CN1712067A - 冷冻干燥的不含白蛋白的重组人第ⅷ凝血因子 - Google Patents

冷冻干燥的不含白蛋白的重组人第ⅷ凝血因子 Download PDF

Info

Publication number
CN1712067A
CN1712067A CNA2004100869047A CN200410086904A CN1712067A CN 1712067 A CN1712067 A CN 1712067A CN A2004100869047 A CNA2004100869047 A CN A2004100869047A CN 200410086904 A CN200410086904 A CN 200410086904A CN 1712067 A CN1712067 A CN 1712067A
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombined human
viii
lyophilization
niastate
human viii
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2004100869047A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1325116C (zh
Inventor
白相勋
辛龙男
金振晚
许在旭
李正湜
权起圣
千知玄
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ryokugugi K K
Original Assignee
Ryokugugi K K
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ryokugugi K K filed Critical Ryokugugi K K
Publication of CN1712067A publication Critical patent/CN1712067A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1325116C publication Critical patent/CN1325116C/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明是关于用作血友病治疗剂的重组人第VIII凝血因子冷冻干燥制剂，作为使冷冻干燥时活性不稳定的蛋白质即重组人第VIII凝血因子稳定化的稳定剂，使用6～100mM精氨酸(L－Arginine)、3.5～50mM异亮氨酸(L－Isoleucine)、10～100mM谷氨酸(L－Glutamic acid)的混合物来代替来自人血液的白蛋白。

