CN1300324A - 杀配子剂草甘膦 - Google Patents

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Abstract

草甘膦被用作对植株的高选择性杀配子剂,所述植株基因组中包含带来组成型草甘膦耐受性的一种第一DNA分子和在雄性生殖组织中特异抑制所述草甘膦耐受性的一种第二DNA分子。通过暴露给草甘膦使得包含第一和第二DNA分子的植株雄性不育。本发明的方法和组分物有利于在杂交种子的产生中使用,用于限制异型杂交和用于延长花期。

Description

杀配子剂草甘膦
本发明一般涉及植物基因工程领域。更详细而言，本发明涉及用草甘膦除草剂选择性诱导出雄性不育表型的转基因植物。本发明所述植物具有草甘膦营养耐受性和雌性耐受性，但对该除草剂为雄性敏感。本发明的方法和组合物提供用于杂交种子生产、用于使不希望产生的农作物异型杂交最小化以及用于延长花期的雄性不育植株。
植物生物学家始终认为，近亲植物的异体受精可产生具有所需联合性状的后代，而近交双亲则不具有这些性状。在主要农作物物种中均出现过这种被称为杂种优势或杂合优势的现象(Stuber,1994)。由于这种杂交种子产生的植株可具有非常优越的农作物性能特征，如植株大小、谷粒产量、抗病性、除草剂耐受性、气候适应性等，因此开发该方法用于农作物商品化生产具有很大的利益。杂交品种对全世界的食品生产已产生了巨大的影响，它有极大的潜力来为增长的世界人口提供高产量的农作物植株。
生产杂交种子的要求是异体授粉相对自体授粉要占优势，目前已开发出多种试图克服自体授粉障碍的技术。但是对大多数农作物物种而言，杂交种子生产的主要限制是缺乏简单可靠并且经济的方法来产生雄性不育体，同时保持雌性配子完整且易于被适当花粉供体授粉。
导致雄性不育的方法可大致分为物理方法、化学方法和/或生物方法。在诸如玉米等某些植物中，物理去除含有雄性配子的器官相对而言比较简单，因为该器官不但暴露在外，而且在空间上与雌性配子相分离。但大多数农作物物种在同一朵花中既含有功能性雄性器官又含有功能性雌性器官，使得去雄既不简单也不直截了当。物理方法导致雄性不育一般为劳动高密集型，并且代价昂贵。此外，利用这些方法很难保证能完全避免自体授粉。因此，开发出无需费力地手工或机械去雄的替代方法将能够大大改善生产的基本成本。
除物理方法导致雄性不育外，还可在杂交种子生产中使用化学杀配子剂，以通过抑制可育花粉的产生来获得暂时雄性不育体。有效的杀配子剂是在适当发育阶段或在性成熟之前施加于一种植物时可杀死植物的雄性配子或有效终止其发育，同时保留植物中能够进行异花授粉的雌性配子或至少其主要部分的化合物。对一种有效的杀配子剂而言，期望破坏雄性配子的施加量要显著低于破坏雌性配子所需的量。因此，杀配子剂应能够在无需格外预防偶尔用药过量的情况下施加于田间。
利用杀配子剂商业化生产杂交种子的主要限制是它们一般对配子缺乏选择性，尤其是对雄性配子。有多种化合物能够破坏或损伤植物的雄性配子；事实上几乎任何***性除草剂都具有该方面的作用。但这些化合物的大多数会同时杀死雌性配子和植物的营养组织。遗憾的是，那些在定向于配子方面确实具有一定选择性并且其程度远高于营养组织的化合物一般又不能分辨所破坏的配子的性别。此外，许多显示出良好选择性的化学杀配子剂具有毒理学问题或其它环境问题，这使它们在杂交种子商业化规模生产中的应用受到了限制。因此，能够改善杀配子剂选择性及环境安全性的方法将会在杂交种子生产中得到广泛的应用。
目前已将一些自然发生的雄性不育遗传机制应用于某些植物物种的杂交种子生产。在很多情况下是通过阻滞花粉的发育和/或阻滞滋养花粉粒并在适当时间释放成熟花粉的花药组织的发育来产生雄性不育。目前已在某些植物物种中成功地采用了使用CMS***的杂交策略。该方法的缺点是它需要三种不同的品系来产生单交叉杂种：雄性不育系(母本)、与雄性不育系基因相同但含有全功能线粒体的保持系、以及父本系。
许多CMS类型具有限制其应用的不利特性；其中包括连锁的或多效性的不良特性如疾病易感性、不育性衰竭、不一致性和/或综合遗传的可育性恢复。此外，CMS在许多重要的农作物物种中无法使用，并且CMS细胞质无法在不同核遗传背景下的某个物种中均造成完全不育。在广泛使用CMS进行杂交种子生产的那些物种中存在对单一不育细胞质的依赖性，这种依赖性十分危险(Williams和Levings,1992)。由T属Helminthosporium maydis引起的南方玉米大斑病可利用胞质性雄性不育T细胞质对所有玉米杂种进行剧烈攻击，这表明了过于依赖单一来源雄性不育细胞质的杂交种子行业的脆弱性。
遗传工程具有提供目前所用杂交种子生产方法的经济的替代方法的潜力，由此为农业生产力做出巨大贡献(Williams,1995)。例如，细胞毒素蛋白编码基因的选择性表达可产生单一的雄性不育植株群体。举一个例子，利用烟草绒毡层特异启动子在花药绒毡层细胞中对细胞毒素芽孢杆菌RNA酶基因进行表达可导致雄性不育，当与含有驱动芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因表达的绒毡层特异启动子的植株杂交时，后代的雄性不育可得到复原(Marini等，1990；Zhan等，1996)。这种芽孢杆菌RNA酶/芽孢杆菌RNA酶抑制剂的基因联合已被用来去除特定类型的花药细胞，这些细胞用于鉴别花药成熟和花粉释放所需的细胞类型(Goldberg等，1995；Beals和Goldberg,1997)。
利用花药特异启动子在花药中表达时可对花粉形成产生细胞毒性作用的DAM-甲基化酶的表达已作为一种由基因工程导致雄性不育的方法被公开(WO9617945)。
用于产生雄性不育植株的反义RNA策略也已进行了尝试。目前认为，与决定花药或花粉正常生长和发育的内源基因互补的RNA的表达是通过，例如，由于与花粉或绒毡层细胞中的天冬氨酸激酶反义而抑制一种必需氨基酸的表达(EP93109226)，或抑制玉米中QM基因的表达(美国专利号5,583,210)来发挥作用的。Fabijanski和Arnison(美国专利号5,356,799)提出一种涉及使用抗生素抗性基因或除草剂抗性基因的反义RNA策略，但未能证明该种方法可成功应用于雄性不育植株的产生。另有报导，花粉或相关细胞中诸如ATPase(Zabaleta等，1996)等代谢活性酶的表达也可导致雄性不育。遗憾的是，这些方法大多实用性有限，因为恢复可育性需要杂交，而由育种系产生种子仍存在问题。
异型杂交是指通过花粉传播将遗传信息散布到相关植株。这对经遗传修饰的植株而言常被视为是不受欢迎的。转基因植物与相关野生型植物物种的异型杂交引起人们对杂草生长的关注，这些杂草由于可通过新基因表达获得选择优势，从而更加强壮。试图将具有昆虫抗性、病毒抗性、真菌抗性、除草剂抗性等抗性的植物商品化的种子公司都必须为政府管理机构和环境利益集团解决这些性状同相关植物物种异型杂交的问题。人们已就此举办了多次会议及专题研究会来讨论这些问题(Serratos等，1997)。问题的范围从杂草增加直到减少相关野生型亲属的生物多样性。
来自作为传统农业育种产品的农作物的基因流动对其杂草亲属的杂草性状起了很大的作用。其实例包括：甜菜、御谷、稻和黑麦。由于缺乏控制花粉产生的有效方法，使控制基因流动至这些相关野生型物种的能力受到了限制，其结果是，如果这些基因确实从栽培植株扩散至相关野生型物种，那么将无法限制这些基因的扩散。因此，在植物生物技术领域还有一种要求未得到解决，即选择性阻碍花粉产生以限制重组遗传物质扩散的方法，同时还要提供一种手段来选择性对抗已获得该遗传物质的野生型植株亲属。
为居住及商业环境提供花坛植物的园艺行业将对可更长时间维持花瓣和/或色彩的花卉产生极大的兴趣。花经授粉后将很快衰退。因此，阻碍授粉将使产生艳丽花卉的多种花坛植物的使用寿命延长数天或数星期。作为其重要性的一个实例，园艺行业目前正支持一项使百合花雄性不育，以此来保持花的外壳并使污染外被和组织的百合花花粉无法产生的育种计划。在天竺葵等植物物种中实现类似的雄性不育也将十分有益，因为这些植物早在授粉后2小时即出现花瓣凋落。花瓣凋落会使销售和作物商品化受到限制。一种可广泛用来减少这些及其它许多物种的花粉脱落并延长花卉的花瓣寿命的遗传工程方法将为园艺行业提供一种生产具有改良特性的产品的重要新工具。
N-膦酰甲基甘氨酸亦称为草甘膦，它是一种对广泛的植物物种均具有活性的公知的除草剂。Roundup_(Monsanto Co.)作为一种具有所需的短半寿期和环境安全性的除草剂，其活性成分即为草甘膦。当草甘膦被施加于植物表面时可移动至整个植株。草甘膦通过抑制为芳香族氨基酸合成提供前体的莽草酸途径而对植物产生毒性。更明确而言，草甘膦通过对5-烯醇丙酮基-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)的抑制来影响磷酸烯醇丙酮酸与3-磷酸莽草酸转化为5-烯醇丙酮基-3-磷酸莽草酸。
利用遗传工程在植物基因组中***一种引起野生型EPSPS更高水平产生的DNA分子，由此可能创造出草甘膦耐受植株。通过与草甘膦的亲合力更低从而施加草甘膦时亦可保持其催化活性的EPSPS变异体的表达也可实现草甘膦耐受性(美国专利号5,633,435)。在植物组织中降解草甘膦的酶(美国专利号5,463,175)也可以使细胞具有草甘膦耐受性。因此，这些基因使草甘膦耐受性转基因农作物得以产生，从而可将草甘膦应用于杂草的有效控制，同时对损害农作物的担心也降至最低。例如，已利用遗传工程将草甘膦耐受性引入玉米(美国专利号5,554,798)和小麦(Zhou等，1995)。
有关草甘膦作为化学杀配子剂的应用已有所描述(美国专利号4,735,649)。其中公开的内容有，草甘膦在理想条件下能够杀死约95％的雄性配子，同时保持约40-60％可受精的雌性配子。此外，在公开的应用水平上通常会观测到一种矮化效应，植物尺寸的减小和少量萎黄病即证明了这一点。因此，用草甘膦作为杀配子剂的主要缺点是由于缺乏对雄性配子的足够选择性而引起植物毒副作用，对大多数杀配子剂而言均是如此。
                             发明概述
从最广泛的意义上来讲，本文所述发明提供一种由除草剂诱导的选择性和加以调控地去除植物中特定类型细胞的方法。该方法涉及将至少两种不同的重组DNA分子***到植物细胞基因组中。第一DNA分子包含经操作按5’-3’方向连接的：
一种在植物细胞中促使第一RNA序列产生的第一启动子；
一种编码第一RNA序列的第一DNA序列，该RNA序列编码一种产生对***运输型除草剂，优选为草甘膦，的耐受性的蛋白；
一种在植物细胞中促使第一RNA序列3’端多腺苷酸化的第一3’非翻译区。
第一DNA分子所用启动子通常以组成型方式表达。在该方面有效发挥作用的适当启动子实例包括花椰菜花叶病毒19S启动子、花椰菜花叶病毒35S启动子、玄参花叶病毒35S启动子、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄色斑点病毒启动子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基启动子、稻胞质性丙糖磷酸异构酶启动子、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶启动子、稻肌动蛋白1启动子、甘露碱合酶启动子和章鱼碱合酶启动子。
本发明的第二DNA分子包含经操作按5’-3’方向连接的：
一种能够在植物细胞中促使第二RNA序列产生的第二启动子；
一种编码与第一RNA序列互补的第二RNA序列的第二DNA序列；
一种在植物细胞中促使第二RNA序列3’端多腺苷酸化的第二3’非翻译区。
