CN101065498A

CN101065498A - 在微阵列上的靶的实时pcr

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Publication number: CN101065498A
Application number: CNA200580039325XA
Authority: CN
Inventors: 若泽·勒马克勒; 伊莎贝尔·亚历山大; 西尔万·马尔盖纳; 迪特尔·胡萨尔
Original assignee: Eppendorf Array Technologies SA
Current assignee: Eppendorf Array Technologies SA
Priority date: 2004-11-18
Filing date: 2005-11-18
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2025-11-18
Also published as: US20090156415A1; US20120231962A9; CN101065498B; US20090186401A1; US8247196B2; EP1659183A1

Abstract

本发明涉及一种用以监测微阵列上存在于溶液中的核苷酸分子的PCR扩增的方法和装置。该方法包括步骤：设置一个表面上固定有微阵列和反应室(14)的支架(15)，该微阵列包括至少一个固定于所述支架的特异性限定区域(21)上的俘获分子(20)，将含有所述核苷酸分子的溶液引入到所述反应室(14)和用于核苷酸分子扩增和标识的试剂中；对该溶液执行两次具有至少2个、优选3个不同温阶的热循环；用以通过PCR扩增获得标识的靶核苷酸分子(13)；通过下列方式在至少一次热循环中对标识的靶核苷酸分子进行至少一次测量：在允许所述靶核苷酸分子(13)和其相应俘获分子(20)之间进行特异结合的情况下培养所述标识的靶核苷酸分子(13)，对盒中含有标识的靶核苷酸分子(13)的溶液施以激发光(2)，测量被结合的标识的靶核苷酸分子应激发光(2)而发出的光发射(7)，其中限定区域的发射面在约0.1μm²到约75mm²之间，以及对在至少一次热循环中获得的数据进行处理以检测和/或定量溶液中的核苷酸分子在扩增前的数量。

Description

在微阵列上的靶的实时PCR

技术领域

本发明涉及一种用以监测微阵列上固定的俘获分子上的多重热循环核酸扩增的聚合酶链式反应(PCR)的方法、装置和诊断试剂盒。更具体讲，本发明提供了使用微阵列在实时PCR扩增中的核苷酸分子的检测和定量。本发明还包括实施该方法的手段和装置。

背景技术

已公开的核苷酸分子检测方法相比之前的用以检测扩增的核酸的方法具有快速、简易和多路化的优点。核酸检测技术通常在医疗诊断试验中非常有用。

聚合酶链式反应(PCR)的发明大大地提高了核酸检测方法的敏感性和特异性。PCR是一种扩增核酸的工艺，它涉及到两种寡核苷酸引物、聚合剂、靶核酸模板的使用，以及核酸的变性、引物的退火和延伸的连续循环，从而制造特定核酸片断的大量拷贝。用这种方法，单拷贝基因组DNA的片断能够保持高特异性和高保真度地扩增超过1千万倍。用以检测PCR产物的方法在美国专利No.4,683,195中有描述。那些方法要求寡核苷酸探针能够与扩增的靶核酸杂交。这些方法要求分离的扩增、俘获和检测的步骤，而且通常需要好几个小时才能完成。

由于PCR工艺巨大的扩增可能，来自高DNA含量样品、正控制模板、或来自先前的扩增的小水平DNA结转物甚至在不刻意添加模板DNA的情况下得到PCR产物。因为引入污染DNA的可能性会随着样品制备、处理和分析所需操作步骤的增加而增加，所以应尽量减少样品的检测和定量分析的操作，尤其是在扩增反应完成之后。

已经描述了同时放大和靶核酸检测的方法以使样品污染减到最小。美国专利No.4,683,195和No.6,171,785涉及将可检测的DNA结合剂(如溴化乙锭)引入到扩增反应中，该试剂产生就结合双链DNA上增强的可检测信号。PCR混合物的荧光增加表明发生了扩增。美国专利No.6,395,518和No.5,952,202公开了一种寡核苷酸探针，包括附着于该寡核苷酸第一端的荧光剂分子和附着于该寡核苷酸相对端的淬灭剂分子，使得只要该寡核苷酸探针处于双链态时，该荧光剂就基本上是未熄灭的。具有5′到3′核酸酶活性的DNA聚合酶在扩增期间溶解所述探针以将指示染料从该淬灭剂中分离出来。PCR混合物的荧光增加表明发生了扩增。美国专利No.5,716,784基于使用两个辅助探针提供了一种替代方法，第一分析探针在其5′端用能量传递给体荧光团标识，而第二检测探针在其3′端用能量传递受体荧光团标识。使用能量传递法测量溶解状态的杂交寡核苷酸分析探针到溶液状态下分光光度计测得的寡核苷酸检测探针，提供了对在靶核酸序列的扩增中消耗掉的寡核苷酸分析探针的量的测量，从而提供了对在PCR复制步骤中扩增出的靶核酸序列的量的测量。美国专利No.5,928,907描述了一种用以实时监测核酸扩增反应产物形成的装置，其中使用了光学对焦于样品体的纤维。

尽管那些方法能够实时监测均质PCR杂交***中核酸的定量，但它们限于每个荧光染料仅一种靶核酸。鉴于对于用以测量同一装置中多个靶核酸扩增的信号增量的不相交荧光染料的要求，实施多路化并不容易。

本发明的一个问题在于提供一种用以实时监测非均匀体系中的PCR的改进方法，其消除了先有技术方法的缺点。具体说，本方法应当易于实施且经济合算。

本发明为在微阵列上多个靶分子的同时放大提出了一种简易和有效的的方法和装置，从而克服上述局限性。

发明内容

为实现上述目标，用以监测微阵列上存在于溶液中的核苷酸分子的PCR扩增的方法包括如下步骤：

-设置一个表面上固定有微阵列和反应室(14)的支架(15)，该微阵列包括至少一个固定于所述支架的特异性限定区域(21)上的俘获分子(20)，

-将含有所述核苷酸分子的溶液引入到所述反应室(14)和用于核苷酸分子扩增和标识的试剂中，

-对该溶液执行两次具有至少2个、优选3个不同温阶的热循环，用以通过PCR扩增获得标识的靶核苷酸分子(13)，

-通过下列方式在至少一次热循环中对标识的靶核苷酸分子进行至少一次测量，

о在允许所述靶核苷酸分子(13)和其相应俘获分子(20)之间进行特异结合的情况下培养所述标识的靶核苷酸分子(13)，

о对盒中含有标识的靶核苷酸分子(13)的溶液施以激发光(2)，测量被结合的标识的靶核苷酸分子应激发光(2)而发出的光发射(7)，其中限定区域的发射面在约0.1μm²到约75mm²之间，以及

-对在至少一次热循环中获得的数据进行处理以检测和/或定量溶液中的核苷酸分子在扩增前的数量。

根据本发明的用以监测微阵列上存在于溶液中的核苷酸分子的PCR扩增的装置包括：

-表面上固定有微阵列的支架(15)，包括至少一个固定于所述支架的特异性限定区域(21)内的俘获分子(20)，其在盒中与所述核苷酸分子和用以核苷酸分子扩增和标识的试剂是流态连通的，

-用以进行自动PCR工艺的热循环器，所述热循环器能够交替地加热和冷却所述支架以制造标识的靶核苷酸分子，

-激发光源(1)，

-用以测量电磁光发射(7)的检测装置(10)，该光发射(7)是对盒中含有标识的靶核苷酸分子的溶液施以激发光而从被结合的标识的靶核苷酸分子上发出的，其中限定区域的发射面在约0.1μm²到约75mm²之间，

