CN1674931A - T细胞受体cdr3序列和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明大体涉及自身免疫病，如多发性硬化(MS)、类风湿关节炎(RA)及其它疾病的治疗领域。本发明公开了通过利用T细胞受体肽治疗和监控自身免疫病的方法。本发明也公开了在MS患者群体中发现的T细胞受体的核酸和肽序列。

Description

T细胞受体CDR3序列和检测方法
发明领域
本发明大体涉及自身免疫病，如多发性硬化(MS)的治疗领域。更具体而言，本发明涉及在某些MS患者中发现的T细胞受体核酸和肽，以及检测这些序列的方法。另外，本发明涉及T细胞受体肽序列在治疗自身免疫病，如MS方面的用途。
发明背景
位于细胞毒性T淋巴细胞或T辅助细胞上、由T细胞受体(TCR)形成的细胞间识别复合体，和位于抗原呈递细胞(APC)上的MHC/肽复合体是在多种类型的细胞间相互作用中的共同识别成分，它们在个体生物体内T细胞所有组成成分的发育期间(正选择；负选择；外周存活)和适应性免疫应答的控制(T辅助细胞)与效应期(T杀伤细胞)期间均可活化TCR。
在适应性免疫应答中，抗原由超变分子，例如抗体或TCR识别，这些超变分子的表达具有充分多样的结构，因而能够识别任何抗原。抗体可结合抗原表面的任意部分。而TCR则仅限于通过与特定抗原来源的短肽结合，而感知该抗原的存在，其中该抗原呈递在与主要组织相容性复合体(MHC)的I或II类分子结合的APC表面。肽/MHC复合体的TCR识别可触发T细胞的活化(克隆扩充)。
TCR是由两条链组成的异二聚体，这两条链可以是αβ(α-β)或γδ(γ-δ)。TCR的结构与免疫球蛋白(Ig)非常相似。每条链均含有两个胞外域，即免疫球蛋白折叠。氨基末端区域高度可变，被称为可变(V)区。最接近膜的区域是恒定(C)区。上述两个区与免疫球蛋白的两个区相似，类似Fab片段。每条链的V区均含有三个互补决定区(CDR)。各TCR链在邻近膜处均具有一个带半胱氨酸残基的短连接序列，在两条链之间形成了二硫键。
编码αβ和γδ异二聚体的基因仅在T细胞系中表达。四个TCR基因座(α、β、γ和δ)均具有与Ig的基因座非常相似的种系组构。α和γ链均为V和J片段重排的产物，而β和δ链则为V、D和J片段重排的产物。对TCR链而言，除δ链基因片段位于α链的V和J基因片段之间外，其它基因片段均位于不同染色体上。δ链基因片段的位置具有下述意义：α链基因片段的有效重排去除了δ链的C基因，因此在特定细胞中，αβ异二聚体不能与γδ受体共表达。
小鼠体内存在大约100个Vα和50个Jα基因片段，并仅存在一个Cα片段。δ链基因家族含有大约10个V、2个D和2个J基因片段。β链基因家族含有20-30个V片段和两个均含有1个Dβ、6个Jβ和1个Cβ的相同重复。最后，γ链基因家族含有7个V和3个不同的J-C重复。人体内的该组构与小鼠类似，但片段数量不同。
α和β链中基因片段的重排与Ig中的情况相似。α链与Ig的轻链相似，由V、J和C基因片段编码。β链则与Ig的重链相似，由V、D和J基因片段编码。α链基因片段的重排导致VJ连接，β链重排则导致VDJ连接。重排基因转录、RNA加工并翻译后，α和β链通过T细胞膜中的二硫键被表达连接。
TCR基因片段的侧翼为含有一个七聚体和一个九聚体的识别信号序列(RSS)，以及一个包含12个核苷酸(一个转角)或23个核苷酸(两个转角)的间插序列。对Ig而言，由重组活化基因(RAG-1和RAG-2)编码的酶负责重组过程。RAG1/2识别RSS并以在Ig重排中的相同方式连接V-J和V-D-J片段。简言之，上述酶在基因片段与RSS之间切下一条DNA链，并催化编码序列中形成发夹结构。信号序列随后被切除。
α链中V和J片段与β链中V、D和J片段的组合连接产生了大量可能的分子，从而造成了TCR的多样性。通过可变连接基因片段也可在TCR中实现多样性。与Ig相比，β和δ基因片段可以可变方式连接。β和δ基因片段中的RSS侧翼基因片段可在β链中形成VJ和VDJ，在δ链上形成VJ、VDJ和VDDJ。和在Ig的情况中一样，基因片段连接中的可变性也可产生多样性。
TCR中被称为互补决定区(CDR)的超变环可识别由MHC分子与结合肽形成的复合表面。α和β的CDR2环仅接触APC表面的MHC分子，而CDR1和CDR3环则与上述肽和MHC分子二者均接触。与Ig相比，TCR在CDR1和CDR2中的多样性更为有限。不过，TCR中CDR3的多样性高于Ig，因为TCR可连接多于1个的D片段，从而提高了连接多样性。
许多自身免疫病的病理被认为是对生物体内存在的自身抗原的自身免疫T细胞应答的缘故。与克隆选择模式相反，胸腺中并非缺失所有自身反应性T细胞。这些具有适合广谱自身抗原的TCR的T细胞代表了正常T细胞所有组成成分的一部分，并在外周自然循环。自身反应性T细胞在进化期间为何可以经历胸腺中的分化，并被容纳在外周的原因尚未清楚。虽然其生理学作用尚未被充分理解，但当被活化时，这些自身反应性T细胞在诱导自身免疫病理方面便具有了潜在威胁。自身反应性T细胞也可分离自并未患有自身免疫病的正常个体中。已被证实的是其自身反应性的抗原识别不足以介导自身破坏的过程。自身反应性T细胞致病的前提之一是其必须被活化。
自身反应性T细胞被指出涉及了自身免疫病，如多发性硬化(MS)和类风湿关节炎(RA)的病理。MS中自身反应性T细胞的病理通常被认为是T细胞应答于髓磷脂抗原，尤其是髓鞘碱性蛋白(MBP)的缘故。与对照个体相比，MBP反应性T细胞被发现经历体内活化，以较高的前体频率出现在MS患者体内的血液和脑脊髓液中。上述MBP反应性T细胞产生了Th1细胞因子，如IL-2、TNF和γ-干扰素，而这些细胞因子有助于炎症细胞迁移进中枢神经***，并加剧MS中的髓鞘破坏性炎症应答。
MBP反应性T细胞也被证明涉及了动物体内实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)的病理，该病类似多发性硬化。通过注射乳化于佐剂中的MBP，或被动地通过注射MBP反应性T细胞系和来源自MBP-敏化动物的克隆，可在易感动物体内主动诱导EAE。体外活化时，诱导EAE所需MBP反应性T细胞的量非常少，而具有相同反应性的静息T细胞即使100倍上述量以上仍然不能介导上述疾病。
已证实接种灭活的MBP-反应性T细胞可减少EAE中的MBP反应性T细胞，该操作被称为T细胞接种，被用于预防和治疗EAE。Ben-Nun et al.，Nature 292：60-61(1981)。虽然T细胞接种的潜在机制尚未被完全理解，还是有一种看法是通过与TCR的相互作用，以及据推测可与T细胞活化标记反应的所谓抗-ergotypicT细胞应答，从而涉及独特型调节网络。独特型和抗-ergotypic调节网络被认为是T细胞接种所诱导的保护性免疫的基础，因为T细胞接种所赋予的保护性免疫对接种所用自身免疫T细胞可诱导的疾病具有特异性。另外，分离自免疫的啮齿类的抗独特型T细胞可特异性识别免疫T细胞克隆/系，而不识别表达了稀疏TCR结构特征的T细胞。抗独特型T细胞识别的TCR决定簇被认为最可能位于CDR3或CDR2内，与根据这些区域内的特征序列多样性所预测的结果相同。
在EAE中，致脑炎MBP-反应性T细胞被限定在MBP上非常有限的几个表位。这些在致病T细胞应答多样性方面的限制允许特定免疫干扰。在预防敏化动物体内EAE的发展方面，人们针对TCR的Vβ区已相应设计了多种治疗方案。例如，已有针对Vβ基因产物的单克隆抗体，和以负责的Vβ基因的CDR2区为基础设计的肽疫苗。