第二DNA分子所用启动子不以组成型方式表达。相反，它具有一种更局限的表达模式，优选地局限于一种或多种雄性生殖组织。本发明的第二DNA分子所采用的优选启动子包括TA29烟草绒毡层特异启动子、PA1苯基苯乙烯酮二氢黄酮异构酶启动子、PA2苯基苯乙烯酮二氢黄酮异构酶启动子、SLG启动子、LAT启动子、聚半乳糖醛酸外切酶启动子、Zmg13启动子、LAT52启动子、LAT59启动子和psgB6-1启动子。
本发明的第一DNA分子的表达可用来在其表达的那些组织中产生草甘膦耐受性。另一方面，第二DNA分子的表达引起产生一种RNA序列，该序列能够抑制由第一DNA分子表达所导致的草甘膦耐受性。第二DNA分子采用一种启动子，其只限制那些表达第一DNA分子的组织亚类的反义RNA产生，由此，只有表达第二DNA分子的组织亚类才会对草甘膦毒性敏感。因此，通过对植株施加草甘膦可选择性去除特定类型或联合类型的细胞，这将取决于所使用的启动子。
因此，作为本发明的一个方面则提供一种产生雄性不育植株的方法，该方法的步骤包括将本发明的第一和第二DNA分子***植物细胞基因组；获得含有第一和第二DNA分子的植物转化细胞；由植物转化细胞再生出转化植株；并将转化植株暴露于草甘膦。
作为本发明的另一方面则提供一种产生杂交种子的方法，该方法包括用雄性可育供体的花粉对公开的雄性不育植株实施异体受精；并收集异体受精后代的种子。
作为本方面的又一方面则提供一种产生杂交种子的方法，其中该种子能够生成已恢复雄性可育性并能够在施加草甘膦时保持可育的植株。包含本发明第一和第二DNA分子的雄性不育植株的产生如文中所述。只是本发明的该方面所采用的雄性可育花粉双亲在其基因组中含有一种第三DNA分子，该分子包含经操作按5’-3’方向连接的：
一种在植物细胞中促使第三RNA序列产生的第三启动子；
一种编码第三RNA序列的第三DNA序列，该RNA序列编码一种产生草甘膦耐受性的蛋白；
一种在植物细胞中促使第三RNA序列3’端添加多腺苷酸核苷酸的第三3’非翻译区；
其中第三DNA分子与第一DNA分子不同。
第三DNA分子的草甘膦耐受性基因在结构上与第一DNA分子的草甘膦耐受性基因无关。因此，第二DNA分子产生的反义或共抑制RNA分子能够与第一DNA分子产生的RNA杂交从而抑制其表达，但由于缺乏足够的互补性而不能与第三DNA分子的草甘膦耐受性基因杂交。作为选择，也可在第三DNA分子中使用与第一DNA分子所用相同或相似的草甘膦耐受性基因。但是在这种情况下，第一与第三DNA分子间仍存在一段可被第二DNA分子差异定向抑制的不同区域。
进一步提供的还有包含本发明所述第一、第二和/或第三DNA分子的植物转化细胞以及由其产生的植株。
在实施本发明时采用的优选植物包括，但并不局限于，玉米、小麦、稻、芸苔、燕麦、大麦、紫苜蓿、胡萝卜、棉花、油籽油菜(oilseedrape)、甜菜、向日葵、大豆、番茄、黄瓜和南瓜。
                            附图简述
以下附图构成该说明书的一部分，它们被用来进一步说明本发明的某些方面。通过参考一个或多个这些附图并结合文中提供的特定实施方案详述将能够更好地理解本项发明。
图1(序列标号：1)说明P-Ztap启动子的DNA序列。
图2(序列标号：2)说明矮牵牛花EPSPS内含子的DNA序列。
图3(序列标号：3)说明矮牵牛花EPSPS叶绿体转运肽的DNA序列。
图4(序列标号：4)说明矮牵牛花EPSPS内含子/矮牵牛花EPSPS叶绿体转运肽的DNA序列。
图5．pMON19470和pMON19437质粒图谱
图6．pMON19653和pMON19340质粒图谱
图7．pMON25232质粒图谱
图8．pMON25233质粒图谱
图9．pMON25234和pMON25235质粒图谱
图10．pMON25241质粒图谱
图11．pMON25258的构建
图12．pMON25259的构建
图13．pMON25260的构建
图14．玉米原生质体中与控制载体或反义载体共同电穿孔的CP4相对表达。
图15．小麦原生质体中与控制载体或反义载体共同电穿孔的CP4相对表达。
                         发明详述
重组DNA分子
DNA向mRNA的转录受基因中称为“启动子”的区域的调控。启动子区域包含的双链DNA序列对RNA聚合酶发出信号，使其与DNA有义链和反义链结合并以有义链为模板产生与DNA有义链互补的相应mRNA链。这种利用DNA模板产生mRNA的过程称为基因的“表达”或“转录”。
选定在本发明实施方案中使用的特定启动子应能够产生足够的表达，以便在第一DNA分子情况下产生草甘膦耐受性，而在第二DNA分子情况下则抑制草甘膦耐受性，其程度足以使组织对草甘膦毒性敏感。
第一DNA分子通常含有一种组成型启动子，即一种编码草甘膦耐受性酶的DNA结构序列，和一段3’非翻译区。对多种在植物细胞中发挥作用的组成型启动子已进行过描述。用于组成型表达第一DNA分子草甘膦耐受性的适当启动子包括，但并不局限于，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(Odell等，1985)、玄参花叶病毒(FMV)35S(Sanger等，1990)、甘蔗杆状病毒启动子(Bouhida等，1993)、鸭跖草黄色斑点病毒启动子(Medberry和Olszewski,1993)、来自核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO)的光诱导型启动子(Coruzzi等，1984)、稻胞质性丙糖磷酸异构酶(TPI)启动子(Xu等，1994)、Arabidopsis的腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)启动子(Moffatt等，1994)、稻肌动蛋白1基因启动子(Zhong等，1996)，以及甘露碱合酶启动子和章鱼碱合酶启动子(Ni等，1995)。所有这些启动子都曾用来创建各种不同类型的可在植物中表达的重组DNA构建体。通过大肠杆菌uidA(β-葡糖醛酸酶)基因等报告基因的表达已对这些和其它启动子进行了组成型启动子比较分析(Li等，1997；Wen等，1993)。
选定在第二DNA分子中使用的启动子要能够提供特殊表达以产生预期的细胞致死性。在优选实施方案中，启动子要能够专门或主要指导诸如花粉本身、花药绒毡层细胞层或花药组织发育至关重要的组织内的表达。
能够调控特定类型细胞和组织中基因表达的植物启动子已为人们所熟知。在本发明的实施方案中，那些最优选的启动子是在雄性生殖组织发育期间或能够在花粉中特异表达，并且其程度足以产生与第一DNA分子的组成型启动子转录出的有义RNA互补的抑制性RNA分子的启动子。这些启动子类型的实例包括TA29烟草绒毡层特异启动子(Mariani等，1990)、矮牵牛花的PA1及PA2苯基苯乙烯酮二氢黄酮异构酶启动子(van Tunen等，1990)、芸苔的SLG基因启动子(Heizmann等，1991)，和番茄的LAT基因启动子(Twell等，1991)。
稻的花药特异性启动子和花粉特异性启动子均已分离出来。其实例包括Osg6B启动子，据显示该启动子在转基因稻中驱动未成熟花药内的β-葡糖醛酸酶基因表达。在小穗、叶和根等其它组织中则未检测到活性(Yokoi等，1997)。据显示，稻的PS1花粉特异性启动子能够在稻的花粉中特异表达β-葡糖醛酸酶基因(Zou等，1994)。在稻的花药绒毡层中特异表达的其它稻基因也已确定(Tsuchiya等，1994；Tsuchiya等，1997)。主要于花药发育期间在稻中表达的其它基因的分离可通过，例如，构建cDNA文库以确定花药特异性克隆的方法加以实现(Qu等，1997)。
该领域的技术人员均了解从在花粉或涉及花粉产生的植物类细胞内高表达的基因或基因家族成员中分离启动子所使用的方法(Stinson等，1987；Brown和Crouch,1990；McCormick等，1989)。这些启动子的其它实例包括玉米的聚半乳糖醛酸外切酶基因启动子(Dubald，等，1993)和Zmc13 mRNA所用的启动子(Hanson等，1989)。已证明在番茄花粉中优先表达的启动子是LAT52启动子和LAT59启动子(Twell等，1991)。玉米pZtap启动子的全序列公开于序列标号：1。在美国专利号5,470,359中则公开了该序列的一部分(psgB6-1)。
本发明的重组DNA分子通常包含一段5’非翻译区、一种启动子、一段植物DNA内含子序列、一段编码叶绿体转运肽(CTP)的结构序列、一段草甘膦耐受性基因的DNA编码序列，和一段3’非翻译区。
5’非翻译前导序列可来源于表达异种DNA序列的选定启动子，并且在需要的情况下可经特异修饰以增加mRNA的翻译。5’非翻译区还可来自病毒RNAs、适当真核生物基因，或一段合成的基因序列。本发明并不局限于其中非翻译区来自带有启动子序列的5’非翻译序列的构建体。前导序列还可来自不相关的启动子或编码序列。
重组DNA分子的3’非翻译区包含一段能够在植物体内促使RNA3’末端添加腺苷酸核苷的多腺苷酸化信号。3’非翻译区可来源于各种能够在植物细胞内表达的基因。通常能够在该方面使用的有胭脂碱合酶3’非翻译区(Fraley等，1983)、豌豆ssRUBISCO的3’非翻译区(Coruzzi等，1994)、大豆75种子贮存蛋白基因的3’非翻译区(Schuler等，1982)以及豌豆ssRUBISCO的小亚基基因。含有土壤杆菌肿瘤诱导(Ti)质粒基因的多腺苷酸化信号的可转录3’非翻译区也同样适合。
适合于在单子叶植物中表达的植物内含子实例包括，例如，玉米hsp70内含子、稻肌动蛋白1内含子、玉米ADH1内含子、ArabidopsisSSU内含子、Arabidopsis EPSPS内含子、矮牵牛花EPSPS内含子和其它为该领域技术人员所公知的内含子。
适合于将草甘膦耐受性基因产物定向导入植物细胞叶绿体的CTPs实例包括矮牵牛花EPSPS CTP、Arabidopsis EPSPS CTP2内含子和其它为该领域技术人员所公知的CTPs。
草甘膦耐受性基因
目前已开发出多种可用来在转基因植物中表达异种DNA序列，下文通常指草甘膦耐受性基因或草甘膦耐受性编码序列，以使植物对除草剂草甘膦具有耐受性的方法。任何为技术人员所公知的这种草甘膦耐受性基因均适合于在本发明的实施中使用。
草甘膦抑制莽草酸途径，该途径引起包括氨基酸、植物激素以及维生素等芳香族化合物的生物合成。更明确而言，草甘膦抑制5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)。就本发明而言，术语“草甘膦”应被认为包括N-膦酰甲基甘氨酸的任何具有除草剂活性的形式(包括其任何一种盐)以及其它可在植物体内产生草甘膦阴离子的形式。
为提供草甘膦耐受性，有多种天然的和变异的EPSPS酶已在转基因植物中表达(Barry等，1992)，其中任何一种都可在本发明中使用。这些EPSPS的一些实例包括美国专利号4,940,835、4,971,908、5,145,783、5,188,642、5,310,667和5,312,910所描述的和/或分离的那些EPSPS，在此均引入作为参考。它们也可来自在结构上分属不同种类的非同种EPSPS基因，如亦在此引入作为参考的美国专利号5,633,435和5,627,061所描述的由土壤杆菌属菌株CP4分离的Ⅱ类EPSPS基因。作为选择，也可使用草甘膦降解酶来提供草甘膦耐受性，如使用一种在此引入作为参考的美国专利号5,312,910所描述的草甘膦氧化还原酶基因。
