CN1746301A - 耐酸耐高温的α－淀粉酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

耐酸耐高温的α－淀粉酶及其制备方法，属于用重组DNA技术定点突变前体α－淀粉酶，以改善其特性，并将其表达的方法，涉及具有耐高温及酸稳定性的α－淀粉酶突变体及其制备方法。本发明解决了已有α－淀粉酶耐酸性较差，耐高温及耐酸不能同时兼顾，以致应用受限制的问题。其技术方案是从微生物特别是地衣芽孢杆菌中分离前体α－淀粉酶基因，对其L134及S320的氨基酸残基进行突变，并在细菌中高效表达α－淀粉酶突变体。其中细菌可以是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等。选用芽孢杆菌作为宿主，安全性好，表达量高，产量可达12g/L发酵液。α－淀粉酶突变体具有良好的酸稳定性，更适于工业化应用，从而为耐酸性α－淀粉酶的工业化生产提供一条可行途经。

Description

耐酸耐高温的α-淀粉酶及其制备方法

技术领域

本发明属于使用重组PCR技术，进行定点突变α-淀粉酶及其制备方法，涉及在特定位点突变的耐酸性、耐高温突变型α-淀粉酶及其制备技术。其中所得到的α-淀粉酶具有较好的酸稳定性，能在生产中所需的工艺条件下完成其功能活性。

背景技术

α-淀粉酶(α-1，4-glucan-glucanhydrolase EC 3.2.1.1)又称为液化型淀粉酶。它能从淀粉分子的内部任意切开α-1，4键，产生分子量比较小的麦芽糖糊精。淀粉在α-淀粉酶的作用下，分子迅速降解，粘度下降，即完成液化作用。α-淀粉酶具有相当大的商业价值，广泛的用于淀粉深加工工业、酒精工业、啤酒工业、柠檬酸工业、味精及淀粉糖化工业、制药工业及纺织业。目前在工业生产中，α-淀粉酶一般以微生物发酵法进行大规模生产，这些微生物包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌等。其中地衣芽孢杆菌生产的α-淀粉酶因具有热稳定性而被优选使用。耐高温α-淀粉酶由于其热稳定性好，适合于在高温下液化淀粉，因此被广泛应用食品、制药等行业，是目前工业上用途最广泛的一种酶。

近年来随着淀粉原料深加工工业的发展，酒精行业工艺条件的改变，要求酶制剂工业不断更新和完善酶的种类，以满足工业生产的要求。对于淀粉糖化工业，一般是采用二酶法，即先加淀粉酶液化，再加糖化酶糖化来生产葡萄糖，但是由于目前市售的淀粉酶最适pH为6.0-9.0，而糖化酶的最适pH为4.5左右，因此，由液化进入糖化需调节pH值，这样一来使工艺变得繁琐，又引入了外源离子，加重了分离负担，不仅如此，还易产生麦芽酮糖，使葡萄糖收率降低。而在酒精行业中，由于废水的回填，使得原料液pH值降为4-5，也不适合α-淀粉酶的作用。在我国传统白酒生产中，由于固态发酵不彻底，在酒糟中普遍含有10％以上的残余淀粉，而酒糟中的pH很低，此酸性条件下的淀粉利用就需要开发适合该生产条件的酸性α-淀粉酶。为了适应整个淀粉糖化工业及酒精行业的需要，简化工艺、降低成本、节省水和能源，满足一些在酸性条件下进行淀粉原料液化工艺的要求，开发一种耐酸的高温α-淀粉酶就势在必行。(高崎羲幸.耐酸·耐熱性α-アミラ一ゼの開[J].食品工業，1994：44-50，王凯军，秦人伟.发酵工业废水处理.科学工业出版社，张丽苹，徐岩，金建中.酸性α-淀粉酶的研究与应用[J].酿酒.2002，29(3)：19-22，刘春莉，张文学，杨瑞.新型耐酸性α-淀粉酶液态发酵条件的研究[J].四川大学学报(工程科学版).2003，35(1)：63-65)。

目前已自然筛选到一些耐酸的α-淀粉酶。1994年，日本宫崎大学的高崎幸义教授分离到一株地衣芽孢杆菌(FERMBP-4480)，所产的酶最适pH为5.0(高崎羲幸.耐酸·耐熱性α-アミラ一ゼ遺伝子[P].特開平8-289788，1996，11)。另外，日本科学家今中忠行也选育出一株最适pH为5.0的耐酸性α-淀粉酶产生菌Pyrococcus sp.(今中忠行等.超耐熱性酸性α-アミラ一ゼぉょび該α-アミラ一ゼ產生遺  伝子を含むDNA断片[P].特開平9-173077，1997，7)。上述耐酸α-淀粉酶均是自然筛选得到的，且最适pH为5.0。

