合温度的设备相连接。

23.如前六个权利要求之一所述的装置，其特征在于温度控制单元能够按照“静态”模式控制读出器的功能，在“静态”模式中预先建立的作为温度函数的分子匹配和错配应答的参考曲线被用来建立能通过所述温度控制单元而被传送的设定温度，从而控制所述工作台的温度。

24.如前七个权利要求之一所述的装置，其特征在于温度控制单元能够按照“动态”模式控制读出器的功能，在“动态”模式中温度控制单元控制工作台上给定的温度变化，并且，在温度的这一变化期间：

·阅读设备实时收集与芯片上各种位点相关联的分子对激发设备的激发做出的应答，并将所述应答传送给处理设备(18)，

·针对芯片上每个点，存储设备存储作为温度函数的分子应答的变化。

25.如前述权利要求所述的装置，其特征在于读出器包括处理设备，其能在所述应答变化的存储末端建立针对每个分子的分子诊断状态。

26.如前述权利要求的装置，其特征在于所述诊断状态是匹配/错配诊断。

27.一种芯片的寡核苷酸杂交的方法，其可以采用根据上述各权利要求之一所要求的读出器来实现，该方法包括以下步骤：

·使对应于靶核酸的核酸探针与包含单链DNA片段的生物样本接触，从而通过形成二倍体实现特定探针与样本的所述单链DNA片段的选择杂交。

·阅读这样形成的二倍体，

该方法的特征在于该方法包括由自动确定以下温度构成的步骤：

·针对每个处于“匹配”构象的靶核酸的融合温度，以及

·针对每个处于“错配”构象的靶核酸的融合温度。

28.如前述权利要求所述的方法，其特征在于所述确定在“静态”模式中采用说明通过阅读分别对应于匹配和错配的二倍体所接受的信号中作为温度函数的变化的参考曲线来实现。

29.如前述权利要求所述的方法，其特征在于该方法包括控制温度，从而实现在对应于匹配和错配之间最大差别的温度进行杂交。

30.如前述权利要求的方法，其特征在于该方法包括在先于阅读步骤之前的步骤期间产生所述参考曲线。

31.如前述权利要求的方法，其特征在于该方法包括存储所述参考曲线。

32.如前述五个权利要求之一所述的方法，其特征在于所述确定在“动态”模式中通过控制样本温度中给定的变化而实现，并且，在温度的这个变化中，执行以下步骤：

·实时收集与通过激发设备激发的芯片上各种位点相关联的二倍体的应答，

·对于每个二倍体，存储应答中作为温度函数的变化。

33.如前述权利要求所述的方法，其特征在于该方法包括，对于每个二倍体，在应答中每个变化的存储末端建立二倍体匹配/错配的诊断。