对EAE的若干研究已延伸至人类自身免疫病。例如，与TCR Vβ5.2相应的肽已被应用在治疗MS患者的临床试验中，Vβ14肽已被用于接种RA患者。美国专利No.5,614,192(Vandenbark)公开了利用含有15-30个氨基酸，且包含至少一部分CDR2的免疫原性TCR肽治疗自身免疫病的方法。美国专利No.6,303,314(Zhang)公开了利用某些免疫原性TCR肽，并结合免疫原性T细胞活化标记肽治疗自身免疫病的方法。
通过测定在自身免疫病，诸如MS患者的自身反应性TCR中发现了哪些共有基序，便可改进TCR肽的接种。这些共有基序既可作为肽疫苗的基础，为减少具有包含上述基序的TCR的T细胞而活化MS患者体内的抗独特型免疫应答，也可作为制备特定抗体所用的目标物，该抗体可发挥阻断功能或直接减少具有包含上述基序的TCR的T细胞。
因此，确定在自身免疫病患者来源的自身反应性T细胞的TCR中被特异性发现的共有基序的氨基酸序列是人们所希望的。能够方便地通过常规方法，诸如PCR检测患者样品中的上述基序也是人们所希望的。另外，利用与检测的基序一致或由其衍生的肽治疗自身免疫病患者也是人们所希望的。利用可特异性结合上述基序从而治疗自身免疫病患者的抗体也是人们所希望的。
美国专利No.6,303,314(Zhang)公开了在一个Vβ13.1 T细胞亚型的TCR中发现的一个共有基序，“LGRAGLTY基序”，其氨基酸序列为Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr(SEQ ID NO：10)，以及通过PCR迅速检测该基序的方法。在可识别MBP的氨基酸83-99(下文参见“MBP83-99”)的若干自身反应性T细胞的若干TCR中也发现了该基序。基于该LGRAGLTY基序的肽可被用于接种若干患者，以治疗或预防与Vβ13.1-LGRAGLTY相关的自身免疫病(如MS)。
由于LGRAGLTY基序仅存在于某些可识别MBP83-99的TCR中，因此人们仍然需要鉴定其它TCR序列，更具体而言是通常由MBP反应性T细胞表达的CDR序列。另外，人们还需要检测其它TCR序列，包括通常由MBP反应性T细胞表达的CDR序列的方法。最后，人们还需要开发针对与其它TCR序列，更具体而言是与CDR序列相关的自身免疫病的疗法。
发明详述
为帮助理解本发明，下文定义了若干术语。
“PCR”指聚合酶链反应，例如，美国专利No.4,683,202(1987年7月28日授予Mullis专利权)所一般性描述的PCR方法，将其引入在此作为参考。PCR是一种扩增技术，其中所选寡核苷酸或引物均可在聚合剂(如DNA或RNA聚合酶)和核苷三磷酸的存在条件下与核酸模板杂交，从而可以由该引物形成延伸产物。随后，可将上述产物变性，并作为循环反应中的模板，扩增现有核酸的数和量，而该现有核酸可能有助于对上述产物的后续检测。本领域已知多种PCR技术，可与此处所公开的内容结合应用。
“肽”指可激发针对特定肽或多肽序列的免疫应答的肽，而无论其是天然、合成还是修饰形式。
“引物”指可充当核苷酸合成的一个起点，并与模板分子的特定核苷酸序列充分互补的寡核苷酸，而无论其是天然、合成还是修饰形式。
“探针”指可与充分互补核苷酸序列特异性结合的寡核苷酸，而无论其是天然、合成还是修饰形式。
在核苷酸序列情况中的“衍生自”指核苷酸序列不限于所述特定序列，还包括上述序列中的变异，该变异可能包括某种程度的核苷酸添加、缺失、替代或修饰，其变异程度仍将使所述序列的变异保留与所述序列的互补链特异性结合的能力。在肽或多肽序列情况中的“衍生自”指肽或多肽不限于所述特定序列，还包括上述序列中的变异，该变异可能包括某种程度的氨基酸添加、缺失、替代或修饰，其变异程度仍将使所述序列中的变异保留激发对所述序列的免疫应答的能力。
“免疫原性”被用于描述肽或多肽时，指肽或多肽可诱导免疫应答，或者是T细胞介导，或者通过抗体，或二者均存在。“抗原性”指肽或多肽可以游离形式被抗体识别，和/或在MHC分子环境中被抗原特异性T细胞识别。
“免疫相关疾病”指病理涉及免疫***的疾病。免疫相关疾病的亚型是自身免疫病。自身免疫病包括但不仅限于，类风湿关节炎、重症肌无力、多发性硬化、***性红斑性狼疮、自身免疫性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎)、突眼性甲状腺肿、炎性肠病、自身免疫葡萄膜视网膜炎、多肌炎和某些类型的糖尿病。根据本公开内容，本领域技术人员可容易地理解其它通过本发明的组合物和方法可治疗的自身免疫病。
“T细胞介导的疾病”指T细胞识别正常存在于生物体内的肽而导致的疾病。
“疗法”或“治疗”当涉及保护动物不受疾病侵袭时，指预防、抑制、阻抑或完全消除疾病。预防疾病包括在疾病发作前对动物施用本发明的组合物。抑制疾病包括在疾病被诱发后，但在出现临床表现前对动物施用本发明的组合物。阻抑疾病包括在疾病出现临床表现后对动物施用本发明合成物。
第一个方面中，本发明涉及长度大约为4-20个氨基酸的肽，该肽包含SEQ ID NO：4、5或6或由其衍生的序列中的至少4个连续氨基酸。该肽的长度也可大约为4-12个氨基酸，包含(i)SEQ ID NO：4或6或由其衍生的序列中的4、5、6或7个连续氨基酸，(ii)SEQ ID NO：5或由其衍生的序列中的4、5、6、7或8个连续氨基酸。本发明肽的长度也可大约为4-20个氨基酸，包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列。本发明肽可以是天然、合成或衍生的。
可将本发明肽作为抗原，激发针对包含SEQ ID NO：4、5或6或由其衍生的序列的肽或多肽的免疫应答。如下文更详细描述的，可将该肽激发的免疫应答作为治疗、生成抗体、抗体纯化和诊断分析的基础。
通过多种本领域技术人员已知的方法均可共价修饰本发明肽。利用常见衍生化试剂便可修饰该肽的特定侧链或末端残基。
半胱氨酸残基可与α-卤乙酸盐(和相应的胺)，如氯乙酸或氯乙酰胺反应，从而获得羧甲基或羧基酰胺甲基衍生物。通过与溴代三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基-2-吡啶基二硫化物、p-氯汞基苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑反应也可对半胱氨酸残基衍生化。
组氨酸残基可通过与pH5.5-7.0的组氨酸特异性试剂二乙基焦碳酸酯的反应而衍生化。对-溴苯酰基溴化物也可应用在pH6.0、0.1M二甲胂酸钠中。
赖氨酸和氨基末端残基可与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。采用这些试剂进行的衍生化可能具有逆转赖氨酸残基电荷的作用。用于使含α-氨基残基衍生化的其它试剂包括亚氨酸酯，如皮考啉基亚氨酸酯；吡哆醛磷酸酯；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4戊二酮；和与乙醛酸进行的氨基转移酶催化反应。
精氨酸残基可通过与一种或多种常规试剂，包括苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和水合茚三酮反应而得以修饰。胍官能团的高pKa值使精氨酸残基的衍生化可在碱性条件下进行。此外，上述试剂均可与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基反应。
酪氨酸残基可与芳香重氮化合物或四硝基甲烷反应。N-acetylimidizol和四硝基甲烷可被分别用于形成O-乙酰基酪氨酰类型和3-硝基衍生物。利用125I或131I可碘化酪氨酸残基，从而制备出可应用于放射免疫测定的标记蛋白质。