-其中不同部分被归并到同一装置中以在PCR扩增期间读取被结合的标识的靶核苷酸分子的光发射。

该装置进一步包括：

-存储***，用以存储在规定的热循环次数下支架的至少5个限定区域内的不同的测量数据，

-控制器(11)，用以重复为微阵列的每个限定区域在至少一次热循环中进行至少一次激发、检测和存储的步骤，

-程序，用以对在至少一次热循环中获得的数据进行处理以检测和/或定量样品中的核苷酸分子在扩增前的数量。

本发明还包括一个用以监测微阵列上以溶液存在的核苷酸分子的PCR扩增的诊断试剂盒：

-表面上固定有微阵列的支架(15)，包括至少一个固定于所述支架的特异性限定区域(21)内的俘获分子(20)，其中所述支架的表面在高于85℃的温度下保持平坦，且所述支架具有弱自荧光性。

-反应室，包括2个、优选3个彼此流态连通的部分，其具有用以承载微阵列的平面。

附图说明

图1整体装置的总示意图，该装置包含支架(15)、载体(12)、调温装置(16)和控温装置(17)、以及检测器(10)。

图2使用标识的引物联机检测在微阵列上的PCR产物的示意图。PCR是在有包含不同俘获分子的微阵列的存在下进行的。在一个反应循环内进行退火、延伸和变性的交替步骤，导致标识产物的积聚，这些产物在位于微阵列上的他们的俘获分子上杂交，但在每次变性循环后从他们的特异的俘获分子脱杂交。

图3使用标识的dNTPs联机检测在微阵列上的PCR产物的示意图。PCR是在有包含不同俘获分子的微阵列的存在下进行的。在一个反应循环内进行退火、延伸和变性的交替步骤，导致标识产物的积聚，这些产物在每次变性循环之后部分整合入它的特异俘获分子中并被检出。

图4如图2所示的使用标识的引物联机检测在微阵列上的PCR扩增的结果。在有包含不同结合的俘获分子的存在条件下，在GMO***序列上进行PCR，结合的俘获分子中一个对扩增产物(P35S)是特异的，另一个(PAT1)则不是。在不同热循环的退火步骤期间对P35S和PAT1俘获分子进行测量。

具体实施方式

定义

在本申请和发明的上下文中，下列定义适用：

如这里所使用的，“俘获分子”是指一个分子或其复合体或组合，其能够特异性地结合于靶分子、或结合于靶分子族、或结合于多个靶分子中的一个或多个成员或其部分。该俘获分子优选为核酸，或者是在支架表面上原位化学合成的或者是被放置在支架上的。核酸结合是通过两个多核苷酸之间碱基配对完成的，一个固定在俘获分子上，另一个作为待检测靶。俘获分子还包括核酸如PNA或LNA的衍生物，只要他们能够特异性地结合靶多核苷酸分子。

术语“单俘获探针种”是一个用以通过碱基配对杂交或通过多肽或蛋白质之间的分子识别来检测给定序列的相关多核苷酸的组合物。多核苷酸是化学或非***合成的、或是样品提纯而得到的，但是合成或提纯并不总是理想的，俘获分子会被其它相关分子如更短的多核苷酸所污染。本发明的俘获种的根本特征是整个种可被用于给定靶核苷酸分子的俘获。

术语“直接在支架表面上”是指光束的主要部分对准支架的表面上并激发表面上的荧光分子。

术语“核酸，微阵列，探针，靶核酸，基本上结合，特异性地杂交于，背景，定量”如国际专利申请WO97/27317中所描述，在此引用他们。

术语“核苷三磷酸”亦称做dNTP，是指存在于DNA或RNA的核苷酸，因此包括核苷酸，其以腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和尿嘧啶为碱基，糖部分则是脱氧核糖或者核糖。也可使用其它能够与传统的碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶中的一个碱基配对的修饰碱基。这样的修饰碱基包括例如8-氮鸟嘌呤和次黄嘌呤。

这里使用的术语“核苷酸”是指与所述核酸的碱基相比，存在于核酸(DNA或RNA)中的核苷，其包括含有上述一般的或修饰的碱基的核苷酸

涉及核苷酸、多核苷酸等包括类似种，其中糖-磷酸酯主链经改性和/或被替换，只要其杂交性能没被破坏。举例来说，主链可被等同的合成肽所替代，称做肽核酸(PNA)。

术语“多核苷酸”序列，其与这里描述的一个或多个基因或基因组序列所互补，是指能够在严格的条件下与所述基因或基因组或其拷贝的至少一部分核苷酸序列杂交的多核苷酸。多核苷酸还包括具有大于2个但低于100个碱基长度的能在特定条件下使用的寡核苷酸。这样的可杂交多核苷酸在核苷酸水平典型地显示对所述基因或基因组至少约75％的序列一致性，优选约80％或95％的序列一致性，或优选对所述基因或基因组大于95％的核苷酸序列一致性。根据试验的特异性和敏感性要求，它们由典型为15～30个碱基长的小序列、或由30～100个较长的甚至100～800个更长碱基长度的序列组成。

术语“同源”用以表示一个多核苷酸序列对另一个多核苷酸序列的一致程度。两个或多个多核苷酸之间可能完全同源(即100％一致)。同源度是在序列校直后计算的，可通过所属技术领域的专业人员所熟知的任何方法确定。

“微阵列”是指其上固定有多个俘获分子的支架，用以能够结合于给定的特异靶分子。该微阵列优选由存在于在支架表面或内部、或覆盖该支架的底物上的特异性限定区域中的俘获分子组成。特异性限定区域是指表面包含有对确定靶分子具有特异性的结合俘获分子的区域。该特异限定区域或者通过建造该微阵列的方法识别，或者在检测期间或者之后确认。斑点是指特异靶分子被固定在它们的俘获分子上的地方，可通过检测器看到。斑点是指特异靶分子被固定在它们的俘获分子上的地方，可通过检测器看到。在本发明的一个特殊应用中，俘获分子的微阵列还可设置在不同的支架上，只要这些不同支架包含特异俘获分子且可以彼此区分开来以能够对特异靶分子定量。这可以通过使用具有特殊特征且能够彼此区别以定量结合分子的微珠混合物来实现。然后一个微珠或一群微珠被认为是具有对靶分子特异的俘获分子的斑点。

术语“背景”或“背景信号强度”是指由标识靶核酸和多核苷酸微阵列的组件(如多核苷酸探针、控温探针、微阵列底物等)之间的非特异结合或其他非特异交互作用引起的杂化信号。背景信号也可能由微阵列组件自身的固有荧光所产生。可为整个微阵列计算单个背景信号，或可为每个靶核酸计算不同的背景信号。在优选的实施方式中，分别为每个斑点计算背景，作为在斑点周围表面上的信号水平强度，但不包括特异俘获分子。

本发明的核苷酸分子典型地通过检测一个或更多个附着于该核苷酸分子的“标识”来检测。该标识可以采用领域内技术人员熟知的任何方法引入，这里参考如WO99/32660所描述的方法。该标识优选直接在荧光中检测。

核苷酸分子是指存在于所感兴趣且待检测的生物材料中的多核苷酸。它们是从存在于优选为生物材料的样品中的所感兴趣的分子中提取或提纯而得到的。术语“生物材料”包括，在其内在意义中，有机体、器官、组织、细胞或通过细胞培养制造的生物材料。

有利地，靶核苷酸分子的测量是在有处于溶液中的标识扩增靶分子存在的固相中进行的。该方法避免了溶液从承载微阵列的支架的表面上被移除，以及避免了测量前冲洗。该冲洗包括含有扩增靶的溶液的液态操作和对实验室中进一步试验的可能的污染。