当前利用基因工程技术对α-淀粉酶的耐酸性改造的研究工作也在开展。中科院微生物研究所的科研人员研究了嗜热真菌Thermomyces lanuginosus的α-淀粉酶。该酶的最适温度和pH值分别为65℃和4.5-5.0，比目前常温真菌A.oryzae和A.awamori的α-淀粉酶以及NOVO公司的“Fungamnyl”真菌α-淀粉酶具有较高热稳定性，比国内市场上大量生产的BF7658α-淀粉酶最适pH偏酸1-2个单位。目前国内市场上的α-淀粉酶的品种较单一，耐高温及耐酸不能同时兼顾，因此不能适应我国酒精、淀粉糖等淀粉深加工行业工艺的要求。为了适应我国二酶法的生产工艺要求，开发既耐高温又耐酸的新的酶种势在必行。特别是为了节约工业用粮，就迫切需要运用基因工程手段，对目前耐高温生产菌株进行改造，使其能产生耐酸的高温α-淀粉酶。

发明内容

针对上述情况，本发明解决了现有α-淀粉酶耐酸性、耐高温不能同时兼顾，以致应用受限制的问题；采用重组DNA技术，提供了定点突变前体α-淀粉酶、以改善其特性，得到了耐高温及耐酸同时兼顾的α-淀粉酶突变体及其制备方法。

本发明从地衣芽孢杆菌[中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)10181]中分离前体α-淀粉酶基因，对其134及320位点的氨基酸残基进行突变，并在芽孢杆菌中高效表达α-淀粉酶突变体。从而为耐酸性α-淀粉酶的工业化生产提供一条可行途径。本发明将分离到的编码前体α-淀粉酶的基因的L134及S320氨基酸残基进行突变，以改变其酸稳定性。并构建重组表达载体，转化枯草芽孢杆菌宿主中。每升发酵液中α-淀粉酶突变体表达量可达12g。α-淀粉酶突变体具有良好的酸稳定性，有较宽的pH适用范围，更适于工业化应用。

α-淀粉酶指的是切割或水解α-1，4键的酶活性。α-淀粉酶突变体，是突变α-淀粉酶编码DNA序列的表达产物。α-淀粉酶突变体具有的氨基酸序列是通过使SEQ ID NO：7所示组成前体α-淀粉酶的氨基酸序列中L134及S320的氨基酸位点的替换而得到的。α-淀粉酶突变体的序列是在前体α-淀粉酶原有序列上发生了氨基酸的替换。本发明设计了四条重叠引物和一对上游和下游引物，按图1所示用重组PCR方法将前体α-淀粉酶的L134及S320位点进行突变，得到经过耐酸性改造的本发明突变体基因。编码α-淀粉酶突变体的基因序列见图4。本发明的α-淀粉酶突变体pH低于5.0时具有酸稳定性。

本发明所用的前体α-淀粉酶来源是地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。

耐酸耐高温的α-淀粉酶，包括突变α-淀粉酶DNA序列的重组表达载体；重组表达载体除包括编码突变α-淀粉酶的DNA序列外，还具有表达该基因所需的调控元件。可供选择使用的在枯草芽孢杆菌中表达的质粒载体有很多。这些载体都带有完整的阅读框架，即含有一个启动子和一个终止子，或另外带有其它的表达调控元件。优选的启动子是枯草芽孢杆菌中的sacB启动子。在启动子和终止子之间有一段多克隆位点，这些多克隆位点分别包含有若干单一酶切位点，选用限制酶将载体切成线状，并用DNA连接酶将突变α-淀粉酶基因连接到所选载体上，从而构建成一个在启动子和终止子之间含有目的基因的重组分泌型载体。本发明使用大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pBCH，***本发明的突变的α-淀粉酶DNA编码序列以后得到重组表达载体，它除了携带有所述的淀粉酶DNA编码序列外，还带有sacB启动子、sacB基因信号肽序列、氨苄青霉素及卡那霉素抗性基因，以及为外源蛋白高效表达所需的各种调控元件。

重组体细胞指的是包含编码本发明α-淀粉酶的DNA的表达载体的适当宿主。本发明适用的宿主细胞包括任何可表达本发明的α-淀粉酶的可转化微生物，重组表达载体转化的重组体细胞，即大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌细胞，优选蛋白酶缺陷的枯草芽孢杆菌细胞。