天冬氨酸和谷氨酸的羧基侧基可通过与碳二亚胺(R’-N-C-N-R’)，如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基))碳二亚胺或1-乙基-3(4氮鎓4，4-二甲基戊基)碳二亚胺反应而得以修饰。此外，通过与铵离子反应，可将天冬氨酰和谷氨酰残基转化为天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。谷氨酰胺酰和天冬酰氨酰可脱去酰胺，形成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。可选地，上述残基可在适度酸性条件下脱去酰胺。
采用双官能试剂对本发明肽进行的衍生化有助于该肽与水不溶性载体基质或其它大分子载体的交联。常用交联剂包括但不仅限于1，1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、具有4-叠氮水杨酸的酯、高双官能酰亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚胺酯，如3，3’-二硫双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)，和双官能马来酰亚胺，如双-N-马来酰亚氨基-1，8-辛烷。衍生化试剂如甲基-3-[(p-叠氮苯基)二硫]丙酸酰亚胺酯可产生在光存在条件下能够交联的光活化中间产物。可选地，反应性水不溶性基质，如溴化氰活化的碳水化合物和美国专利No.3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537和4,330,440描述的反应性底物均可应用于蛋白质固定。
通过脯氨酸和赖氨酸残基的羟基化、丝氨酸或苏氨酸残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链α氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecule Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，pp.79-86(1983))、N末端胺的乙酰化和某些情况中C末端羧基的酰胺化，也可修饰本发明肽。
本发明肽的衍生化可提高该肽的溶解度、吸收、生物半衰期等特性。根据被引入在此作为参考的Remington’s PharmaceuticalSciences，16th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.(1980)所公开的内容，衍生化也可消除或削弱本发明肽和类似物的任何不良副作用。本发明肽的化学修饰在某些情况下可提供其它优越性，如提高该肽的稳定性，延长其循环时间，并提高免疫原性。有关肽化学衍生化的更多信息可参见被整体引入在此的美国专利No.6,350,730(Friedman)。
本发明肽的免疫原性可通过下列途径得以增强，即将该肽包括在更长的肽或多肽中，或利用标准连接技术，使该肽偶联至“免疫”载体，诸如KLH、血清白蛋白、破伤风类毒素等载体。这些方法均是本领域已知的，例如，利用凝聚剂，如二环己基碳二亚胺或利用连接体，诸如可通过商业渠道获自Pierce Chemical Co.，Rockford，III的那些连接体。
本发明肽也可被配制用于动脉内、腹膜内、肌内、皮下、静脉内、口、鼻、直肠、颊、脑池内、鞘内、舌下、肺部、局部、经皮或其它给药途径。
本发明肽也可被用于活化具有特定TCR的T细胞，该TCR可与包含SEQ ID NO：4、5或6或由其衍生的序列的肽或多肽特异性结合。利用本领域已知多种方法中的任意一种均可从自身免疫病患者体内获得T细胞。该T细胞也可用于富集特定亚群，如自身反应性T细胞。随后，可采用本发明肽体外刺激已分离的T细胞，该操作可活化具有特定TCR的T细胞和/或扩充其数量，其中TCR可与包含SEQ IDNO：4、5或6或由其衍生的序列的肽或多肽特异性结合。随后，可对T细胞所来源的患者施用已活化和/或已扩充的T细胞，使其与具有特定TCR的自身反应性T细胞结合，其中该TCR包含SEQ ID NO：4、5或6或由其衍生的序列，从而减少上述自身反应性T细胞。
第二个方面中，本发明针对可与包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列的表位特异性结合的抗体。该抗体可能属于IgG、IgM、IgA、IgD和IgE及其片段和衍生物，包括Fab、F(ab’)2、Fd和单链抗体(scFv)。该抗体可能是单克隆抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或以上抗体的混合物，这些抗体均对包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列的表位表现出充分结合特异性。如上文本发明的第一个方面所描述，通过附着本领域已知的一种或多种化学物质、肽或多肽部分，可将本发明抗体衍生化。
利用本领域已知的技术，如被整体引入在此的美国专利No.5,565,332(Hoogenboom等人)、5,858,657(Winter等人)、5,871,907(Winter等人)、5,969,108(McCafferty等人)和6,172,197(McCafferty等人)所描述的噬菌体展示，可鉴定并分离本发明抗体。本发明抗体也可分离自哺乳动物，包括但不仅限于经由特定抗原免疫过的小鼠、大鼠、山羊、兔、绵羊、猪或牛，其中该抗原可激发针对SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列的免疫应答。如被整体引入在此的美国专利No.5,565,332(Hoogenboom等人)、5,858,657(Winter等人)、5,871,907(Winter等人)、5,969,108(McCafferty等人)和6,172,197(McCafferty等人)所描述的内容，本发明抗体也可以是人类抗体或人源化抗体。
如下文更详细描述的，本发明抗体可作为治疗或诊断分析的基础。也可将其用于富集或纯化具有特定TCR的自身反应性T细胞，其中该TCR包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列。根据被整体引入在此、共同未决的美国专利申请No.09/952,532(Zhang)，具有特定TCR的富集或已纯化自身反应性T细胞可被应用在用于自身免疫病患者的T细胞疫苗中，其中该TCR包含了SEQ ID NO：4、5或6或由其衍生的序列。
第三个方面中，本发明涉及编码特定肽或多肽的寡核苷酸，该肽或多肽包括本发明第一个方面的肽或其片段。该寡核苷酸的长度大约为15-30个核苷酸，包含编码SEQ ID NO：4、5或6的片段的至少10个连续核苷酸或其互补核苷酸序列或由其衍生的序列。该寡核苷酸的长度也可大约为15-30个核苷酸，包含(i)编码SEQ ID NO：4或6的片段的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸或其互补核苷酸序列或由其衍生的序列，(ii)编码SEQ ID NO：5的片段的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个连续核苷酸或其互补核苷酸序列或由其衍生的序列。该寡核苷酸的长度也可大约为15-30个核苷酸，包括编码SEQ ID NO：4、5或6的核苷酸序列或其互补核苷酸序列或由其衍生的序列。
