MX2011001624A - Factor viii y ix humano producido en forma recombinante. - Google Patents

Abstract

Una proteína del factor VIII o IX humano recombinante la cual tiene un patrón de glicosilación humano pero la proteína no tiene el ácido N-glicolilneuramínico y/o el grupo carbohidrato Gala-3Gal.

Description

FACTOR VIII Y IX HUMANO PRODUCIDO EN FORMA RECOMBINANTE Campo de la Invención La presente invención se relaciona a una glicoproteína del factor VIII y/o factor IX humano producida en forma recombinante que tiene un patrón de glicosilación similar al humano.

Antecedentes de la Invención Las glicoproteínas son abundantes en los reinos animal y vegetal así como también en microorganismos. Las porciones carbohidrato de las glicoproteínas han sido mostradas para tener múltiples funciones como tener importantes roles para reconocimiento de célula a célula, señalización celular, estructura de proteína, protección de proteína, estabilización de proteína, e interacción proteína a proteína. Las cadenas de carbohidratos de la mayoría de las glicoproteínas son enlazadas a proteínas por ya sea la N-acetilglucosamina (GlcNAc por sus siglas en inglés) enlazada a los grupos amino libres de residuos de asparagina (carbohidrato N-enlazado) o por N-acetilgalactoseamina (GalNAc por sus siglas en inglés) enlazada a los grupos hidroxilo de residuos de serina o treonina (carbohidrato 0-enlazado) . La porción de carbohidratos en cada sitio está con frecuencia compuesta de varias unidades de monosacárido que forman estructuras complejas. La mayoría de las Ref.:217163 glicoproteínas contienen varias cadenas de carbohidrato diferentes en una molécula. Las estructuras de carbohidratos enlazados a asparagina son de tres tipos: concentrado en mañosa, complejo y tipo híbrido. Todos estos tienen un núcleo de pentasacárido común, Manal-6 (Manal-3 ) anPl-4Glc Ac l-4GlcNAc . En estructuras del tipo concentradas en mañosa unidades de mañosa adicionales son acopladas a este núcleo y en estructuras del tipo de complejo, fucosa, galactosa, N-acetilglucoseamina y ácido siálico son encontrados comúnmente. Dos o más antenas de unidades de monosacárido pueden extenderse desde el núcleo común. El tipo híbrido de cadenas de carbohidrato contiene antenas de tanto el tipo concentrado en mañosa y tipo complejo.

La hemofilia es un grupo de trastornos genéticos hereditarios que dañan la capacidad del cuerpo para controlar la coagulación o aglutinación sanguínea. En su forma más común, la hemofilia A, es deficiente del factor de coagulación VIII. En la hemofilia B, es deficiente en el factor IX. La hemofilia A ocurre en aproximadamente 1 en 5,000-10,000 nacimientos de niños, mientras que la hemofilia B ocurre en aproximadamente 1 en aproximadamente 20,000-34,000. La proteína del factor VIII es un cofactor esencial en coagulación sanguínea donde el factor IXa convierte al factor X a su forma activada. La deficiencia del factor VIII y factor IX, respectivamente, puede ser tratada con concentrados derivados de plasma del factor VIII y factor IX o con factor VIII y factor IX producidos en forma recombinante . El tratamiento con los concentrados del factor VIII o factor IX ha llevado a una vida normal de los pacientes con hemofilia. Sin embargo, un cierto porcentaje de los pacientes con hemofilia A desarrollan anticuerpos inhibitorios dirigidos contra el producto del factor VIII en infusión lo cual resulta en un efecto terapéutico dañado. En años recientes los productos recombinantes producidos en líneas celulares hámster han llegado a ser usados más frecuentemente. Sin embargo, algunos reportes pueden sugerir que estos productos provocan una incidencia superior de la formación de inhibidor que los derivados de plasma (Ettingshausen and Kreuz, 2006; Hay, 2006).