本发明包括产生α-淀粉酶突变体的方法，包括以下步骤：

·突变编码前体α-淀粉酶的基因及其片断；通过定点突变技术，得到编码α-淀粉酶突变体的DNA序列；

·将上述的突变DNA序列与载体相连，得到携带α-淀粉酶突变体基因的重组表达载体；

·将重组表达载体转化宿主菌株中，得到重组体细胞；

·将重组体细胞进行发酵制备α-淀粉酶突变体。每升发酵液可生产α-淀粉酶达12g；

·分离并纯化提取耐酸pH4.0～4.5且耐高温70～90℃的淀粉酶突变体。

所述的前体α-淀粉酶来源于地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌；所述的重组载体适于在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中表达。所述的载体适于在枯草芽孢杆菌中表达；所述的重组体细胞是重组体枯草芽孢杆菌细胞。

其中所述的α-淀粉酶突变体基因是将前体α-淀粉酶基因的L134及S320氨基酸残基进行突变而得到的；所述的重组载体适于在产生前体α-淀粉酶同种或同属的宿主菌株中表达；尤其适于在蛋白酶缺陷的枯草芽孢杆菌菌株中表达。

可使用任何已知的转化方法，如感受态法、电转化法等将本发明的重组表达载体转入宿主细胞中，以实现α-淀粉酶突变体的表达。

应用本发明获得的重组体菌株可以进行耐酸性α-淀粉酶突变体的工业化生产。在由选择压力的液体培养基中培养重组体细胞，经诱导表达后，上清液加入氯化钠及Tris缓冲液，加热除沉淀。上清中加入苯基琼脂糖凝胶树脂后，用洗脱剂洗脱、沉淀及透析即可得到所需的耐酸性α-淀粉酶突变体。

有益效果：

本发明使用重组PCR技术，对前体α-淀粉酶基因进行定点突变，得到了耐高温及耐酸同时兼顾的α-淀粉酶突变体，并构建了重组分泌型表达载体，转化枯草芽孢杆菌，使耐酸pH4.0～4.5，且耐高温70～90℃的α-淀粉酶得以高效表达，产量可达12g/L发酵液。α-淀粉酶突变体具有良好的酸稳定性，更适于工业化应用。为耐酸性耐高温α-淀粉酶的工业化大生产提供一条可行途径，不仅适应我国二酶法的生产工艺要求，且提高收得率、降低消耗、提高产品的质量、增加效益，特别是可以节约工业用粮。不仅具有重要的经济效益，也具有明显的社会效益。

附图说明

图1：前体α-淀粉酶的PCR扩增电泳图；

图2：前体α-淀粉酶的DNA序列；

图3：前体α-淀粉酶的突变示意图；

图4：编码α-淀粉酶突变体的DNA序列；

图5：重组表达载体结构图；

图6：α-淀粉酶突变体的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

具体实施方式：

下面结合附图与具体实施方案对本发明作进一步详细描述。其具体实施方案应该理解为仅为举例说明，而非任何方式限制本发明的范围。

实施例1：前体α-淀粉酶基因的扩增

提取地衣芽孢杆菌[中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)10181]染色体DNA。设计如下引物(引物委托上海生物工程有限公司合成)：

上游引物F1：5‘-AGGATCCCTTGAAGAAGTGAAGAAGCAGAGAGG

下游引物R1：5‘-AAAAGCTTCCTGAGGGCTGATGATGACACTTTG

其中上游引物F1 5’端含BamHI酶切位点，下游引物R1 5’端含HindIII酶切位点。以地衣芽孢杆菌020401染色体DNA为模板进行PCR扩增，按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合：采用50L扩增体系：ddH₂O 41.5L，10×buffer 5L，dNTP(2.5mmol/L each)1L，上游引物F1(20mol/L)0.5L，下游引物R1(20mol/L)0.5L，DNA模板1L，TaqDNA聚合酶0.5L。扩增条件为：95℃ 3min，1个循环；94℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 180s，30个循环；最后一个循环为72℃ 10min。将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测到扩增产物约为1.9kb，结果如图1所示，可以看到在约1.9kb处出现了一条特异性带，其大小与目的基因片段大小完全吻合。连接在pUC19(购自invitrogen公司)载体上，得到pUCA，将其测序可知(委托上海生工)扩增到的α-淀粉酶基因的DNA序列如图2。

实施例2：前体α-淀粉酶的定点突变

α-淀粉酶的突变示意图见图3。设计重叠引物如下：

重叠引物A：5’-GAGAACACCGCATTAAAGCCTGGAC-3’