由于遗传密码的简并性，大量核苷酸序列均可编码本发明第一个方面的肽。例如，长度大约为15-30个核苷酸，包含SEQ ID NO：1、2或3中至少10个连续核苷酸或其互补序列或由其衍生的序列的寡核苷酸。该寡核苷酸的长度也可大约为15-30个核苷酸，包含(i)SEQ IDNO：1或3中的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸或其互补核苷酸序列或由其衍生的序列，(ii)SEQ ID NO：2中的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个连续核苷酸或其互补序列或由其衍生的序列。该寡核苷酸的长度也可大约为15-30个核苷酸，包含SEQ ID NO：1、2或3的一个核苷酸序列或其互补序列或由其衍生的序列。
如下文更详细描述的，上述寡核苷酸可作为引物应用在PCR中。也可作为探针用于结合并检测TCR基因或其片段，包括互补核苷酸序列或其衍生核苷酸序列。该寡核苷酸也可标记有可检测部分。可检测部分的诸多实例是本领域已知的，包括但不仅限于32P、35S、生物素或洋地黄毒苷。
第四个方面中，本发明涉及引物对，所包括的第一引物即本发明第三个方面的寡核苷酸，第二引物即长度大约为15和30个核苷酸，且不包含第一引物序列的寡核苷酸，也是T细胞中TCR基因Vβ-Cβ区的一个片段或由其衍生的序列，其中第一和第二引物与TCR基因的不同链特异性结合。第二引物可与Cβ区的一个序列互补，从而存在一个大约400bp长，且包括TCR基因Vβ-Dβ-Jβ区的序列，将第一与第二引物分隔开。
如下文更详细描述的，上述引物对可被用于扩增编码人类T细胞来源TCR的核苷酸序列，该TCR包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列。
第五个方面中，利用本发明第二个方面的抗体进行免疫测定，可检测样品中包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列的TCR。术语“免疫测定”包括本领域技术人员熟知的同时夹心、正向夹心和反向夹心免疫测定。
待检验其中是否存在包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列的TCR的样品可直接或间接地分离自表达T细胞受体β链基因的任何动物或人体组织，如外周血单核细胞(PBMC)。
第六个方面中，通过扩增包含目标序列的TCR基因的片段，可检测样品中包含了特定核苷酸序列的TCR基因，该特定核苷酸序列编码SEQ ID NO：4、5或6或由其衍生的序列(“目标序列”)，其中该扩增采用本发明第四个方面的引物对进行。
通过利用本领域已知的任何特定PCR技术或设备，进行聚合酶链反应(PCR)，可扩增包含了目标序列的TCR基因的片段，该目标序列编码SEQ ID NO：4、5或6或由其衍生的序列。例如，PCR扩增可按照下述操作进行，其中制备的反应混合物含有下列成分：5μL 10xPCR缓冲液II(100mM Tris-HCl、pH8.3、500mM KCl)、3μL 25mM MgCl2、1μL 10mM dNTP混合物、0.3μL Taq聚合酶(5U/μL)(AmpliTaq Gold，Perkin Elmer，Norwalk，Conn.)、30pmol第一引物、30pmol第二引物和1μL样品DNA。上述聚合酶在至少95℃的温度条件下均稳定，持续合成能力为50-60，延伸率为每分钟延伸超过50个核苷酸。
该PCR反应可按照下述方案进行，即95℃ 1分钟(变性)、56℃ 20秒(退火)和72℃ 40秒(延伸)，共40个循环。第一个循环开始之前，反应混合物可经历一次大约5-15分钟的初始变性。同样，最后一个循环结束后，反应混合物可经历一次大约5-10分钟的最终延伸。某些PCR反应可能进行少则15-20个循环，多则50个循环。根据特定PCR反应，针对扩增方案的每一步骤可采用较长或较短的温育时间和较高或较低的温度。
待检验其中是否存在包含目标序列的TCR基因的样品可以是核酸，如基因组DNA、cDNA、PCR预先扩增的DNA或其它任何形式的DNA。该样品可直接或间接地分离自表达T细胞受体β链基因的任何动物或人体组织，如外周血单核细胞(PBMC)。基因组DNA可直接分离自表达T细胞受体β链基因的组织。cDNA可间接地通过mRNA的逆转录而得以分离，而mRNA则直接分离自表达T细胞受体β链基因的组织。
通过两步PCR反应扩增基因组DNA、cDNA或其它任何形式的DNA，间接分离样品DNA，可增强检测是否存在T细胞受体基因的能力，该T细胞受体基因包含编码SEQ ID NO：4、5或6的核苷酸序列或由其衍生的序列。例如，可进行第一PCR扩增反应，以扩增大于和包含特定片段的初级片段，其中第一和第二引物可选择性地结合在该特定片段的相对链上。以上述初级片段为模板，并利用上述第一和第二引物，进行第二PCR扩增反应，以扩增包含目标序列的片段。如果在第一PCR反应中采用上述第一或第二引物扩增初级片段，则第二PCR反应为“半嵌套式”。如果在第一PCR反应中未采用上述第一或第二引物以扩增初级片段，则第二PCR反应为“嵌套式”。
在典型的两步PCR反应中，通过采用可退火至TCR基因Vβ区的第一初级引物和可退火至TCR基因Cβ区的第二初级引物，进行第一PCR反应，以扩增从Vβ经由Vβ-Dβ-Jβ连接延伸至Cβ的初级片段，随后进行可为嵌套式或半嵌套式的第二PCR反应，便可扩增包含了特定核苷酸序列的PCR基因片段，该核苷酸序列编码SEQ ID NO：4、5或6或由其衍生的序列。根据本公开内容，技术人员可选择T细胞来源TCR基因片段的PCR扩增合适的引物和反应条件，其中TCR基因片段包含编码SEQ ID NO：4、5或6或由其衍生的序列的核苷酸序列。
对包含特定核苷酸序列的TCR基因片段的扩增结束后，可通过若干操作步骤检测其扩增产物，该特定核苷酸序列编码SEQ ID NO：4、5或6或由其衍生的序列。例如，可将等分试样的扩增产物上样在电泳凝胶上，施加电场以根据尺寸分离DNA分子。另一种方法中，可将等分试样的扩增产物上样在经由SYBR绿、溴化乙锭或其它可结合DNA的分子染色，并发射可检测信号的凝胶上。干凝胶可含有本发明第三个方面的标记寡核苷酸，由此可通过将凝胶曝光于胶片获取放射自显影。
本发明的第七个方面中，检验试剂盒包括本发明第二个方面的抗体。该检验试剂盒可被用于分析样品是否存在包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列的TCR或其衍生物。
该检验试剂盒也可包括一种或多种可与自身反应性T细胞上TCR的表位特异性结合的其它抗体。可特异性结合上述一种或多种其它抗体的TCR可包含或不包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列。由于SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列仅存在于某些TCR中，因此，利用可与其它TCR序列，更具体而言与其它CDR序列结合的抗体可能是有利的。