La forma naciente del factor VIII es una cadena sencilla de aproximadamente 300 kDa la cual consiste de dominios descritos como A1-A2-B-A3-C1-C2 (Gitschier et al., 1984; Toóle et al., 1984; Vehar et al., 1984; Wood et al., 1984) . La proteína sufre de procesamiento antes a la secreción en la sangre que resulta en una cadena pesada de aproximadamente 200kDa la cual consiste de los dominios A1-A2 y la mayor parte del dominio B y una cadena ligera de 80 kDa la cual consiste de los dominios A3-C1-C2 (aquí llamado factor VIII de longitud total) . El dominio B ha sido mostrado para ser dispensable para la actividad coagulante del factor VIII (Andersson et al., 1986; Brinkhous et al . , 1985; Pittman et al . , 1993). Por lo tanto, es posible usar el factor VIII con el dominio B eliminado en uso terapéutico para el tratamiento de la hemofilia A (Courter and Bedrosian, 2001) .

En la circulación sanguínea el factor VIII intacto está presente en un complejo fuerte con la proteína de masa molecular alta, el factor von Willebrand (vWF por sus siglas en inglés) . El vWF no es una enzima y por lo tanto no tiene actividad catalítica. Su función primaria es enlazar a otras proteínas, particularmente el factor VIII y es importante en la adhesión de plaquetas en sitios de heridas. El vWF es una proteína grande la cual consiste de múltiples monómeros con una masa molecular total hasta de 20,000 kDa . Como una proteína portadora del factor VIII en la circulación sanguínea vWF lo protege de la degradación proteolítica y por lo mismo incrementa la sobrevivencia in vivo del factor VIII. Adicionalmente , se ha sugerido que el enlace de vWF al factor VIII tiene un efecto protector contra el reconocimiento del factor VIII por el sistema inmunológico y por lo mismo resulta en un riesgo disminuido para desarrollo de anticuerpos de inhibición contra el factor VIII (Gensana et al., 2001; Rallas and Talpsep, 2001).

El factor VIII de longitud total es una proteína glicosilada pesada con 25 sitios potenciales para glicosilación N-enlazada, de los cuales la mayoría reside en el dominio B. Solamente seis de estos sitios son localizados dentro de los dominios A y C. Los datos previamente publicados muestran que cuatro de los sitios potenciales en los dominios A y C del factor VIII son glicosilados . Estos son Asn 41 y Asn 239 en la cadena pesada y Asn 1810 y Asn 2118 en la cadena ligera (Lenting et al., 1998, Sandberg et al., 2001). Trece sitios para glicosilación O-enlazada son encontrados en el factor VIII recombinante de longitud completa, la mayoría de ellos ubicados en el dominio B (Lenting et al., 1998). El factor VIII eliminado del dominio B, ReFacto®, es reportado para tener dos sitios substituidos con cadenas de carbohidrato O-enlazadas (Sandberg et al. 2001) .

Las proteínas humanas recombinantes son con mayor frecuencia expresadas en líneas celulares de murino. Esto significa que aunque se ha usado una construcción de gen humano para expresión, las proteínas tienen patrones de glicosilación de murino. Uno de esos ejemplos es el grupo de carbohidratos antigénico Galal-3Gal no ramificado, presente en proteínas recombinantes producidas de estas líneas celulares (Galili et al., 1985; Hokke et al., 1995). Sin embargo, este grupo de carbohidratos no está presente en glicoproteínas humanas nativas. Otro ejemplo es la composición de tipos de ácido siálico presentes. Las proteínas recombinantes derivadas de líneas celulares de murino han sido reportadas además de la forma principal del ácido siálico, ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac por sus siglas en inglés) , para también contener algo del porcentaje del ácido siálico antigénico, ácido N-glicolilneuram£nico (Neu5Gc por sus siglas en inglés) (Hokket et al., 1990) . Neu5Gc está normalmente ausente en proteínas humanas nativas debido a una mutación en el gen que codifica la enzima ácido CMP-N-acetil neuramínico hidroxilasa, pero presente en todas las otras glicoproteínas mamíferas (Chou et al., 2002). Sin embargo, Neu5Gc ha sido reportado para estar presente en células que crecen rápidamente como las células cancerosas humanas y en células embriónicas humanas (Kawashima et al., 1993; Marquina et al., 1996; Tangvoranuntakul et al., 2003).

La mayoría de los humanos han sido mostrados para tener anticuerpos circulantes tanto contra el epítopo Galocl-3Gal y el Neu5Gc .