本发明的双链DNA分子可利用适当方法***植物的基因组内。植物转化的适当方法包括土壤杆菌介导的转化、采用可提高游离DNA摄取量的脂质体、电穿孔和化学制品、通过微射轰击提供游离DNA、利用病毒或花粉转化，等。
细胞(或原生质体)转化后，用于再生步骤的方法的选择并不是关键性的，可使用的规程有适用于豆科(紫苜蓿、大豆、三叶草等)宿主、伞形科(胡萝卜、芹菜、欧防风)宿主、十字花科(甘蓝、萝卜、油菜籽等)宿主、葫芦科(甜瓜、黄瓜)宿主、禾本科(小麦、稻、玉米等)宿主以及茄科(马铃薯、烟草、蕃茄、胡椒)宿主。
这些用于植物转化和再生的方法对该领域的技术人员而言已众所周知，并且能够很容易获得(例如，综述可参考Hinchee等，(1994)和Ritchie & Hodges(1993))。
雄性不育及杂交种子的产生
本发明的一项实施方案涉及一种用草甘膦作为杀配子剂来产生雄性不育植株的改进方法。由于缺乏足够高的对雄性配子的选择性，使草甘膦在该方面的有效使用以及一般杀配子剂的使用受到了限制，以防止对雌性配子和营养组织产生不必要的伤害。
本发明拓展了草甘膦耐受性基因的使用，再加上由RNA介导的对基因表达的组织特异性抑制(如，通过反义、共抑制、核糖酶等)，从而为草甘膦诱导雄性不育提供了一种改进方法。本文描述的技术基本上可应用于所有农作物物种，其中包括稻、小麦、燕麦、大麦、玉米等单子叶植物，也包括紫苜蓿、芸苔、胡萝卜、棉花、油籽油菜、甜菜、向日葵、大豆、番茄、黄瓜以及甜瓜、南瓜等双子叶植物以及其它。该方法可应用于多种观赏植物，以对其杂交种子的生产进行设计。
使人尤其感兴趣的两种农作物是玉米(Zea mays)和小麦(Triticumaesativum)。目前使玉米产生雄性不育的最常用方法是机械去雄，而对小麦的最常用方法是利用化学杀配子剂。本文描述的方法是用于这些农作物及其它农作物的杂交种子生产的一种有效而又经济的替代方法。
尽管组成型表达了由第一DNA分子编码的草甘膦耐受性酶，但为了使雄性生殖组织选择性地对草甘膦引起的毒性敏感而采用了一种第二DNA分子。第二DNA分子包含一种组织特异型启动子，该启动子专门或主要指导雄性生殖组织中促使一种RNA序列产生的DNA序列的表达。该RNA序列与第一DNA分子产生的RNA互补，并且能够与其杂交，从而通过反义机制或共抑制机制来阻碍第一DNA分子编码的蛋白的表达(例如见Schuch,1991；Bird,1991；Jorgensen,1990)。作为选择，该RNA也可编码一种经设计可裂解第一DNA分子产生的mRNA的RNA催化分子(即核糖酶)(例如见Gibson,1997；Steinecke,1994；Marrs,1995)。因此通过对第一DNA分子表达的组织特异性抑制，可使草甘膦耐受性以一种雄性特异性方式被选择性减弱。
第二DNA分子可定向于第一DNA分子的草甘膦抗性基因编码序列。作为选择，也可将第一DNA分子的其它区域作为目标，如内含子序列和/或CTP编码序列等。
技术人员都将承认，有多种方法可用来获得含有本发明第一及第二DNA分子的转基因植物。DNA分子可按照任何适当的方式和/或顺序引入植物，如同时引入、单独引入、顺序引入等。举例来说，在将第一和第二DNA分子单独引入以产生独立品系的情况下，可利用传统育种方法将两种植物品系杂交，并测定杂交后代中转基因的存在情况。对同时含有两种转基因的后代则可以进行自花授粉，并测定自花授粉后代中两种转基因的存在情况。测定两种基因均为纯合型的那些种群对雄性不育体和草甘膦营养耐受体施加草甘膦后的反应。显示出有效的草甘膦营养耐受性以及证实所需雄性不育水平的品系可进一步增殖。
作为选择，也可将包含第一DNA分子和第二DNA分子的表达盒容纳于同一质粒中，并将其作为单一DNA片段转化到植物细胞内。用草甘膦处理由这类转化细胞产生的再生植株，那些显示出所需草甘膦耐受性水平和所需雄性不育水平的植株利用野生型花粉授粉，并收集种子。使杂交种子发芽生长，并测定植株中两种基因的存在情况。阳性植株则进行自花授粉并收集种子。种植一部分收集的种子，测定两种基因的存在情况，并用草甘膦处理。对植株达到所需草甘膦耐受性及雄性不育水平的情况进行评定。种植同胞种子并增殖，以增加种子数量。
由包含本发明所述第一和第二DNA分子的转化植物细胞再生出的植株对草甘膦具有营养耐受性和雌性耐受性，但雄性对该化合物敏感。在不喷洒草甘膦时，植株正常生长并完全可育。这使品系维持能够简单地通过自花授粉来实现。当在本发明的植株上喷洒草甘膦时可导致完全雄性不育。
用于产生雄性不育植株的公开方法很容易地适用于杂交种子，其中包括已恢复可育性的杂交种子，的生产。因此，本发明的附加实施方案有关，提供一种产生杂交种子的方法，该方法包括首先由包含上述第一和第二DNA分子的转化植物细胞再生出植株，在无草甘膦的情况下通过栽培及自花授精来增加植株的数量，再将植株暴露于草甘膦以产生雄性不育植株，用适当供体的花粉进行异体受精，并收集异体受精后代的种子。在杂交种子的生产过程中，用草甘膦喷洒种子的双亲植株，并使其雄性不育，再利用雄性不育双亲的花粉进行授粉。因此，只要不施加草甘膦，由这种方法产生的杂交种子就会产生恢复雄性可育性的植株。由于上述原因，对含有本发明所述第一和第二DNA分子的杂交植株施加草甘膦将会导致其雄性不育。
在本发明的另一实施方案中提供一种产生杂交种子的方法，其中该种子能生成已恢复雄性可育性并在施加草甘膦时保持可育性的植株。雄性不育植株的产生如上文所述。但在该实施方案中，雄性可育双亲的花粉基因组中包含一种第三DNA分子，该分子含有一种组成型启动子和一段DNA结构序列，该序列可产生一种能够提供草甘膦耐受性的蛋白，其中所述耐受性基本不受第二DNA分子编码的RNA的影响。因此，该第三DNA分子能够，例如，在组成型启动子的调控下表达一种草甘膦耐受性基因，其中该基因提供草甘膦耐受性的能力不受第二DNA分子产生的反义RNA的影响。
第三DNA分子的草甘膦耐受性基因可在结构上独立(即，与第一DNA分子的草甘膦耐受性基因无显著同源性)。因此，第二DNA分子产生的反义或共抑制RNA分子能够与第一DNA分子产生的RNA杂交从而抑制其表达，但由于缺乏足够的互补性而不能与第三DNA分子的草甘膦耐受性基因杂交。适用于该实施方案的非同源草甘膦耐受性基因联合体包括，例如，Ⅰ类和Ⅱ类EPSPS(例如见，美国专利号5,633,435)、或在植物内表达时提供草甘膦耐受性但又充分非同源以致第二DNA分子抑制其中一个的表达但不抑制另外一个的其它任何联合体。另外也可在第一或第三DNA分子中使用草甘膦降解酶编码基因，同时在另一个中使用，例如，EPSPS。
作为选择，也可在第三DNA分子中使用与第一DNA分子所用相同或相似的草甘膦耐受性基因。但是在这种情况下，第一与第三DNA分子间仍存在一段可被第二DNA分子差异定向的不同区域。因此，尽管第一与第三DNA分子可使用相同的草甘膦耐受性基因，但它们仍需，例如在其非翻译区，具有可被选择性定向的差异。例如可将第三DNA分子设计成包含一段区域，如一段内含子序列或CTP序列，该区域与第一DNA分子中被第二DNA分子定向抑制的区域截然不同。
防止与野生亲本的异型杂交
该领域的技术人员都将理解，本发明的方法和组合物可用于希望限制其草甘膦耐受性基因散布至相关野生型物种的植物，以限制其产生可育的花粉。例如，这对铺草皮用的草类就非常有益，因为对这些草类而言，组成型草甘膦营养耐受性是一种符合需要的特性，但又不希望它们与野生型草类物种进行异型杂交。在生长有本发明所述植物的大田施加草甘膦，将提供具有环境安全性的杂草控制，同时又限制草甘膦耐受性基因与野生型物种进行异型杂交的可能性。
本发明还可应用于林业树木，如普通树种、花旗松、桉树、火炬松、辐射松、美国长叶松、胶皮糖香树等(Strauss等，1995)。如此产生的树木将具有草甘膦耐受性，并且在适当发育期施加草甘膦时可变为花粉不育，从而限制可育花粉的扩散。
本发明的另一项应用涉及使稻与杂草物种“红米”的异型杂交最小化。由于第二DNA分子的启动子，优选的为绒毡层特异启动子，可能会在配伍杂草物种中发挥作用，因而任何有关草甘膦耐受性脱逃至杂草物种的潜在担忧都将明显减少。由此，任何异型杂交事件所产生的后代都将具有对草甘膦毒性作用敏感的雄性配子或相关细胞。
在大田条件下已对Brassica napus(芸苔)异型杂交为Brassicarapa和Brassica juncea进行了证明。对包含本发明所述第一和第二DNA分子的转基因农作物植株经异型杂交所产生的杂交草物种施加草甘膦可导致植株雄性不育，并且经草甘膦处理后可强烈抑制其存活能力和/或散布草甘膦耐受性性状的能力。
此外，根据本发明所述方法产生的甜菜、甘蔗、马铃薯、甘薯等植物营养体部分是初级农产品的农作物；莴苣、甘蓝、菠菜和茶叶等多叶植物；胡萝卜、萝卜、芜箐、大蒜和洋葱等根用营养体作物均对草甘膦的毒性效应具有营养抗性。因此，草甘膦可用于控制这些农作物中的杂草，并且一旦喷洒草甘膦，这些植物即变为雄性不育。
防止种子由自生植物产生
自生作物是指在曾出产前一季农作物的大田内或大田周围出现的植物。在某些情况下，自生作物可逸入该环境并成为杂草。在这些农作物含有草甘膦耐受性基因的情况下，草甘膦耐受性基因扩散至该环境的潜在可能性就很值得担忧。但如果有一种可有效限制该可能性的方法，那么就会使这些担心减至最小。
本文所述的发明可防止或强烈抑制经草甘膦喷洒的自生作物中产生种子，从而防止草甘膦耐受性杂草植株的繁殖。芸苔(Brassicanapus)已引起特别关注，因为其欧洲的冬季油籽油菜变种已成为其常种植地区内及周围的杂草。Brassica napus种子可保持在土壤剖面内，并在随后的作物轮作中长成自生植物。在芸苔的杂交生产中使用本发明的方法将使对环境的关注减少，因为喷洒草甘膦可使植株雄性不育。
以下实施例用来对本发明某些优选实施方案的实例加以演示。该领域的技术人员都应理解，以下实施例中公开的技术均是发明人在本发明实施过程中发现可良好运作的方法，因此可被认为构成其优选实施方式的实例。但是从本公开内容的观点考虑，该领域的技术人员都应理解，在公开的特定实施方案中可出现多种不脱离本发明范围的变化，并且这些变化仍可得到相同或相似的结果。
                               实施例
实施例1
利用玉米原生质体及小麦原生质体中不同的反义基因片段抑制CP4的表达
A．质粒pMON19340、pMON25232、pMON25233、pMON25234、pMON25235及pMON25241的制备
美国专利号5,424,412中描述的pMON19470质粒以pUC119(Yanisch-Perron等，1985)为主链，并含有0.65kb的花椰菜花叶病毒(CaMV)35SRNA启动子(e35S)，该启动子包括-90--300区域的一个重复(Kay等，1987)、玉米HSP70基因的第一内含子(美国专利号5,424,412)、一个多克隆位点，和一个含有胭脂碱合酶(NOS)基因3’多腺苷酸序列的0.25kb片段(Fraley等，1983)。pMON19340、pMON25232、pMON25233、pMON25234、pMON25235和pMON25241均来源于pMON19470表达盒元件。
图6．pMON19653 e35S/hsp70内含子/CTP2/CP4 EPSPS/NOS3’
图6．pMON19340 e35S/PetEPSP内含子/PetEPSPS CTP/CP4/NOS3’
图7．pMON25232 e35S/hsp70内含子/抗PetEPSPS内含子-PEPSPCTP/NOS3’
图8．pMON25233 e35S/hsp70内含子/抗PetEPSPS内含子/NOS3’
图9．pMON25234 e35S/hsp70内含子/抗PetEPSPS CTP/NOS3’
图9．pMON25235 e35S/hsp70内含子/抗-CP4 EPSPS/NOS3’
图10．pMON25241 e35S/hsp70内含子/抗GUS/NOS3’B．玉米原生质体中的基因表达分析
植物原生质体中的基因表达分析已有充分的论述(Sehledzewski等，1994；Steinbiss等，1991；Stefanov等，1991)。原生质体表达分析常作为预测某些基因是否能在植物细胞内发挥作用的一种有效方法。评估不同反义基因片段对CP4 EPSPS表达的影响采用的是玉米原生质体瞬时表达***。玉米叶片原生质体的分离和电穿孔则按照Sheen,1991的描述进行。质粒DNAs的制备采用标准碱裂解然后氯化铯梯度纯化的方法(Maniatis等，1982)。利用电穿孔将5μg pMON19340DNA与40μg四种反义质粒DNAs(pMON25232、pMON25233、pMON25234，和pMON25235)中的一种以及GUS(β-gluc)反义调控质粒(pMON25241)一同引入玉米原生质体。pMON25241 DNA质粒作为填充物，以使总质粒量与只含CP4 EPSPS DNA的对照电穿孔和5μg LUX质粒DNA(pMON19437)的对照电穿孔所使用的总质粒量相同。将电穿孔后的细胞培养24小时，然后离心收集。利用三个冷冻/解冻循环获取原生质体总蛋白，再离心去除细胞碎片。利用Bio-Rad蛋白分析(Bio-RadLaboratories，目录号500-0006)测定总蛋白浓度。
利用ELISA对CP4 EPSPS的表达进行定量。将含有1mg总蛋白的原生质体粗提取物加入经山羊抗-CP4 EPSPS IgG包被的96-孔板的孔中进行反应。将板冲洗后加入第二抗体兔抗-CP4 EPSPS IgG，并将板保温过夜。冲洗板，再将结合碱性磷酸酶的驴抗兔IgG加入每个孔中，用碱性磷酸酶底物对CP4 EPSPS的存在情况进行显像。样品中CP4 EPSPS浓度的定量是由每个板的CP4 EPSPS标准曲线得出对数拟合曲线并外推而实现。荧光素酶分析则按照美国专利号5,424,412中的描述进行。
各反义片段的效果用CP4 EPSPS表达与荧光素酶内部对照表达水平的比率(CP4 EPSPS/LUX)表示。如图14及表1所示，各反义型式均使CP4 EPSPS的表达降低。有趣的是，抗内含子构建体pMON25232似乎不但能降低CP4 EPSPS，也能降低按反义方向包含CP4 EPSPS完整编码序列的构建体的水平。
表1．玉米原生质体中CP4 EPSPS反义片段CP4 EPSPS表达的影响
载体 表达的基因 CP4/LUX
对照 无DNA 0
pMON19340 CTP4-CP4 EPSPS 100×
pMON25235 CTP4-CP4+抗PetEPSPS内含子-抗CTP4 33×
pMON25232 CTP4-CP4+抗PetEPSPS内含子 24×
pMON25233 CTP4-CP4+抗CTP4 63×
pMON25234 CTP4-CP4+抗CP4 22×
C．小麦原生质体中的基因表达分析
利用对照及反义构建体对Bobwhite wheat原生质体进行电穿孔。原生质体是利用(Zhou等，1993)和(He等，1994)的改进规程由悬浮培养物制得。简单地说，即利用40ml酶溶液将8g小麦细胞培养物悬浮，并置40rpm旋转的转子上于26℃培养2小时。溶液于200g下离心8分钟。将原生质体冲洗两次，其间离心分离。用10ml清洗液悬浮并置于冰上。测定原生质体的数量并调整体积使浓度为4×106原生质体/ml。将原生质体(0.75ml)加入各电穿孔池，然后在原生质体中加入50μl包含50μg质粒DNA的溶液。利用Bio-Rad Gene Pulser进行电穿孔，其条件为960微法拉和160伏。样品置冰上保持10分钟，然后吸至MS1 WSM培养基内并置暗处于24℃培养18-22小时。200-250g下离心8分钟使细胞沉淀。将沉淀置干冰上冷冻。
利用ELISA(酶联免疫吸附测定)方法对玉米叶片、种子和全植物组织内的CP4烯醇丙酮基-莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)进行定量。该规程所描述的测定是一种可对玉米植物组织提取物中CP4 EPSPS蛋白质的存在水平进行定量的直接ELISA。将玉米组织置于Brinkmannpolytron机械匀浆器中以17,500rpm匀浆30秒，使其按20∶1的体积/重量提取至缓冲液中。6,660g下单次离心8分钟将可溶提取物中的不溶碎片分离。将植物样品中的CP4 EPSPS含量与分离自大肠杆菌的纯化CP4 EPSPS参考标准进行对比。简单地说，即利用纯化的山羊抗-CP4包被96孔聚苯乙烯板(2μg/孔)，然后于30℃下用脱脂奶粉(以1％浓度溶于1×PBST缓冲液，磷酸缓冲盐溶液pH7.4,0.05％吐温-20)阻断30分钟，再用1×PBST清洗3次。在经抗体包被的孔中每孔加入250μl可溶植物组织提取物(如需要可用1×PBST稀释提取物)，旁边则为一定浓度范围的纯CP4 EPSPS标准蛋白。将板保温使抗原被表面结合的抗体捕获。用缓冲液洗掉未结合的样品，并加入与辣根过氧化物酶结合的兔抗-CP4 EPSPS(1∶170溶于1×PBST)，使之与CP4 EPSPS抗原结合。保温并清洗，然后在各孔内加入过氧化物酶底物。由于孔内含有CP4 EPSPS，因此夹层状抗体(山羊抗CP4 EPSPS+植物CP4 EPSPS+兔抗CP4 EPSPS辣根过氧化物酶)将变为蓝色。过氧化物酶TMB底物和过氧化氢缓冲液(目录号50-76-02,Kirkegaard& Perry Labs)反应产生可溶性蓝色产物，并且用3M磷酸终止反应时产物将变为黄色。样品中CP4 EPSPS浓度的定量是由(0.1ng-2.0ngCP4/孔)或(0.4ng-8.0ng CP4/毫升)范围内的CP4 EPSPS标准曲线得出log-log二次回归拟合曲线并外推(以ELISA板读数仪在450nm下所得样品吸光度值为根据，参比波长为655nm)而实现。
表2及图5所示结果表明，通过使用与植物表达载体pMON25235、pMON25232、pMON25233和pMON25234所表达的遗传因子的反义，可以在小麦原生质体中抑制pMON19340的草甘膦耐受性基因的表达。植物表达载体pMON19340以组成型方式转录出一种RNA分子，该RNA分子含有一段5’前导序列、一段内含子、一段包含CTP和草甘膦耐受性基因RNA编码序列的外显子序列，以及一段3’非翻译区。在小麦原生质体测定中，与内含子/外显子序列反义的序列对CP4 EPSPS蛋白表达的抑制产生了意想不到的协同作用。
表2．反义构建体对小麦原生质体中CP4 EPSPS表达的影响
Figure 9980600600261
Figure 9980600600271
实施例2
含有花药特异启动子构建体的稳定转化玉米植株的产生A. pMON25258、pMON25259和pMON25260的制备
玉米基因组克隆由S.Goff,USDA,Albany,CA提供，该克隆含有玉米花药特异性基因(SGB6)的编码序列和该基因2,719个核苷酸碱基对(pSGB6)的5’上游启动子区域。根据厂商说明(New EnglandBioLabs)用限制性核酸内切酶NheⅠ消化包含SGB6启动子区域(pSGB6)的DNA，按照Maniatis等1982所述方法利用互补核苷酸由Klenow聚合酶(New England BioLabs)将NheⅠ3’突出端补平。将包含pSGB6启动子区域的DNA片段用HindⅢ进一步消化，以产生2,656个碱基对的SGB6上游启动子区域片段。该2,656个核苷酸碱基对的SGB6启动子片段称为P-Ztap，表示玉米绒毡层启动子。然后将P-Ztap启动子***已用核酸内切酶BglⅡ消化、用互补核苷酸由Klenow聚合酶补平DNA突出端、然后用核酸内切酶HindⅢ进一步消化的pMON19648中。按照Maniatis等1982所述方法利用T4 DNA连接酶(New England BioLabs)将P-Ztap启动子片段与消化的pMON19648载体片段连接。将该质粒的E35S启动子区域用P-Ztap启动子替代则得到pMON25258(P-Ztap/HSP70内含子/GUS/NOS 3’)(图11)。GUS基因和GUS：1指β-葡糖苷酸酶(β-gluc)，一种常用于转基因植物以确定组织特异性表达的可计数标记(Jefferson等1987)。与此类似，将P-Ztap启动子***已用BglⅡ消化、用互补核苷酸由Klenow聚合酶补平突出端、然后将质粒用HindⅢ消化的pMON25235中。P-Ztap启动子替代E35S启动子区域则得到pMON25259(P-Ztap/HSP70内含子/抗CP4 EPSPS/NOS 3’)(图12)。由pMON25259的KpnⅠ/PvuⅡDNA片段分离出5.4Kb的表达盒。然后用T4 DNA连接酶将该DNA片段连接于已预先用HindⅢ消化、用互补核苷酸由Klenow聚合酶补平末端、然后将质粒用KpnⅠ消化的pMON25258中。所得质粒为包含P-Ztap/HSP70内含子/GUS/NOS 3’::P-Ztap/HSP70内含子/抗CP4EPSPS/NOS 3’的pMON25260(图13)。
B．转化玉米植株的产生与鉴定
按Brown等(美国专利号5,424,412)所述利用生物基因枪轰击胚胎性玉米组织培养细胞而将pMON25260 DNA与pMON19653 DNA(E35S/Zmhsp70内含子/PetCTP2/CP4 EPSPS/NOS 3’)共转化入Hi-Ⅱ玉米植株内。选择具有草甘膦耐受性的转化细胞，并在温室条件下再生出完整植株并使其生长。
利用快速聚合酶链反应(PCR)筛选方法检测含有CP4 EPSPS反义基因的转基因植株。在1.5毫升(mL)微离心管中收集20毫克(mg)幼龄玉米苗的叶片组织，在干冰上冷冻，然后用木制敷药棒研磨成粉。管中加入500微升(μl)提取缓冲液(100mM Tris缓冲液，pH8.0；50mM EDTA；500mM NaCl；10mM 2-巯基乙醇)并在水浴中煮10分钟。用桌面微离心机将提取物离心(12,000rpm,10分钟)并将上清液转至新管，然后加入50μl 10M醋酸铵和1ml 95％乙醇。室温放置5分钟，再将管于室温12,000rpm下离心10分钟以沉淀DNA。加入25μl TE缓冲液(10mM Tris缓冲液，pH8.0；1mM EDTA)使DNA沉淀重悬。在DNA溶液中加入0.5μl 10mg/ml的RNAse A并将管于37℃保温5分钟以破坏RNA污染物。利用PCR Core试剂盒(Boehringer Mannheim,目录号1578553)并根据该试剂盒中所述方法对1μl提取物实施PCR反应。在PCR中用于检测CP4 EPSPS反义表达盒的DNA引物为位于P-Ztap启动子内的序列标号：5(5’-GAACAAGTTCATGAGCAAGGACCCTG-3’)和位于CP4 EPSPS反义基因内的序列标号：6(5’-CAAGCTCAATGGCGTGGATTGCG-3’)。反应采用Perkin Elmer热循环控制仪并符合以下条件：
1个循环：94℃,3分钟；64℃,1分钟；72℃,3分钟
40个循环：94℃,1分钟；64℃,30秒；72℃,3分钟
若按照Maniatis等(1982)方法在琼脂糖凝胶中检测出玉米品系内确实存在～1.3千碱基(kb)的DNA片段，则对其CP4 EPSPS表达盒的转基因情况进行检测。在单独进行的反应中使用特定引物来检测pMON25260的GUS(β-gluc)表达盒区域。检测GUS表达盒的引物为位于P-Ztap启动子序列内的序列标号：5(5’-GAACAAGTTCATGAGCAAGGACCCTG-3’)和位于β-gluc编码区中部的序列标号：7(5’-GTAGAGCATTACGCTGCGATGG-3’)。利用琼脂糖凝胶电泳在接收pMON25260的该区域的玉米品系中检测出～1.5kb的DNA片段。经检测有17株玉米品系呈反义CP4 EPSPS基因PCR阳性(表3)。
实施例3
pZtap启动子的表达评定
对pZtap启动子表达模式的评估采用GUS活性组化定位。该方法基本上按照Van der Krol等(1991)的描述进行。在染色前用刀片将花药、子房和其它植物组织切为两半，使X-gluc底物能够穿透组织。为排除可能由细胞大小差异、底物对组织的穿透以及背景活性所造成的假象，对转基因植株与非转基因植株的花药均进行了若干次独立的组化测定。
经组化染色在43个转基因Hi-Ⅱ品系中发现有16个品系在花药中具有高水平的GUS活性。在GUS阳性品系中有5个品系仅在花药中显示出GUS特异染色。有7个品系除花药染色外还在颖壳、鞘皮、内稃及花粉粒等其它雄花穗组织中显示出GUS雄性特异性染色。有4个品系显示出在子房和叶片中的表达，但其染色明显弱于雄花穗组织。
利用RT-PCR测定法检测Hi-Ⅱ品系中由pMON25260产生的抗-CP4EPSPS RNA。按上文所述从雄花穗组织中提取总RNA。根据厂商说明利用Stratagene RT-PCR试剂盒(编号#200420)进行反转录酶反应以产生第一链cDNA。在各20μl的反转录酶反应中使用1μg的总RNA和2.5pmol如序列标号：8(CP42：5’-CGA GGA CGT CAT CAA TAC GGG CAAGGC-3’)的引物。然后用PCR Core试剂盒(Boehringer Mannheim，目录号1578553)对1μl的cDNA样品进行PCR反应，在100μl的反应体积中使用序列标号：8和序列标号：9(5’-CAC GTC GAT GAC TTG GCC GGTGAG C-3’)各300nM作为引物，并采用如下热循环条件：
1个循环：94℃,3分钟；64℃,1分钟；72℃,3分钟；
30个循环：94℃,1分钟；64℃,30秒；72℃,3分钟
利用该技术，在30个评估的转基因Hi-Ⅱ品系中发现有17个品系在雄花穗组织中显示出可检测的反义CP4 EPSPS表达。
实施例4
转基因玉米植株的草甘膦耐受性RO植株
利用基因枪轰击法创建含有pMON25260的转基因Hi-Ⅱ玉米植株，用草甘膦对转基因细胞进行筛选，并按照描述再生出植株。利用上述的PCR测定法证实转基因植株中含有CP4基因。RO愈伤组织各独立再生出约5个植株，转至土壤营养钵中并温室保存。在第五个叶片出现时每种品系取3个植株用最多32盎司/英亩(2.23kg/ha)的Roundup_进行喷洒。剩余两个植株作为未喷洒对照。
如表3所示，图中采用相对于同品系未喷洒RO植株的0-100的营养比数(生长减缓百分率)。比数100表示植株由于喷洒Roundup而被杀死，0则表示喷洒与未喷洒植株间没有可见差异。叶片畸形百分率也被用作草甘膦营养耐受性的度量方法。开花和雄性不育的评估则采用0-5的评分体系。0分表示无雄花穗出现，1分表示植株有不能开花的雄花穗，5分表示植株完全可育。未喷洒植株亦在相同评分体系下评定。
利用RT-PCR筛选在雄花穗中表达反义CP4基因的品系。以32盎司/英亩(2.23kg/ha；品系1的喷洒为8盎司/英亩(0.56kg/ha))的比率喷洒草甘膦后，有8个转基因品系显示出具有极佳的营养耐受性(生长减缓百分率评分低)和高水平的雄性不育性(开花-雄性不育评分为1)。将喷洒植株与未喷洒植株的开花-雄性不育评分进行比较，选出7个品系用于进一步的特征鉴定。它们是品系1、2、3、6、11、13和14。表3．RO系玉米的草甘膦植物抗性的温室评定及喷洒后的繁殖力评定
pMON 19653/pMON252605-6叶期时用3202/ac(2.23kg/ha)喷雾的Ro
Figure 9980600600321
选定品系的喷洒与未喷洒植株均用非转基因玉米品系(B73)的花粉杂交，以产生F1种子。由喷洒而导致不育的植株所产生的穗在数量和种子形状上与未喷洒植株所产生的穗相似，表明植株在所用的草甘膦喷洒条件下完全为雌性可育。
F1后代分析
将三个草甘膦诱导的雄性不育品系的F1后代置小土壤营养钵中生长，并按上文所述通过幼苗叶片的PCR确定继承了转基因的品系。在5叶期时用32盎司/英亩(2.23kg/ha)的Roundup_喷洒PCR阳性F1植株，以此来评估对草甘膦的营养耐受性和生殖耐受性。营养耐受性和生殖耐受性的评分如上文所述。结果显示于表4。
表4．草甘膦诱导的雄性不育系玉米品系的R1后代温室评定
F1数据，在5-6叶期用32盎司/英亩(2.23kg/ha)喷雾(用8盎司/英亩(0.56kg/ha))喷雾一个品系，RTPCT阳性F1后代
产生后代的品系号 生产减缓百分率 畸形百分率 开花-雄性不育
1(5910) 0(8盎司/英亩) 0 2
1(5911) 0(8盎司/英亩) 0 2
1(5912) 0(8盎司/英亩) 0 3.5
2(6038) 0 0 1
三种品系均显示出极佳的营养耐受性评分(0-10的生长减缓)。所有三种品系的可育性评分均为1(完全不育)。据观察，喷洒的植株产生紧密合拢的花药，而相比之下，未喷洒对照的花药开放且开裂出大量花粉。解剖已喷洒植株的花药并在解剖镜下观察花粉粒。雄性不育花药所产生的花粉粒明显少于可育对照，并且出现的花粉粒均呈皱缩和异常状态。
用非转基因B73玉米花粉对这些品系及其它品系进行授粉，以产生用于田间试验评定的种子。
田间条件下的品系评定
利用与CP4 EPSPS草甘膦耐受性基因反义的RNA的P-Ztap调控表达来诱导具有草甘膦营养耐受性和雄性不育性的转基因玉米品系，并对此进行温室筛选，选定品系经草甘膦处理后的田间试验结果显示于表5。田间试验植株的筛选是以此前的营养耐受性、草甘膦诱导的雄性不育性、基因表达以及可用种子供应的评分为根据。田间测试植株系的谱系为〔(Ro×B73)×B73〕或(B73×Ro)。依据这些谱系，预计一个地块上将有一半的植株由于不包含转基因而在施加草甘膦(Roundup_)后被杀死。
场地设为两个区；每个区包括四组预定接受独立喷洒处理的地块。其处理为1)不喷洒，2)于12叶期喷洒32盎司/英亩(2.23kg/ha)的Roundup_,3)于4-5叶期喷洒32盎司/英亩(2.23kg/ha)的Roundup,4)于6-8叶期喷洒32盎司/英亩(2.23kg/ha)的Roundup_。对照包括两种此前显示出对Roundup_的极佳营养耐受性但极小生殖耐受性的品系(pMON19653，只含CP4 EPSPS)。
当植物已开始开花时评定其雄性不育性，并每1-2天重复评定一次，持续约8天。观测的数据包括一个地块上植株最先及最后形成花药的日期，以及这些花药中花粉的可育性(利用手持显微镜判断)。
对产生雄性不育性而言，在6-8叶期喷洒Roundup_最为有效。有四个品系在喷洒后存活并产生雄花穗。但当各自的未喷洒地块上的所有植株均已开始开花时，这四个于6-8叶期喷洒的植株品系中仍未出现可见的花药。据观察，在对照地块已完成脱落后约10天，才发现初期未产生花药的植株上伸出一些花药。但除一例之外，其余所有情况下的花药数与正常情况相比均明显减小(例如，有一个品系每个植株具有5个或更少的花药)，而且这些晚期出现且定位异常的花药被认为不合有可育的花粉。将Roundup_处理后显示出雄性不育性的植株用B73花粉授粉。如前所述，已处理植株上ears borne的种子形状十分正常，表明其完全具有雌性可育性。
表5．在6-8叶期以32盎司/英亩(2.23kg/ha)的比例喷洒草甘膦(Roundup_)的转基因玉米植株的可育性田间评定
品系号 植株平均高度 花药外露百分率1 可育率2
3 -46％ 0 2.0
6 -14％ 0 2.5
13 -8％ 0 3.0
16 -12％ 0 2.0
1相同品系未喷洒植株的花粉正在脱落时喷洒植株上的花药外露百分率
2未喷洒植株的花粉脱落后10天时喷洒植株的可育性评定。评分体系：0为完全不育，无花药形成，1为有一些花药形成，2为有一些花药形成并有一些花粉脱落，3为形成花药并有一些花粉脱落，4为形成花药并有花粉脱落但少于完全可育植株，5为完全可育。所有未喷洒植株的可育性评分均为5。
实施例5
F1植株中的CP4表达
利用CP4 ELISA测定法(收集20mg叶片和花药组织并快速冷冻于液氮中)对非转基因B73花粉与雄性不育Hi-Ⅱ Ro植株杂交的F1后代进行评估，以确定叶片和花药组织中的CP4 EPSPS表达。提取总蛋白并利用Bio-Rad蛋白测定(Bio-Rad Laboratories，目录号500-0006)进行定量。利用大肠杆菌表达的CP4 EPSPS的标准曲线对叶片和花药组织提取物中的CP4 EPSPS蛋白进行定量。分别将野生型植株的叶片和花药蛋白提取物加到叶片和花药CP4 EPSPS测定的标准曲线中。在所有测试植株中，叶片组织内的CP4 EPSPS水平均大大高于花药组织内的水平。测定玉米品系号1、3和6中CP4 EPSPS蛋白表达的叶片/花药比率，其单位为ng CP4 EPSPS/μg可溶蛋白。CP4 EPSPS表达的抑制范围为1.76×-14.87×，花药组织相对于叶片组织的平均CP4 EPSPS抑制为7.34×。
实施例6
利用可选的反义构建体产生Roundup_Ready F1植株
植株的产生采用的是诸如实施例1所述的构建体(如pMON25235、pMON23232、pMON23233)，这些构建体用花药或花粉特异性启动子以及可提供草甘膦营养耐受性和雌性耐受性的组成型启动子替代了原组成型启动子。选择显示出良好营养耐受性和雌性耐受性但具有草甘膦雄性生殖敏感性的转基因品系。将该性状与近交系回交，近交系在杂交中作为母本。
具有完全草甘膦耐受性(Roundup Ready_)的玉米品系作为父本。这些品系包含诸如植物EPSPS基因等非同源草甘膦耐受性基因，或包含不同的叶绿体定向肽和/或内含子序列。因此，用于产生雄性不育性雌性植株的反义构建体对从父本引入的草甘膦耐受性基因无效，并且由所得F1种子产生的植株当喷洒草甘膦时完全可育。
实施例7
花期延长
提高花期的长度对园艺行业而言是一个重要的领域。矮牵牛花物种的受精通常为自交不亲和性。这使我们能够对矮牵牛花物种的花期进行温室观测。对矮牵牛花变体V26和Mitchell的观测结果显示，开放后未授粉的花可在植株上保持4-6天，平均为5天。开花时进行手工杂交授粉的花的花期范围为1.5-3天，平均2.25天。
所有在此公开并要求专利保护的组合物和方法均能够在没有进行过度实验的情况下按照本公开内容进行制造和实施。尽管本发明的组合物和方法是利用优选实施方案来加以描述，但该领域的技术人员均明白，在不脱离本发明的思想和范围的情况下存在适用于文中所述DNA分子和方法步骤或步骤顺序的变化。更明确而言，显然可利用在化学和生理学上均相关的一些制剂来替代文中所述制剂，同时又获得相同或相似的结果。对该领域技术人员而言，显然所有这些类似的替代和修改均应被认为处于附加权利要求所规定的本发明的思想和范围之内。
文献目录：
Barry等氨基酸生物合成抑制剂：赋予农作物植株草甘膦耐受性的
策略。见“植物中氨基酸的生物合成与分子调控”，BK Singh,HE
Flores，和JC Shannon，编著，(1992),Amer Soc Plant Phys.Beals和Goldberg.一种阻碍烟草花药破裂的细胞去除新策略。Plant
Cell(1997)vol.9.pp.1527-1545.Bird&Ray，利用反义RNA控制植物基因的表达。Biotech.&Gen.Eng.
Rev.(1991)9:207-27.Bouhida等，可感染香蕉和稻的甘蔗杆状病毒基因组的全序列分析。
Journal General Virology(1993)vol.74pp.15-22.Brown和Crouch.在Oenothera organensis花粉中高表达并与多聚
半乳糖醛酸酶具有序列相似性的基因家族的特性。Plant Cell vol
2pp.263-274.Coruzzi等豌豆核酮糖-1,5-二磷酸小亚基核编码基因的组织特异性
光控表达。EMBO J.(1984)vol.3pp.1671-1679.Dubald等玉米中聚半乳糖醛酸外切酶的普遍存在表明该酶具有基本
的细胞功能。Plant J.(1993)vol.4pp.781-791.Fraley等植物细胞中的细菌基因表达。Proc.Natl.Acad.Sci.
(1983)vol.80pp.4803-4807.Gibson & Shillitoe.核糖酶，其功能及应用策略。Molec.Biotech
(1997)7(2)125-37.Goldberg等.一种研究植物发育的细胞去除新策略。Philos.Trans.
R.Soc.Lond.(1995)vol.350.pp.5-17.Hanson等.玉米的花粉特异性cDNA克隆的特性及其表达。Plant Cell
(1989)vol.1pp.173-179.He等通过原生质体的电穿孔对小麦(Triticum aestivum L.)进行
转化。Plant Cell Reports,1994,14:192-196.Heizmann等SLG基因家族新成员SLG自交不亲合性基因在芸苔花药
中的表达。Plant Science(1991)vol.80pp.193-200.Hinchee,M.A.W.,D.R.Corbin,C.L.Armstrong,J.E.Fry,S.S.
Sato,D.L.DeBoer,W.L.Petersen,T.A.Armstrong,D.V.
Conner-Ward,J.G.Layton and R.B.Horsch，植物转化，见植
物细胞及组织培养，231-270,1994,Vasil和Thorpe(编著)，
Dordrecht出版社，Netherlands.Huang等Arabidopsis thaliana ACT4/ACT12肌动蛋白基因亚类在
整个花粉发育过程中强烈表达。Plant Journal(1996)vol.10 pp
189-202.Jefferson等GUS融合：β-葡糖苷酸酶作为高等植物中的灵敏并且通
用的基因融合标记。EMBO J.(1987)vol.6 pp.3901-3907.Jorgensen,R.同源基因间的反式相互作用可改变植物中的基因表
达.Trends in Biotech.(1990)8:12,340-44.Kay等CaMV35S启动子序列复制而成为植物基因的强增强子。Science
(1987)vol.236pp.1299-1302.Li等用于印度籼稻转化的启动子及可选标记基因的比较。Molecular
Breeding(1997)vol.3pp.1-14.Maniatis等分子克隆：实验室手册。CSH Labs,N.Y.(1982).Marini等利用核糖核酸酶嵌合基因诱导植物的雄性不育性。Nature
(1990)vol.347.pp.737-741.Marini等核糖核酸酶抑制剂嵌合基因可使雄性不育植株恢复可育
性。Nature(1992)vol.357.pp.384-387.Marrs等经电穿孔的玉米原生质体中的瞬时基因表达分析。Methods
Mol.Biol.(1995)vol.55pp.133-145.McCormick等花药特异性基因：转基因植物中的分子特性及启动子
分析。Amer.Soc.Plant Physiol.Symp.Ser.(1989)vol.1pp.
128-135.Medberry和Olszewski.参与鸭跖草黄色斑点病毒启动子活性的顺
式元件识别。Plant Journal(1993)vol.3pp.619-626.Moffatt等Arabidopsis thaliana的腺嘌呤磷酸核糖基转移酶编码
基因。Gene(1994)vol 143pp.211-216.Ni等来自章鱼碱及甘露碱合酶基因的嵌合启动子的强度与组织特异
性。Plant J.(1995)vol.7pp.661-676.Odell等保持花椰菜花叶病毒35S启动子活性所需DNA序列的识别。
Nature(1985)vol.313 pp.810-812.Qu等稻花药的查耳酮合酶样cDNA。Sex Plant Reprod.(1997)vol.
10pp.181-183.Ritchie,S.W.和Hodges,T.K.,转基因植物的细胞培养与再生，
147-177,1993,见转基因植物，vol.1,Kung and We(Eds.),
Academic Press Inc,Harcourt Brace Jovanovich Publishers.Sanger等玄参花叶病毒强启动子的特性：与花椰菜花叶病毒35S同
功启动子及甘露碱合酶调节启动子的比较。Plant Mol.Biol.
(1990)vol.14pp.433-443.Schledzewski等定量瞬时基因表达：来自玉米多聚泛素1、稻肌动
蛋白1、大麦细胞内来源于玉米的Emu和CaMV 35S、玉米以及烟
草的启动子比较。Transgenic Research(1994)vol.3pp.
249-255.Schuch,W.利用反义RNA研究基因的功能。Symposia of the Soc.
Exper.Bio.(1991)45:117-27.Schuler等大豆7s贮存蛋白复合物α和α′亚基的近亲家族基因编码
Nucleic Acids Res.(1982)vol.10pp.8225-8244.Serratos，等长白猪玉米、改进型玉米变种以及墨西哥假蜀黍之间
的基因流动：转基玉米的暗示。(1997)Mexico,D.F.CIMMYTSheen玉米正磷酸丙酮酸二激酶基因的差异表达分子机制。Plant Cell
(1991)vol.3pp.225-245.Stefanov等植物原生质体内一种报告基因的启动子及其基因型依赖
性瞬时表达。Acta Biologica Hungarica(1991)vol.42.pp.
323-330.Steinbiss等嵌合基因在农作物细胞及组织内的瞬时基因表达。
Subcellular Biochem.(1991)vol.17pp.143-166.Steinecke等核糖酶的体外内切核苷酸活性无需一种稳定的锤头结
构。Gene(1994)vol.149pp.47-54.Stinson等显花植物雄性配子体的基因表达及其分离。Plant Physiol.
(1987)vol.83pp.442-447.Strauss等林木生殖不育体遗传工程。Molecular Breeding(1995)vol.
1pp.5-26.Stuber.植物育种中的杂种优势。Plant Breeding Reviews(1994)vol.
12pp.227-252.Toriyama等芸苔S基因座基因启动子调控转基因Arabidopsis花药
绒毡层内的孢子体表达。Developmental Biology(1991)vol.143
pp.427-431.Tsuchiya等转基因烟草中内切-β-1,3-葡聚糖酶基因的绒毡层特异
表达导致雄性不育。Plant and Cell Physiology(1995)vol.36
pp.487-494.Tsuchiya等在花药绒毡层特异表达的稻基因的分子特性。Plant
Molecular Biology(1994)vol.26pp.1737-1746.Twell等由花粉发育其间协同表达基因的启动子分析揭示的花粉特异
性增强子序列及共有调控元件。Genes&Development(1991)vol.
5pp.496-507.van der Krol等植物B-ZIP蛋白的碱性结构域可促进一种报告蛋白
进入植物的核内。Plant Cell(1991)vol.3pp.667-675.van Tunen等矮牵牛花的花粉及花药特异性启动子：chiA基因的串
联启动子调控。Plant Cell(1990)vol.2pp.393-402.Wen等转基因稻中用于gusA基因的转基因遗传稳定表达的启动子的
效率比较。Chinese J.of Bot.(1993)vol.5pp.102-109.Williams.授粉控制遗传工程。Trends in Biotechnology(1995)vol.
13pp.344-349.Williams和Levings.细胞质雄性不育分子生物学。Plant Breeding
Reviews(1992)vol.10pp.23-52.Xu等稻丙糖磷酸异构酶基因的5’序列控制转基因烟草内β-葡糖醛酸
酶的活性，但需要一种用于在稻内表达的内含子。Plant
Physiology(1994)vol.106pp.459-467.Yanisch-Perron等改进的M13嗜菌体克隆载体及宿主菌株：M13mp18
与pUC19载体的核苷酸序列。Gene(1985)vol.33pp.103-119.Yokoi等Osg6B启动子-β-葡糖醛酸酶基因在转基因稻中的绒毡层特
异性表达。Plant Cell Reports(1997)vol 16pp.363-367.Zabaleta等由未编辑的ATP9基因诱导的转基因雄性不育植株可通
过利用反义RNA抑制其表达而恢复为可育植株。Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.(1996)vol.93pp.11259-11263.Zhan等利用核糖核酸酶的花粉特异性表达诱导核雄性不育体。Sexual
Plant Reproduction(1996)vol.9pp.35-43.Zhong等玉米稳定转基因植株(Zea mays L.)内稻肌动蛋白1基因
的1.4kb 5’区域的功能性活性分析。Plant Science(1996)vol.
116pp.73-84.Zhou等利用电穿孔诱导基因直接转化获得小麦稳定转化愈伤组织。
Plant Cell Reports,1993,12:612-616.Zhou等在小麦转化中作为可选标记的草甘膦耐受性CP4和GPX基因。
Plant Cell Reprots(1995)vol.15pp.159-163.Zou等稻花粉特异性基因的特性及其表达。Am.J.Bot.Vol.81pp.
552-561.
引用的专利文献
美国专利
4,940,835 07/1990    Shah,D
4,971,908 11/1990    Kishore,G.
5,145,783 09/1992    Kishore,G.
5,188,642 02/1993    Shah,D.
5,310,667 05/1994    Eichholtz,D.
5,312,910 05/1994    Kishore,G.
5,583,210 12/1996    Neill,J.
5,470,359 11/1995    Huffman,G.
5,356,799 10/1994    Fabijanski,S.
5,254,801 10/1993    Dotson,S.
4,735,649 04/1989    Dhingra,O.
5,554,798 09/1996    Lundquist,R.
5,478,369 12/1995    Albertson,M.
5,530,191 06/1996    Maliga,P.
5,463,175 10/1995    Barry,G.
5,627,061 05/1997    Barry,G.
5,633,435 05/1997    Barry,G.
5,424,412 01/1997    Brown,S.
外国专利文献
WO9631113    Badger,M
WO9325695    Leemans,J
WO9213957    De Beuckeleer,M
WO9413809    Knox,R.
WO9617945    Cigan,A.
EP93109226   Dirks,R.
WO9704112    Poulsen,P.
序列表<110>BROWN,SHERRI
 FROMM,MICHAEL<120>杀配子剂草甘膦<130>MOBT122<140><141><150>60/077,277<151>1998-03-09<160>9<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2657<212>DNA<213>Zea mays<400>1aagcttatcg ataccgtcga cctgcaggtc aacggatcaa aggacgccgc cgaagtcacc 60cgatcggagg attggtcgtc gatggacgcc agagccaccc acgcctctcg tggccgccat 120cgccagagac aaccgcgcct cacgcgaccg ccggagcgac ccgtgtacct cgtggccacc 180gccgccgctg ccgacgccta ccgcgcctcg cacaaccgcc gttgctaccg ggcctagggt 240gcgccaccgc cgcccgtccg cttcgagagc accgtcaccg cttgcccgcc cgcctcggga 300gcgtcgccgt cgctcgttcc ttgtagagcg cctgtgatat cttggcccct gggatggtga 360tgtcctggcc caaggcttaa tagaattaat aaagtatcta taccaataag gtgcattttg 420tttttcggaa gcctatctcg aaagaacctc caagttaagt gtgcttggct tggagcaatt 480ttggatgggt gaccgtccgg gaagtttttc tcgggtgcgc atgagtaagg acaaagtgtt 540cacaaaagac atgtgttggc ctgtggggac aatatatgat cctagagaga tgccaggagt 600aagtaccgcc ggtccaggga ttggacgggg tgttacaagt ggtatcagag ctggccctcg 660cggtttcacg ggtgtgtgtg ggttaggggt tcgggtatat ggtgcatgtg ggcccgaagt 720ggtcacatgg catggtaggg gttcgggtat atggcgcatg gcgcatgtgg gcccgaagtg 780gtcacatggt atggtatatg acgacactag acacagacat ggctaagatg ggaggttcct 840ggattggggt tgaccgacga ggacgtcggt cttctaaggg gggtggattg tgatatcctg 900acccttggga tggtgatgta ctggcccaag gcttaataga attaatagag tatccatact 960aacacggtgc atcttctttt tcggaagcct atctcgaaag aacctccaag ttaagtgtgc 1020ttggcttgca gtaatctggg atgggtgacc gaccgggaag tttttctcgg gtgcgcatga 1080gtgaggacaa agtgtgcaca aaaaacccgt gttggtttgt ggggacaata tatgatccta 1140tagagctgcc aggagtaagt accgccggtc cagggattgg acggggtgtt acagcgccgc 1200cgtcggtcgc tcgcctcggg gcggcactgc cgccgacccc tggatcgcct ccactcgcac 1260gcccgaggta accgccgcct ccactaaaag ctaatccctg gcggtgtggg gttgttttta 1320tagcagcccg gacctggtcc agctcaaccg gattgcaccg tctgacatgg gcttcctcta 1380gttattggaa gcccaggcct aataatatac aatatatata tatatatata tatatatata 1440tatatatata tatatatata tatatataac aagtagacca aaaaatgtga tataaaattt 1500aagtgtttaa gtgggacagg tgcaaccttt tagtctatga tttgccagaa atgatgtaat 1560tttagtaaaa ccattacatt ctttttttac aaattacttt cagggccatc tattagatgc 1620aatctagttc ccacttaaaa agagttccat tagtgcaacg aaccaaattt gaagcacaca 1680tggcgagtga tgtatactct agctaataga gatttttttt gtaccaacaa tgtgtgatta 1740ataatcatag agttcggttt gctactagtc atacggtctc acactttcct tacttttaat 1800caactctttt ttatcagccg ggcactgaaa ctatgtagta atacttggct cactgcaaat 1860ttcttataga agctggaata aaatcctttt aagggctagt ttgggaacca catttttcca 1920agggatttca attttcgcaa gggaaattag ttcattttcc cttgggaaaa tagaaatccc 1980atgggaaaat gtggttccca aactagccct aaataaaaaa aatgagcaga ggaacagttc 2040actagatatg catgatcttt aacaattgct gctggattgt gcggtttctt ttggcacaaa 2100tggcatgaac agagtaatcc gggacgcgcc atcagtgtgg gtgtgtcatc cgtgggagac 2160gcgggtgcgg cgcatgagtc tgggatacag gggccagtgt gaggagcagc taccatacca 2220gggcacctag ttattttttc tcaggggtgt ttggttacac ccccgctaaa atttagctcc 2280tattccatcg aatgtttgaa cctccgttcc gggtattaaa tatagtcgga ttataaaact 2340aatttaccag ccgaagatta aaagacgaga cgaatctagt ccagttggtt gggtctatat 2400ttcatactcc tatttaaaag tcaaacgctt gatgtgaccc gggctaaact ttagcaggag 2460caaccaaaca cccgggtttg gaacaagttc atgagcaagg accctgcacc gaccaccaaa 2520gttcaacgat tcacacgctt tggaactaga acaactgctg ttggaaacct cctggtgaaa 2580tctcacccta ttaataccat gctgacgagc caatagcaga agcatcacac actaatcaac 2640aagcaggacc agctagc                                                2657<210>2<211>91<212>DNA<213>矮牵牛花x杂种<400> 2tctagactat aaaaccacag caaaatggta aagtatcaat ctttataatc taagttcaga 60ttacagagaa ggacgaaacg aagtgggatc c                                91<210>3<211>212<212>DNA<213>矮牵牛花x杂种<400>3tctagaggct gtagccactg atgctgaaat cctaaaggaa caaaactttt gcataaaaat 60tgaatctttt ttcaaaacca acatagaatt tgctgaattt ttcagttttt tagatccaaa 120aacaagaaaa cttgaagatt taggaacttg gggtttatgg aaattggaat tgggattaag 180ggtttgtatc ccttgagcca tgttcgggat cc                               212<210>4<211>460<212>DNA<213>矮牵牛花x杂种<400>4gctgctctgt ctgaggtata tatcacttcg tttcgtcctt ctctgtaatc tgaacttaga 60ttataaagat tgatacttta ccattttgct gtggttttat agggacaact gtagtggaga 120tcctagagga tctatcgata agctgatctt tcaagaatgg cacaaattaa caacatggct 180caagggatac aaacccttaa tcccaattcc aatttccata aaccccaagt tcctaaatct 240tcaagttttc ttgtttttgg atctaaaaaa ctgaaaaatt cagcaaattc tatgttggtt 300ttgaaaaaag attcaatttt tatgcaaaag ttttgttcct ttaggatttc agcatcagtg 360gctacagcct gcatgcttca cggtgcaagc agccggcccg caaccgcccg caaatcctct 420ggcctttccg gaaccgtccg cattcccggc gacaagtcga                       460<210>5<211>26<212>DNA<213>合成<400>sgaacaagttc atgagcaagg accctg                                       26<210>6<211>23<212>DNA<213>合成<400>6caagctcaat ggcgtggatt gcg                                         23<210>7<211>22<212>DNA<213>合成<400>7gtagagcatt acgctgcgat gg                                          22<210>8<211>27<212>DNA<213>合成<400>8cgaggacgtc atcaatacgg gcaaggc                                      27<210>9<211>25<212>DNA<213>合成<400>9cacgtcgatg acttggccgg tgagc                                         25

Claims (39)

1．一种产生雄性不育植株的方法，该方法的步骤包括：
在植物细胞基因组中***：
一种第一DNA分子，该分子包含经操作按5’-3’方向连接的：
一种能够在植物细胞中促使第一RNA序列产生的第一启动子；
一种编码第一RNA序列的第一DNA序列，该RNA序列编码一种可导致草甘膦耐受性的蛋白；
一种能够在植物细胞中促使第一RNA序列3’端多腺苷酸化的第一3’非翻译区；以及
一种第二DNA分子，该分子包含经操作按5’-3’方向连接的：
一种能够在植物细胞中促使雄性生殖组织产生第二RNA序列的第二启动子；
一种编码与第一RNA序列互补的第二RNA序列的第二DNA序列；
一种能够在植物细胞中促使第二RNA序列3’端多腺苷酸化的第二3’非翻译区；
获得含有第一和第二DNA分子的植物转化细胞；由植物转化细胞再生出转化植株；以及将转化植株暴露于草甘膦。
2．权利要求1的方法，其中第一启动子选自花椰菜花叶病毒19S启动子、花椰菜花叶病毒35S启动子、玄参花叶病毒35S启动子、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄色斑点病毒启动子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基启动子、稻胞质性丙糖磷酸异构酶启动子、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶启动子、稻肌动蛋白1启动子、甘露碱合酶启动子，以及章鱼碱合酶启动子。
3．权利要求1的方法，其中第一DNA序列编码一种天然EPSPS酶、突变EPSPS酶，或一种草甘膦降解酶。
4．权利要求1的方法，其中第二启动子选自TA29烟草绒毡层特异启动子、PA1苯基苯乙烯酮二氢黄酮异构酶启动子、PA2苯基苯乙烯酮二氢黄酮异构酶启动子、SLG启动子、LAT启动子、聚半乳糖醛酸外切酶启动子、Zmc13启动子、LAT52启动子、LAT59启动子，以及psgB6-1启动子。
5．权利要求1的方法，其中第二RNA序列与第一RNA序列的蛋白编码区互补。
6．权利要求1的方法，其中第二RNA序列与第一RNA序列的非翻译区互补。
7．权利要求1的方法，其中所述植物选自玉米、小麦、稻、芸苔、燕麦、大麦、紫苜蓿、胡萝卜、棉花、油籽油菜、甜菜、向日葵、大豆、番茄、黄瓜，以及南瓜。
8．权利要求1的方法，进一步包括用一种雄性可育供体的花粉使雄性不育植株杂交可育化。
9．权利要求8的方法，进一步包括收集杂交可育后代的种子。
10．一种由权利要求1的方法产生的雄性不育植株。
11．一种植物细胞，该细胞的基因组包含：
一种第一DNA分子，该分子包含经操作按5’-3’方向连接的：
一种能够在植物细胞中促使第一RNA序列产生的第一启动子；
一种编码第一RNA序列的第一DNA序列，该RNA序列编码一种可导致草甘膦耐受性的蛋白；
一种能够在植物细胞中促使第一RNA序列3’端多腺苷酸化的第一3’非翻译区；以及
一种第二DNA分子，该分子包含经操作按5’-3’方向连接的：
一种能够在植物细胞中促使雄性生殖组织产生第二RNA序列的第二启动子；
一种编码与第一RNA序列互补的第二RNA序列的第二DNA序列；
一种能够在植物细胞中促使第二RNA序列3’端多腺苷酸化的第二3’非翻译区。
12．权利要求11的植物细胞，其中第一启动子选自花椰菜花叶病毒19S启动子、花椰菜花叶病毒35S启动子、花叶病毒35S启动子、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄色斑点病毒启动子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基启动子、稻胞质性丙糖磷酸异构酶启动子、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶启动子、稻肌动蛋白1启动子、甘露碱合酶启动子，以及章鱼碱合酶启动子。
13．权利要求11的植物细胞，其中第一DNA序列编码一种天然EPSPS酶、突变EPSPS酶，或一种草甘膦降解酶。
14．权利要求11的植物细胞，其中第二启动子选自TA29烟草绒毡层特异启动子、PA1苯基苯乙烯酮二氢黄酮异构酶启动子、PA2苯基苯乙烯酮二氢黄酮异构酶启动子、SLG启动子、LAT启动子、聚半乳糖醛酸外切酶启动子、Zmc13启动子、LAT52启动子、LAT59启动子，以及psgB6-1启动子。
15．权利要求11的植物细胞，其中第二RNA序列与第一RNA序列的蛋白编码区互补。
16．权利要求11的植物细胞，其中第二RNA序列与第一RNA序列的非翻译区互补。
17．权利要求11的植物细胞，其中所述植物选自玉米、小麦、稻、芸苔、燕麦、大麦、紫苜蓿、胡萝卜、棉花、油籽油菜、甜菜、向日葵、大豆、番茄、黄瓜，以及南瓜。
18．一种植株，该植株包含权利要求11的植物细胞。
19．包含权利要求11的植物细胞的种子。
20．一种产生杂交种子的方法，该方法的步骤包括：
产生雄性不育植株，其方法是通过在植物细胞基因组中***：
一种第一DNA分子，该分子包含经操作按5’-3’方向连接的：
一种能够在植物细胞中促使第一RNA序列产生的第一启动子；
一种编码第一RNA序列的第一DNA序列，该RNA序列编码一种可导致草甘膦耐受性的蛋白；
一种能够在植物细胞中促使第一RNA序列3’端多腺苷酸化的第一3’非翻译区；以及
一种第二DNA分子，该分子包含经操作按5’-3’方向连接的：
一种能够在植物细胞中促使雄性生殖组织产生第二RNA序列的第二启动子；
一种编码与第一RNA序列互补的第二RNA序列的第二DNA序列；
一种能够在植物细胞中促使第二RNA序列3’端多腺苷酸化的第二3’非翻译区；
获得含有第一和第二DNA分子的植物转化细胞；
由植物转化细胞再生出转化植株；
通过在不施加草甘膦的情况下栽培转化植株来增加转化植株的数量；
允许自身受精；以及
在不施加草甘膦的情况下将所述转化植株的种子栽培多代；
将转化植株暴露于草甘膦以产生雄性不育植株；
用雄性可育供体的花粉实现雄性不育植株的异体受精，其中供体的基因组中含有一种第三DNA分子，该分子包含经操作按5’-3’方向连接的：
一种能够在植物细胞中促使第三RNA序列产生的第三启动子；
一种编码第三RNA序列的第三DNA序列，该RNA序列编码一种导致草甘膦耐受性的蛋白；
一种能够在植物细胞中促使第三RNA序列3’端添加多腺苷酸核苷酸的第三3’非翻译区；
其中该第三DNA分子与第一DNA分子不同；以及
收集所述异体受精后代的种子。
21．权利要求20的方法，其中第一启动子选自花椰菜花叶病毒19S启动子、花椰菜花叶病毒35S启动子、玄参花叶病毒35S启动子、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄色斑点病毒启动子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基启动子、稻胞质性丙糖磷酸异构酶启动子、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶启动子、稻肌动蛋白1启动子、甘露碱合酶启动子，以及章鱼碱合酶启动子。
22．权利要求20的方法，其中第一DNA序列编码一种天然EPSPS酶、突变EPSPS酶，或一种草甘膦降解酶。
23．权利要求20的方法，其中第二启动子选自TA29烟草绒毡层特异启动子、PA1苯基苯乙烯酮二氢黄酮异构酶启动子、PA2苯基苯乙烯酮二氢黄酮异构酶启动子、SLG启动子、LAT启动子、聚半乳糖醛酸外切酶启动子、Zmc13启动子、LAT52启动子、LAT59启动子，以及psgB6-1启动子。
24．权利要求20的方法，其中第二RNA序列与第一RNA序列的蛋白编码区互补。
25．权利要求20的方法，其中第二RNA序列与第一RNA序列的非翻译区互补。
26．权利要求20的方法，其中第三DNA的第三启动子选自花椰菜花叶病毒19S启动子、花椰菜花叶病毒35S启动子、玄参花叶病毒35S启动子、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄色斑点病毒启动子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基启动子、稻胞质性丙糖磷酸异构酶启动子、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶启动子、稻肌动蛋白1启动子、甘露碱合酶启动子，以及章鱼碱合酶启动子。
27．权利要求20的方法，其中所述植物选自玉米、小麦、稻、芸苔、燕麦、大麦、紫苜蓿、胡萝卜、棉花、油籽油菜、甜菜、向日葵、大豆、番茄、黄瓜，以及南瓜。
28．由权利要求20的方法产生的种子。
29．由权利要求28的种子产生的植株。
30．一种植物细胞，该细胞的基因组中包含
一种第一DNA分子，该分子包含经操作按5’-3’方向连接的：
一种能够在植物细胞中促使第一RNA序列产生的第一启动子；
一种编码第一RNA序列的第一DNA序列，该RNA序列编码一种导致草甘膦耐受性的蛋白；
一种能够在植物细胞中促使第一RNA序列3’端多腺苷酸化的第一3’非翻译区；
一种第二DNA分子，该分子包含经操作按5’-3’方向连接的：
一种能够在植物细胞中促使雄性生殖组织产生第二RNA的第二启动子；
一种编码与第一RNA序列互补的第二RNA序列的第二DNA序列；
一种能够在植物细胞中促使第二RNA序列3’端多腺苷酸化的第二3’非翻译区；
一种第三DNA分子，该分子包含经操作按5’-3’方向连接的：
一种能够在植物细胞中促使第三RNA序列产生的第三启动子；
一种编码第三RNA序列的第三DNA序列，该RNA序列编码一种导致草甘膦耐受性的蛋白；
一种能够在植物细胞中促使第三RNA序列3’端添加多腺苷酸核苷酸的第三3’非翻译区；
其中该第三DNA分子与第一DNA分子不同。
31．权利要求30的植物细胞，其中第一启动子选自花椰菜花叶病毒19S启动子、花椰菜花叶病毒35S启动子、玄参花叶病毒35S启动子、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄色斑点病毒启动子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基启动子、稻胞质性丙糖磷酸异构酶启动子、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶启动子、稻肌动蛋白1启动子、甘露碱合酶启动子，以及章鱼碱合酶启动子。
32．权利要求30的植物细胞，其中第一DNA序列编码一种天然EPSPS酶、突变EPSPS酶，或一种草甘膦降解酶。
33．权利要求30的植物细胞，其中第二启动子选自TA29烟草绒毡层特异启动子、PA1苯基苯乙烯酮二氢黄酮异构酶启动子、PA2苯基苯乙烯酮二氢黄酮异构酶启动子、SLG启动子、LAT启动子、聚半乳糖醛酸外切酶启动子、Zmc13启动子、LAT52启动子、LAT59启动子，以及psgB6-1启动子。
34．权利要求30的植物细胞，其中第二RNA序列与第一RNA序列的蛋白编码区互补。
35．权利要求30的植物细胞，其中第二RNA序列与第一RNA序列的非翻译区互补。
36．权利要求30的植物细胞，其中第三启动子选自花椰菜花叶病毒19S启动子、花椰菜花叶病毒35S启动子、玄参花叶病毒35S启动子、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄色斑点病毒启动子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基启动子、稻胞质性丙糖磷酸异构酶启动子、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶启动子、稻肌动蛋白1启动子、甘露碱合酶启动子，以及章鱼碱合酶启动子。
37．权利要求30的植物细胞，其中所述植物选自玉米、小麦、稻、芸苔、燕麦、大麦、紫苜蓿、胡萝卜、棉花、油籽油菜、甜菜、向日葵、大豆、番茄、黄瓜，以及南瓜。
38．一种转基因植株，该植株包含权利要求30的植物细胞。
39．包含权利要求30的植物细胞的种子。
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AU (1) AU2992999A (zh)
BR (1) BR9908631A (zh)
WO (1) WO1999046396A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103635483A (zh) * 2011-07-01 2014-03-12 孟山都技术公司 用于选择性调控蛋白质表达的方法和组合物
WO2022053009A1 (zh) * 2020-09-10 2022-03-17 隆平生物技术(海南)有限公司 重组启动子、基因表达盒及其在植物育种中的应用

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2415327A1 (en) 2000-07-13 2002-01-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Zmaxig1 polynucleotides and methods of use
EP1174512A1 (en) * 2000-07-17 2002-01-23 Peter Stamp Seed composition and method for reducing or preventing the release of genetically manipulated pollen
US6646186B1 (en) 2000-07-26 2003-11-11 Stine Seed Farm Inc. Hybrid soybeans and methods of production
WO2002027004A2 (en) * 2000-09-29 2002-04-04 Monsanto Technology Llc Glyphosate tolerant wheat plant 33391 and compositions and methods for detection thereof
AR031645A1 (es) * 2000-12-07 2003-09-24 D & Pl Technology Holding Corp Esterilidad macho en las plantas dicotiledoneas, inducida por el glyphosate
DE10163163A1 (de) 2001-12-20 2003-07-03 Basf Ag Verfahren zur Herstellung hochfunktioneller, Hyperverzweigter Polyester durch enzymatische Veresterung
US7230168B2 (en) 2001-12-20 2007-06-12 The Curators Of The University Of Missouri Reversible male sterility in transgenic plants by expression of cytokinin oxidase
AU2003207323B2 (en) 2002-02-26 2007-09-13 Syngenta Limited A method of selectively producing male or female sterile plants
WO2004072235A2 (en) 2003-02-12 2004-08-26 Monsanto Technology Llc Cotton event mon 88913 and compositions and methods for detection thereof
WO2004082366A2 (en) * 2003-03-19 2004-09-30 Regents Of The University Of Minnesota Methods to confer enhanced floral properties to plants
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
ZA200803234B (en) * 2005-10-13 2009-01-28 Monsanto Technology Llc Methods for producing hybrid seed
EA023885B1 (ru) 2005-10-13 2016-07-29 МОНСАНТО ТЕКНОЛОДЖИ, ЭлЭлСи Конструкция рекомбинантной днк для индуцирования стерильности в трансгенном растении, стерильные трансгенные растения и способы получения гибридных семян
EP2059601A2 (en) * 2006-10-03 2009-05-20 Monsanto Technology, LLC Methods for hybrid corn seed production and compositions produced therefrom
US8946511B2 (en) 2006-10-12 2015-02-03 Monsanto Technology Llc Plant microRNAs and methods of use thereof
BR112012012404B1 (pt) * 2009-11-23 2019-03-06 Monsanto Technology Llc "molécula de dna reconbinante de amplicon, sonda de dna, par de moléculas de dna mètodo para detectar a presença de uma molècula de dna e kit de detecçao de dna".
CN103222423B (zh) * 2013-05-14 2014-11-12 安徽省农业科学院水稻研究所 一种水稻杂交育种材料及其培育方法与应用
HUE061144T2 (hu) 2015-07-22 2023-05-28 Monsanto Technology Llc Eljárások és készítmények fehérjeexpresszió szelektív szabályozására

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ227835A (en) * 1988-02-03 1992-09-25 Paladin Hybrids Inc Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
CA2088661C (en) * 1990-08-31 2001-12-18 Gerard F. Barry Glyphosate tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103635483A (zh) * 2011-07-01 2014-03-12 孟山都技术公司 用于选择性调控蛋白质表达的方法和组合物
WO2022053009A1 (zh) * 2020-09-10 2022-03-17 隆平生物技术(海南)有限公司 重组启动子、基因表达盒及其在植物育种中的应用

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