重叠引物B：5’-GTCCAGGCTTTAATGCGGTGTTCTC-3’

重叠引物C：5’-AAGCATCCGTTGAAAGCGGTTACAT-3’

重叠引物D：5’-ATGTAACCGCTTTCAACGGATGCTT-3’

重叠引物A与重叠引物B互补，重叠引物C与重叠引物D互补。重叠引物A与B中包含了对134位氨基酸的突变，而重叠引物C与D中则包含了对320位氨基酸的突变。以重组质粒pUCA为模板进行PCR扩增，按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合：PCR1：采用50μL扩增体系，ddH₂O 38.5μL，10×buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L each)2μL，上游引物F1(20mol/L)1μL，重叠引物B(10mol/L)2μL，DNA模板1μL，Pyrobest高保真DNA聚合酶0.5μL。PCR2：采用50μL扩增体系，ddH₂O 37.5μL，10×buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L each)2μL，重叠引物A(10mol/L)2μL，下游引物R2(20mol/L)2μL，DNA模板1μL，Pyrobest高保真DNA聚合酶0.5μL。PCR3：采用50μL扩增体系，ddH₂O 38.5μL，10×buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L each)2μL，上游引物F1(20mol/L)1μL，重叠引物D(10mol/L)2μL，DNA模板1μL，Pyrobest高保真DNA聚合酶0.5μL。PCR4：采用50μL扩增体系，ddH₂O 37.5μL，10×buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L each)2μL，重叠引物C(10mol/L)2μL，下游引物R2(20mol/L)2μL，DNA模板1μL，Pyrobest高保真DNA聚合酶0.5μL。扩增条件均为：95℃ 3min，1个循环；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 120s，30个循环；最后一个循环为72℃ 10min。接着进行第二步的重组PCR。按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合：PCR5：采用50μL扩增体系，ddH₂O 37.5μL，10×buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L each)4μL，PCR1产物1μL，PCR2产物2μL，Pyrobest高保真DNA聚合酶0.5μL。PCR6：采用50μL扩增体系，ddH₂O 37.5μL，10×buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L each)4μL，PCR3产物1μL，PCR4产物2μL，Pyrobest高保真DNA聚合酶0.5μL。扩增条件均为：95℃ 3min，1个循环；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 90s，10个循环；最后一个循环为72℃ 5min。此时再向两个PCR体系中各加入1μL(20mol/L)上游引物F1和2μL(10mol/L)下游引物R2，扩增条件改为：95℃ 3min，1个循环；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 120s，25个循环；最后一个循环为72℃ 10min。最终得到突变的耐高温α-淀粉酶基因。其序列见图4。

实施例3：表达载体的制备

在含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基中接种携带质粒pBCH的大肠杆菌JM109菌株(购自宝生物公司)，于37℃振荡培养过夜。将1.5mL菌液转入微量离心管中，12000转/分钟，离心30秒收集菌体，弃上清，空干残液。将沉淀重悬于100μL预冷的溶液I(50mmol蔗糖，25mmol Tris，10mmol EDTA，pH8.0)，混合均匀。加入200μL新配的溶液II(0.2mol NaOH，1％SDS)，盖紧管口，轻轻摇匀，放置冰上1-2分钟至液体清亮。加入150μL预冷的溶液III(3mol乙酸钾，pH4.8)，轻轻转动离心管，使溶液III在粘稠的细菌裂解液中混合均匀，冰浴3-5分钟。12000转/分钟，离心5分钟，将上清转移到另一管中，加等体积用Tris饱和的酚-氯仿-异戊醇混合液(三者的体积比为25∶24∶1)，混合均匀，12000转/分钟，离心5分钟，再将上清转移到另一离心管中。加入2-2.5倍体积的无水乙醇，混匀，冰浴(或-20℃)放置30分钟。12000转/分钟，离心5分钟，收集质粒DNA沉淀。用70％乙醇洗涤沉淀2-3次，弃去残液，空气中干燥10-20分钟，用20μL灭菌的双蒸水溶解沉淀。

在微量离心管中加入5μL按上述方法制备的质粒DNA，2μL 10倍浓度酶切缓冲液，0.5μL PstI，0.5L HindIII，加入双蒸水至总体积为20μL，于37℃保温3-4小时，然后于65℃保温20分钟，使限制酶失活。取2μL样品用琼脂糖凝胶电泳检测，超螺旋的pBCH载体被切成线性的DNA分子。