Hoy en día, los productos del factor VIII humano recombinante para uso terapéutico son todos los derivados de líneas celulares de murino, lo cual significa que tienen un patrón de glicosilación de murino. De esta forma el grupo de carbohidratos antigénico, Galal-3Gal no ramificado, puede estar presente en el factor VIII producido de estas líneas celulares (Hironaka et al., 1993) . Sin embargo, este grupo de carbohidratos no está presente en el factor VIII humano derivado de plasma. Otro ejemplo es la presencia del ácido siálico antigénico el ácido N-glicolilneuratnínico en el factor VIII de las líneas celulares de murino.

Los métodos para producir la proteína del factor VIII recombinante en las líneas celulares humanas han sido descritos en la técnica anterior. La solicitud de los Estados Unidos de Norteamérica US-A-2006/099685 se relaciona a un proceso para la producción de una proteína del factor viII recombinante en células de retina embriónica humana que se enfoca en la importancia de las células para expresar por lo menos una proteína E1A adenoviral . Se dice que 1 proteína recombinante producida de acuerdo a este procedimiento es para tener un patrón de glicosilación humano diferente de la contraparte humana aislada.

La solicitud WO-A-2007/003582 proporciona un método para la transfección y producción de proteínas recombinantes humanas, en particular proteínas sanguíneas, en líneas celulares humanas bajo condiciones libres de suero y proteínas, transíectadas establemente con un vector específico que porta el gen que codifica para la proteína de interés .

La solicitud de patente de los Estados Unidos de Norteamérica US-A-2003/0077752 se relaciona a proteínas glicosiladas las cuales tienen actividad del factor VIII humano. El patrón de glicosilación de este producto contiene ácido siálico alfa- (2 , 6) -enlazado y biseccionar N-acetilglucosamina enlazada a un núcleo de beta-manosa.

La solicitud de patente Europea EP-A-0774261 describe complejos del factor VIII y vWF y su valor terapéutico .

B. Mei en Molecular Biotechnology Volumen 34, 2006, 165-178; V. Picanco-Castro et al., en Genetics and Molecular Research 7 (2):314-325 (2008); M-H. Rodríguez, British Journal of Haematology, 127, 568-575; G-Ch. Gil, Glicobiology vol . 18 no. 7, pág . 526-539 así como también la solicitud WO-A-2008/092643 describe la producción del factor IX recombinante o factor VIII en células humanas.

Puede ser deseable con un producto del factor VIII humano recombinante y producto del factor IX humano recombinante con un patrón de glicosilación humano con el fin de minimizar la inmunogenicidad de la proteína recombinante cuando se usa en terapia.

Sumario de la Invención La presente invención se relaciona a una proteína del factor VIII o IV humano recombinante la cual tiene un patrón de glicosilación similar al humano. La proteína es carece del ácido siálico, ácido N-glicolilneuramínico, y/o el grupo carbohidrato Galoc-3Gal. La proteína también muestra un mejor enlace para el factor von illebrand que una proteína recombinante correspondiente producida en una línea celular no mamífera. El patrón de glicosilación humano puede tener un impacto benéfico en la proteína cuando se usa en terapia ya que puede mejorar las propiedades funcionales y/o disminuir la inmunogenicidad.

La invención también se relaciona a una proteína del factor VIII humano recombinante la cual tiene un patrón de glicosilación humano en donde la proteína muestra un mejor enlace al factor von Willebrand que una proteína recombinante correspondiente producida en una línea celular no mamífera.

Modalidades adicionales serán aparentes a partir de la siguientes descripción y las reivindicaciones anexas incorporadas en la presente en su totalidad.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es un diagrama que muestra los sensogramas para los dos minutos de inyección de 1 IU FVIII:C/ml de tres lotes de rhFVIII humano-cl y rhFVIII X murino-cl y rhFVIII murino-cl entre una superficie vWF. Todas las inyecciones son realizadas por triplicado. Para claridad solamente una inyección para cada molécula FVII es mostrada. Todas las respuestas son normalizadas a la respuesta de la molécula VIII la cual tiene la respuesta más alta en el final de la inyección.

La Figura 2 es un diagrama el cual muestra respuestas normalizadas con desviaciones estándar 10 segundos después del final de la inyección de 1 IU/ml de los diferentes productos rhFVIII. La barra rhFVIII humana- el representa las respuestas promedio para los tres lotes rhFVIII humanos-cl. Todas las respuestas son normalizadas a la respuesta de la molécula FVIII la cual tiene la respuesta más alta 10 segundos después del final de la inyección.

Descripción Detallada de la Invención Antes de que se describa la presente invención, se entiende que la terminología empleada en la presente es usada para el propósito de describir modalidades particulares solamente y no se propone para ser limitante, ya que el alcance de la presente invención será limitada solamente por las reivindicaciones anexas y equivalentes de las mismas.

Debe notarse que, como se usa en esta especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un, una, uno" y "el, la" incluyen las referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa.

También, el término "aproximadamente" es usado para indicar una desviación de +/- 2% del valor dado, preferentemente +/- 5%, y más preferentemente +/- 10% de los valores numéricos, donde sea aplicable.

En el contexto de la presente invención el término "que carece de" significa sin un rasgo o características no detectables con métodos cromatográficos líquidos estándar, como, pero no limitados a, HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio de aniones de alta resolución con detección amperométrica por impulsos) .

En el contexto de la presente invención el término "ácido siálico" se relaciona a cualquier miembro de una familia de azúcares carboxilados de nueve carbonos. El miembro más común de la familia del ácido siálico es ácido N-acetil-neuramínico (ácido 2-ceto-5-acetamido-3 , 5-dideoxi-D-glicero-D-galactononulopiranos-l-ónico (con frecuencia abreviado como Neu5Ac, NeuAc o NANA) . Un segundo miembro de la familia es ácido N-glicolil-neuramínico (Neu5Gc o NeuGc) , en el cual el grupo N-acetilo de NeuAc es hidroxilado.

En el contexto de la presente invención el término "afinidad" se relaciona al fenómeno donde ciertos átomos o moléculas tienen la tendencia para agregarse o enlazarse. La constante de disociación de equilibrio (KD) es usada comúnmente, por ejemplo, para describir la afinidad entre un ligando y una proteína, es decir cómo enlaza fuertemente un ligando a una proteína particular. La KD tiene unidades molares (M) , lo cual corresponde a la concentración del ligando en el cual el sitio de enlace en una proteína particular es ocupada en la mitad, es decir la concentración del ligando, en la cual la concentración de la proteína con el enlace de ligando, iguala la concentración de la proteína sin enlace de ligando. Entre más pequeña la KD, más fuerte se enlaza el ligando, o mayor es la afinidad entre el ligando y proteína. Por ejemplo, un ligando con un nanomolar (nM) ¾ enlaza más fuertemente a una proteína particular que un ligando con un micromolar (uM)KD.

En el contexto de la presente invención el término "capacidad de enlace" se relaciona al grado al cual el factor VIII humano recombinante puede enlazar al factor von Willebrand (v F) , es decir este se relaciona al número de moléculas del factor VIII en un producto con la capacidad para enlazar a vWF. La capacidad de enlace puede ser estimada por métodos bien conocidos en la técnica para una persona experta en la técnica.

En el contexto de la presente invención el término "línea celular humana inmortalizada" se refiere a células humanas que no son células primarias tomadas directamente de un organismo. En particular se refiere a cultivo celular permanentemente establecido que proliferará indefinidamente dado el medio fresco y espacio apropiados, y de esta forma ha escapado al límite Hayflick (es decir el número de veces que una célula se dividirá antes de que se detenga debido a que el telómero alcanza una longitud crítica) .

La presente invención proporciona una nueva glicoproteína del factor VIII y/o IX humano recombinante. La proteína del factor VIII y/o IX producida en forma recombinante de la presente invención se produce en una línea celular humana lo cual significa tendrá un patrón de glicosilación similar al humano. De esta forma, la persona experta puede esperar que el factor VIII y/o IX humano muestre un patrón de glicosilación humano.

Sin embargo, se ha encontrado sorpresivamente que la proteína del factor VIII y/o factor IX producido en forma recombinante de la presente invención carece del ácido siálico antigénico el ácido N-glicolilneuramínico y/o el grupo carbohidrato antigénico Gala-3Gal. Ya que las células cancerígenas humanas o células fetales humanas que crecen rápidamente han sido encontradas para expresar el ácido N-glicolilneuramínico es esperado que la proteína del factor VIII y/o IX producido en forma recombinante pueda tener el ácido N-glicolilneuramínico ya que son producidos en una línea celular fetal inmortalizada humana. Esta característica y/o la carencia del grupo carbohidrato antigénico Gala-3Gal y el patrón de glicosilación humano total de la proteína del factor VIII y/o del factor IX recombinante será esperado para tener un impacto benéfico en el producto ya que disminuye la inmunogenicidad y también mejora las propiedades funcionales de la proteína. Una de las propiedades del factor VIII recombinante es mejor enlace al factor von Willebrand (vWF) .

En una modalidad la presente invención se relaciona a una proteína del factor VIII o IX recombinante el cual tiene un patrón de glicosilación humano y que carece del ácido N-glicolilneuramínico antigénico y/o Galal-3Gal.

En otra modalidad la presente invención se relaciona a una proteína del factor VIII recombinante que carece de ácido N-glicolilneuramínico antigénico y/o Galocl-3Gal que muestra un mejor enlace al v F que aquel de la proteína del factor VIII recombinante producida en células mamíferas no humanas, por ejemplo pero no limitado a, células de murino, como las células de ovario de hámster Chino (CHO por sus siglas en inglés) y células de riñon de hámster bebé (BHK por sus siglas en inglés. Mejor enlace se relaciona a la afinidad al vWF humano que es superior a aquel del factor VIII recombinante producido en células mamíferas no humanas. En una modalidad particular, la afinidad al vWF es por lo menos aproximadamente 10-60% superior, preferente y aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50% ó 60% superior a aquel del factor VIII recombinante producido en células mamíferas no humanas .

La afinidad puede también ser estimada por la constante de disociación de equilibrio (KD) . De esta forma, en aún otra modalidad de la presente invención la afinidad entre la proteína recombinante y vWF tiene una KD inferior que el factor VIII producido en células mamíferas no humanas, por ejemplo pero no limitado a, células de murino, como las células de ovario de hámster Chino (CHO) y células de riñon de hámster bebé (BHK) .

Además, mejor enlace a vWF también se relaciona a la capacidad de enlace. De esta forma, la presente invención también se relaciona a la glicoproteína del factor VIII producida en forma recombinante la cual tiene una capacidad de enlace a vWF que es superior que aquella del factor VIII recombinante producido en células mamíferas no humanas, por ejemplo pero no limitado a, células de murino, como las células de ovario de hámster Chino (CHO) y las células de riñon de hámster bebé (BHK) . En una modalidad particular, la capacidad de enlace a vWF es por lo menos aproximadamente 10-60% superior como se prueba en el mismo experimento, preferente y aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50% o 60% superior a aquel del factor VIII recombinante producido en células mamíferas no humanas.

La proteína del factor VIII recombinante de acuerdo a la invención que carece del ácido siálico antigénico de ácido N-glicolilneuramínico y/o el grupo carbohidrato Gala-3Gal antigénico está en una modalidad un derivado de eliminación del factor VIII nativo, parcial, o enteramente que carece del dominio B del factor nativo VIII. En una modalidad el domino B eliminado es reemplazado por un péptido enlazador, el cual comprende 10 a 25, preferentemente 14 a 20 residuos de aminoácidos. Para más detalles acerca del derivado de eliminación del dominio B y el enlazador ver la solicitud WO-A-01/70968 y O-A-2007/003582 , las cuales son incorporadas en la presente en su totalidad.

De esta forma, la presente invención se relaciona a una glicoproteína del factor VIII recombinante la cual tiene un patrón de glicosilación similar al humano y que tiene un mejor enlace al vWF humano que aquel del factor VIII recombinante producido en células mamíferas no humanas, por ejemplo, pero no limitado a, células de murino como las células de ovario de hámster chino (CHO) y células de riñon de hámster de bebé (BHK) . El mejor enlace a vWF se relaciona a la afinidad al vWF y la capacidad de enlace como se define anteriormente .

En una modalidad la proteína recombinante la cual tiene un patrón de glicosilación similar al humano y mejor enlace al vWF humano que aquel del factor VIII recombinante producido en células de mamífero no humanas es un derivado de eliminación del factor VIII nativo, que carece parcial o enteramente del dominio B del factor VIII nativo. En una modalidad el dominio B eliminado es reemplazado por un péptido enlazador, el cual comprende 10 a 25, preferentemente 14 a 20 residuos de aminoácidos. Para más detalles acerca del derivado de eliminación del dominio B y el enlazador ver las solicitudes WO-A-01/70968 y WO-A-2007/003582 , las cuales son incorporadas en la presente en su totalidad.

La glicoproteína del factor VIII y/o IX humano recombinante como se define anteriormente es producido preferentemente en una línea celular humana, preferentemente una línea celular humana inmortalizada. Ejemplos no limitantes de las líneas celulares son riñon, vejiga, hígado, pulmón, músculo cardiaco, músculo liso, ovario, retina, líneas celulares nerviosas y gastrointestinales.

En una modalidad particular la proteína inventiva es producida en una línea celular de riñon embriónica humana inmortalizada (HEK por sus siglas en inglés) . Ejemplos no limitantes de las líneas celulares son HEK293 (ATCC CRL-1573 DSM ACC 305; ECACC ref : 85120602); HEK293T (ATCC CRL 11268; DSM ACC 2494) y HEK293F (Invitrogen R79007) . En una modalidad particular la línea celular humana es HEK293F (Invitrogen R79007) .

En aún otra modalidad la presente invención se relaciona a una proteína recombinante como se define anteriormente la cual tiene menor inmunogenicidad comparada con la proteína del factor VIII o IX recombinante humano producida en una línea celular no humana, por ejemplo pero no limitado a, células de murino como las células de ovario de hámster Chino (CHO) y las células de riñon de hámster bebé (BHK) .

La presente invención también se relaciona a una composición farmacéutica la cual comprende la proteína inventiva como se define anteriormente en mezcla con un excipiente aceptable farmacéuticamente. La composición farmacéutica comprende la proteína del factor VIII o IX recombinante en una dosis terapéuticamente efectiva. La dosis y duración del tratamiento depende de la severidad de la deficiencia del factor VIII y/o factor IX, la ubicación y grado de sangrado, y la afección clínica del paciente. Los pacientes individuales pueden variar en su respuesta al factor VIII y factor IX, logrando diferentes niveles de la recuperación in vivo y demostrando diferentes vidas medias. Las dosis administradas deben ser tituladas a la respuesta clínica del paciente por un practicante experto dentro de la técnica. En la presencia de un inhibidor, pueden ser requeridas dosis superiores o tratamiento específico apropiado. El número de unidades del factor VIII o factor IX administrado es expresado en las unidades internacionales (IU por sus siglas en inglés) , lo cual se relaciona al estándar WHO actual para los productos del factor VIII o IX. La actividad del factor VIII en el plasma es expresado ya sea como un porcentaje (con relación al plasma humano normal) o en unidades internacionales (con relación al estándar internacional para el factor VIII en plasma) .

Una unidad internacional (IU por sus siglas en inglés) de la actividad del factor VIII corresponde aproximadamente a la cantidad de la actividad del factor VIII en un mi de plasma humano normal. El cálculo de la dosis requerida del factor VIII es en base al descubrimiento empírico que 1 IU, del factor VIII por kg de peso corporal incrementa la actividad del factor VIII de plasma por aproximadamente 2 IU/dl.

La dosis a ser administrada y la frecuencia de aplicación en tratamiento de hemofilia A es dependiente de la efectividad clínica en el paciente individual. La dosis profiláctica usual es 20-40 IU/kg de peso corporal cada 2-3 días.

En una modalidad la invención se relaciona a un método para el tratamiento de un trastorno asociado al factor VIII y/o factor IX, como la hemofilia A y hemofilia B, en donde una proteína recombinante como se define anteriormente es administrada junto con un excipiente aceptable farmacéuticamente en una cantidad aceptable terapéuticamente. Los excipientes aceptables farmacéuticamente son bien conocidos para una persona experta en la técnica.

La presente invención también se relaciona al uso de una proteína recombinante como se define anteriormente para el tratamiento del desorden asociado al factor VIII y/o factor IX, como la hemofilia A y hemofilia B. La proteína recombinante de acuerdo a la invención puede ser administrada con métodos estándar en este campo de terapia, como, pero no limitado a, inyecciones e infusiones, subcutánea o intravenosamente.

En otra modalidad, la presente invención se relaciona al uso de una proteína recombinante como se define anteriormente para fabricar un medicamento para el tratamiento de un trastorno asociado al factor VIII y/o factor IX, como la hemofilia A y hemofilia B. El medicamento puede ser administrado con métodos estándar en este campo de terapia, como, pero no limitados a, inyecciones e infusiones, subcutánea o intravenosamente.

En aún otra modalidad, la presente invención se relaciona a un complejo entre la proteína como se define anteriormente y el factor von Willebrand en donde la proteína es el factor VIII recombinante . El complejo tiene una afinidad de enlace mejorada entre la proteína inventiva y vWF que lleva a una sobrevivencia del factor recombinante VIII in vivo.

La presente invención será ahora además descrita en los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 Una proteína del factor VIII eliminado del dominio B humano, el factor VIII humano recombinante de la línea celular humana (rhFVIII humano-cl) es producida en HEK293F de la línea celular humana de acuerdo al proceso descrito en EP-A-l 739 170 (Schróder et al., 2007b; Schróder et al., 2007a). El proceso de purificación consiste de cinco etapas cromatográficas y genera una proteína del factor VIII altamente puro (Winge et al., 2008) .

Los ácidos siálicos de la proteína del factor VIII purificado (400-600 µg) del cual 10 µg de ácido cetodeoxinonulosónico (KDN; estándar interno) ha sido agregado son hidrolizados en ácido usando ácido clorhídrico 0.1 M (80°C por 1 hora). Los productos son purificados usando la cromatografía de intercambio de cationes Dowex y la solución resultante es liofilizada, resuspendida en agua y analizada por HPAEC-PAD. Una mezcla estándar la cual contiene 5 9 cada uno de Neu5Ac y NeuGc y 10 µ9 de KDN y un reactivo testigo con 10 µ9 de KDN son hidrolizados y analizados en paralelo con las muestras.

Las tablas 1 y 2 muestran los resultados del análisis de Neu5Ac y NeuGc de dos muestras A y B de rhFVIII humano -el. Es mostrado que el NeuGc tipo ácido siálico no es detectable. Solamente se encontró Neu5Ac .

Tabla 1. Cuantificación por HPAEC-PAD de ácido N- acetilneuramínico (Neu5Ac) y ácido N-glicolilneuramínico (NeuGc) liberado por ácido de rhFVIII.

Ej emplo Neu5Ac NeuGc Nmoles/ml Nmoles/ml Mezcla estándar de 16 15 5 µ9 Neu5Ac y 5 µ9 de NeuGc RhFVIII humano-el, No detectado muestra A, alícuota 1 RhFVIII humano-el, 11 No detectado muestra A, alícuota 2 RhFVIII humano-el 13 No detectado muestra A, alícuota Tabla 2. Cuantificación por HPAEC-PAD de ácido N- acetilneuramínico (Neu5Ac) y ácido N- glicolilneuramínico (NeuGc) liberado por ácido de rhFVIII Ej emplo Neu5Ac NeuGc Nmoles/ml Nmoles/ml Mezcla estándar de 16 15 5 µ<3 de Neu5Ac y 5 µ9 de NeuGc RhFVIII humano-cl, 8 No detectado muestra B, alícuota 1 1 RhFVIII humano-cl, 8 No detectado muestra B, alícuota 2 Ejemplo 2 El enlace de rhFVIII humano -el al factor de von Willebrand humano es analizado usando resonancia de plasmón superficial con el instrumento Biacore 3000. Los productos X y Y del factor VIII recombinante derivado de líneas celulares de murino (rhFVIII X y Y) murino-cl son usados como comparadores.

El factor de von Willebrand es inmovilizado a través de las aminas primarias al dextrano carboximetilado de un chip detector CM5. Los datos de enlace son fijados globalmente a un modelo de interacción simple el cual produce los parámetros cinéticos y afinidades. Las cinéticas en enlace y afinidad al factor von Willebrand son analizadas. Adicionalmente , se obtiene una medición cuantitativa de la capacidad de rhFVIII humano-cl para enlazar al factor de von Willebrand en comparación con otros productos del factor VIII recombínate.

La tabla 3 posterior muestra los parámetros cinéticos y afinidades obtenidas por rhFVIII humano-cl en comparación con los productos X y Y rhFVIII de murino-cl. Se muestra que rhFVIII humano-cl tiene significativamente superior afinidad, aproximadamente 50-60%, a un factor de von Willebrand que los productos rhFVIII murino-cl.

La tabla 3. parámetros cinéticos y afinidades de la interacción entre el factor rhFVIII humano-cl y factor de von Willebrand en comparación con rhFVIII X y Y de murino-cl.

Parámetro cinético Afinidad Proteína Kon.lO^M^.S"1) Koff .10"4 (S-1) KD (pM) rhFVIII (n=27) 4.5±0.3 9.5+1.2 210 Human-el RhFVIII 3.3±0.4 10.5±0.2 320 murino-cl X (n=6) RhFVIII 3.1+0.2 10.5±0.7 340 murino-cl (n=3) N=número de análisis de enlace Las Figuras 1 y 2 muestran los resultados de medición cuantitativa de la capacidad de rhFVIII humano-cl para enlazar al factor von Willebrand en comparación con los productos X y Y de rhFVIII de murino-cl. Cada producto FBI es inyectado por dos minutos entre la misma superficie con factor de von Willebrand inmovilizado en una concentración de una unidad internacional de la actividad del factor VIII por mi. El resultado indica que una porción mayor significativamente (aproximadamente 40% más) de rhFVIII humano-cl puede enlazar al factor von Willebrand que es el caso para los productos de rhFVIII de murino-cl.

Aunque modalidades particulares han sido descritas en la presente en detalle, esto se hizo en forma de ejemplo para propósitos de ilustración solamente, y no es propuesto para ser limitante con respecto al alcance de las reivindicaciones anexas que siguen. En particular, se contempla por el inventor que varias substituciones, alteraciones y modificaciones pueden ser hechas a la invención sin alejarse del espíritu y alcance de la invención como se define en las reivindicaciones.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una proteína del factor VIII o IX humano recombinante caracterizada porque tiene un patrón de glicosilación similar al humano pero la proteína no tiene el ácido N-glicolilneuramínico y/o el grupo carbohidrato Galot-3Gal.

2. La proteína recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína es el factor VIII y es un derivado de eliminación del factor VIII nativo, parcial o que totalmente carece del dominio B del factor VIII nativo.

3. La proteína recombinante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el dominio B eliminado parcial o totalmente es reemplazado por un péptido enlazador, el cual comprende 10 a 25, preferentemente 14 a 20 residuos de aminoácidos.

4. La proteína recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque la proteína es el factor VIII recombinante y tiene una afinidad para el factor von Willebrand que es superior que aquella del factor recombinante VIII producido en células mamíferas no humanas, en particular en células de murino.

5. La proteína recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque la proteína es el factor VIII recombinante y tiene una capacidad de enlace al factor von Willebrand que es superior que aquella del factor recombinante VIII producido en células mamíferas no humanas, en particular en células de murino.

6. La proteína recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína es el factor VIII recombinante y tiene una afinidad al factor von Willebrand que es superior a aquella del factor recombinante VIII producido en células mamíferas no humanas, en particular en células de murino.

7. La proteína recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la proteína es el factor VIII recombinante y tiene una capacidad de enlace al factor von Willebrand que es superior a aquella del factor recombinante VIII producido en células mamíferas no humanas, en particular en células de murino.

8. La proteína recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 y/o 7, caracterizada porque la proteína es el factor VIII y es un derivado de eliminación del factor VIII nativo, que carece parcial o totalmente del dominio B del factor VIII nativo.

9. La proteína recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el dominio B parcial o totalmente eliminado es reemplazado por un péptido enlazador, el cual comprende 10 a 25, preferentemente 14 a 20 residuos de aminoácidos.

10. La proteína recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la proteína es producida en una línea celular humana, en particular una línea celular inmortalizada seleccionada del grupo el cual consiste de riñon, vejiga, hígado, pulmón, músculo cardiaco, músculo liso, ovario, retina, líneas celulares nerviosas y gastrointestinales.

11. La proteína recombinante de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la línea celular humana es una línea celular de riñon embriónica humana (HEK) , en particular seleccionada del grupo el cual consiste de HEK 293 (ATCC CRL-1573; DS ACC 305; ECACC ref: 85120602) y 293F (Invitrogen R79007)

12. La proteína recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque se obtiene al producir la proteína en una línea celular embriónica humana (HEK) seleccionada del grupo el cual consiste de HEK 293 (ATCC CRL-1573; DSM ACC 305; ECACC ref: 85120602) y 293F (Invitrogen R79007) .

13. El uso de una proteína recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para el tratamiento de un trastorno asociado al factor VIII y/o factor IX.

14. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende la proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12 y un excipiente aceptable farmacéuticamente en una cantidad efectiva terapéuticamente.

15. Un complejo del factor VIII recombinante caracterizado porque es de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12 y el factor de von illebrand.