有利地，本发明的方法不要求使用不同的荧光染料来定量不同的核苷酸分子。一种荧光染料足以定量多个不同核苷酸分子，因为它们通过杂交在俘获分子上的特异性结合对每个靶核苷酸序列都具有特异性，而且定位于微阵列的不同的区域内。例如，一个核苷酸分子与使用相同或不同引物的另一个核苷酸分子一起扩增，而两种扩增子用同一荧光染料标识。不同的扩增子在分离的俘获分子上被检测和/或定量，而不像实时溶液PCR所要求的那样需要几种荧光染料。

该方法的另一个优点是它高特异性。第一特异性水平通过引物的退火获得，第二特异性水平通过俘获分子上的杂交获得。这种双特异性极大的增加了最终检测的特异性，这通常是在复合体生物标本的分析中所需要的。另一个优点是在PCR扩增期间行程的引物二聚物或非特异扩增产物不会在微阵列上产生信号，因为不存在引物或非特异性产物的互补性俘获分子。

对同一靶核苷酸分子使用不同的俘获分子仍能够增加特异性。两个或更多个俘获分子能够设计成结合同一链，或一个俘获探针结合扩增产物的有义链、而另一个俘获分子结合反义链。

有利地，待扩增的核苷酸分子是同源核苷酸序列，其在PCR期间使用与WO 0177372所描述的相同引物在微阵列上被定量。同一引物被用来扩增所有可能存在于样品中的同源序列。用同一荧光染料标识的扩增子在不同的俘获分子上被区别，每个都对应不同的同源序列。这对仅一个引物对和一个荧光染料也适用，通过使用微阵列上的多重俘获探针以实现试验的多路化。在一个实施方式中，被同一引物扩增的序列的数目大于2，甚至大于5，更甚至大于20。然后在阵列上检测扩增靶。

在另一个实施方式中，标准物核苷酸序列被引入到经检测的溶液中，标准物使用与靶核苷酸序列相同的引物扩增。

在又一个实施方式中，

在主体实施方式中，靶和/或俘获分子是多核苷酸。俘获分子优选通过共价键附接在支架上或支架上的底物上。在另一个实施方式中，俘获分子可以吸附在支架上，只要他们在PCR循环期间不会明显释放到溶液中。

俘获探针的沉积优选通过物理方式实现，如插脚或“插脚和环”接触表面，或通过采用如压力或纳米分配器的方法使溶液的微液滴的释放来实现。或者，俘获分子的原位合成是本发明实施方式的一种，其在如5,744,305和6,346,413所提供的场所中那样具有寡核苷酸或多核苷酸合成的高空间分辨率。

在另一个实施方式中，核苷酸分子是存在于生物试样的DNA中。该DNA是从样品中提取并通过PCR扩增，扩增子通过它们在其特异俘获分子上的固定而联机检测。在一特别实施方式中，该核苷酸分子是同源核苷酸序列，其在使用与WO 0177372相同的引物对基因组DNA扩增之后在微阵列上接受联机检测和/或定量。

根据本发明，微阵列的固体载体优选为选自于玻璃、金属支架、聚合物支架(优选耐热的弱自荧光性)或任何其他用于微晶片(或微阵列)技术的其它支架(优选载有醛或环氧树脂或丙烯酸酯基团的活化玻璃)，所述支架还包含特异性涂层、标识器或装置(条形码、电子器件等)用以改进试验。

在一个优选实施方式中，支架(15)包含其上固定有俘获分子的底物。

如果玻璃带来诸多优点(如惰性且弱自荧光性)，其他的支架如聚合物，其表面上具有不同的具有明确化学定义的基团，能够用于核苷酸序列的结合，也有其用处。在另一个优选实施方式中，承载该俘获分子的支架具有三维多孔结构。传统的载玻片在其表面具有少于60％的二氧化硅。这固有地限制了可在表面上化学键合的量。多孔材料显示出较高的俘获分子的荷载能力。典型的多孔支架是凝胶垫、熔融纤维基质、纤维状聚合物基质。阵列可整个由多孔材料构造，或可包含安装在如玻璃、塑料或金属平面上的多孔材料层。

在另一个实施方式中，俘获分子位于不同的支架上，这些支架优选为具有能为特异俘获分子识别的化学或物理性质的微珠。

在又一个实施方式中，支架承载有多个以物理或化学界面分离的微阵列。物理障碍的例子是阱，例如支架是96，384，1536多阱板，因此创建出分离的限定区域，其上俘获分子可被分别定点。384阱和1536阱板可从细胞基试验的BD Falcon获得(Merck Eurolab公司，Leuven，比利时)，或从Nunc A/S(Roskilde，丹麦)获得。6144格式微量滴定板可从ParallelSynthesis技术公司(PSTI，Menlo Park，加州，美国)获得。多阱可以板或条形式存在。其它物理障碍是管，如96、384、1536或甚至6144管沉积在支架表面上。管与阱形式相似，但不具有平底，因此当沉积在支架表面上时，它们创建出彼此隔离的限定区域。化学障碍的例子如DE 0019949735A1所描述，其中在疏水表面内的限定区域具备亲水锚，允许俘获分子在载体上的精确定位和限制。

在一个优选实施方式中，支架载有多个被物理界面(优选以多阱板或条的形式)分离的微阵列。在另一实施方式中，在测量光发射(7)期间对多阱板执行温度梯度。

在一个优选实施方式中，反应室包括2个、或更好为3个彼此流态连通的部分，其具有用以承载微阵列的平面。支架优选由塑料滑片制成，滑片被穿过观测通道的气流所覆盖，在那里微阵列得以建立。该观测通道终止于优选位于两端的一个或两个储液器。一个储液器优选用于引入溶液，而另一个则用来排出溶液。储液器被特殊的盖所密封，以防治溶液在热循环期间蒸发。在一特别实施方式中，溶液从微阵列处移开以提高标识靶核苷酸分子在其俘获分子上的结合反应速度。这是通过至少在热循环的退火步骤期间旋转、变换或上下移动反应室来实现的。在又一个实施方式中，液体在具有固定微阵列的表面上的高度低于1mm，优选低于0.1mm，更优选低于0.02mm。

在优选实施方式中，用作俘获分子的多核苷酸为10～1000核苷酸长，优选为100～400核苷酸长。为在同一样品中可能的同源序列特异性结合，多核苷酸俘获分子包含如专利WO0177372描述的隔离物。可能在同一样品中的同源序列或SNP的特异性结合可使用具有10～30个核苷酸的特异性部分的俘获分子实现。

在优选实施方式中，用作俘获分子的多核苷酸处于密度大于10fmoles、优选100fmoles每载体cm²表面的微阵列限定区域上。

根据本发明的微阵列包含4～100000斑点/cm²，优选20～1000斑点/cm²，每个斑点是一个俘获分子的限定区域。微型化允许在表面上执行试验(通常约0.1～约1mm直径的圆形斑点)。包含20到400个斑点的低密度阵列能以具有0.25mm的插脚且以低成本获得。1,600斑点/cm²的更高密度的斑点能够通过将斑点尺寸降低至例如0.15mm获得。获得高密度俘获分子的方法早在US 5,445,934中有描述。斑点尺寸的微型化可以获得高数量的数据，能够同时获得和分析这些数据，并使得执行重复成为可能，以及使得试验所需生物试样量尽可能少。在微阵列上检测的微型化优选与用以将核苷酸分子从细胞抽提物中分离和提取的微流态底物相关联。

在一个优选实施方式中，微阵列包含大于5个、优选大于20个甚至大于50个不同俘获分子(20)。

在一个优选实施方式中，限定区域为约10μm²～约1mm²，优选约1μm²～100μm²。

在一个优选实施方式中，微阵列上的俘获分子与溶液中的扩增靶核苷酸的至少一部分序列是互补的。俘获分子包含能够与扩增靶核苷酸序列特异性结合的核苷酸序列，所述特异的核苷酸序列还优选被具有至少约6.8mm长或对扩增靶分子不具结合亲合力的20个双链形式核苷酸的隔离臂从载体的表面上分离。在一个优选实施方式中，俘获分子是单链多核苷酸，其包含能够特异性结合于标识靶核苷酸分子的序列和具有至少20个、优选90个核苷酸的隔离物。该隔离物部分可以是单链或双链DNA。

在一个优选实施方式中，对靶结合具有特异性的探针序列包含15～100个核苷酸，优选15～35个核苷酸。

适用于本发明的可检测标识包括任何可用电磁光发射检测的组合物。在一个实施方式中，靶分子被荧光染料标识。荧光标识可通过酶或化学反应引入到靶中。典型的酶反应包括核苷酸类似物引入到靶中。或者，可将5′端被荧光染料标识的引物引入到靶中。荧光染料还通过化学反应而被引入到靶中，如载有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团的荧光染料与靶的胺基的反应。可用于本发明的荧光染料包括花青染料(Cy3、Cy5、Cy7)、荧光素、texas红、罗丹明、绿色荧光蛋白质。优选的，花青3的激发波长为540～558nm，峰值在550nm，发射波长为562～580nm，峰值在570nm。

优选的，花青5的激发波长为639～659nm，峰值在649nm，发射波长为665～685nm，峰值在670nm。优选的，花青7的激发波长为733～753nm，峰值在743nm，发射波长为757～777nm，峰值在767nm。

教导使用这些标识的专利包括美国专利Nos.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。在一个优选实施方式中，荧光染料是花青3，花青5或花青7。

有些荧光标识可能引起特别的兴趣，如具有荧光性能的纳米晶体粒子。最常见的是Quantum点(Han et al.，Nature Biotechnology 19，631-635，2001)。它们具有荧光性且不因时间或照明而褪去。它们的稳定性使得它们适合于连续使用，在本发明中建议使用。还有，它们含有金属，这些金属给予这些粒子以特异性能，使得除荧光外的方法可用于跟随它们在俘获探针上的附着。对这些粒子的热加热是随时间的参数之一。金属吸收光束、尤其是激光的能量以及诱导粒子的加热的事实已经成为在支架上检测密度低的金粒子甚至单粒子检测的基础(Boyer et al Science，297，1160-2002)。该方法被称作光热干涉相衬。

另一个直接测量纳米粒子的技术是瑞利散射。该方法是基于使用经调整的光束以获得金属粒子中电子的振荡，以从可检测粒子中获得电磁辐射。(Stimpson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(2003)，11350-11353)(使用光波引导实时检测DNA杂交和寡核苷酸阵列上的熔融；)该方法在生物试样上应用上缺乏灵敏度。

或者，拉曼散射和表面等离子共振也可用于本发明中，这些技术已广泛应用于抗体/抗原结合检测，但同时也适用于阵列的多参数测量并满足生物试样所要求的灵敏度。(Thiel et al.，Analytical Chemistry，69(1997)，4948-4956)

在另一个实施方式中，可使用石英微量天秤，其已足够灵敏，可以测量低于纳克的质量变化(参看Caruso et aL，Analytical Chemistry 69(1997)，2043-2049)。这是实时微阵列检测的一个建议。

悬臂是在微阵列上DNA检测的又一选择。(McKendry et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99(2002)，9783-9788)

此外，另一个技术是考虑了金属特性的纳米粒子的电检测。电化学检测被最先采用但是灵敏度低。更为先进和灵敏的方式是使用差动脉冲伏特计检测(Ozsoz et al.，AnalyticalChemistry 75(2003)，2181-2197)。

金属的电阻和电容也是在电子芯片上检测的最佳性能。金属在二个电极间的存在将诱导电阻和电容的变化。当俘获分子出现在一个电极上时观察DNA或蛋白质的检测(Moreno-Hagelsieb et al Sensors and Actuators B-Chemical，98，269-274，2004)。金标识的DNA的电容试验由Guiducci et al.ESSDERC 2002所描述。由于电子芯片可由几个小区构成，不同的靶可以在不同的绘图上检测，可以记录在电阻或电容上的变化。如果该方法不足以制造生物试样所要求的可靠和灵敏的检测，但能预测它们中的一些能够满足实时检测的要求。

另一个具前景的在微阵列的俘获分子上测量靶分子结合的技术是基于非线性变频光谱学(GFS)的光学工艺的化学绘图法(L.Dreesen et al.Chem Phys Chem，5，1719-172，2004)。这些技术允许表面和界面的振动特性以亚微粒空间分辨率实时成像。该测量是通过在底物表面上混合两个激光束而获得，其中一个具有可见光区的固定频率(绿色)，另一个在红外区具有可变频率。界面上的振动特征波形是作为红外激光束的频率的函数，通过测量由样品发出的光而得到的。这些方法允许避免对待检测靶的标识。

初始核苷酸分子在扩增之前没必要标识，但会在扩增步骤期间导致被标识的靶分子。

扩增的核苷酸分子在变性步骤之后能够在俘获分子上杂交。由于扩增的核苷酸分子是双链的，理论上它们必须在溶解状态中再聚集，而且比在固体支架上固定的俘获分子上杂交更快，那里扩散小且特异性结合序列短，从而更加降低反应速率。因此，在一个培养时间的短周期之后观察到俘获分子经多重热循环的信号显著升高并不奇怪(图4)。

在一特别的实施方式中，在热循环的退火和/或延伸期间当结合的靶标记分子再聚集成双链形式时进行测量。

在一个优选实施方式中，核苷酸分子扩增用的试剂包括引物对，dNTPs，热稳定DNA聚合酶和缓冲剂。

在一特别的实施方式中，试验的退火和/或延伸和/或变性步骤是以连续或半连续的方式进行的。

在一个优选实施方式中，核苷酸分子扩增用试剂包括引物和/或用荧光染料标识的dNTP，优选花青3、花青5或花青7。

在一特殊的实施方式中，在同一溶液中使用两个或更多个荧光染料。在一备选实施方式中，调整溶液组成以进行核苷酸分子上的引物的退火和在同一温阶上对俘获分子上的标识靶分子的特异性结合。

在一个优选实施方式中，微阵列上的PCR所使用的热稳定DNA聚合酶是在62℃下工作的热Master(Eppendorf，德国汉堡)。在一个优选实施方式中，阵列上的退火、延伸和杂交步骤是在同一温度(60～80℃)下进行的。有利地，本发明的方法与大多数市售的热稳定DNA聚合酶相兼容。它不像美国专利No.5,952,202那样要求5′～3′核酸酶具有活性。

在一个实施方式中，溶液包含5′端标识的寡核苷酸或引物，其作为聚合酶在微阵列上复制待检测靶序列的锚。图2显示了使用标识的引物检测在微阵列上的PCR产物。出乎意料的是，在热循环的退火的温阶期间，引物与核苷酸分子在溶解状态中杂交，同时在上述热循环中获得的扩增靶分子在同一时间、同一条件下与固定于支架的特异性限定区域内的俘获分子杂交。在热循环的延伸的温阶期间，与核苷酸分子杂交的引物在溶解状态中延伸。与标识靶核苷酸分子结合的俘获分子(20)可能延伸但不被标识。在一个反应循环内进行退火、延伸和变性的交替步骤，导致标识产物的积聚，这些产物在位于微阵列上的他们的俘获分子上杂交，但在每次变性循环后从他们的特异的俘获分子脱杂交。在一个优选实施方式中，优选在退火和/或延伸的温阶期间，标识的靶核苷酸分子特异性地结合在相应的俘获分子(20)上。

在另一实施方式中，溶液含有标识的dNTP，该dNTP通过聚合酶引入到微阵列上待检测的目标脉冲顺序中。

图3显示了使用标识的dNTPs检测在微阵列上的PCR产物。在热循环的退火的温阶期间，引物与核苷酸分子在溶解状态中杂交，同时在上述热循环中获得的扩增靶分子在同一时间、同一条件下与固定于支架的特异性限定区域内的俘获分子杂交。

在热循环的延伸的温阶期间，与核苷酸分子杂交的引物在溶解状态中被延伸，结合于靶核苷酸分子的固定俘获分子(20)被延伸并被标识。在反应循环期间进行退火、延伸和变性的交替步骤，导致标识产物的积聚，这些产物部分整合入它的特异俘获分子中，并能够在每个变性步骤的期间或者末尾被检测出。

在一个实施方式中，一些俘获分子被聚合酶延伸，同时一些则与在热循环期间在溶解状态中积累的扩增产物杂交。在一个实施方式中，延伸的俘获分子在变性的温阶期间被检测。在另一个实施方式中，延伸的俘获分子和与其俘获分子结合的标识核苷酸分子都在退火和/或延伸的温阶期间被检测。

在一个优选实施方式中，杂交优选使用不能被延伸的俘获探针在延伸期间进行。在这种情况下，俘获分子优选包括碱基终止剂或同一碱基在其3′端的长拉伸如polyA。或者，俘获分子通过它们不能被聚合酶延伸的3′端、自由5′端被固定在支架上。

在另一个实施方式中，优选杂交期间的延伸，是通过在一个引物过量、另一引物量有所减少的情况下进行PCR。

在另一个实施方式中，在热循环的末尾，进行至少10分钟、优选至少30分钟、最好60分钟的退火步骤，以提高扩增前甚低浓度的核苷酸分子的杂交信号。

在一个优选实施方式中，热循环进行10分钟以内、优选6分钟以内、甚至3分钟以内。在一可选实施方式中，在5小时内、优选3小时内、甚至1.5小时内进行30次热循环。

有利地，经扩增的靶核苷酸分子的长度选择为100～800个碱基的有限长度，优选为100～400个碱基，更优选为100～200个碱基。这一优选要求取决于发现引物的可能性，该引物用以扩增样品中可能存在的所要求的序列。太长的靶会更快再分配并采用能够抑制在俘获核苷酸序列上固定的二次结构。

热循环器优选由如下相关组件以最简单形式组成：热电偶、传送器、转换器和加热器。

热电偶尽可能靠近微阵列待加热的限定区域并测量温度给传送器。温度信息经转换器传给计算机。每0.1秒钟，软件比较测得的真实温度与终端用户要求的设定温度。如果实测温度高于所要求的温度，就只是停止加热器(而不启动冷却)。如果实测温度低于设定点，***继续加热进程。热循环器优选调整至与支架形式相符合，而支架形式优选为约一个2.5×7.5cm的载玻片或一个96阱的微滴定板。可选的加热和冷却优选使用Peltier或脉冲空气来实现。

在一个优选实施方式中，热循环器能够以5℃/min、优选10℃/min、更优选30℃/min、甚至优选40℃/min的斜率交替地加热和冷却支架。

该方法尤其适于控制光激发，因为光是直接射在支架的表面上，在每个限定区域上的激发的均匀性能被确定和更正(如有必要)。

在一个优选实施方式中，光束是激光束，其聚焦在微阵列的表面上以直接激发荧光分子。激光束优选垂直聚焦于阵列的表面或经由溶液或支架。发射光在激发激光束的反向方向被检测。发射光优选作为共焦光被检测，并在扩增用光电倍增管测量。在优选实施方式中，微阵列的表面通过激光束扫描以获得被结合靶的最大光激发。

在一个优选实施方式中，来自光源(1)的激发光(2)对准到支架的表面上。

在一个优选实施方式中，与微阵列上的俘获分子相关联的信号被定量。优选的方法是用优选为激光共焦扫描器的扫描器扫描阵列以检测荧光标识的靶。图像的分辨率为1～500μm、优选为5～50μm。

在一个优选实施方式中，对经标识的靶核苷酸分子的测量在至少5次热循环，优选至少10次、甚至20次热循环中执行。

在一个优选实施方式中，光发射(7)是从温阶开始起的规定时刻测量的，例如退火后1分钟。

在另一优选实施方式中，光发射(7)是在退火温阶开始后5分钟内、甚至2分钟内、更甚至1分钟内测量的。在一可选的实施方式中，光发射(7)是在PCR扩增中的3个温阶中的至少一个的末尾测量的。

在又一实施方式中，光发射(7)是PCR扩增的末尾测量的。

优选扫描微阵列，随后测量每个限定区域。阵列的扫描优选在1分钟内、较好在30秒钟内、甚至在10秒钟内进行。优选对每个限定区域的扫描是在温阶的同一精确时刻测量的，此时在多重热循环过程中重复读取。每个限定区域随后被测量的事实能够有利地用于监测被标识的靶核苷酸分子对固定在支架不同限定区域的同一俘获探针的杂交动力学，其中俘获探针是以依赖于时间的方式扫描的。由于温度在测量过程中保持恒定，靶核苷酸分子在扫描期间继续杂交在它们的俘获探针上。

在一特别的实施方式中，在不同PCR循环进行的扩增靶分子的定量数据经过处理以定量扩增之前核苷酸分子在原始溶液中的数量。当扩增效率是最大时，扩增循环导致每个循环中靶序列翻倍。初始核苷酸浓度的定量是使用外推法由第一循环给出的可检测值或经过固定阈值的值计算而来的。然后由参考曲线或由在标准物分子上获得的数据来计算浓度。

在一个优选实施方式中，数据经处理以获得每个限定区域的信号值。在另一实施方式中，数据经处理以获得每个限定区域和局部背景的信号值。对数据进行进一步处理，对每个限定区域将背景从信号值中减去。在一个优选实施方式中，核苷酸分子的定量通过将限定区域的信号值与一定值进行比较来进行。

在一备选实施方式中，核苷酸分子的定量通过将达到一定值所需的热循环数目(循环阈值或CT)与基准核苷酸分子的CT值加以比较来进行。该基准核苷酸分子优选是在同一溶液中被扩增并作为靶核苷酸分子在同一微阵列上被检测。

在另一实施方式中，核苷酸分子的定量通过将达到一定值(CT)所需的热循环数目与CT值对标准浓度作图得到的标准曲线加以比较来进行。

在一个实施方式中，微阵列与试剂接触以进行一个或多个核苷酸序列的扩增。在一个优选实施方式中，在同一试验中对1～4个核苷酸分子、优选1～20个核苷酸分子在溶液中进行扩增、检测和/或定量。在另一实施方式中，在同另一个试验中对20～1000个核苷酸分子在溶液中进行扩增、检测和/或定量。

用以根据本发明事实该方法的装置包含两个不同的部分。

第一部分包含培养***，其为靶在它们的俘获分子上的结合反应提供必要的条件。第一部分优选包含温度控制***，用以调节并控制结合反应期间的温度。

在一个优选实施方式中，温度调节装置选自于受控Peltier、夹在透明聚酯片之间微细发热丝元件(如Minco公司的Thermal-Clear^TM透明加热器)、或流体***(外循环温度调节流体)。

在一个优选实施方式中，温度调节装置安装在支持支架的载体上。温度调节装置优选位于载体和支架之间。

在另一实施方式中，温度调节装置安装在支架上但不接触载体。

在一个优选实施方式中，培养***提供条件以使与微阵列相接触的溶液的厚度在所有阵列斑点或限定区域上都是一致的。阵列表面上两个斑点或限定区域间的厚度差异优选低于100微米，甚至低于10微米，更甚至低于1微米。

在另一实施方式中，培养***为与微阵列接触的溶液的厚度在两侧测量之间的变化提供条件。

装置的第一部分还优选包含混合或搅拌***，用于即将移入到反应室的液体并提高反应速率。在一个优选实施方式中，通过物理方式如泵、开口阀和节制阀、静电波或压电振荡来移动液体以进行混合。

第二部分包含检测***，用以检测从靶结合到它们的相应俘获分子的光发射。光源产生一束光以激发支架上被标识的靶。在该优选实施方式中，检测部分必须设置成用以在整个被待分析微阵列覆盖的表面上获取相同的检测效率。

在一个优选实施方式中，激发光是激光束，其优选以约15mW的功率传送，散度低于1.2mrad，波长约532nm。在另一个实施方式中，检测***包含2乃至4个激光。

在一个优选实施方式中，由光源(1)产生的激光束(2)几乎成平行且几乎高斯型。可交换的激发过滤器(4)用于只收集所关心的波长。优选放置附加滤色镜轮(3)作为减光器以精确调节激光功率。该滤光轮以可变的已知吸收水平被不同地遮蔽。具有防反射涂膜的透镜(5)用于是激光束聚焦于支架(15)上。光源、透镜和支架间的距离是可变的以方便聚焦。

其后，光通过分色镜或光束分离器(6)。该镜能通过波长低于约530nm的光但波长大于560nm的光被反射。因此，来自激光的532nm波长的光穿过分色镜到支架。光然后穿过反应室(14)和经荧光标志的样品(13)并到达支架(15)，在那里被结合的标识靶被激发并发出约560nm的荧光。

发射光(7)然后通过聚焦透镜(9)聚焦到光电倍增管(10)以检测那里的光子数目。

在一特殊实施方式中，增加一个传送波长大于约550nm的光的附加发射过滤器(8)。因此，光电倍增管(10)基本上仅检测荧光。光电倍增管产生为每个被检光子产生一个脉冲。每个脉冲通过光电效应经过放大并转换成电子信号。数据获取板或控制器(11)然后收集结果信号。该控制器包括控制温度装置，用以控制PCR扩增所需要的温阶。

在从底物的区域手机数据之后，载体(12)移动支架以使激发光对准支架(15)上的不同区域。重复该过程直到所有在底物上的区域都被扫描。在另一个实施方式中，支架被固定，激发光束从支架表面上的一个部分移向另一个部分。在又一个实施方式中，整个微阵列被照亮，检测来自每个限定区域的光发射。

在一个实施方式中，支架本身就是载体。在一个优选实施方式中，存储和处理数据用以计算不同靶分子在溶解中和在原始生物试样中的量或浓度。存储数据和数据处理优选使用可编程计算机执行，它被整合入本发明的装置中。数据处理可以在存储数据以后任何时候进行。

在一个实施方式中，支架在读取期间相对于检测***移动。支架相对于激发光移动以读取支架的不同区域。激发光可以固定或在一个方向上移动以扫描支架。

在一备选实施方式中，支架同时相对于培养***和检测***移动。在培养期间，支架与温度控制***(培养位置)接触。当需要启动读取时，支架从培养***移动到检测***(读取位置)。在读取期间，支架或者相对于激发光移动或者被固定。读取之后，支架回到到它的初始位置。使支架在读取期间相对于培养部分移动的一个优点是可以避免加热器对检测***部分产生有害效应。

在另一个实施方式中，该装置的两个部分被固定且一同运作而没有固体支架相对于培养部分和检测部分的移动。一个上下文使用的典型的检测器是CCD相机，其能够拾取整个微阵列的图像。

在一个特殊的实施方式中，装置通过可编程计算机控制，它控制该***两个部分的参数。扫描器如Axon的Genepix 4200A型扫描器，其配备有Axon的可编写Genepix 5.1软件。

在步骤1，用户被要求填写所需参数，如：分辨率，PMT电压，激光功率，扫描数，扫描间隔，扫描面积。底物的温度独立设置在加热装置上，加热装置可以是安装在底物上的Peltier装置。

***参数：

分辨率决定像素大小。通常，像素大小的选择要使每个限定区域内具有1个像素、优选10～100个像素。分辨率设定过高导致数据过载，而像素大小设置过低则导致低质量结果。PMT电压乘以已检信号。增加激光功率将增加每个像素内的光子计数。

参数“扫描数”对应于用户希望扫描底物的次数，而参数“扫描间隔”控制开始下一轮扫描所需等待的时间。用这样的方式，用户可以执行一系列的扫描以跟踪反应动力学。

扫描面积参数对应于待测底物的尺寸。温度参数控制进行检测时的温度。温度可根据被测聚合物的类型而变化。优选测试是在能够产生最大结合亲合力而使错配达到最小的温度下进行。

然后初始化***：载体移到原始位置，同时检查激光功率。在步骤2，执行第一次扫描，收集从包含底物微阵列的被选区域上发出的荧光。当扫描完成时启动JavaScript复查(步骤3)。如果未达到需要做的扫描数，那么程序等待用户提出延迟。然后图像在步骤4被保存，如果需要则进行一次新扫描(步骤5)。JavaScript复查允许该回路继续。在步骤6，从数据中提取数值；在步骤7，执行计算和分析。为此目的，在微阵列上放置一个包含该数目个行和列的待测微阵列的栅板。该栅板由圆圈组成，其直径与待定量斑点的直径的像素对应。该直径取决于为扫描选择的分辨率。在圆圈内的像素强度的平均值给出了斑点信号。然后每次都计算该信号并对培养时间作图。步骤6优选通过将扫描的16位图像输入到软件中进行，该软件为“Imagene4.0”(BioDiscovery，美国加州洛杉矶)，其用于定量信号强度。

算法

    ＜html＞

　　＜head＞

　　＜style type="text/css"＞

　　@import url(GenePix_Style_Base.css);

　　＜/style＞

　　＜title＞Example Automation＜/title＞

　　＜/head＞

　　＜body marginheight="0"marginwidth="0"topmargin="0"leftmargin="0"＞

　　＜!-HTML Layout portion--＞

　　＜p＞

　　＜table width=600 border=0 cellspacing=0 cellpadding=5＞

　　＜tr class="title"＞

　　＜td＞

　　＜p class="heavy"＞实时扫描：允许在没有任何用户干预的情况下对同一样品以一定的间隔进行多重扫
描

　　＜/td＞

　　＜/tr＞                   //步骤1：用户参数

　　＜tr＞

　　＜td class-′underline instructions′＞

　　＜p＞PMT:＜input type=text size=2 name=setpmt value="700"＞

　　＜p＞Resolution:＜input type=text size=2 name=setres value="40"＞μm

　　＜p＞Scan interval:＜input type=text size=2 name=interval value="120"＞(s)

　　＜p＞Scan numbers:＜input type=text size=2 name=snumber value="10"＞

　　＜p>

　　＜input type=checkbox size=5 name=saved value="10"＞Save images?

　　＜p＞Images directory:C:\Documents and Settings\user\desktop\＜input type=text size=20 name=ipath
value=""＞

　　＜/td＞

　　＜/tr＞

　　＜tr＞

　　＜td class="underline instructions′^

　　＜input type="button"value="Prescan"onclick="GenePix.PreviewScan()"＞

　　＜input type="button"value="Start scanning"onclick="startscan()"＞

　　＜/td＞

　　＜/tr＞

　　＜/tr＞

　　＜/table＞

　　＜!--Scripting portion--＞

　　＜script language=vbscript>

　　//

　　+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

　　++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

　　Option Explicit

　　Dim GenePix　

　　Dim Scanner

　　dim i    //PMT值

　　dim j    //分辨率(μm)

　　dim k    //扫描间隔(s)

　　dim n    //扫描数

　　dim e    //计数器

　　dim s    //图像通道

　　dim tl    //计时器

　　//这些步骤通过按开始扫描按钮启动

　　+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

　　++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

　　sub startscan()                //步骤2

　　c=0

　　Set GenePix=window.external    //表明扫描器对象

　　Set Scanner=GenePix.Scanner

　　GenePix.DiscardImages()        //清除显示

　　call InitializeCallbacks()     //定义Javascript复查

　　i=cint(setpmt.value)                  //设定PMT值

　　j=cint(setres.value)                  //设定分辨率值

　　k=cint(interval.value)                //设定扫描间隔

　　n=cint(snumber.value)                 //设定扫描数

　　s=cstr(ipath.value)                   //设定图像通道

　　Scanner.PixelSize=j

　　Scanner.PMT(0)=i

　　tl=timer()//sets the time 0

　　GenePix.DataScan                      //开始第一次扫描

　　end sub

　　//保存图像并启动新扫描

　　+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

　　++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

　　Function ScanDone()             //步骤4

　　if saved.checked=true then  //保存图像

　　GenePix.Savelmages"C:\"& s &"\RT-"& cstr(formatnumber(timer()-tl-k,0))&"s.GIF,"",&h008000

　　end if

　　GenePix.Discardlmages()         //重初始化显示

　　c=c+1                               //计数扫描数

　　ifc＜n then                          //步骤5：如有必要

　　GenePix.DataScan                //启动新扫描

　　end if

　　End Function

　　＜/script＞

　　＜script language="JavaScript"＞

　　该功能在扫描完成后调入

　　+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

　　++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

　　function waitjs()                       //步骤3

　　{

　　Ifc＜n then                             //如果需要更多扫描

　　setTimeout("ScanDone()",k*1000)；//间隔期间暂停程序

　　else                               //并调入ScanDone功能

　　End if

　　}

　　//Javascript复查：确定每次事件后应运行何种功能

　　+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

　　++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

　　function InitializeCallbacks()

　　{

　　GenePix.OnScanDone=function(){waitjs();}

　　}

　　＜/script＞

　　＜/body＞

　　＜/html＞

图1表示本发明的一个实施方式，其中两个过程的部分存在于同一室中。这两个过程在整体***中执行，只要各职能部分(具有技术条件多必要的)彼此兼容。光源(1)对准到支架(15)的表面上，该表面与接触于热稳定载体(12)的表面相对。控制器(11)包括控制温度装置。

在优选实施方式中，激发光(2)以45°～135°、优选60°～120°、更优选80°～100°的角度到达微阵列表面。光激发标识靶的直接激发，不使用如由损耗波提供的光的内反射。

在一个优选实施方式中，装置包含其上固定有俘获分子的底物。在一个优选实施方式中，装置的支架是热稳定的，其表面在高于85℃甚至高于94℃的温度下保持平坦。该支架还表现出弱自荧光性，为的是配合荧光测量。优选的是，装置所包含的微阵列包含大于5个不同俘获分子(20)，优选大于20个甚至大于50个。

在一个优选实施方式中，热循环的加热和冷却以5℃/min、优选30℃/min的斜率进行。在一个优选实施方式中，包含俘获分子的限定区域为约10μm²～约1mm²，优选约1μm²～100μm²。

本装置进一步包含光学***，用以将从激发光源(1)发出的激发光(2)对准并直接聚焦到所述支架上，其中激发光以45～135°的角度到达微阵列表面。

在一特殊的实施方式中，提供了一个诊断试剂盒，用以监测在微阵列上存在于溶液中的核苷酸分子的PCR扩增。该试剂盒包括一个盒，该盒包含：表面上固定有微阵列的支架(15)，包括至少一个固定于所述支架的特异性限定区域(21)内的俘获分子(20)，其中所述支架的表面在高于85℃的温度下保持平坦，且所述支架具有弱荧光性。以及反应室，包括2个、优选3个彼此流态连通的部分，其具有用以承载微阵列的平面。

根据本发明的诊断试剂盒还优选包含dNTPs，热稳定的DNA聚合酶，缓冲剂和可选的作为内标的引物和/或核苷酸分子。

下面给出本发明适用于从初始核苷酸分子确定扩增靶测量的一个例子。

实施例1 监测微阵列上的PCR扩增

俘获核苷酸序列固定

根据专利申请WO02/18288描述的方法，对Diaglass滑片(Eppendorf，德国汉堡)进行官能团化以有醛的存在。按照该专利申请中描述的方案将胺化DNA接枝到醛激活玻璃上。该胺化俘获核苷酸序列从浓度为3μM的溶液中点样。使用自制机械臂、以250μm直径的插脚将该俘获核苷酸序列印到显微载玻片上。该点样直径为400μm，配给的体积为0.5nL。滑片在室温下干燥，使用前在4℃下保存。

本实验使用的俘获探针具有下面的序列：

TP35S(SEQ ID NO：23)：

5′Amine-GTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATAT-3′

TGUT(PCR control)(SEQ ID NO：24)：

5′Amine-GGGACTGGCTGCTATTGGGCGAA-3′

TPAT1(SEQ ID NO：25)：

5′Amine-CTGTGTATCCCAAAGCCTCATGCAA-3′

每个俘获探针在其5′端包含95个碱基长的隔离物，其具有以下序列：

ATAAAAAAGTGGGTCTTAGAAATAAATTTCGAAGTGCAATAATTATTATTCACAA

CATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTA.

PCR和杂交

为DNA样品的35个促进剂因子的扩增设计PCR，该DNA样品是参照面粉ERM-BF412f的基因改性有机体(GMO)。

本实验使用的引物具有下面的序列：

OP35SF(SEQ ID NO：26)：

5′-Cy3-CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG-3′

OP35SR(SEQ ID NO：27)：

5′-TCTTGCGAAGGATAGTGGGATT-3′

经扩增的产物具有其链序列特异俘获分子P35S中之一的部分(SEQ ID NO：23)。

PCR反应的混合制备如下：对于终体积为100μL，混合10μL的PCR Eppendorf缓冲剂，10μL的dNTP混合(每个dNTP的终浓度为200μM)，1μL的20μM标识在5′端的引物OP35SF-Cy3和1μL的20μM引物OP35SR，2μL的Eppendorf Taq DNA聚合酶，10μL的NaCl600mM，55μL的水和10μL基于面粉ERM-BF412f提取的20ng/μL的DNA样品。