Description

冷冻干燥的不含白蛋白的重组人第VIII凝血因子
技术领域
本发明是关于用作血友病A的治疗剂的、冷冻干燥的重组人第VIII凝血因子混合物，更详细地说，是关于作为使冷冻干燥时不稳定的蛋白质即重组人第VIII凝血因子稳定化的稳定剂，使用没有病毒感染危险的氨基酸来代替来自人血液的白蛋白，以稳定化重组人第VIII凝血因子的不含白蛋白的重组人第VIII凝血因子冷冻干燥组成成分。
背景技术
血友病是一种因先天性凝血障碍而无法进行止血的遗传性疾病，被认为是由于缺乏在人血浆中正常存在的蛋白质之一的生物学活性凝血因子而引起。
血友病是一种隐性的伴性遗传病，因而在女性的情况下即使带有血友病遗传因子也不会发病，发病只限于男性，根据其所缺乏的凝血因子的种类，血友病可分为血友病A、血友病B、血友病AB、血友病C等。
血友病A是因缺乏人体内的第VIII凝血因子(抗血友病因子)而所致，在2万人中发病率约为1人或2人。血友病B是因缺乏人体内的第IX凝血因子(克里斯马斯因子)而所致，在10万人中发病率约为1人。血友病AB是因缺乏重组人体内的第VIII或第IX凝血因子而所致。还有，血友病C是因缺乏人体内的第XI凝血因子而所致。
大约30年来，血友病A的治疗剂一直是从人的血浆中分离第VIII凝血因子后再进行精制、浓缩而获得的，正是由于这种治疗剂才能够使血友病患者们维持着生命。
然而，用作以往血友病治疗剂的来自人血的第VIII凝血因子，由于是从人的血浆中提取，因此具有被肝炎或HIV、TTVirus等各种经血液传递的病毒所感染的问题。为了克服这类问题，如在文献【J.Gitschier et al.，Nature 312，330-37，1984和EP160457】中所报道那样，目前通常使用从利用了重组DNA技术的重组动物细胞培养产物中分离、精制而制备重组人第VIII凝血因子的方法。
重组人第VIII凝血因子产物的结构以及其生物化学反应记载在文献【Kaufman Tibtech，Vol 9，1991 and Hematology，63，155-65，1991】中。
从人血浆中分离得到的人第VIII凝血因子浓缩物中包括多个被片段化的活性稳定的第VIII凝血因子形态【参考文献：Andersson etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol 83，2979-83.May 1986】。最小活性形态的分子量为170kDa，它是90kDa和80kDa的两个链通过金属离子交联而构成【参照EP 197901】。Kabi Pharmacia公司开发出了从来自人血的第VIII凝血因子浓缩物中去除相当于170kDa分子量大小的B-domain部分后获得的重组人第VIII凝血因子产物。被切断的重组人第VIII凝血因子被命名为r-VIIISQ，它是通过在无血清的培养基中利用Chinese Hamster ovary(CHO)细胞株用动物细胞培养方法生产。r-VIII SQ的结构以及生物化学反应被记载于WO 91/09122号中。
像重组人第VIII凝血因子这样的蛋白质的情况下，为了保存、储藏和处理而制成冷冻干燥形态后市售，在向患者给药时，是以再用合适的溶剂再溶解(reconstitution)后向患者注射的方式给药。但是，像冷冻干燥的重组人第VIII凝血因子这种蛋白质的情况下，在精制、灭菌、冷冻干燥、包装和再溶解后给药的期间，存在蛋白质的活性大幅度下降的问题以及干燥后块状外观(cake appearance)不良的问题，因此以往是添加来自人血液的白蛋白来作为重组人第VIII凝血因子冷冻干燥时的稳定剂以稳定重组人第VIII凝血因子。来自人血液的白蛋白起到精制、灭菌以及冷冻干燥时的一般稳定剂的作用【参照：Wang et al.，J.of Parenteral Sci.and Tech.Vol 42，Number2S，Supplement.1988】。来自人血液的白蛋白也是一种冷冻干燥用剂型中的良好的块状(cake)成形剂。为了稳定化重组人第VIII凝血因子而使用白蛋白是公知的，并且正被使用于目前市售的所有高纯度的重组人第VIII凝血因子部分产品中。但是，来自人血液的白蛋白是从人血浆中分离得到，因此如上所述要面临被肝炎、HIV、TTVirus等来自血液的病毒所感染的问题，因此不适合作为利用重组DNA技术制得的血友病治疗剂。并且，在对最终产品进行异化学检验时，会发生因相对于少量的主药效成分过量存在的白蛋白所引起的干扰现象，因此难以进行严格的品质管理。
因此，需要一种在干燥或冷冻干燥期间在溶液中稳定以及作为冷冻干燥之后再溶解之后的溶液稳定的、不含白蛋白的重组人第VIII凝血因子剂型。
为了使重组人第VIII凝血因子稳定化，提出了各种方案。
US 5,763,401(EP 818204，Bayer)，提出了使用15～60mM蔗糖作为稳定化剂来稳定化重组人第VIII凝血因子的方法。
US 5,733,873(EP627924，Pharmacia & Upjohn)，提出了使用0.01～1mg/ml的非离子性表面活性剂(聚三梨糖醇酯20或80)作为稳定化剂来稳定化重组人第VIII凝血因子的方法。
US 4,877,608(EP315 968，Rhone-Poulenc Rorer)，提出了利用0.5～15mM NaCl、CaCl2以及0.01～10mM的盐酸赖氨酸来稳定化重组人第VIII凝血因子的方法(添加了麦芽糖、蔗糖、甘露糖等糖)。
US 5,605,884(EP 314 095，Rhone-Poulenc Rorer)，提出了利用高浓度离子即0.35～1.2M NaCl、1.5～40mM CaCl2来稳定化重组人第VIII凝血因子的方法(添加了麦芽糖、蔗糖、甘露糖等糖)。
WO 96/22107(Quadrant Holings Cambrige Limited)，提出了使用海藻糖作为稳定剂。
WO 89/09614(Genentech)中记载了包括甘氨酸、甘露醇和缓冲剂的人生长激素的稳定化剂型，在优选实施例中还添加了聚三梨糖醇酯80等非离子性表面活性剂。非离子性表面活性剂是为了被还原的凝聚和变性而添加。冷冻干燥过程和再溶解后的剂型的稳定性提高。
在EP 268 110(Cetus)中记载了包含特定蛋白质例如白细胞间介素-2的溶液，所述特定蛋白质溶解在作为溶解剂/稳定剂而包含非离子性聚合物澄清剂的惰性载体培养基中。优选的澄清剂有辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、聚乙二醇一硬脂酸酯和聚失水山梨糖醇脂肪酸亚乙酯。
在US 4,783,441(Hoechst)中记载了包含蛋白质例如胰岛素以及表面活性物质的水溶液。
在US 4,165,370(Coval)中记载了γ球蛋白溶液及其制造方法。溶液中含有聚乙二醇(PEG)。可以将非离子性表面活性剂添加到溶液中。
EP 77 870(Japan Green Cross)中，提出了为了改善含有重组人第VIII凝血因子的溶液的稳定性而添加氨基酸、单糖类、低聚糖或糖醇或烃羧酸的技术，在EP 117064号中记载了为了提高热处理期间的稳定性而在重组人第VIII凝血因子的水溶液中添加糖醇或二糖的技术。
在WO 91/10439(Octopharma)中提出了包含二糖类优选是蔗糖和1种以上氨基酸的第VIII凝血因子或第IX凝血因子的稳定的注射用溶液。
发明内容
本发明的目的在于，解决可能由一直以来作为人第VIII凝血因子的稳定剂来使用的来自人血液的白蛋白而发生的病毒感染的问题，同时提供与上述含白蛋白的产品相比药效上没有差别的新型的不含白蛋白的冷冻干燥重组人第VIII凝血因子制剂。
本发明的不含白蛋白的冷冻干燥重组人第VIII凝血因子剂型是使用精氨酸、异亮氨酸和谷氨酸的混合物作为稳定剂来实现的。
本发明的不含白蛋白的重组人第VIII凝血因子制剂与以往的含有白蛋白的重组人第VIII凝血因子制剂相比，在块状外观以及再溶解后的活性、再溶解后的澄清度方面具有大致同样的效果。
本发明提供即使不含白蛋白稳定性也高的冷冻干燥的重组人第VIII凝血因子制剂。
本发明者们为了寻找能够替代来自人血液的白蛋白的冷冻干燥重组人第VIII凝血因子时的稳定剂，通过试验发现了在按照特定的比率来添加特定氨基酸进行冷冻干燥的情况下，即使在冷冻干燥之后其活性、块状外观和澄清度优异。
下面，详细说明本发明。
本发明中使用的重组人第VIII凝血因子原液是指，利用亲和层析和离子交换层析对含有重组人第VIII凝血因子的溶液进行精制而得到的溶液，所述含有重组人第VIII凝血因子的溶液是培养利用重组DNA技术制备的动物细胞来得到的。
另外，重组人第VIII凝血因子最终原液是指，在重组人第VIII凝血因子原液中添加碱性缓冲剂(Basic Buffer)和稳定剂进行稀释后得到的冷冻干燥之前的溶液。
本发明的不含白蛋白的重组人第VIII凝血因子制剂，其特征在于，作为稳定剂含有精氨酸(L-Arginine)、异亮氨酸(L-Isoleucine)、谷氨酸(L-Glutamic Acid)。
冷冻干燥之前上述精氨酸的浓度优选为6～100mM，更优选为6～42mM。
冷冻干燥之前上述异亮氨酸的浓度优选为3.5～50mM，更优选为7～35mM。
冷冻干燥之前上述谷氨酸的浓度优选为10～100mM，更优选为10～70mM。
另外，作为本发明的重组人第VIII凝血因子最终原液的碱性缓冲剂可以是由适当量的组氨酸、NaCl和CaCl2的混合物来构成。
上述组氨酸、NaCl和CaCl2被作为人体蛋白质的缓冲剂来广泛使用的是大家所公知的。
附图说明
图1是表示本发明的重组人第VIII凝血因子制剂的冷冻干燥过程的图。
图2是将本发明的不含白蛋白的重组人第VIII凝血因子制剂，与含白蛋白的重组人第VIII凝血因子制剂，以及含非离子性表面活性剂的重组人第VIII凝血因子制剂进行比较的照片。
图3是将本发明的不含白蛋白的重组人第VIII凝血因子制剂，与含白蛋白的重组人第VIII凝血因子制剂，以及含非离子性表面活性剂的重组人第VIII凝血因子制剂的活性(activity)进行比较的图表。
图4是将本发明的不含白蛋白的重组人第VIII凝血因子制剂，与含白蛋白的重组人第VIII凝血因子制剂，以及含非离子性表面活性剂的重组人第VIII凝血因子制剂的块状外观(cake appearance)进行比较的图表。
图5是将本发明的不含白蛋白的重组人第VIII凝血因子制剂，与含白蛋白的重组人第VIII凝血因子制剂，以及含非离子性表面活性剂的重组人第VIII凝血因子制剂的澄清度(clarity)进行比较的图表。
具体实施方式
下面，根据实施例详细说明本发明，但本实施例仅仅是优选的实施例，本发明并不限定于以下实施例。
实施例1
为了寻找替代以往的来自人血液的白蛋白使重组人第VIII凝血因子稳定化的物质，作为稳定剂使用卵磷脂(磷脂酰胆碱)、蔗糖、甘氨酸、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和氨基酸(精氨酸、异亮氨酸、谷氨酸)而制备了各重组人第VIII凝血因子的冷冻干燥用最终原液混合物，并且为了确认冷冻干燥后的活性，对于所制得的各冷冻干燥后的重组人第VIII凝血因子混合物测定了其活性(activity)、块状外观(cake apperance)、和澄清度(clarity)。
所使用的材料和仪器如下。
-L-精氨酸(M.W.210.7 Sigma)
-L-异亮氨酸(M.W.131.2 Sigma)
-L-谷氨酸(M.W.169.1 Sigma)
-L-一盐酸组氨酸(M.W.209.63 Fluka)
-蔗糖(M.W.342.3 Sigma)
-Tween 80(Sigma)
-PEG 3350(M.W.3350 Carbowax)
-人血清白蛋白(20％ KGC)
-甘氨酸(M.W 75.07 Sigma)
-PVP(K30)(M.W.4000，Fluka)
-磷脂酰胆碱(卵磷脂 Doosan)
-FVIII显色分析试剂盒(Coamatic kit，Chromogenix)
-96well培养箱(Sanofi-BMS)
-ELISA读数器(Magellan)
-凝血计
-FVIII deficient plasma(DADE BEHRING)
-肌动蛋白(DADE BEHRING)
-CaCl2(DADE BEHRING)
-CA缓冲剂(巴比妥盐，DADE BEHRING)
-冷冻干燥机VIRTIS-GENESIS 25XL
-浊度计2400(HACH)
重组人第VIII凝血因子的精制
利用亲和层析和1次和2次离子交换层析精制含重组人第VIII凝血因子的培养液，该培养液是培养利用重组DNA技术制得的动物细胞而获得的。并且将该精制得到的溶液称为重组人第VIII凝血因子原液。
不同组成的含稳定剂的重组人第VIII凝血因子制剂的制备
按照以下表1制备不同组成的碱性缓冲剂和稳定剂，将精制得到的重组人第VIII凝血因子原液与上述碱性缓冲剂和稳定剂混合进行稀释，制造重组人第VIII凝血因子最终原液(第VIII凝血因子浓度：50～125IU/ml)，然后向10ml用VIAL分别注入该最终原液4ml，使最终达到200～500IU/Vial，进行了冷冻干燥。
表1
产品组成   碱性缓冲液   稳定剂
实验1含白蛋白的重组人第VIII凝血因子制剂   组氨酸  50mMNaCl    150mMCaCl2  4mM   白蛋白   1％(HSA)PEG3350  0.3mM(0.1％)
实验2含非离子表面活性剂的重组人第VIII凝血因子制剂   组氨酸  8.9mMNaCl    192.5mMCaCl2  2.82mM   蔗糖     115.4mMTween 80 0.125mg/ml
实验3   组氨酸  50mMNaCl    150mMCaCl2  4mM   PEG3350  0.3mM(0.1％)
实验4   蔗糖     100mM(100～400mM test)
实验5   蔗糖     100mMPEG3350  0.3mM(1％)
实验6   甘氨酸   400mM(50～400mM test)
实验7   甘氨酸   400mM蔗糖     100mM
  实验8   卵磷脂   (1～6)(0.004mg～0.16mg test)蔗糖     100mM
  实验9   PVP      0.5％(0.1～1.4％test)
  实验10   PVP      0.5％蔗糖     100mM
  实验11   PVP      0.5％甘氨酸   50～400mM
  实验12   PVP      0.5％蔗糖     100mM甘氨酸   50mM
  实验13   PVP      0.5％卵磷脂   (1～6)
  实验14   PVP      0.5％卵磷脂   (1～6)蔗糖     100mM
  实验15   L-精氨酸 6～42mM异亮氨酸 7～35mM谷氨酸   10～70mM
  实验16   L-精氨酸 35mM异亮氨酸 7mM谷氨酸   57mM
冷冻干燥
向精制得到的重组人第VIII凝血因子原液混合上述碱性缓冲剂和稳定剂而得最终原液混合物后，分别装入在VlAL，加入到冷冻干燥机(VIRTIS-GENESIS 25XL)中，然后如图1所示急剧冷却到-45℃，维持6小时，然后转换为真空状态并维持6小时，接着以0.2℃/min的速度用2小时缓慢升温到-20℃(第1次加温)，在-20℃维持80小时平衡。接着，以0.1℃/min的速度用7小时缓慢升温至25℃(第二次加温)，在25℃维持平衡3小时，以0.1℃/min的速度再次升温至33℃，然后在33℃维持温度平衡20小时，完成了冷冻干燥。
冷冻干燥结束之后，分别在2～8℃的冷藏室中保管各产品，必要时同时测定了活性、块状外观和澄清度。
效果的确认
对于按照上述方法制备的重组人第VIII凝血因子制剂测定了其块状外观、再溶解后的澄清度和再溶解后的活性，并将结果示于以下表2中。
表2
产品组成   稳定剂   块状外观          澄清度           活性
  实测值(NTU)   相对值(％)   实测值(IU/ml)   相对值(％)
实验1含白蛋白的重组人第VIII凝血因子制剂   白蛋白1％(HAS)PEG3350 0.3mM(0.1％)   100％   3.0   100％   102   100％
实验2含非离子表面活性剂的重组人第VIII凝血因子制剂   蔗糖    115.4mMTween80 0.125mg/ml   80％   3.0   100％   86   84.3％
实验3   PEG3350 0.3mM(0.1％)   30％   3.6   80％   77   75.5％
实验4   蔗糖    100mM(100～400mM test)   80％   3.0   100％   81   79.4％
实验5   蔗糖    100mMPEG3350 0.3mM(1％)   30％   3.0   100％   82   80.4％
实验6   甘氨酸  400mM(50～400mM test)   50％   3.0   100％   89   87.3％
实验7   甘氨酸  400mM蔗糖    100mM   40％   3.0   100％   90   88.2％
实验8   卵磷脂  (1～6)(0.004mg～0.16mg test)蔗糖    100mM   80％   3.6   80％   90   88.2％
实验9   PVP     0.5％(0.1～1.4％ test)   100％   3.0   100％   76   74.5％
实验10   PVP     0.5％蔗糖    100mM   50％   3.0   100％   67   65.7％
实验11   PVP     0.5％甘氨酸  50～400mM   40％   3.0   100％   90   88.2％
实验12   PVP     0.5％蔗糖    100mM甘氨酸  50mM   40％   3.0   100％   75   73.5％
实验13   PVP     0.5％卵磷脂  (1～6)   100％   3.6   80％   91   89.2％
实验14   PVP     0.5％卵磷脂  (1～6)蔗糖    100mM   40％   3.3   90％   86   84.3％
实验15   L-精氨酸 6～100mM异亮氨酸 3.5～50mM谷氨酸   10～100mM   100％   3.0   100％   87～92   85.3～90.2％
实验16   L-精氨酸 35mM异亮氨酸 7mM谷氨酸   57mM   100％   3.0   100％   92   90.2％
块状外观是用肉眼进行了比较；澄清度是利用浊度计2400(HACH)进行了比较实验；活性是用层析分析和凝固分析(APTT)进行了比较试验，并以使用来自人血液的白蛋白的情况作为基准评价了相对值，也就是说，将含白蛋白的重组人第VIII凝血因子制剂(实验1)的块状外观、澄清度和活性分别作为100％来进行了评价。冷冻干燥之前的活性为107IU/ml。
由上述表2可以看出，把作为稳定剂添加来自人血液的白蛋白并进行冷冻干燥而获得的重组人第VIII凝血因子制剂的块状外观、澄清度、和活性看作为100％时，可以确认实验2的含非离子性表面活性剂的重组人第VIII凝血因子混合物，其澄清度优良，但其块状外观和活性不太好。另一方面，使用了本发明的稳定剂精氨酸、异亮氨酸和谷氨酸的情况下，可以确认块状外观、澄清度和活性均优良(实验13、14)。
使用卵磷脂作为稳定剂的情况下，在活性方面获得了优良的效果，但可以确认再溶解之后的澄清度不好。并且，使用蔗糖和甘氨酸作为稳定剂的情况下虽然在活性方面上显示了较好的效果，但可以确认块状外观不良。在使用PVP(聚乙烯吡咯烷酮)作为稳定剂的情况下虽然在块状外观上较好，但可以确认活性不良。
图2是将本发明的不含白蛋白的重组人第VIII凝血因子制剂(实验16)与含白蛋白的重组人第VIII凝血因子制剂(实验1)和含非离子性表面活性剂的重组人第VIII凝血因子制剂(实验2)进行比较的照片。
图3是将本发明的不含白蛋白的重组人第VIII凝血因子制剂与含白蛋白的重组人第VIII凝血因子制剂(实验1)和含非离子性表面活性剂的重组人第VIII凝血因子制剂(实验2)的活性进行比较的图表。具体分析为如下：将含白蛋白的重组人第VIII凝血因子混合物的平均活性作为100％基准时，实验2的含非离子性表面活性剂的重组人第VIII凝血因子混合物的平均活性为80±5％，作为本发明组成的不含白蛋白的重组人第VIII凝血因子混合物的平均活性为90±5％，效果优良。
图4是比较了冷冻干燥之后块状外观的图表。具体分析为如下：将含白蛋白的重组人第VIII凝血因子混合物的平均块状外观作为100％基准时，含非离子性表面活性剂的重组人第VIII凝血因子混合物的平均块状外观为80％，作为本发明组成的不含白蛋白的重组人第VIII凝血因子混合物的平均块状外观为100％，效果优良。
图5是比较澄清度的图表。具体分析为如下：将含白蛋白的重组人第VIII凝血因子混合物的平均澄清度作为100％基准时，含非离子性表面活性剂的重组人第VIII凝血因子混合物的平均澄清度为100％，作为本发明组成的不含白蛋白的重组人第VIII凝血因子混合物的平均块状外观为100％，效果没有差别。
实施例2
为了寻找如在上述实施例1中所示的那样，作为能够取代白蛋白稳定剂而显示出最佳条件的氨基酸(精氨酸、异亮氨酸、谷氨酸)重组人第Ⅷ凝血因子混合物其冷冻干燥之后块状外观的最佳条件进行实验，并将实验结果示于以下表3中。
表3
  外观   实验17   实验18   实验19   实验20   实验21   实验22   实验23
  精氨酸(mM)   6   12   18   24   30   36   42
  异亮氨酸(mM)   0   4   7   11   14   18   21
  谷氨酸(mM)   10   19   29   38   48   57   67
  含白蛋白(实验1)对比(％) 60％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 60％
如上表3所示，与对照样品(含白蛋白)相比，在精氨酸12～36mM、异亮氨酸4～18mM、谷氨酸19～57mM的条件下显示了最佳的块状外观。
实施例3
参照上表3的结果，在3种氨基酸中将2种氨基酸的浓度恒定在形成块状外观的最小浓度(精氨酸12mM、异亮氨酸3.5mM、谷氨酸19mM)，并且为了按照精氨酸、异亮氨酸、谷氨酸的各个浓度调查活性的变化，改变一种氨基酸的浓度，如上实施例1那样进行冷冻干燥而制得重组人第VIII凝血因子混合物，并且根据层析分析和凝固分析将活性表示为相对于含白蛋白的重组人第VIII凝血因子混合物的％进行了分析。
将异亮氨酸和谷氨酸浓度分别恒定在冷冻干燥之后形成完整的块状外观的最小浓度3.5mM和19mM，并在6～100mM的范围内仅改变精氨酸的浓度，评价了其活性，并将结果示于下表4中。冷冻干燥之前的活性为107IU/ml。
表4
异亮氨酸浓度恒定为3.5mM且谷氨酸浓度恒定为19mM时
 精氨酸(mM)   6   12   18   24   30   36   42   48   75   90   100
 活性(IU/ml)   77   82   83   86   88   92   88   86   81   76   72
 含白蛋白(实验1)对比(％)   75.5％   80.4％   81.4％   84.3％   86.2％   90.2％   86.2％   84.3％   79.4％   74.5％   70.6％
如表4中所示，在6～100mM的精氨酸浓度范围内显示了较好的活性。特别是在12～48mM范围内显示了含白蛋白的重组人第VIII凝血因子活性的80％以上活性，随着精氨酸浓度的增加活性也随之上升，达到了最佳活性(90％)。
将精氨酸浓度恒定在显示出最佳活性的36mM，将异亮氨酸浓度恒定在3.5mM后，在10～100mM范围内仅改变谷氨酸浓度，评价了其活性，并将其结果表示于下表5中。冷冻干燥之前的活性为107IU/ml。
表5
精氨酸浓度恒定为36mM且异亮氨酸浓度恒定为3.5mM时
 谷氨酸(mM)   10   19   29   38   48   57   67   76   86   95   100
 活性(IU/ml)   79   79   82   84   88   92   88   82   78   76   67
 含白蛋白(实验1)对比(％)   77.5％   77.5％   80.4％   82.4％   86.3％   90.2％   86.3％   87.1％   76.5％   74.5％   65.7％
如表5中所示，在10～100mM的谷氨酸浓度范围内显示了较好的活性。特别是在29～76mM范围内显示了较好的活性(80％以上)活性，随着谷氨酸浓度的增加活性也随之上升，在57mM时显示了最佳活性。
将精氨酸和谷氨酸浓度分别恒定在显示出最佳活性的36mM和57mM后，在0～50mM的范围内仅改变异亮氨酸的浓度，评价了其活性，并将结果示于下表6中。冷冻干燥之前的活性为107IU/ml。
表6
精氨酸恒定为36mM且谷氨酸恒定为57mM时
 异亮氨酸(mM)   0   4   7   11   14   18   21   25   50
 活性(IU/ml)   81   82   92   86   86   82   73   67   62
 含白蛋白(实验1)对比(％)   79.4％   80.4％   90.2％   84.3％   84.3％   80.4％   71.6％   65.7％   60.8％
如表6中所示，在0～50mM的异亮酸浓度范围内显示了较好的活性。特别是在0～18mM范围内显示了较好的活性，在异亮酸浓度为7mM时显示了最佳活性。
通过实验调查在冷冻干燥的重组人第VIII凝血因子制剂中显示出最佳条件的白蛋白替代物氨基酸稳定剂的最佳活性维持条件的结果，在精氨酸36mM、异亮氨酸7mM、谷氨酸57mM时相对于对照样品(含白蛋白)显示了最佳的活性维持条件。
本发明的重组人第VIII凝血因子制剂通过不使用以往的有病毒感染危险的白蛋白而使用特定的氨基酸，不会发生病毒感染并且在人体内产生副作用的几率减少，同时在其活性、块状外观、澄清度方面显示了与白蛋白近似的效果。并且，与含非离子性表面活性剂的重组人第VIII凝血因子制剂相比，其活性和块状外观上显示出更优异的效果。

Claims (8)

1、一种冷冻干燥的重组人第VIII凝血因子制剂，其中作为用作血友病治疗剂的重组人第VIII凝血因子的稳定化剂，包含精氨酸、异亮氨酸和谷氨酸。
2、根据权利要求1所述的冷冻干燥的重组人第VIII凝血因子制剂，其特征在于，冷冻干燥之前上述精氨酸的浓度为6～100mM。
3、根据权利要求1所述的冷冻干燥的重组人第VIII凝血因子制剂，其特征在于，冷冻干燥之前上述精氨酸的浓度为6～42mM。
4、根据权利要求2所述的冷冻干燥的重组人第VIII凝血因子制剂，其特征在于，冷冻干燥之前上述异亮氨酸的浓度为3.5～50mM。
5、根据权利要求1或2所述的冷冻干燥的重组人第VIII凝血因子制剂，其特征在于，冷冻干燥之前上述异亮氨酸的浓度为7～35mM。
6、根据权利要求1或2所述的冷冻干燥的重组人第VIII凝血因子制剂，其特征在于，冷冻干燥之前上述谷氨酸的浓度为10～100mM。
7、根据权利要求1或2所述的冷冻干燥的重组人第VIII凝血因子制剂，其特征在于，冷冻干燥之前上述谷氨酸的浓度为10～70mM。
8、一种冷冻干燥的重组人第VIII凝血因子制剂，其特征在于，冷冻干燥之前上述精氨酸的浓度为6～42mM，上述异亮氨酸的浓度为7～35mM，上述谷氨酸的浓度为10～70mM。
CNB2004100869047A 2004-06-25 2004-10-20 冷冻干燥的不含白蛋白的重组人第ⅷ凝血因子 Active CN1325116C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020040047985A KR100624013B1 (ko) 2004-06-25 2004-06-25 동결건조된 알부민 비함유 재조합 사람 혈액응고 제 8인자 제제
KR1020040047985 2004-06-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1712067A true CN1712067A (zh) 2005-12-28
CN1325116C CN1325116C (zh) 2007-07-11

Family

ID=34511263

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB2004100869047A Active CN1325116C (zh) 2004-06-25 2004-10-20 冷冻干燥的不含白蛋白的重组人第ⅷ凝血因子

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6887852B1 (zh)
EP (1) EP1712223B1 (zh)
JP (1) JP4119407B2 (zh)
KR (1) KR100624013B1 (zh)
CN (1) CN1325116C (zh)
AT (1) ATE460155T1 (zh)
AU (1) AU2005202673B2 (zh)
CA (1) CA2504377C (zh)
DE (1) DE602005019853D1 (zh)
DK (1) DK1712223T3 (zh)
ES (1) ES2342404T3 (zh)
PL (1) PL1712223T3 (zh)
TW (1) TWI285112B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102580062A (zh) * 2012-03-09 2012-07-18 中国医学科学院输血研究所 人凝血因子Ⅷ与vWF复合物或人凝血因子Ⅷ制剂的干热处理稳定剂
CN105348382A (zh) * 2015-12-05 2016-02-24 上海洲跃生物科技有限公司 一种高纯人凝血因子viii的制备方法
CN107988292A (zh) * 2018-01-18 2018-05-04 江苏江山聚源生物技术有限公司 提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺
CN108245669A (zh) * 2018-02-06 2018-07-06 昆明龙津药业股份有限公司 一种稳定的降纤酶注射剂及制备方法

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007074880A1 (ja) * 2005-12-28 2007-07-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体含有安定化製剤
MX2011001624A (es) 2008-08-21 2011-03-28 Octapharma Ag Factor viii y ix humano producido en forma recombinante.
KR101691443B1 (ko) * 2008-09-03 2016-12-30 옥타파마 아게 재조합에 의해 제조된 인자 ⅷ을 위한 신규한 보호 조성물
JP2014522827A (ja) 2011-06-28 2014-09-08 ロイコケア・アクチェンゲゼルシャフト （ポリ）ペプチドのアンフォールディングを防止し、および／または（ポリ）ペプチドの（リ）フォールディングを誘導するための方法
AU2015240354A1 (en) * 2014-04-01 2016-11-17 Advantech Bioscience Farmaceutica Ltda. Stabilization of Factor VIII without calcium as an excipient
CA2944349A1 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Advantech Bioscience Farmaceutica Ltda. Stable factor viii formulations with low sugar-glycine
ES2788870T3 (es) * 2014-08-04 2020-10-23 Csl Ltd Formulación de factor VIII
US20160265984A1 (en) * 2015-03-13 2016-09-15 Purdue Research Foundation Wireless sensors, systems, and methods thereof
BR112017022101A2 (pt) 2015-04-14 2018-07-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha composição farmacêutica para prevenção e/ou tratamento de dermatite atópica contendo antagonista de il-31 como ingrediente ativo
WO2019074886A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 Terumo Bct Biotechnologies, Llc LYOPHILIZATION CONTAINER AND METHOD OF USE
US11609043B2 (en) 2019-03-14 2023-03-21 Terumo Bct Biotechnologies, Llc Lyophilization container fill fixture, system and method of use
KR20220029733A (ko) 2019-07-04 2022-03-08 체에스엘 베링 렝나우 아게 응고 인자 viii의 시험관내 안정성을 증가시키기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 (vwf)
WO2021100794A1 (ja) 2019-11-20 2021-05-27 中外製薬株式会社 抗体含有製剤
US20220380439A1 (en) 2020-11-09 2022-12-01 Takeda Pharmaceutical Company Limited Purification of fviii from plasma using silicon oxide adsorption

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2916711A1 (de) * 1979-04-25 1980-11-06 Behringwerke Ag Blutgerinnungsfaktoren und verfahren zu ihrer herstellung
JPS5874617A (ja) 1981-10-28 1983-05-06 Green Cross Corp:The 人由来血液凝固第７因子含有水溶液の加熱処理方法
JPS6122022A (ja) * 1983-12-28 1986-01-30 Green Cross Corp:The 血漿蛋白の加熱処理方法
DE3622642A1 (de) * 1986-07-05 1988-01-14 Behringwerke Ag Einkomponenten-gewebekleber sowie verfahren zu seiner herstellung
CA1292686C (en) 1986-10-27 1991-12-03 Ze'ev Shaked Pharmaceutical compositions of recombinant interleukin-2 and formulation process
US5096885A (en) 1988-04-15 1992-03-17 Genentech, Inc. Human growth hormone formulation
DE4001451A1 (de) 1990-01-19 1991-08-01 Octapharma Ag Stabile injizierbare loesungen von faktor viii und faktor ix
AU670793B2 (en) * 1992-04-30 1996-08-01 Alpha Therapeutic Corporation Improved solubilization and stabilization of factor VIII complex
CA2124690C (en) * 1992-10-02 2007-09-11 Thomas Osterberg Composition comprising coagulation factor viii formulation, process for its preparation and use of a surfactant as stabilizer
US5686419A (en) * 1994-01-21 1997-11-11 Georgia Tech Research Corp. Basic α-aminoalkylphosphonate derivatives
GB9501040D0 (en) 1995-01-19 1995-03-08 Quadrant Holdings Cambridge Dried composition
US5763401A (en) * 1996-07-12 1998-06-09 Bayer Corporation Stabilized albumin-free recombinant factor VIII preparation having a low sugar content
EP0852951A1 (de) * 1996-11-19 1998-07-15 Roche Diagnostics GmbH Stabile lyophilisierte pharmazeutische Zubereitungen von mono- oder polyklonalen Antikörpern
AUPO871997A0 (en) * 1997-08-25 1997-09-18 Csl Limited Dried biologically or therapeutically active preparations
CZ307715B6 (cs) * 1999-02-22 2019-03-06 University Of Connecticut Způsob lyofilizace vodné farmaceutické formulace faktoru VIII prosté albuminu
US7572619B2 (en) * 2000-03-22 2009-08-11 Octagene Gmbh Recombinant blood clotting factors
FR2857267B1 (fr) * 2003-07-09 2006-03-10 Lab Francais Du Fractionnement Formulation stabilisante et solubilisante pour les proteines cryoprecipitables.

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102580062A (zh) * 2012-03-09 2012-07-18 中国医学科学院输血研究所 人凝血因子Ⅷ与vWF复合物或人凝血因子Ⅷ制剂的干热处理稳定剂
CN102580062B (zh) * 2012-03-09 2017-03-08 中国医学科学院输血研究所 人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂
CN105348382A (zh) * 2015-12-05 2016-02-24 上海洲跃生物科技有限公司 一种高纯人凝血因子viii的制备方法
CN105348382B (zh) * 2015-12-05 2020-09-11 上海洲跃生物科技有限公司 一种高纯人凝血因子viii的制备方法
CN107988292A (zh) * 2018-01-18 2018-05-04 江苏江山聚源生物技术有限公司 提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺
CN107988292B (zh) * 2018-01-18 2023-12-26 江苏江山聚源生物技术有限公司 提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺
CN108245669A (zh) * 2018-02-06 2018-07-06 昆明龙津药业股份有限公司 一种稳定的降纤酶注射剂及制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1712223A1 (en) 2006-10-18
DE602005019853D1 (de) 2010-04-22
CA2504377A1 (en) 2005-12-25
DK1712223T3 (da) 2010-05-31
AU2005202673A1 (en) 2006-01-12
EP1712223B1 (en) 2010-03-10
AU2005202673B2 (en) 2007-05-17
CA2504377C (en) 2011-09-20
PL1712223T3 (pl) 2010-08-31
TWI285112B (en) 2007-08-11
TW200605909A (en) 2006-02-16
JP2006008650A (ja) 2006-01-12
JP4119407B2 (ja) 2008-07-16
ATE460155T1 (de) 2010-03-15
CN1325116C (zh) 2007-07-11
ES2342404T3 (es) 2010-07-06
US6887852B1 (en) 2005-05-03
KR100624013B1 (ko) 2006-09-19
KR20050123356A (ko) 2005-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1712067A (zh) 冷冻干燥的不含白蛋白的重组人第ⅷ凝血因子
TWI515006B (zh) 重組ｖｗｆ調配物
KR101772674B1 (ko) 동결건조된 재조합 ｖｗｆ 제제
JP6078129B2 (ja) 安定ｍｉａ／ｃｄ−ｒａｐ製剤
CN1122573A (zh) 氧降低的因子viii水溶液
CN102740840A (zh) 长效g-csf缀合物的液体制剂
CN1173739C (zh) 含人生长激素的水性药物组合物
CN1367703A (zh) Hgf冻干制剂
CN1802171A (zh) 不包含血清白蛋白的人红细胞生成素的稳定水溶液
JP2015535238A (ja) ペグインターフェロンα−２ｂの安定な医薬組成物
CN1832754A (zh) 不含清蛋白的红细胞生成素制剂
CN100341575C (zh) 水溶性干燥组合物
JP2023123738A (ja) 組換えｖｗｆの投与による重度のフォンヴィレブランド病を患う患者における消化管出血の治療
TWI480288B (zh) 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
KR20210134642A (ko) 재조합 vwf (rvwf)를 이용한 예방 치료 방법

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant