CN1693462A

CN1693462A - 东北白桦Myb转录因子基因

Info

Publication number: CN1693462A
Application number: CN 200510009908
Authority: CN
Inventors: 杨传平; 魏继承; 王超; 姜静; 刘桂丰; 刘关君
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2005-04-19
Filing date: 2005-04-19
Publication date: 2005-11-09

Abstract

东北白桦Myb转录因子基因，它属于基因工程技术领域。本发明采用抑制性消减cDNA文库构建，对文库克隆进行EST分析，从大量基因序列中筛选获得了该基因的部分序列，该序列5’端编码区完整，3’端不完整，应用3’RACE技术克隆出其全长cDNA序列，用Pfam程序中的蛋白质搜索对该蛋白进行家族预测，确定该基因为Myb蛋白家族，cDNA全长1298bp，编码区位置在44～1156碱基之间，长1113bp，包含370个氨基酸。Myb转录因子基因为花青素合成的关键调控基因，通过结合顺式元件MBS II调节下游基因的表达赋予花色，它具有很宽的市场前景，应用潜力在于未来通过基因工程手段塑造观赏植物，可用于花色调节和塑造彩叶植物。

Description

东北白桦Myb转录因子基因

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域。

背景技术：

抑制性消减杂交是一种筛选差异表达基因的有效策略，其优点在于能够通过实现高低丰度表达基因的均一化，使各基因获得均等的测序机会，这对于筛选在发育过程中起关键作用的调控基因而言，可以达成事半功倍的效果。但是，该技术有其自身的缺点，即只能获得基因片段。作为EST筛选的有力后续手段，RACE技术已获得了极大的改进和完善。近年来，RACE成功地应用于许多基因的分离，充分显示了其巨大的应用潜力。自1983年获得第一株转基因植株以来，植物基因工程的发展日新月异，先后已有上百种转基因植物问世，其中部分转基因产品已进入商品化阶段。目的基因的分离与克隆是植物基因工程的第一步，但现有的具有市场前景的有用基因的种类和数量还不够多，并已日益成为限制植物基因工程研究和应用的“瓶颈”。

发明内容：

本发明针对现有的具有市场前景的有用基因的种类和数量还不够多的不足，提供一种具有市场前景的东北白桦Myb转录因子基因。本发明采用抑制性消减cDNA文库构建，对文库克隆进行EST分析，从大量基因序列中筛选获得了该基因的部分序列，该序列5’端编码区完整，3’端不完整，应用3’RACE技术克隆出其全长cDNA序列，用Pfam( pfam.wustl.edu/)程序中的蛋白质搜索(Protein search)对该蛋白进行家族预测，确定该基因为Myb蛋白家族，其cDNA全长是1298bp，编码区位置在44～1156碱基之间，长1113bp，包含370个氨基酸，编码区的基因序列为：

ATGCGTCGTTCTCAATGCTGCGAGAACGTGGGGCTGAAGAAAGGG

CCGTGGACCCCTGAGGAAGACCAGAAGCTTTTGGCTTACATCGAAGAA

CATGGCCATGGAAGCTGGCGAGCCTTGCCTACAAAGGCTGGGCTGCAG

AGATGTGGGAAGAGCTGTAGACTGAGATGGACTAATCACCTCAGACCT

GACATTAAAAGAGGGAAGTTTAGCTTGCAGGAAGAACACACCATCATT

CAGCTCCACGCTCTACTCGGCAACAGATGGTCTGCTATAGCAACTCACT

TGCCCAAAAGAACCGATAACGAGATCAAGAACTACTGGAACACGCATC

TGAAGAAAAGACTAACTAAGATGGGCATCGATCCCATGACCCACAAGC

CCAAAAGCGATGCCCTTAGCTCCGGCAGTGACCAGTACTCCAAAGGCA

CAGCCAATTTAAGCCACATGGCTCAGTGGGAAAGC GCACGGCTGGAA

GCCGAAGCCAGACTGGTAAGAGAGTCCAAGCTTGTGTCTAACCCTATC

CAACAACAGCTCGATTTTAGCACTCCTGCTCCGGCTCAGCTCATCATCA

ACAAACCCGCACTACCTCCACGTCTTGACGTACTCAAAGCTTGGCAAG

GGGCATGGTCAAAGTCAACGAGTACCAGCATGTTCCCAATCCCCGGCG

ACGACCTCGAGTCTCCAACATCAACGTTGAACTTCCCGGAGAACGCAC

TCCCCGTCCAAACTGTTGCGCTCAATGAAAGCATAGTGACTTCAGTACT

TGATTTCGCCAAAAGCTCAGTTACGTGCAATGGAGGGTTTATCAAAGA

AAGATCGGATATTGACACGATGGCAATGCAGGACATGACGTATGCTACG

GAAAGTGCATGGCTTGTGGACTCTTTCAGGGCCGGGAATGAAAACATG

CCTTTCTCAACTATAATGGAAGGCTTCACCGATACATTGGCGTATAATTG

TGACGACCAGAACTCGTTGATGGCCGGAGACAACTTGGATAATAGGGG

TAAAAGCTGGAGTACTGGTGACTTTGAGGACAATAATAAGAATTGCTG

GAATGGCATGCTCAGTCTGCTGAATGCTTGGTCATCTGGTTCGCCCGTG

CTCTGA。

本发明的Myb转录因子基因为花青素合成的关键调控基因，该基因通过结合顺式元件MBSII调节下游基因(如类黄酮羟化酶基因)的表达，赋予花色。本发明的Myb转录因子基因具有很宽的市场前景，其应用潜力在于未来通过基因工程手段塑造观赏植物，它一方面可用于花色调节；另一方面可通过使用叶中特异表达启动子驱动，塑造彩叶植物。

具体实施方式：

具体实施方式一：本实施方式采用抑制性消减cDNA文库构建，对文库克隆进行EST分析，从大量基因序列中筛选获得了该基因的部分序列，该序列5’端编码区完整，3’端不完整，应用3’RACE技术克隆出其全长cDNA序列，用Pfam( pfam.wustl.edu/)程序中的蛋白质搜索(Protein search)对该蛋白进行家族预测，确定该基因为Myb蛋白家族。具体提取、测试方法如下：

一、提取东北白桦雌花序的总RNA：

a、向离心管中加入CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液(2％(w/v)CTAB，NaCl1.4mol/L，四硼酸钠0.025mol/L，pH＝9)和10％(V/V)β-巯基乙醇，65℃水浴锅中预热5分钟；b、将白桦雌花序不同时期材料分别用液氮冷却研磨，加入到提取液中，混匀，65℃水浴10分钟；c、加入等体积的Tris酚/氯仿混合液，12000g离心5分钟；d、取上清液，重复酚/氯仿抽提一次，向上清液中加入等体积氯仿，12000g离心5分钟；e、取上清，加入终浓度为2mol/L的LiCl，冰浴放置3小时，15000g、4℃离心15分钟，弃上清，用70％乙醇清洗沉淀，溶于适量的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水中待用。

二、以源自白桦雌花序最后时期材料的总RNA为起始材料，使用BD公司的特定反转录酶(Power Script Reverse Transcriptase)和SMART(SwitchingMechanism At 5′end ofRNA Transcript)策略，合成driver cDNA，以源自白桦雌花序其它时期材料的总RNA为起始材料，以同样手段合成tester cDNA。

三、用BD公司的消减杂交试剂试剂盒(Clontech PCR-Select cDNASubtraction Kit)进行抑制性消减杂交，文库构建使用Promega公司的T载体(pGEM-T System)完成。

四、对文库克隆进行测序，引物为M13通用引物，测序仪为AmershamPharmacia公司的MegaBACE^TM 1000DNA序列分析仪。通过对文库克隆的Blastx分析获得Myb基因的片段，该片段长度为461bp，具有完整的5’端，但3’端不完整，序列如下：

>MYB

ACTTTTAGAGGCCTAAAGTTTTTTAACTTGGTTTGTATCGGAAATGCGT

CGTTCTCAATGCTGCGAGAACGTGGGGCTGAAGAAAGGGCCGTGGAC

CCCTGAGGAAGACCAGAAGCTTTTGGCTTACATCGAAGAACATGGCCA

TGGAAGCTGGCGAGCCTTGCCTACAAAGGCTGGGCTGCAGAGATGTG

GGAAGAGCTGTAGACTGAGATGGACTAATTACCTCAGACCTGACATTA

AAAGAGGGAAGTTTAGCTTGCAGGAAGAACACACCATCATTCAGCTCC

ACGCTCTACTCGGCAACAGATGGTCTGCTATAGCAACTCACTTGCCCAA

AAGAACCGATAACGAGATCAAGAACTACTGGAACACGCATCTGAAGA

AAAGACTAACTAAGATGGGCATCGATC CCATGACCCACAAGCCCAAAA

GCGATGCCCTTAGCTCCGGCAGTGACCAGT。

五、根据上面获得的已知的基因序列设计3’RACE引物：myb：5’-CTTGGTTTGTATCGGAAATGCGTCG-3’，巢式引物nmyb：5’-GACCCCTGAGGAAGACCAGAAGC-3’，然后通过3’RACE方法获得完整的基因。

用RACE试剂盒(RACE克隆试剂盒为Smart RACE cDNA AmplificationKit(BD Biosciences公司))进行克隆全长cDNA序列。用1μg总RNA进行反转录，具体所用的试剂及操作步骤均严格参照按试剂盒说明书，反转录后将反转录溶液用TE缓冲液(试剂盒提供)稀释到100μL，PCR反应体系严格参照试剂盒说明书。PCR反应使用单向PCR(one-side PCR)程序。首轮PCR以myb引物和NUP引物组合，程序为：94℃预变性1min，94℃30sec，68℃30sec，72℃ 1min 30sec，30个循环；将首轮产物稀释100倍，第二轮PCRnmyb引物和NUP引物组合，程序为：以94℃预变性5min，94℃30sec，68℃30sec，72℃ 1min30sec，30个循环；72℃保温15min。扩增后获得了1条长度约为1.2kb的特异扩增片段，将该片段与pGEM-T载体连接，将连接产物转化大肠杆菌TOP10，将***片段与目的片段大小相符合的克隆进行测序，测序结果为：

GACCCCTGAGGAAGACCAGAAGCTTTTGGCTTACATCGAAGAACA

TGGCCATGGAAGCTGGCGAGCCTTGCCTACAAAGGCTGGGCTGCAGA

GATGTGGGAAGAGCTGTAGACTGAGATGGACTAATCACCTCAGACCTG

ACATTAAAAGAGGGAAGTTTAGCTTGCAGGAAGAACACACCATCATTC

AGCTCCACGCTCTACTCGGCAACAGATGGTCTGCTATAGCAACTCACTT

GCCCAAAAGAACCGATAACGAGATCAAGAACTACTGGAACACGCATCT

GAAGAAAAGACTAACTAAGATGGGCATCGATCCCATGACCCACAAGCC

CAAAAGCGATGCCCTTAGCTCCGGCAGTGACCAGTACTCCAAAGGCAC

AGCCAATTTAAGCCACATGGCTCAGTGGGAAAGCGCACGGCTGGAAG

CCGAAGCCAGACTGGTAAGAGAGTCCAAGCTTGTGTCTAACCCTATCC

AACAACAGCTCGATTTTAGCACTCCTGCTCCGGCTCAGCTCATCATCAA

CAAACCCGCACTACCTCCACGTCTTGACGTACTCAAAGCTTGGCAAGG

GGCATGGTCAAAGTCAACGAGTACCAGCATGTTCCCAATCCCCGGCGA

CGACCTCGAGTCTCCAACATCAACGTTGAACTTCCCGGAGAACGCACT

CCCCGTCCAAACTGTTGCGCTCAATGAAAGCATAGTGACTTCAGTACTT

GATTTCGCCAAAAGCTCAGTTACGTGCAATGGAGGGTTTATCAAAGAA

AGATCGGATATTGACACGATGGCAATGCAGGACATGACGTATGCTACGG

AAAGTGCATGGCTTGTGGACTCTTTCAGGGCCGGGAATGAAAACATGC

CTTTCTCAACTATAATGGAAGGCTTCACCGATACATTGGCGTATAATTGT

GACGACCAGAACTCGTTGATGGCCGGAGACAACTTGGATAATAGGGGT

AAAAGCTGGAGTACTGGTGACTTTGAGGACAATAATAAGAATTGCTGG

AATGGCATGCTCAGTCTGCTGAATGCTTGGTCATCTGGTTCGCCCGTGC

TCTGAAAGTGTCGAAAAATTGTTTGAGATATTGCAGGATAATTAGGTGT

TACGTTGCATTGCATCACAACTAATGTAATAATAAGTAGGACTTCCAAAT

AAGAAGTTTTTTAATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。

将测序结果同原序列进行拼接，使用blastX对其进行序列比对，经氨基酸序列推导后，分析结果如下：该序列全长1298bp，编码区长1113bp，编码氨基酸370个，5’非翻译区长占43bp，3’非翻译区长142bp。

用Pfam( pfam.wustl.edu/)程序中的蛋白质搜索(Protein search)对该蛋白进行家族预测，确定该基因为Myb蛋白家族。结果如下：Myb_DNA-binding：domain 1 of 2，from 14 to 61：score 50.6，E＝4.6e-12

*->rgrWtaeEdellveavekhGkgfgIrlsltkanWkkIaekmgpgssn

+g+Wt+eEd++l++++e+hG+g +W+ ++ k g+

14KGPWTPEEDQKLLAYIEEHGHG----------SWRALPTKAGLQ---47

nvegrtaeqcklryykyk<-*

r++++c+lr+ +++

48----RCGKSCRLRWTNHL61Myb_DNA-binding：domain 2 of 2，from 67 to 112：score 47.0，E＝5.5e-11

*->rgrWtaeEdellveavekhGkgfgIrlsltkanWkkIaekmgpgssn

rg+++ +E+ ++++++++G++ W+ Ia +++

67RGKFSLQEEHTIIQLHALLGNR-----------WSAIATHLP-----97

nvegrtaeqcklryykyk<-*

rt++++k++++ ++

98---KRTDNEIKNYWNTHL 112

序列表

<110>东北林业大学

<120>东北白桦Myb转录因子基因

<160>1

<210>1

<211>1061

<212>mRNA

<213>Myb转录因子基因序列编码区及编码区的氨基酸序列

<400>1

1 ATGCGTCGTTCTCAATGCTGCGAGAACGTGGGGCTGAAGAAAGGGCCGTGGACCCCTGAG

M R R S Q C C E N V G L K K G P W T P E

61 GAAGACCAGAAGCTTTTGGCTTACATCGAAGAACATGGCCATGGAAGCTGGCGAGCCTTG

E D Q K L L A Y I E E H G H G S W R A L

121 CCTACAAAGGCTGGGCTGCAGAGATGTGGGAAGAGCTGTAGACTGAGATGGACTAATCAC

P T K A G L Q R C G K S C R L R W T N H

181 CTCAGACCTGACATTAAAAGAGGGAAGTTTAGCTTGCAGGAAGAACACACCATCATTCAG

L R P D I K R G K F S L Q E E H T I I Q

241 CTCCACGCTCTACTCGGCAACAGATGGTCTGCTATAGCAACTCACTTGCCCAAAAGAACC

L H A L L G N R W S A I A T H L P K R T

301 GATAACGAGATCAAGAACTACTGGAACACGCATCTGAAGAAAAGACTAACTAAGATGGGC

D N E I K N Y W N T H L K K R L T K M G

361 ATCGATCCCATGACCCACAAGCCCAAAAGCGATGCCCTTAGCTCCGGCAGTGACCAGTAC

I D P M T H K P K S D A L S S G S D Q Y

421 TCCAAAGGCACAGCCAATTTAAGCCACATGGCTCAGTGGGAAAGCGCACGGCTGGAAGCC

S K G T A N L S H M A Q W E S A R L E A

481 GAAGCCAGACTGGTAAGAGAGTCCAAGCTTGTGTCTAACCCTATCCAACAACAGCTCGAT

E A R L V R E S K L V S N P I Q Q Q L D

541 TTTAGCACTCCTGCTCCGGCTCAGCTCATCATCAACAAACCCGCACTACCTCCACGTCTT

F S T P A P A Q L I I N K P A L P P R L

601 GACGTACTCAAAGCTTGGCAAGGGGCATGGTCAAAGTCAACGAGTACCAGCATGTTCCCA

D V L K A W Q G A W S K S T S T S M F P

661 ATCCCCGGCGACGACCTCGAGTCTCCAACATCAACGTTGAACTTCCCGGAGAACGCACTC

I P G D D L E S P T S T L N F P E N A L

721 CCCGTCCAAACTGTTGCGCTCAATGAAAGCATAGTGACTTCAGTACTTGATTTCGCCAAA

P V Q T V A L N E S I V T S V L D F A K

781 AGCTCAGTTACGTGCAATGGAGGGTTTATCAAAGAAAGATCGGATATTGACACGATGGCA

S S V T C N G G F I K E R S D I D T M A

841 ATGCAGGACATGACGTATGCTACGGAAAGTGCATGGCTTGTGGACTCTTTCAGGGCCGGG

M Q D M T Y A T E S A W L V D S F R A G

901 AATGAAAACATGCCTTTCTCAACTATAATGGAAGGCTTCACCGATACATTGGCGTATAAT

N E N M P F S T I M E G F T D T L A Y N

961 TGTGACGACCAGAACTCGTTGATGGCCGGAGACAACTTGGATAATAGGGGTAAAAGCTGG

C D D Q N S L M A G D N L D N R G K S W

1021 AGTACTGGTGACTTTGAGGACAATAATAAGAATTGCTGGAATGGCATGCTCAGTCTGCTG

S T G D F E D N N K N C W N G M L S L L

1061 AATGCTTGGTCATCTGGTTCGCCCGTGCTCTGA

N A W S S G S P V L *

Claims

1、东北白桦Myb转录因子基因，其特征在于Myb转录因子基因的cDNA全长1298bp，编码区位置在44～1156碱基之间，长1113bp，包含370个氨基酸，编码区的基因序列为：

ATGCGTCGTTCTCAATGCTGCGAGAACGTGGGGCTGAAGAAAGGGCCGTGGACCCCTGAGGAAGACCAGAAGCTTTTGGCTTACATCGAAGAACATGGCCATGGAAGCTGGCGAGCCTTGCCTACAAAGGCTGGGCTGCAGAGATGTGGGAAGAGCTGTAGACTGAGATGGACTAATCACCTCAGACCTGACATTAAAAGAGGGAAGTTTAGCTTGCAGGAAGAACACACCATCATTCAGCTCCACGCTCTACTCGGCAACAGATGGTCTGCTATAGCAACTCACTTGCCCAAAAGAACCGATAACGAGATCAAGAACTACTGGAACACGCATCTGAAGAAAAGACTAACTAAGATGGGCATCGATCCCATGACCCACAAGCCCAAAAGCGATGCCCTTAGCTCCGGCAGTGACCAGTACTCCAAAGGCACAGCCAATTTAAGCCACATGGCTCAGTGGGAAAGCGCACGGCTGGAAGCCGAAGCCAGACTGGTAAGAGAGTCCAAGCTTGTGTCTAACCCTATCCAACAACAGCTCGATTTTAGCACTCCTGCTCCGGCTCAGCTCATCATCAACAAACCCGCACTACCTCCACGTCTTGACGTACTCAAAGCTTGGCAAGGGGCATGGTCAAAGTCAACGAGTACCAGCATGTTCCCAATCCCCGGCGACGACCTCGAGTCTCCAACATCAACGTTGAACTTCCCGGAGAACGCACTCCCCGTCCAAACTGTTGCGCTCAATGAAAGCATAGTGACTTCAGTACTTGATTTCGCCAAAAGCTCAGTTACGTGCAATGGAGGGTTTATCAAAGAAAGATCGGATATTTGACACGATGGCAATGCAGGACATGACGTATGCTACGGAAAGTGCATGGCTTGTGGACTCTTTCAGGGCCGGGAATGAAAACATGCCTTTCTCAACTATAATGGAAGGCTTCACCGATACATTGGCGTATAATTGTGACGACCAGAACTCGTTGATGGCCGGAGACAACTTGGATAATAGGGGTAAAAGCTGGAGTACTGGTGACTTTGAGGACAATAATAAGAATTGCTGGAATGGCATGCTCAGTCTGCTGAATGCTTGGTCATCTGGTTCGCCCGTGCTCTGA。