将25μL这种PCR混合溶液加载到由杂交室构造的微阵列上，尺寸为9×9mm，并具有平滑塑料盖玻片(Grace Biolabs)。

在滑片后部，固定了一个专门的温控热电偶。完整的加热过程试验台由一下相关组件构成：

^*热电偶：RS-COMPONENT ndeg.219-4321，自粘热电偶K型-镍铬/镍铝，

^*传送器：RS-COMPONENT ndeg.363-0222，传送器测温热电偶4-20mA，

^*转换器：NATIONAL INSTRUMENTS 779026-01 USB-6009 48K样品/秒DAQ多功能，USB14位

^*加热器：MINCO Heating热箔柔性加热器：Kapton 0，75″×0，75″HK 5578 R 18，3 L12F。

热电偶尽可能靠近待加热的斑点并测量温度给传送器。温度信息经转换器传给计算机。每0.1秒钟，软件比较测得的真实温度与终端用户要求的设定值，控制器调整加热以提供所要求的稳定。

然后滑片倒置进入Axon扫描器(4100个人型)，并在整个实验保持在那里。扫描以500的增益、10微米的分辨率在通道Cy3进行。

然后将加温罩加热到95℃(变性)保持1分钟，然后到56℃(退火)2分钟，再然后到72℃(延伸)保持1分钟。同一循环重复39次。荧光发射是在循环6、10、14、18、22、24、26、28、30、32、33、34、35、37、38和40的退火步骤(56℃下)开始1分钟后对微阵列表面进行扫描而确定的。扫描器使用激光作为激发光，其聚焦在支架的表面上。发射光被检测并通过光电倍增管放大。在图像拾取之后，扫描的16位图像被输入给软件Genepix 5(Axon，Union市，美国加州)，其用于定量信号强度。对阵列上六次重复的两个俘获探针P35S(SEQID NO：23)和PAT1(SEQ ID NO：25)进行信号定量。减去局部背景，将背景减去的信号对循环数作图。阵列还包含用作负杂交控制和正检测控制的俘获探针，用Cy3标志，在阵列上以四重存在。

微阵列上的实时PCR的结果见图4。结果显示特异的俘获探针P35S在循环22处出现信号。该信号持续规则地升高直到循环40。对俘获探针PAT1未观察到信号。

Claims

1、一种用以监测微阵列上存在于溶液中的核苷酸分子的PCR扩增的方法，包括步骤：

-将含有所述核苷酸分子的溶液引入到所述反应室(14)和用于核苷酸分子扩增和标识的试剂中。

o在允许所述靶核苷酸分子(13)和其相应俘获分子(20)之间进行特异结合的情况下培养所述标识的靶核苷酸分子(13)，

o对盒中含有标识的靶核苷酸分子(13)的溶液施以激发光(2)，测量被结合的标识的靶核苷酸分子应激发光(2)而发出的光发射(7)，其中限定区域的发射面在约0.1μm²到约75mm²之间，以及

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，对经标识的靶核苷酸分子的测量在至少5次热循环，优选至少10次、甚至20次热循环中进行。

3、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光发射(7)是从温阶开始起的规定时刻测量的。

4、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光发射(7)是在退火温阶开始后5分钟内、甚至2分钟内、更甚至1分钟内测量的。

5、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光发射(7)是在PCR扩增中的3个温阶中的至少一个的末尾测量的。

6、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光发射(7)是在PCR扩增的末尾测量的。

7、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述数据经处理以获得每个限定区域的信号值。

8、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述数据经处理以获得每个限定区域和局部背景的信号值。

9、如权利要求8所述的方法，其特征在于，通过从每个限定区域的信号值中减去背景来进一步处理所述数据。

10、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸分子的定量通过将限定区域的信号值与一个定值进行比较来进行。

11、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸分子的定量通过将达到一定值所需的热循环数目(CT)与基准核苷酸分子的CT值加以比较来进行。

12、如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述基准核苷酸分子在同一溶液中被扩增并作为靶核苷酸分子在同一微阵列上被检测。

13、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸分子的定量通过将达到一定值(CT)所需的热循环数目与CT值对标准浓度作图得到的标准曲线加以比较来进行。

14、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸分子扩增用的试剂包括引物对，dNTPs，热稳定DNA聚合酶和缓冲剂。

15、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸分子扩增用试剂包括引物和/或用荧光染料标识的dNTP，优选花青3、花青5或花青7。

16、如权利要求1所述的方法，其特征在于，在同一溶液中使用两种荧光染料。

17、如权利要求1所述的方法，其特征在于，调整所述溶液组成以进行核苷酸分子上的引物的退火和在同一温阶期间对俘获分子上的标识的靶分子的进行特异性结合。

18、如权利要求1所述的方法，其特征在于，与所述标识的靶核苷酸分子结合的所述俘获分子(20)在延伸的温阶期间被延伸。

19、如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述延伸的俘获分子在变性的温阶期间被检测。

20、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述限定区域为约10μm²～约1mm²，优选约1μm²～100μm²。

21、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微阵列包含大于5个不同俘获分子(20)，优选大于20甚至大于50。

22、如权利要求1所述的方法，其特征在于，在同一试验中对在溶液中的1～4个核苷酸分子、优选1～20个核苷酸分子进行扩增、检测和/或定量。

23、如权利要求1所述的方法，其特征在于，在同一试验中对在溶液中的20～1000个核苷酸分子进行扩增、检测和/或定量。

24、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述支架(15)包含其上固定有俘获分子的底物。

25、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述支架(15)载有多个用物理界面分离的微阵列。

26、如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述支架(15)具有多阱板形或条形。

27、如权利要求26所述的方法，其特征在于，在测量光发射(7)期间对所述多阱板执行温度梯度。

28、如权利要求1所述的方法，其特征在于，来自光源(1)的激发光(2)对准到所述支架的表面上。

29、如权利要求1所述的方法，其特征在于，在10分钟以内、优选6分钟以内、甚至3分钟以内进行一次热循环。

30、如权利要求1所述的方法，其特征在于，在5小时内、优选3小时内、甚至1.5小时内进行30次热循环。

31、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述俘获分子是单链多核苷酸，其包含能够特异性结合于标识靶核苷酸分子的序列和具有至少20个核苷酸的隔离物。

32、一种用以监测微阵列上存在于溶液中的核苷酸分子的PCR扩增的装置，包括：

-激发光源(1)，

33、如权利要求32所述的装置，其特征在于，进一步包含：

34、如权利要求32所述的装置，其特征在于，所述支架(15)包含其上固定有俘获分子的底物。

35、如权利要求32所述的装置，其特征在于，所述微阵列包含大于5个、优选大于20个、甚至大于50个不同俘获分子(20)。

36、如权利要求32所述的装置，其特征在于，所述加热和冷却是以5℃/min、优选30℃/min的斜率进行。

37、如权利要求32所述的装置，其特征在于，所述限定区域为约10μm²～约1mm²，优选约1μm²～约100μm²。

38、如权利要求32所述的装置，其特征在于，进一步包含：光学***，用以将从所述激发光源(1)发出的激发光(2)对准并直接聚焦到所述支架上，其中激发光以45～135°的角度到达所述微阵列表面。

39、一种用以监测微阵列上存在于溶液中的核苷酸分子的PCR扩增的诊断试剂盒，包括：

-表面上固定有微阵列的支架(15)，包括至少一个固定于所述支架的特异性限定区域(21)内的俘获分子(20)，其中所述支架的表面在高于85℃的温度下保持平坦，且所述支架具有弱自荧光性；

40、如权利要求39所述的诊断试剂盒，其特征在于，进一步包含：dNTPs、热稳定DNA聚合酶和缓冲液。

41、如权利要求39所述的诊断试剂盒，其特征在于，进一步包含：dNTPs、热稳定DNA聚合酶，缓冲液和引物。

42、如权利要求39所述的诊断试剂盒，其特征在于，进一步包含作为内标的核苷酸分子。

43、如权利要求39所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述支架和反应室是盒的一部分。