上述酶切片段采用DNA纯化试剂盒(promega公司)进行纯化。具体方法是：用前充分混合Wizard DNA纯化树脂，如有结晶或沉淀出现，可将树脂放入37℃保温10分钟，用前冷却到25-30℃。每个样品使用一个Wizard柱。取出3mL注射器的活塞，将注射器管体部分连接到Wizard柱的外接口上。取1mL Wizard DNA纯化树脂加到1.5mL离心管中。再加入样品(50μL)，轻柔地颠倒几次混匀。将结合有DNA的纯化树脂加入到注射器管中，***活塞，缓慢地推动活塞，将树脂与DNA的混合物压入Wizard柱。将注射器从Wizard柱上取下，取出活塞，重新将注射器管体部分连接到Wizard柱的外接口上，向注射器管内加入2mL异丙醇，***活塞，轻柔推动活塞使溶液流经Wizard柱。取下注射器，将Wizard柱放入1.5mL离心管中，10000转/分钟，离心2分钟，干燥树脂。将Wizard柱移入新的1.5mL离心管中，向柱中加入50μL预先加热到65-70℃的去离子水或TE缓冲液，静置1分钟。17000转/分钟，离心20秒洗脱DNA片段。丢弃Wizard柱，纯化好的DNA保存在4℃或-20℃条件下。所获得的线性纯化pBCH即可用作连接α-淀粉酶基因的载体。

实施例4：突变α-淀粉酶表达载体的构建

先将突变α-淀粉酶的PCR产物用DNA纯化试剂盒(TaKaRa公司)进行割胶纯化。具体操作如下：制作1％的琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。在紫外灯下切下含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，切碎胶块。称量胶块重量，计算胶块体积(按照1mg相当于1μL计算)。向胶块中加入胶块融化液DR-I缓冲液，DR-I缓冲液的加入量为胶块体积的3倍。均匀混合后75℃加热融化胶块，同时间断振荡，使胶块充分融化(约6分钟)。向胶块融化液中加入DR-I缓冲液量的1/2体积的DR-II缓冲液，均匀混合。分离小于400bp的DNA片段时，在此溶液中加入异丙醇至终浓度为20％。将试剂盒中的Spin Column安置与CollectionTube上。将溶液转移至SpinColumn中，3600转/分钟，离心1分钟，弃滤液。将500μL的RNA酶加入Spin Column中，3600转/分钟，离心30秒，弃滤液。将700μL的RNA酶加入Spin Column中，3600转/分钟，离心30秒，弃滤液。12000转/分钟，离心1分钟。将Spin Column安置于新的1.5mL离心管上，在SpinColumn膜的中央加入25μL水或洗脱液，室温静置1分钟。12000转/分钟，离心1分钟洗脱DNA。琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果。

取26μL纯化的PCR产物，加入5μL 10倍浓度的酶切缓冲液，2μL PstI，2μLHindIII，加入双蒸水至50μL总体积，于37℃保温3小时，然后于65℃保温20分钟，使限制性内切酶失活。用实施例2所述的方法对酶切片段进行纯化。在1.5mL管中加入3μL纯化的DNA，1μL线形pBCH载体，1μL连接缓冲液，1μL T4DNA连接酶，加水至总体积为10μL，16℃连接过夜。所得到的连接混合物用电转化法转化大肠杆菌JM109。

按下述方法制备大肠杆菌JM109的感受态细胞。接E.coli JM109斜面菌种接种于5mLLB培养基中，37℃振荡培养过夜。将培养物以1％接种量接种于另一装有100mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃振荡培养2-3小时，使细胞达到对数生长期(OD₆₀₀＝0.6)。将三角瓶转移到冰上放置20分钟，3000转/分钟，4℃离心15分钟收集细胞。用10％甘油洗细胞3次，每次100mL，3000转/分钟，4℃离心15分钟，收集细胞。最后将细胞悬浮在300μL甘油中，按每份40μL分装到预冷的离心管并迅速在液氮中冷冻，然后置-80℃保存。

使用时将感受态细胞置冰上融化，同时将电转化杯也放在冰上冷却。在一管中加入5μL上述连接混合物，一管加入3μL不含淀粉酶基因的载体质粒，混匀后加入电转化杯中，轻击液体以确保细菌与DNA悬液位于电转杯底部。打开电转化仪，调整到Ec1档，即专为大肠杆菌转化设置的一档。擦干电转化杯外面的冷凝水和雾气，放进电转化仪中，按上述设定的档，启动对细胞的电转化。转化结束后，尽可能快地取出电转杯，加入1mLSOC培养液。混匀后转入1.5mL离心管中，于37℃培养1小时。按每个平板100μL涂布到含氨苄青霉素(100μg/mL)的LA平板上，37℃倒置培养过夜(16-20小时)。从平板上挑取单一菌落，接种于液体LB培养基中，于37℃振荡培养12-18小时，然后小量提取质粒DNA，用限制酶PstI和HindIII进行双酶切鉴定。选择能切下1.9kb片段的克隆，含有突变α-淀粉酶基因的重组质粒命名为pBEC。重组质粒结构见图5。