该检验试剂盒也可进一步包括一种或多种可用于检测TCR或其衍生物的试剂，该TCR或其衍生物均包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列。该试剂可以是缓冲剂、阳性对照、阴性对照或上述物质的组合。阳性对照可以是包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列的肽或多肽序列。阴性对照可以是包含特定序列的肽或多肽序列，该特定序列不包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列。
本发明的第八个方面中，检验试剂盒包括第一引物，即本发明第三个方面的寡核苷酸。该检验试剂盒也可包含第一和第二引物，即本发明第四个方面的引物对。
本发明的检验试剂盒也可进一步包括一种或多种试剂，该试剂可被用于扩增包含特定核苷酸序列的TCR基因的片段，该特定核苷酸序列编码SEQ ID NO：4、5或6或由其衍生的序列。该试剂可以是缓冲剂、脱氧核苷三磷酸、热稳定DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照或以上物质的组合。热稳定DNA聚合酶可以是Taq聚合酶。阳性对照可以是核苷酸序列，包括编码SEQ ID NO：4、5或6或由其衍生的序列的核苷酸序列。阴性对照可以是核苷酸序列，但不包括编码SEQ ID NO：4、5或6或由其衍生的序列的核苷酸序列。本发明检验试剂盒也可包括本发明第三个方面所描述的标记寡核苷酸。可被包括在该检验试剂盒中的其它试剂是本领域技术人员已知的。
第九个方面中，通过获得来源于患者的样品，测定该样品是否存在具有特定TCR的自身反应性T细胞，便可诊断自身免疫病患者，该特定TCR包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列。上述样品可被用于富集T细胞、自身反应性T细胞或自身反应性MBP83-99T细胞。上述自身免疫病可以是任何自身免疫病，其中被发现位于T细胞上的TCR包含SEQ ID NO：4、5或6的肽序列或由其衍生的序列。
通过将具有特定TCR的T细胞水平与对照组来源的上述T细胞水平进行比较，可诊断上述自身免疫病，该特定TCR包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列。T细胞水平可通过在本发明第五个方面的免疫测定中，检测是否存在包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列的TCR而得以确定。也可通过采用本发明第六个方面描述的方式进行PCR，检测是否存在编码特定序列的核酸以确定上述T细胞水平，该特定序列包括SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列。
第十个方面中，通过施用包含了免疫原性有效量本发明第一个方面的肽的疫苗，可治疗某些患者的自身免疫病，其中这些患者携带了具有特定TCR的自身反应性T细胞，该特定TCR包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列。施用疫苗可导致免疫应答，其中患者可能出现抗体，施用疫苗也可诱导特定T细胞应答，该应答可识别并结合包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列的TCR，施用疫苗还可减少上述自身反应性T细胞。
本发明疫苗可仅包含肽，或结合免疫原性有效量的其它TCR肽序列，尤其是其它CDR序列。临床研究表明接受自身T细胞接种的自身免疫患者对MBP-反应性T细胞的免疫性可显示逐渐下降。某些情况中，再次出现的自身反应性T细胞可来源自不同克隆群体，说明MBP反应性T细胞可能经历着与进行性疾病过程潜在相关的克隆转变或表位扩散。克隆转变或表位扩散可能是自身反应性T细胞介导的免疫病中的难题。包含多抗原肽的疫苗可避免克隆转变或表位扩散的难题，其中该多抗原肽可诱导针对多个群体的自身反应性T细胞上TCR的免疫应答。
由于包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列，以及其它TCR序列，尤其是CDR序列的TCR可存在于自身免疫病患者和并未患该病的正常个体体内，因此可将包含特定肽或肽组合的疫苗施用于自身免疫病患者和正常个体，上述特定肽和肽组合能够激发针对TCR，尤其是CDR，最为尤其是CDR3上表位的免疫应答。其它肽序列可包括美国专利No.5,614,192(Vandenbark)所公开的LGRAGLTY基序(SEQ ID NO：7)和CDR序列。
本发明疫苗可进一步包括T细胞活化标记肽。该T细胞活化标记肽可以是美国专利No.6,303,314(Zhang)所描述的标记肽，将其引入在此作为参考。本发明疫苗也可进一步包括一种或多种可增强针对免疫原的免疫应答的试剂。该试剂可以是缓冲剂、佐剂或二者的组合。佐剂可以是美国专利No.5,980,912(Podolski)所公开的基于脱乙酰壳多糖的佐剂，将其整体引入在此作为参考。
第十一个方面中，通过施用包含本发明第二个方面的抗体的组合物，可治疗某些具有特定TCR的患者的自身免疫病，该特定TCR包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列。施用本发明组合物可使包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列的TCR减少。
本发明组合物可仅包括抗体，或者组合了可与其它TCR序列，尤其是其它CDR序列特异性结合的其它抗体。如上所述，自身免疫病的进展可包括自身反应性T细胞的克隆转变或表位扩散。包含多种抗体，其中各抗体可与多个群体自身反应性T细胞上的TCR，尤其是CDR的不同表位特异性结合的组合物可避免克隆转变或表位扩散的难题。
由于包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列，以及其它TCR序列，尤其是CDR序列的TCR可存在于自身免疫病患者和并未患该病的正常个体体内，因此可将包含特定抗体或抗体组合的组合物施用于自身免疫病患者和正常个体，上述特定抗体和抗体组合可与TCR，尤其是CDR，最为尤其是CDR3上的表位特异性结合。
本发明的第十二个方面中，根据本发明的第六个方面，检测自身免疫病患者来源的样品中是否存在包含SEQ ID NO：1、2或3的序列或由其衍生的序列的TCR基因，并对包含SEQ ID NO：1、2或3的序列或由其衍生的序列的TCR基因进行定量，便可监控自身免疫病。
自身免疫病症状的严重程度可能与通过自身反应性T细胞的数量所检测到样品中的DNA量相关。另外，可将样品中检测到的DNA量的增加作为指标，应用于旨在使症状的严重程度最小化和/或在症状出现之前治疗疾病的治疗中。
本发明的第十三个方面中，根据本发明的第七个方面，检测自身免疫病患者来源的样品中是否存在SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列的TCR，并对包含SEQ ID NO：4、5或6的序列或由其衍生的序列的TCR进行定量，便可监控自身免疫病。
自身免疫病症状的严重程度可能与通过自身反应性T细胞的数量所检测到样品中的肽或多肽量相关。另外，可将样品中检测到的肽或多肽量的增加作为指标，应用于旨在使症状的严重程度最小化和/或在症状出现之前治疗疾病的治疗中。
第十四个方面中，本发明涉及药物组合物，如本发明第十个方面所描述的疫苗和第十一个方面所描述的抗体的制造。该药物组合物可利用本领域熟知的方法生产。
应用诊断和治疗方面的公认原理，技术人员可制备出在疾病或失调的治疗中可作为临床前和临床治疗的药物组合物。上述原理是本领域已知的，并在例如Braunwald et al.，eds.，Harrison’s Principles ofInternal Medicine，11th Ed.，McGraw-Hill，publisher，New York，N.Y.(1987)中得以阐明，将其引入在此作为参考。本发明药物组合物可被施用于可能体验到该组合物的有利效果的任何动物。接受该药物组合物的动物可以是人类或其它哺乳动物。
本发明药物组合物可通过任何可实现其预期目的方式施用。例如，可通过肠胃外、皮下、静脉内、皮内、肌内、腹膜内、经皮或颊的途径施用。可选或同时通过口服途径施用。本发明药物组合物可通过快速浓注或随时间逐渐灌注而肠胃外施用。
施用剂量取决于受体的年龄、性别、健康情况和体重，合并治疗的种类，若有的话，还取决于治疗频率和所期望效果的性质。该药物组合物的施用剂量范围可大至足以产生预期效果，由此，例如实现可通过DH或抗体产量测定的针对本发明肽的免疫应答，并显著预防、抑制或治疗该自身免疫病。该剂量不可过大以致引起有害的副作用，如不需要的交叉反应、全身性免疫抑制、过敏反应等。对人类而言，该剂量范围可为大约0.001-25mg/kg体重。
该药物组合物可进一步包括合适的药物可接受载体，包括有助于将活性化合物加工为可药物应用的制剂的赋形剂和辅助物质。药物组合物的添加剂可包括佐剂的引入，诸如明矾、脱乙酰壳多糖或本领域已知的其它佐剂(见例如Warren et al.，Ann.Rev.Immunol.4：369-388(1986)；Chedid，L.，Feder.Proc.45：2531-2560(1986)，将其引入在此作为参考)。利用本领域已知的方法和化合物，可使本发明药物组合物进一步包括脂质体以增强送递或生物活性。
本发明药物组合物也可以片剂和胶囊形式口服施用。本发明药物组合物也可以栓剂形式直肠施用，和以溶液形式注射或口服导入。
本发明药物组合物可含有大约0.001％-大约99％，或大约0.01％-大约95％的活性化合物以及赋形剂。合适的赋形剂可以是填料，如糖类，例如乳糖或蔗糖、甘露醇或山梨醇，纤维素制剂和/或磷酸钙，例如磷酸三钙或磷酸氢钙，以及粘合剂，如淀粉糊，采用例如，玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮。
可口服施用的其它药物制剂包括由明胶制成的推入契合(push-fit)胶囊，以及由明胶和诸如甘油或山梨醇的增塑剂制成的软、密封胶囊。推入契合胶囊可含有颗粒形式的活性化合物，该活性化合物可与诸如乳糖的填料，诸如淀粉的粘合剂和/或诸如滑石或硬脂酸镁的润滑剂，以及任选的稳定剂混合。在软胶囊中，该活性化合物可溶解或悬浮于合适的液体中，诸如脂肪油或液体石蜡。另外，可添加稳定剂。
可直肠施用的药物制剂包括，例如，由一种或多种活性化合物与栓剂基质的组合构成的栓剂。合适的栓剂基质可以是，例如，天然或合成的甘油三酯或链烷烃。另外，可采用由活性化合物与基质的组合构成的明胶直肠胶囊。可能的基质材料包括，例如液体甘油三酯、聚乙二醇或链烷烃。
用于肠胃外施用的合适配方包括水溶性形式的肽或抗体的水溶液，例如水溶性盐。另外，可施用适当油性注射悬液形式的肽或抗体的悬液。合适的亲脂溶剂或载体包括脂肪油，例如芝麻油或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射悬液可含有可提高悬液粘度的物质，包括例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬液也可含有稳定剂。
采用常规药物可接受的肠胃外载体可配制肽和抗体用于注射给药。这些载体可以是无毒并具有疗效的，Remington’s PharmaceuticalSciences(如上)描述了若干制剂。赋形剂的非限制性实例为水、盐、林格液、右旋糖溶液和Hank’s平衡盐溶液。药物组合物也可含有较少量的添加剂，如可维持等渗性、生理pH和稳定性的物质。
本发明的肽和抗体可被配制成基本上不含凝聚物和其它物质的纯化形式，其浓度包括大约1.0ng/ml-100mg/ml。
用于预防、抑制或治疗自身免疫病的肽和抗体的有效剂量范围大约为1ng-100mg/kg体重。该剂量范围也可大约为10ng-10mg/kg。也可大约为100ng-1mg/kg。
下述实施例可例证本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解的是，在遵循本发明者所发现代表性技术的实施例中公开的技术在本发明实践中的效果良好，因此可认为这些技术构成了针对其实践的优选模式。不过，本领域技术人员应根据本公开内容理解的是，可以在公开的特定实施方案中做出多种改动，仍然可获得相似或类似的结果，而不偏离本发明的精神和范畴。
实施例1
MS患者中所鉴定的T细胞受体Vβ-Dβ-Jβ DNA序列
从Genbank中挑选出MBP反应性T细胞的一组20个CDR3序列，其中该MBP反应性T细胞可识别MBP的83-99免疫显性表位。为确定20个序列中是否有若干序列被共同表达，基于被整体引入在此的美国专利No.6,303,314(Zhang)所描述的RT-PCR检测方法，利用两步RT-PCR和引物筛选40位MS患者和15位对照个体来源的外周血淋巴细胞标本。
简言之，利用RNeasy微型试剂盒(Qiagen，Santa Clarita，CA)从MS患者来源的T细胞中提取总RNA。采用Vβ家族特异性引物和Cβ引物，对逆转录自总RNA的第一链cDNA进行第一个循环的PCR扩增，随后采用Vβ-Dβ-Jβ引物和Cβ引物，对其进行第二个循环的嵌套或半嵌套PCR。在1％琼脂糖凝胶中电泳分离扩增的PCR产物，并利用真空印迹(Bio-Rad，Hercules，CA)以5mHg运行90分钟，将扩增产物转移至带正电荷的尼龙膜(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)上。通过暴露于UV3分钟而交联，将DNA固定在膜上，并于68℃预杂交至少1小时。在预杂交溶液(5xSSC、1％封闭溶液、0.1％N-月桂酰肌氨酸、0.02％SDS)中加入0.1mg/ml聚腺苷酸，以减少探针与非目标DNA的非特异性结合。根据不同CDR3-特异性探针优化杂交温度和洗涤条件，以确保严格性杂交条件。杂交在含有下列组分的缓冲液中进行，即5xSSC、1％封闭溶液、0.1％N-月桂酰肌氨酸、0.02％SDS和0.3pmol/ml特异于编码CDR3区的核苷酸序列的洋地黄毒苷标记探针。
DNA杂交产物的检测是利用Digoxigenin Luminescent DetectionKit(洋地黄毒苷发光检测试剂盒)(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，并根据生产商的说明书进行。随后室温下将膜曝光于X射线胶片15-30分钟。
在20个受检序列中，有3个CDR3编码的序列被检测出MS衍生标本的百分比高于对照标本。表1列出了包含上述三个已检测CDR3-编码序列中每个序列的TCR基因的Genbank编号，以及与该序列的CDR3区的核苷酸和氨基酸序列。表2列出了MS衍生和对照PBL标本中CDR3编码序列的阳性检测的总百分比。
表1-特异于MBP83-99的CDR3序列
Genbank编号 V基因                               CDR3序列
MS2002-DH(SEQ ID NO：7) BV17  gcc agt agt act gac tgg agc (SEQ ID NO：1)A   S   S   T   D   W   S  (SEQ ID NO：4)
