CN103834606A - 一种表达耐酸高温α-淀粉酶基因突变体的工程菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表达耐酸高温α-淀粉酶基因突变体的工程菌株。该工程菌是是将表达耐酸高温α-淀粉酶基因的重组载体导入地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)中，筛选得到的耐酸高温α-淀粉酶表达量提高的工程菌株；所述耐酸高温α-淀粉酶具有序列表中序列2的氨基酸序列。该工程菌具有比目前国内生产菌株更强的产耐酸高温α-淀粉酶能力，具有独特的鉴定标签，是一株极具生产应用价值的耐酸高温α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌生产菌株。
Description
技术领域
本发明涉及一种表达耐酸性高温α-淀粉酶基因的工程菌株。具体说是通过化学诱变剂对高温α-淀粉酶基因amy进行突变，再通过酸性条件筛选获得新型耐酸高温α-淀粉酶基因突变体amyM，在地衣芽孢杆菌工程菌中实现表达和应用。
背景技术
高温α-淀粉酶，即能水解淀粉、可溶性糊精及低聚糖中的a-1，4葡萄糖苷键的α-淀粉酶，因为其最适反应温度较高，一般为60摄氏度以上，因此称为高温α-淀粉酶。
高温α-淀粉酶广泛应用于酒类、味精及淀粉糖等工业生产，代替传统工艺既省工省厂房设备，又能提高出品率，降低成本，增加效益。地衣杆菌α-淀粉酶是我国产量最大用途最广的一种高效液化型淀粉酶，它是由耐热性能高的地衣杆菌诱变后逐级扩大培养再经提纯而获得的一种酶制剂，主要作用是能将原料中的淀粉质液化为糊精。
目前，国内外市场中常用的淀粉酶的最适pH值在6.0～10.0，在酸性条件下，其酶活性降低很明显，甚至失去活性。随着我国淀粉质原料深加工工业的发展，工艺条件的不断改变，一些淀粉原料深加工工艺需要在较低的pH值条件下进行。所以，开发新型耐酸性α-淀粉酶迫在眉睫。
由于从自然界筛选得到的野生菌株产酸性α-淀粉酶的活力一般都比较低，不能直接运用于工业化的发酵生产。国内外学者一般通过对野生菌株的诱变、杂交育种等技术手段，来提高菌株的产酶能力，戚薇等通过利用低能N+注入枯草芽孢杆菌，诱变后得到的菌株，其酸性α-淀粉酶的酶活为343U／ml，通过诱变后，与出发菌株相比较，最适作用pH值偏低一个单位(戚薇，王海燕，王建玲，等.氮离子注入选育耐酸性α2淀粉酶产生菌诱变效应的研究。天津科技大学学报，2007，22(9)：7-8.)。随着分子生物学的迅速发展，基因工程育种技术由于可以对基因进行预先设计和控制，并且表达作用效果明显，所以越来越受到国内外研究者的青睐。蔡恒等把α-淀粉酶的基因改造后，克隆到穿梭质粒pBE2中，构建了含突变α-淀粉酶基因的分泌型诱导表达载体pBSAT,含有pBSAT的菌株可将突变α-淀粉酶分泌到胞外，分泌的α-淀粉酶具有较高的耐酸性(蔡恒，陈忠军，李金霞，等。α-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。食品与发酵工业，2005，31(10)：33-36.)；欧洲研究者采用基因改造Bacillus licheniformis来生产耐热性的酸性α-淀粉酶，在原有天然菌株的DNA序列中将N188位的天冬氨酸用其他任何一种氨基酸代替，使在N15或N197位的蛋氨酸残基缺失，得到的高产菌株所生产的α-淀粉酶适用的液化pH值可以降低到5.0，且在100～110℃时活性不变(SHAWA,BOTT R,DAY A G.Protein engineering ofα-amylase for low pH performance.Curr OpinBiotechnol，1999(10)：349-352.)。
我国是农业大国，淀粉资源非常丰富，酸性淀粉酶的应用范围也越来越广泛。早在20世纪70年代，国内就有学者对酸性淀粉酶开始了研究，取得了一些研究成果，但与国外相比，差距甚远，我国产酸性α-淀粉酶的菌株较单一，且酶活较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达耐酸性高温α-淀粉酶的基因工程菌株。
本发明所提供的可表达高温α-淀粉酶的工程菌，是将来自于地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)高温α-淀粉酶基因进行突变，得到突变体，然后把表达耐酸性高温α-淀粉酶基因突变体重组载体导入地衣芽孢杆菌中，筛选得到的高温α-淀粉酶耐酸性提高的工程菌株；所述高温α-淀粉酶氨基酸序列如序列表1所示；所述耐酸性高温α-淀粉酶突变体氨基酸序列如序列表2所示。
所述地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis)为地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis)CICC10181。所述可表达耐酸性高温α-淀粉酶的工程菌优选为地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformi5)ZHWY CGMCC No.6669。
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)ZHWY CGMCC No.6669，已于2012年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.6669。
所述发酵用培养基为含75-86g/L的玉米粉，35-45g／L的豆饼粉，1-3g／L的氯化钙，6.5-8.5g／L的磷酸氢二钠，3.5-5.5g/L的硫酸铵的液体培养基。
所述发酵的温度为36.0-38.5℃，优选为37℃。
本发明的可表达耐酸高温α-淀粉酶的工程菌，特别是地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)ZHWY CGMCC No.6669，具有比目前国内高温α-淀粉酶生产菌株更强的耐酸能力，具有独特的鉴定标签，是一株极具生产应用价值的耐酸高温α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌生产菌株。实验证明，在相同的发酵条件下，本发明的含有耐酸高温淀粉酶基因突变体的工程菌株生产的高温α-淀粉酶的最适pH为5.2，而野生型菌株的高温α-淀粉酶的最适pH为6.4。
附图说明
图1为pAXOI-amyM的结构图。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、亚硝酸钠诱变获得耐酸性高温α-淀粉酶突变体基因amyM
提取地衣芽孢杆菌CICC10181(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)的基因组DNA。(提取方法参照Bron，S(1990).Plasmids.In Molecular BiologicalMethods for Bacillus,pp75-174.Edited by C.R.Harwood&S.M.cutting.Chichester：Wiley)。
以地衣芽孢杆菌(B.Licheniformis)CICC10181基因组DNA为模板进行PCR扩增amy基因，上游引物为引物1(5’-ACCTGCCTGTACACTTGCG-3’)和下游引物为引物2(5’-CTCTCTGCTCTTCTATCTTTG-3’)。
扩增条件：预变性94℃5分钟，然后变性94℃1分钟，退火56℃一分钟，延伸72℃1分30秒。完成30个循环后，72℃保温10分钟。
上述扩增得到1978bp的amy片段，经过测序表明，该片段包括高温α-淀粉酶基因的启动子、信号肽编码序列和结构基因。该DNA片段编码如序列表中序列1所示氨基酸序列。
将amy基因与大肠杆菌表达载体pEASY-T3连接，转化E.coli Top10，培养富集后提取质粒pEASY-T3-amy。
对提取的质粒pEASY-T3-amy进行亚硝酸钠诱变及筛选得到pEASY-T3-amyM，方法如下：
①EP管中加入1.0μgDNA。
②加入50mMol／L的亚硝酸钠200μL，100mMol／L醋酸钠缓冲液(pH4.6)200μL，混匀，20℃下静置，15-60分钟。
③加入100μL2.5Mol／L醋酸钠缓冲液(pH7.0)混匀，终止亚硝酸钠诱变反应。
④加入2倍体积100％冷乙醇，混匀，-20℃放置30分钟。
⑤12000rpm离心10分钟，倒去上清液，将沉淀晾干，加入适量去离子水溶解。
⑥将含有突变基因的质粒转化进入E.coli Top10感受态细胞，在LB液体培养基中培养。
⑦将培养12小时的大肠杆菌涂布于不同pH值(pH5.0-5.8)的LB培养基。观察其生长情况和产透明圈的大小，选择在较低pH平板上生长且透明圈较大的菌落，提取质粒进行测序，得到耐酸性高温α-淀粉酶突变体基因amyM。
根据amyM核酸测序结果对应的氨基酸密码子进行分析，结果表明，amyM编码的耐酸性高温α-淀粉酶突变体与amy编码的野生型高温α-淀粉酶相比，发生了以下变化：第4位的赖氨酸突变为天冬酰胺；第134位精氨酸突变为亮氨酸；第288位的天冬酰胺突变为天冬氨酸；第289位的苯丙氨酸突变为酪氨酸；第320位的丙氨酸突变为丝氨酸。耐酸性高温α-淀粉酶突变体氨基酸序列如序列表2所示。
实施例2、表达耐酸性高温α-淀粉酶突变体基因amyM的携带LacA整合臂穿梭载体pAXOI-amyl的构建
以质粒pEASY-T3-amyM为模板进行PCR扩增耐酸性高温α-淀粉酶突变体基因amyM。扩增引物为：上游引物5′-cgggatcc ACCTGCCTGTACACTTGCG-3′(下划线标注部分为BamHI酶切位点)和下游引物5′tccatccgcgg-CTCTCTGCTCTTCTATCTTTG-3′(下划线标注部分为SacII,酶切位点)。
上述扩增得到1978bp的amyM片段，经过测序表明，该片段包括耐酸性高温α-淀粉酶基因的启动子、信号肽编码序列和结构基因。
分别用BamHI和SacII双酶切PCR产物amyM和穿梭整合质粒pAXOI(购自从美围俄亥俄州立大学菌种保存中心，Bacillus Genetic Stock Center(BGSC)The Ohio State University)，将酶切产物分别用PCR产物回收试剂盒回收纯化后，在4℃采用T4DNA连接酶进行连接反应16小时。将连接反应物转化宿主菌E.coli Top10(购自北京天根生化科技有限公司)感受态细胞，涂布LB平板(Amp+)，挑选阳性克隆，进行摇瓶培养16小时。收获细胞，提取小量质粒进行酶切和测序验证。将验证正确的穿梭质粒即携带耐酸性高温淀粉酶的启动子、信号肽和结构基因的表达穿梭整合质粒命名为pAXOI-amyM(结构图如图1所示)。
实施例3、表达耐酸性高温α-淀粉酶基因突变体的工程菌ZHWY的构建
将实施例2诱变得到的携带耐酸性高温淀粉酶的启动子、信号肽和结构基因的表达穿梭整合质粒pAXOI-amyM以原生质体加电穿孔法(Romero D，Journal ofMicrobiology Methods,2006Vol66p556-559)转化产高温淀粉的地衣芽孢杆菌CICC10181(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC10181)，具体方法如下所述：
采用Romero D地衣芽孢杆菌原生质体制备方法(Romero D，Journal ofMicrobiology Methods,2006Vol66p556-559)获得地衣芽孢杆菌CICC10181原生质体后，取5ul(2ug)纯化后的质粒pAXOI-amyM于一个1.5ml的离心管中，将其和0.2CM的电击杯放在冰上预冷，将120ul制备好的原生质体转入至上述装有pAXOI-amyM的1.5ml的离心管中，小心混匀，冰上放置10min，然后开启电转仪，调电压到600V；将质粒和原生质体细胞混合液移到已经预冷的电击杯中，用干滤纸擦干电击杯，注意混合液中不得有气泡。将电击杯放入电转仪的杯槽中，按下电击键，有放电声出现后，立即向电转杯中加入1ml细胞复苏缓冲液(Romero D，Journal of MicrobiologyMethods,2006Vol66p556-559)，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。
将上述装有转化后的细胞的离心管放置37℃，100rpm摇床培养12-16小时，取150ul菌液涂布于含有10ug/ml红霉素的DM3固体培养基(含8g／L琼脂，5g／L水解酪蛋白，5g／L酵母粉，1.5g／L KH2PO4，3.5g／L K2HPO4，45.5g／L山梨醇和10g／L淀粉的培养基)平板，放入37℃培养箱培養72-96小时后出现地衣芽孢杆菌的单菌落，挑取单菌落即为可在含10ug/ml红霉素平板上生长的阳性克隆，将得到的阳性菌株提取基因组基因，用实施例1所述的扩增高温α-淀粉酶的基因(amy)的上下游引物进行PCR鉴定，扩增得到1978bp的片段的菌株即为阳性菌株，结果得到一株验证表明正确的导入pAXOI-amyM的基因重组菌，将该菌株命名为地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)ZHWY。该地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)ZHWY CGMCC No.6669，已于2012年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCCNo.6669。
实施例4、基因重组地衣芽孢杆菌ZHWY耐酸性高温淀粉酶表达验证
采用500毫升带档板的三角瓶，装培养基的量为50ml，将实施例2所得地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)ZHWY或地衣芽孢杆菌(B.Licheniformis)CICC10181(野生菌)分别按照0.01g菌体／ml培养基的量接种于一个三角瓶中，在37℃摇床培养，摇床转速为200rpm。发酵96h，终止发酵。两组处理分别设三个重复。
所述培养基的组成为：豆饼粉26.1g／L，棉籽饼粉21.1g／L，氯化钙0.46g／L，硫酸铵5g／L，柠檬酸钠2g／L，磷酸氢二钾14g／L，磷酸二氢钾6g／L，玉米浆21.1g／L，乳糖105g／L(独立灭菌)，pH值为6.7，其余为水。
发酵过程中，取发酵上清液进行耐酸性检测及酶活检测，方法如下：
取发酵液1ul，点到不同pH(5.0-6.6，间隔0.2)的0.5％淀粉平板上，反应15分钟，测量透明圈的大小。
结果表明，在发酵培养96小时，重组地衣芽孢杆菌ZHWY在pH5.2的淀粉平板上透明圈最大，而野生菌地衣芽孢杆菌(B.Licheniformis)CICC10181在pH6.4的淀粉平板上透明圈最大，表明耐酸性高温α-淀粉酶基因突变体amyM比野生型高温淀粉酶基因amy耐酸性更强。
Claims (5)
1.表达耐酸高温α-淀粉酶的工程菌，是将含有耐酸性高温α-淀粉酶基因突变体amyM的重组载体导入地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)中，筛选得到的耐酸高温α-淀粉酶表达量提高的工程菌株。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述耐酸性高温α-淀粉酶基因amyM编码的所述耐酸性高温α-淀粉酶突变体的序列如序列表2所示。
3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于：所述的耐酸性高温α-淀粉酶突变体包含但不限于：第4位的赖氨酸突变为天冬酰胺；第134位精氨酸突变为亮氨酸；第288位的天冬酰胺突变为天冬氨酸；第289位的苯丙氨酸突变为酪氨酸；第320位的丙氨酸突变为丝氨酸。
4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)为地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)ZHWY CGMCC No.6669。
5.一种表达耐酸高温α-淀粉酶的方法，是发酵权利要求1-4中任意一项所述的表达耐酸高温α-淀粉酶的工程菌，得到耐酸高温α-淀粉酶。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140604 |