也可以用氯化钙法转化大肠杆菌。大肠杆菌JM109的培养同电转化法。培养好的菌液置0℃冰上冷却10分钟，取50mL培养液装入预冷的离心管中，4℃离心(4000转/分钟)10分钟。倒出培养液，空干离心管。用30mL冰浴的MgCl₂-CaCl₂溶液(80mmol/LMgCl₂，20mmol/L CaCl₂)重悬细胞沉淀。4℃离心(4000转/分钟)10分钟，倒出上清液，空干离心管。用1mL冰浴的0.1mol/L CaCl₂溶液悬浮。按每管40μL分装到1.5mL离心管中，-80℃保存。使用时将感受态细胞置冰上融化，加入5μL连接混合物，轻轻混匀，冰浴20分钟。于42℃热激90秒，迅速转移至冰浴中，放置2-3分钟。加入SOC培养基1mL，37℃缓慢摇动45分钟。按每个平板100μL涂布到含氨苄青霉素(100μg/mL)的LA平板上，37℃倒置培养过夜(16-20小时)。从平板上挑取单一菌落，接种于液体LB培养基中，37℃振荡培养12-18小时，然后小量提取质粒DNA，并用限制性内切酶PstI和HindIII进行双酶切鉴定。选择能切下1.9kb片段的克隆，含有突变α-淀粉酶基因的重组质粒命名为pBEC。

实施例5：表达载体转化枯草芽孢杆菌

按下述方法制备枯草芽孢杆菌DB104(实验室保存)的感受态细胞。接种枯草杆菌单菌落至3mL SPI培养基中，37℃，250r/min培养过夜。100μL菌液接种至5mL SPI培养基中，(SPI培养基配方：0.2g/mL(NH4)₂SO₄，1.4g/Ml k₂HPO₄，0.6g/L KH₂PO₄，00.2g/LMgSO₄.7H₂O，0.1g/L柠檬酸钠，0.2g/L蛋白胨，1g/L酵母膏，0.01g/mL葡萄糖)37℃，250r/min培养5h，至OD₆₀₀＝1，取200μL菌液接种至2mL SPII培养基中(SPII培养基配方：SPI培养基，1％50mmol/L CaCl₂溶液，1％250mmolMgCl₂溶液)，37℃，100r/min培养1.5h，加20μL 100×EGTA(100×EGTA配方：20g/L蛋白胨100g/L酵母膏)，于37℃放置10分钟，分装。加入5μL穿梭质粒，轻轻混匀后先37℃，100rpm培养30分钟，再于37℃，250rpm培养1.5h，取菌液涂布含5μg/mL卡那霉素的LB平板，培养10-12h。

枯草杆菌转化子质粒的提取和检测如下：接种转化子一环于5mL含抗菌素的LB培养基中，振荡培养过夜。将培养物转入250mL预热的LB培养基中，37℃培养2-3h，OD₆₀₀＝0.4-0.6。将培养物在冰水中冷却，4℃，8000r/min离心10min收集细胞，用预冷的TES(TES配方：50mM Tris-HCI，pH 8.0，1mM Na₂EDTA，10mM NaCl)悬浮细胞，4℃离心，弃尽上清。用10mL TSS(TSS配方：25％(W/V)蔗糖，用100mM NaCl和50mMTris-HCI(pH 8.0)配制)悬浮细胞再加入0.25mL溶菌酶溶液(溶菌酶溶液浓度为20mg/mL)。37℃保温1h。按顺序加入如下试剂，每次加入后要轻柔的彻底混匀：2.4mL 5M NaCl，0.6mL 0.5M EDTA(pH8.0)，12.5mL溶液SDS溶液(SDS溶液配方：2％SDS溶于0.7M NaCl溶液中)。加入SDS溶液后，要轻轻颠倒离心管3-5次以彻底混匀，裂解液在冰水中放置过夜。4℃，12000r/min离心60min，小心取出上清液。加入2.5mL5M NaCl，混匀。65℃水浴15min，冷却至室温，15000r/min离心30min，小心取出上清液。加入约1/4体积的40％PEG7500，混匀，在冰水中放置1h。10000r/min离心10min，弃尽上清，用1mL TE溶解。用酚，氯仿各抽提一次。上清液在65℃保温15min。用乙醇沉淀过夜，用0.2mL TE溶解。提取的质粒用限制性内切酶PstI和HindIII进行双酶切鉴定。

实施例6：枯草芽孢杆菌重组菌株中α-淀粉酶基因的表达及纯化突变α-淀粉酶

接种一环重组枯草杆菌于20mL含5μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。接200μL菌液于20mL含抗生素的LB培养基中，培养2h。加入蔗糖至2％进行诱导表达。表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图见图6。M为蛋白质标准，1为带有空质粒的枯草芽孢杆菌，2为枯草芽孢杆菌重组菌株。分泌的淀粉酶由以下方法回收：氯化钠被加到培养上清液内至20mM，使用1M的Tris缓冲液(pH7.2)调整至pH7.0。上清液加热15min至70℃，离心除去沉淀。加硫酸铵至1.3M，再加20ml苯基琼脂糖凝胶快流6树脂，搅拌后过滤分离，再用洗涤液(1M硫酸铵，20mM乙酸铵，5mM氯化钙)洗涤。洗脱液加入硫酸铵使蛋白沉淀。再用20mM乙酸铵和5mM氯化钙的混合溶液使沉淀溶解，并透析过夜。冷冻干燥得到α-淀粉酶突变体成品。每升发酵液可得12g。

产品性能测定：

1)α-淀粉酶突变体耐酸活性测定

重组菌株诱导表达后，12000r/min离心10分钟去除细胞，测定上清液中的酶活(计为细胞外酶活)。将菌体重新悬浮破碎细胞，在不同的pH条件下测定酶活。酶活单位定义：在相应条件下，1min液化可溶性淀粉1mg成为糊精所需要的酶量，即为1个酶活力单位，以1U表示。测定方法如下：取1％可溶性淀粉溶液1.0mL，和所需pH的缓冲液(磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液)0.25mL于1.5mLEppendorf管中，混合，在所需温度水浴5min，加入预先稀释好的酶液0.1mL，立刻用秒表计时，在20s用微量取液器取出反应液0.1mL，加入预先盛有1.0mL比色碘液的试管中，当试管中反应液颜色由紫色逐渐变成红棕色，恰与标准终点色相同时，即为反应终点，并记录到达终点所需时间。

酶活计算：X＝(((1/t)×1×1％×n)＝0.1)×10³

t-到达反映终点所需时间(min)

1-可溶性淀粉体积(mL)

1％-可溶性淀粉溶液浓度

n-样品稀释倍数

10³-1g等于10³mg

0.1-测定酶液用量

          表1

PH	酶活力(U/mL)
		4.0	3005
4.5	3250
		5.0	3600
5.5	3800
		6.0	3840

如表1所示，在pH4.0仍具有很强的酶活，可达3000U/mL。说明按上述方法制备的α-淀粉酶突变体具有酸稳定性。

2)α-淀粉酶突变体热稳定性测定

将酶液分别在60℃，70℃，80℃，90℃，95℃保温30min，按上述1)。α-淀粉酶突变体耐酸活性测定中的方法测定酶活力。测定结果如下表所示：

              表2

测定温度(℃)	酶活力(U/mL)
		60	2500
70	2750
		80	3050
90	2800
		95	2450

表2测定结果说明，本发明制得的α-淀粉酶突变体的热稳定性很好。

                     序列表

SEQUENCE LISTING

<110>天津科技大学

<120>耐酸耐高温的α-淀粉酶及其制备方法

<130>050518

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>dna

<222>(1)..(33)

<223>

<400>1

aggatccctt gaagaagtga agaagcagag agg                                  33

<210>2

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

aaaagcttcc tgagggctga tgatgacact ttg                                  33

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gagaacaccg cattaaagcc tggac                                            25

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gtccaggctt taatgcggtg ttctc                                            25

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

aagcatccgt tgaaagcggt tacat                                            25

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

atgtaaccgc tttcaacgga tgctt                                            25

<210>7

<211>1539

<212>DNA

<213>地衣芽孢杆菌

<220>

<221>GENE

<222>(1)..(1539)

<223>

<400>7

atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttgctgacgc tgttatttgc gctcatcttc    60

ttgctgcctc attctgcagc agcggcggca aatcttaatg ggacgctgat gcagtatttt    120

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ttggctgaac acggtattac tgccgtctgg attcccccgg catataaggg aacgagccaa    240

gcggatgtgg gctacggtgc ttacgacctt tatgatttag gggagtttca tcaaaaaggg    300

acggttcgga caaagtacag cacaaaagga gagctgcaat ctgcgatcaa aagtcttcat    360

tcccgcgaca ttaacgttta cggggatgtg gtcatcaacc acaaaggcgg cgctgatgcg    420

accgaagatg taaccgcggt tgaagtcgat cccgctgacc gcaaccgcgt aatttcagga    480

gaacacctaa ttaaagcctg gacacatttt cattttccgg ggcgcggcag cacatacagc    540

gattttaaat ggcattggta ccattttgac ggaaccgatt gggacgagtc ccgaaagctg    600

aaccgcatct ataagtttca aggaaaggct tgggattggg aagtttccaa tgaaaacggc    660

aactatgatt atttgatgta tgccgacatc gattatgacc atcctgatgt cgcagcagaa    720

attaagagat ggggcacttg gtatgccaat gaactgcaat tggacggttt ccgtcttgat    780

gctgtcaaac acattaaatt ttcttttttg cgggattggg ttaatcatgt cagggaaaaa    840

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aactatttga acaaaacaaa ttttaatcat tcagtgtttg acgtgccgct tcattatcag    960

ttccatgctg catcgacaca gggaggcggc tatgatatga ggaaattgct gaacggtacg    1020

gtcgtttcca agcatccgtt gaaatcggtt acatttgtcg ataaccatga tacacagccg    1080

gggcaatcgc ttgagtcgac tgtccaaaca tggtttaagc cgcttgctta cgcttttatt    1140

ctcacaaggg aatctggata ccctcaggtt ttctacgggg atatgtacgg gacgaaagga    1200

gactcccagc gcgaaattcc tgccttgaaa cacaaaattg aaccgatctt aaaagcgaga    1260

aaacagtatg cgtacggagc acagcatgat tatttcgacc accatgacat tgtcggctgg    1320

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attaccggaa accgttcgga gccggttgtc atcaattcgg aaggctgggg agagtttcac    1500

gtaaacggcg ggtcggtttc aatttatgtt caaagatag                           1539

<210>8

<211>1539

<212>DNA

<213>地衣芽孢杆菌

<220>

<221>GENE

<222>(1)..(1539)

<223>

<400>8

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gtaaacggcg ggtcggtttc aatttatgtt caaagatag                           1539

Claims (10)

1.耐酸耐高温的α-淀粉酶，其特征在于是α-淀粉酶突变体编码DNA序列的表达产物；α-淀粉酶突变体具有的氨基酸序列是通过使SEQ ID NO：7所示组成前体α-淀粉酶的氨基酸序列中L134及S320的氨基酸位点的替换而得到的。

2.编码根据权利要求1的耐酸耐高温的α-淀粉酶突变体的基因。

3.根据权利要求1所述的耐酸耐高温的α-淀粉酶，其特征在于pH低于5.0时具有酸稳定性。

4.根据权利要求1所述的耐酸耐高温的α-淀粉酶，其中所述的前体α-淀粉酶来源是地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。

5.根据权利要求1所述的耐酸耐高温的α-淀粉酶，其特征在于，包括突变α-淀粉酶DNA序列的重组表达载体；重组表达载体除编码突变α-淀粉酶的DNA序列外，还具有表达该基因所需的调控元件。

6.根据权利要求1所述的耐酸耐高温的α-淀粉酶，其特征在于，重组表达载体转化的重组体细胞，即大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌细胞。

7.根据权利要求6所述的耐酸耐高温的α-淀粉酶，其特征在于，其重组体细胞为重组体枯草芽孢杆菌细胞。

8.权利要求1所述的耐酸耐高温的α-淀粉酶制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

·突变编码前体α-淀粉酶的基因及其片断；

·将上述的突变序列与载体相连，得到携带突变α-淀粉酶基因的重组表达载体；

·将重组表达载体转化宿主菌株中，得到重组体细胞；

·将重组体细胞进行发酵制备α-淀粉酶突变体；

·提取耐酸pH4.0～4.5且耐高温70～90℃的α-淀粉酶突变体。

9.根据权利要求8所述的耐酸耐高温的α-淀粉酶制备方法，其特征在于，所述的前体α-淀粉酶来源于地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌；所述的重组载体适于在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中表达。

10.根据权利要求8或9所述的耐酸耐高温的α-淀粉酶制备方法，其特征在于，所述的载体适于在枯草芽孢杆菌中表达；所述的重组体细胞是重组体枯草芽孢杆菌细胞。

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