M52002-18(SEQ ID NO：8) BV5.2  agc agc ttg agg ggg gcg cta aac att (SEQ ID NO：2)S   S   L   R   G   A   L   N   I  (SEQ ID NO：5)
MSFRANS1 E3(SEQ ID NO：9) BV9  agc agc caa gat cgt ttt tgg (SEQ ID NO：3)A   S   Q   D   R   F   W  (SEQ ID NO：6)
表2-CDR3 DNA的阳性检测的百分比
Genbank编号     MS患者中的％     对照的％
MS2002-DH     57.5％     33％
MS2002-18     50％     6.7％
MSFRANS1 E3     80％     20％
表2中的结果令人惊讶，因为大量研究并不支持优先采用特定Vβ-Dβ-Jβ基因产物。例如，仅在某些个体中发现了美国专利No.6,303,314(Zhang)描述的LGARAGLTY基序。相反，MBP自身反应性T细胞克隆则典型地显示出在个体中相对受限的Vβ-Dβ-Jβ基因使用的异质模式。本领域内通常认为Vβ-Dβ-Jβ基因使用的异质性将显著削弱采用基于肽疫苗的方法在治疗上消除致病自身反应性T细胞的可行性。此处的结果第一次说明基于一种或多种肽的疫苗可以在消除致病自身反应性T细胞方面证实其效果。
实施例2
抗MBP-反应性T细胞受体单克隆抗体的制备
制备可产生抗MBP反应性T细胞受体单克隆抗体的杂交细胞系的操作包括，BALB/c小鼠骨髓瘤细胞与采用特异性MBP反应性T细胞受体蛋白来源的肽基序所引发的BALB/c小鼠脾细胞融合。
1.融合所用脾细胞的制备
特异性MBP反应性T细胞受体来源的肽基序可分离自纯化的重组T细胞受体，或通过肽合成方法获得。纯化该肽基序，使其纯度大于95％，将约30ug乳化于弗氏完全佐剂中，通过皮下施用以免疫成年BALB/c或C57B46雄性小鼠。2周后进一步皮下接种乳化于不完全佐剂中的肽基序，再次免疫小鼠。继续2-6周后，静脉内施用20-40ug的肽基序，并于2-4天后处死小鼠，并以Gefter，et al.，Somatic CellGenetics 3：231，1977中所描述的方式制备脾细胞悬液。将红细胞温育在40℃的NH4Cl(0.83％)中15分钟，使其裂解。通过离心(800xg)，并采用热灭活小牛血清洗涤如上所获的细胞悬液，随后在无蛋白培养基(RRMI 1640，由7.5mM HEPES，pH7.2缓冲)中离心。
2.融合所用骨髓瘤细胞的制备
骨髓瘤细胞来源自P3U1系，并如Yelton，et al.，Curr.Top.Microbiol.Immunal.81：1-7(1978)所述在HPRT(E.C2.4.2.8)中缺乏，将其维持在含有10％胎牛和15％马血清的Eagle’s极限必需培养基(MEM)中。骨髓瘤细胞的生长受选择性次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基抑制。
3.杂交瘤的生成
通过将107个BALB/c骨髓瘤细胞与108个脾细胞混合，以生成杂交瘤，其中脾细胞获得自经由肽基序免疫过的BALB/c或C57B1/6小鼠。800xg离心细胞混合物，并将细胞重新悬浮于经由无血清极限必需培养基(MEM)稀释过的50％(w/v)聚乙二醇(PEG1000)溶液中，随后进行如Gefter等人(1977)描述的操作，使细胞融合。通过Galfre和Milstein Meth.Enzymol.73：3，1975所描述的有限稀释，将所获杂交瘤细胞克隆进次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)中。筛选出可产生识别本发明肽基序的抗体的杂交瘤细胞系。
4.对生成MBP反应性T细胞受体抗体的克隆的检验
采用50-100μg肽基序或T细胞受体蛋白包被Linbro(Flow Lab)微量滴定96孔培养板，并于20℃温育过夜。采用含有5％Carnation速溶奶粉和0.085叠氮化钠的0.1M Tris(pH7.5)--1％nonidet P-40洗涤三次，加入0.05ml培养上清液，并于40℃温育过夜。采用RIA缓冲液洗涤三次后，弃去上清液，并利用杂交瘤筛选试剂盒(BethesdaResearch Labs)检测抗体。通过不加第二抗体或培养上清液将非特异性结合的对照包括在内。
目前已完整描述了本发明，本领域任何一位普通技术人员均应理解的是，可以在不偏离如下说述本发明精神或范畴的前提下对本发明进行多种改动和改进。
根据本公开内容可制备此处公开并要求保护的所有组合物，和/或在不进行过多实验的前提下实施此处公开并要求保护的所有方法。虽然从优选实施方案方面已描述了本发明的组合物和方法，本领域技术人员仍应理解的是，在不偏离本发明概念、精神和范畴的前提下，可以对此处描述的组合物和/或方法，以及方法的步骤或步骤顺序进行改动。更具体而言，应当理解的是可以将某些与化学和生理学相关的试剂替代此处描述的试剂，仍然可获得相同或相似的结果。如附件权利要求所定义的内容，本领域技术人员理解的所有上述相似替代物和改进均被认为在本发明精神、范畴和概念内。
实施例3
用于治疗MS患者的有效的基于肽的疫苗的鉴定
对该试验而言的入选标准是临床确定患有MS至少两年的患者，基线扩展的残疾程度评分(EDSS)对RR-MS而言为1.5-6.5，对继发进展性MS(SP-MS)而言则为4.0-8.0，并在进入缓解-复发型MS(RR-MS)分组研究之前的两年内至少病情恶化一次。该患者在登记该研究之前至少三个月内未服用任何免疫抑制药物，包括类固醇。如果研究期间出现病情恶化可服用类固醇。不禁止针对疲劳、痉挛和膀胱主诉的症状疗法。患者将被检验是否存在具有特定TCR的自身反应性T细胞，其中该TCR包含SEQ ID NO：4、5、6、10或美国专利No.5,614,192(Vandenbark)所公开的CDR序列。
制备的疫苗包含免疫原性有效量的基于肽的抗原，该基于肽的抗原具有包含SEQ ID NO：4、5、6或10的序列或由其衍生的序列。共检验15种疫苗，如下：(i)四种抗原中任意一种抗原(共计4种)；(ii)四种抗原中任意两种抗原的组合(共计6种)；(iii)四种抗原中任意三种抗原的组合(共计4种)；和(iv)四种抗原的组合(共计1种)。每位患者每隔两个月接受一种受检疫苗的三次皮下注射。
随后观察患者一段时间，直至证实残疾、EDSS、复发率和MRI病变活性的进展被证实开始。将结果与患者自身治疗前病程以及在RR-MS和SP-MS患者中进行的两次最近临床试验的安慰剂组相比，将其作为对MS自然史的一个评估(Jacobs et al.，(1996)，European StudyGroup，1998)。通过持续至少2个月的EDSS评分，根据至少1.0的增量(Poser et al.，1983)确定至进展的时间。在研究中的病情恶化是通过持续至少48小时，并伴随神经学检查的客观变化(EDSS评分至少恶化0.5分)的新神经症状的出现或预先存在的神经症状的恶化而定义。指示患者在定期的两次常规检查之间汇报情况，如果症状显示病情恶化，便由神经病学家对其进行检查。安全性评估包括副作用、生命体征和常规检查时的身体检查。采用Wilcoxon秩和检验分析基于肽的接种之前和之后，被研究患者体内临床变量的差异。
实施例4
采用基于肽的疫苗对MS患者的治疗
将在实施例3中被鉴定为可有效延缓MS临床症状进展的疫苗施用于MS患者。接受疫苗治疗的患者可以是患有持续任意时间的MS，并可通过任何已知标准诊断的患者。
                                  序列表
<110>BAYLOR COLLEGE OF MEDICINEOPEXA PHARMACEUTICALS INC.Zhang，Jingwu
<120>T细胞受体CDR3序列和检测方法
<130>05627.0007.00PC00
<140>PCT/US2003/017873
<141>2003-06-05
<150>US 60/386,287
<151>2002-06-05
<160>7
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>智人
<400>1
gccagtagta ctgactggagc                                               21
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>智人
<400>2
agcagcttga ggggggcgct aaacatt                                        27
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>智人
<400>3
agcagccaag atcgtttttg g                                              21
<210>4
<211>7
<212>PRT
<213>智人
<400>4
Ala Ser Ser Thr Asp Trp Ser
1               5
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>5
Ser Ser Leu Arg Gly Ala Leu Asn Ile
1               5
<210>6
<211>7
<212>PRT
<213>智人
<400>6
Ala Ser Gln Asp Arg Phe Trp
1               5
<210>7
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>7
Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr
1               5

Claims (21)

1.一种寡核苷酸，长度大约为15-30个核苷酸，包含一个特定序列的至少10个连续核苷酸或其互补序列或由其衍生的序列，该特定序列编码选自SEQ ID NO：4、5和6的序列。
2.权利要求1的寡核苷酸，包含一个特定序列的至少15个连续核苷酸或其互补序列或由其衍生的序列，该特定序列编码选自SEQ IDNO：4、5和6的序列。
3.权利要求1的寡核苷酸，包含一个特定序列或其互补序列或由其衍生的序列，该特定序列编码选自SEQ ID NO：4、5和6的序列。
4.引物对，包括：
(a)第一引物，长度大约为15-30个核苷酸，包含一个特定序列的至少10个连续核苷酸或其互补序列或由其衍生的序列，该特定序列编码选自SEQ ID NO：4、5和6的序列；和
(b)第二引物，包含一个长度大约为15和30个核苷酸的核酸，它不包含上述第一引物的序列，并被发现位于T细胞中T细胞受体基因的Vβ-Cβ区，
其中上述第一和第二引物的序列未被发现位于T细胞受体基因的相同链上。
5.权利要求4的引物对，其中第二引物包含选自SEQ ID NO：7、8和9的序列。
6.一种寡核苷酸探针，包括：
(a)寡核苷酸，长度大约为10-30个核苷酸，包含一个特定序列的至少10个连续核苷酸或其互补序列或由其衍生的序列，该特定序列编码选自SEQ ID NO：4、5或6的序列，和
(b)标记部分。
7.权利要求6的寡核苷酸探针，其中标记部分选自32P、35S、生物素和洋地黄毒苷。
8.一种检测MBP83-99 T细胞的方法，该T细胞表达选自SEQ IDNO：4、5和6的T细胞受体基序或由其衍生的序列，该方法包括：
(a)从MBP83-99 T细胞中获得核酸样品；
(i)使该核酸样品与特定引物对接触，该引物对选自：
(ii)第一寡核苷酸，长度大约为15-30个核苷酸，包含一个特定序列的至少10个连续核苷酸或其互补序列或由其衍生的序列，该特定序列编码选自SEQ ID NO：4、5和6的序列；和
(iii)第二寡核苷酸，长度大约为15和30个核苷酸，它不包含第一寡核苷酸的序列，并被发现位于T细胞中T细胞受体基因的Vβ-Cβ区，
其中第一和第二寡核苷酸的序列未被发现位于T细胞受体基因的相同链上；和
(b)检测编码上述T细胞受体基序的核酸的存在。
9.权利要求8的方法，其中第二引物包含选自SEQ ID NO：7、8和9的序列。
10.权利要求8的方法，其中核酸样品的片段通过聚合酶链反应(PCR)扩增。
11.权利要求10的方法，其中检测步骤包括采用寡核苷酸探针探测，该探针包括：
(a)寡核苷酸，包含一个特定序列或其互补序列或由其衍生的序列，该特定序列编码选自SEQ ID NO：4、5和6的序列；和
(b)标记部分。
12.权利要求10的方法，其中检测步骤包括放射自显影。
13.一种检验试剂盒，包括长度大约为15-30个核苷酸的第一寡核苷酸，该第一寡核苷酸包含一个特定序列的至少10个连续核苷酸或其互补序列或由其衍生的序列，该特定序列编码选自SEQ ID NO：4、5和6的序列。
14.权利要求13的检验试剂盒，进一步包括：一个长度大约为15和30个核苷酸的第二寡核苷酸，它不包含上述第一寡核苷酸的序列，并被发现位于T细胞中T细胞受体基因的Vβ-Cβ区，其中第一和第二寡核苷酸的序列未被发现位于T细胞受体基因的相同链上。
15.权利要求14的检验试剂盒，其中第二引物包含选自SEQ IDNO：7、8和9的序列。
16.权利要求13的检验试剂盒，进一步包括一个标记部分，其中该标记部分选自32P、35S、生物素和洋地黄毒苷。
17.一种监控自身免疫病的方法，包括：
(a)从人类中获得MBP83-99 T细胞；
(b)检测编码选自SEQ ID NO：4、5和6的序列或由其衍生的序列的核酸的存在，
(i)从MBP83-99 T细胞中获得核酸样品；
(ii)使该核酸样品与特定引物对接触，该引物对选自：
a.第一寡核苷酸，长度大约为15-30个核苷酸，包含一个特定序列的至少10个连续核苷酸或其互补序列或由其衍生的序列，该特定序列编码选自SEQ ID NO：4、5和6的序列；和
b.第二寡核苷酸，长度大约为15和30个核苷酸，它不包含上述第一寡核苷酸的序列，并被发现位于T细胞中T细胞受体基因的Vβ-Cβ区中，其中上述第一和第二寡核苷酸的序列未被发现位于T细胞受体基因的相同链上；和
c.检测编码T细胞受体基序的核酸的存在，并且，如果可检测到该核酸，
(c)定量该核酸。
18.权利要求17的方法，其中第二引物包含选自SEQ ID NO：7、8和9的序列。
19.一种疫苗，包含第一肽，并任选包含一种药物可接受载体，其中第一肽包含选自SEQ ID NO：4、5和6的序列或由其衍生的序列。
20.权利要求19的疫苗，进一步至少包含第二肽，并任选包含一种药物可接受载体，其中第二肽包含选自SEQ ID NO：4、5、6和7的序列或由其衍生的序列，且第一与第二肽的序列不同。
21.一种治疗自身免疫病的方法，包括对自身免疫病患者施用权利要求19或20任意一项的疫苗。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication