CN1671644A - 消除dna损伤导致的细胞周期g2关卡和/或增强dna损伤性治疗抗癌活性的化合物 - Google Patents

消除dna损伤导致的细胞周期g2关卡和/或增强dna损伤性治疗抗癌活性的化合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供组合物和方法，在哺乳动物细胞(包括人细胞)中，抑制细胞周期G2关卡，具体的说是DNA损伤导致的G2关卡。具体的说，本发明提供组合物和方法，通过消除细胞周期G2关卡使细胞对DNA损伤剂敏感。本发明化合物用于治疗增殖性疾病例如癌症。本发明提供组合物和方法，选择性使G1关卡受损的癌症细胞对DNA损伤剂和治疗敏感。

Description

消除DNA损伤导致的细胞周期G2关卡和/或 增强DNA损伤性治疗抗癌活性的化合物
                      相关申请
本申请要求对2002年6月6日申请的申请号为No.60/386.930的美国申请的优先权。
                      发明领域
本发明涉及具有抗细胞增殖活性的化学物质、它们的生产、含有它们的药用组合物和采用这些化合物和组合物治疗增殖失调的方法。因此本发明化合物可用于抑制细胞增殖，并且照此可用于治疗包括癌症的细胞增殖失调。具体的说，本发明涉及的化合物消除细胞周期G2关卡，包括由DNA损伤引起的G2关卡，此化合物可用于治疗增殖失调，例如癌症，包括治疗转移性和非转移性的实体肿瘤或液体肿瘤。
                      背景
细胞周期包括S期(DNA复制)、M期(有丝***)和两个S期与M期之间的间期(G1期和G2期)。细胞周期中的关卡保证细胞周期各阶段的准确进程，包括监控DNA完整性情况、DNA复制、细胞大小和周围环境(Maller(1991)Curr.Opin.Cell Biol.，3：26)。对于多细胞生物维持基因组完整性特别重要，并且有多个关卡监控基因组情况。其中G1和G2关卡分别在DNA复制和有丝***之前。在进入S期之前，修复或更正DNA损伤具有决定性，因为一旦受损的DNA发生复制，常常导致突变(Hartwell(1992)Cell，71：543)。广泛的DNA损伤未经修复而度过G1和G2关卡会导致有丝***紊乱和/或细胞凋亡。
大多数癌细胞的G1关卡相关蛋白，例如p53、Rb、MDM-2、p16INK4和p19ARF(Levine(1997)Cell，88：323)携带异常。另一种情况是，突变可导致癌基因产物，如Ras、MDM-2和细胞周期蛋白D的过度表达和/或过度活化，这样降低了G1关卡的严格性。除了这些突变，生长因子的过度表达可导致生长因子信号的过度转导，也可降低G1关卡严格性。加上功能丧失突变和功能获得突变，由生长因子受体或下游信号传导分子引起的持续活化作用可使细胞越过G1关卡而产生细胞转化。被破坏或消除的G1关卡有助于更高的突变率和许多在癌细胞中观察到的突变。其结果是大多数癌细胞依赖G2关卡以拮抗DNA过度损伤而存活(O′Connor和Fan(1996)Prog.Cell Cycle Res.，2：165)。
G2细胞周期关卡限制有丝***的起始，直到DNA复制和修复的完成。G2关卡的失灵将允许有丝***的不成熟起始先于DNA复制和修复的完成，使子细胞缺少大量基因组DNA或携带多种突变。G2关卡的功能包括检测DNA损伤和检测到DNA损伤时产生能导致细胞周期停止的信号。促进DNA损伤后细胞周期G2停止的机制被认为从酵母到人是保守的。在受损DNA存在的情况下，Cdc2/细胞周期蛋白B激酶由于Cdc2激酶上14位苏氨酸残基和15位酪氨酸残基的磷酸化而保持失活状态；另一方面，细胞周期蛋白B的水平可能会下降。在有丝***起始时，Cdc25磷酸酶除去Cdc2/细胞周期蛋白B激酶上的抑制性磷酸，因而激活Cdc2/细胞周期蛋白B激酶。Cdc2/细胞周期蛋白B激酶的活化等同于开始M期。
在裂殖酵母中，蛋白激酶Chk1是因受损DNA而停止细胞周期所必须的。Chk1激酶作用于下游一些rad基因产物，并且在DNA损伤时被磷酸化修饰。出芽酵母的Rad53激酶和裂殖酵母的Cds1激酶已知可传导来自未复制DNA的信息。看起来在Chk1和Cds1之间存在一些冗余，因为除去Chk1和Cds1会使对受损DNA引起的G2停止的破坏达到最高。有趣的是，Chk1和Cds1均可磷酸化Cdc25，且均促进Rad24与Cdc25结合，这样将Cdc25与细胞溶质隔开并防止Cdc2/细胞周期蛋白B的活化。因此Cdc25表现为这些激酶的共同靶点，提示此分子是G2关卡不可缺少的因子。
在人类，与裂殖酵母Chk1同源的人hChk1以及与出芽酵母Rad53和裂殖酵母Cds1同源的人Chk2/HuCds1均可磷酸化Cdc25C于216位丝氨酸，此位点是响应DNA损伤的关键调节位点。该磷酸化产生一个可供与裂殖酵母Rad24和Rad25同源的人小酸性蛋白14-3-3s结合的位点。将Cdc25C中216位的丝氨酸取代为丙氨酸可破坏人细胞的细胞周期G2停止，这一事实清楚的表明了该磷酸化的调控作用。但是，G2关卡的机制仍未完全阐明。
                      发明概述
本发明提供化合物，其可用于治疗细胞增殖失调，如与良性和恶性癌细胞有关的失调，并进一步提供含有这些化合物的药用组合物。虽然本发明不仅限于任何具体机制，但是认为本发明化合物可以通过抑制、破坏或消除G2关卡发挥作用，具体的说是消除DNA损伤导致的G2关卡。本发明化合物可作为抗癌剂，选择性使具有DNA损伤的细胞如癌细胞对DNA损伤效应敏感。本发明化合物可使细胞、尤其是癌细胞对DNA损伤剂或治疗作用敏感。本发明化合物可在无其它DNA损伤性治疗时抑制细胞增殖，并对正常细胞没有或几乎没有细胞毒性作用。因此，在有或没有其它DNA损伤性治疗时，本发明化合物可用作抗癌剂和作为抗癌药品的药用组合物中的活性成分。
本发明提供治疗增殖失调性细胞的方法。本发明提供消除细胞G2关卡、尤其是消除DNA损伤导致的G2关卡的方法，该方法使细胞与足以消除G2关卡剂量的本发明化合物或药用组合物接触。本发明进一步提供一种方法，用于特异性使具有受损G1关卡的细胞对DNA损伤剂敏感，所述方法包括使细胞与足以消除G2关卡剂量的本发明化合物或药用组合物接触，从而使细胞对DNA损伤剂敏感。所述细胞可以是哺乳动物细胞，优选是人体细胞，更优选是人癌细胞。
本发明提供一种方法，用于引起某一个体的细胞有丝***紊乱和/或细胞凋亡，该方法为给予足以消除细胞G2关卡剂量的本发明化合物或药用组合物，从而使细胞对DNA损伤剂和给予DNA损伤剂敏感。所述细胞可为哺乳动物细胞，优选是人体细胞，优选是人癌细胞。所述癌细胞可具有受损的G1细胞周期停止关卡。所述的DNA损伤剂可为5-氟尿嘧啶(5-FU)、雷别卡霉素、阿霉素、博来霉素、顺氯氨铂、高温、UV辐射或伽马射线或者任何合适的化合物，此化合物是已知可导致DNA损伤的和/或通过筛选方法鉴别的，例如美国专利申请号No.09/667,365中所述。
                      附图简述
图1表示用流式细胞仪分析博来霉素(40μg/ml)或博来霉素加上不同浓度CBDC402(0.2、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25和50μg/ml)处理24小时后的Jurkat细胞DNA含量的结果。
图2表示用流式细胞仪分析秋水仙素(5μg/ml)或秋水仙素加上不同浓度CBDC402(0.2、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25和50μg/ml)处理24小时后的Jurkat细胞DNA含量的结果。
图3a-b表示不同CBDC化合物的活性；图3a表示不同CBDC化合物对G2关卡消除作用的剂量-反应曲线，图3b则说明了CBDC化合物的构效关系。
图4表示一些CBDC化合物的结构、化学名和CBDC编号。
图5表示一些CBDC化合物的结构和相对活性。
图6表示一些CBDC化合物G2关卡消除作用的IC50值。
图7表示将HCT116细胞用阿霉素(ADR)、博来霉素(Bleo)、喜树碱(Campto)和顺氯氨铂(CDDP)处理24小时后，然后不用CBDC004处理或用2uM、10uM或50uM的CBDC004处理，用流式细胞仪分析细胞DNA含量的结果。
图8表示将HCT116细胞用博来霉素(10ug/ml)、阿霉素(1ug/ml)、喜树碱(1ug/ml)或顺氯氨铂(CDDP，10ug/ml)处理，同时在每种处理方案中，用无、2uM、10uM或50uM的CBDC004处理细胞，用流式细胞仪分析细胞毒性(G1期细胞数％)的结果；G1期细胞数通过用Krishan溶液将细胞染色来测定。
图9表示CPT-11、CBDC402或CPT-11和CBDC402合用对肿瘤生长的效果，其中人结肠肿瘤细胞系HCT116皮下种植于SCID小鼠；将每个处理组肿瘤平均大小(n＝4)对处理天数作图。
图10a-c表示用流式细胞仪分析CDBC402特异性消除DNA损伤引起的细胞周期G2关卡的结果；图10a表明CBDC402消除博来霉素导致的G2期活化正常T细胞增加；图10b表明CBDC402消除博来霉素导致的G2期白血病性T细胞(Jurkat细胞)大量增加；图10c表明CBDC402不影响秋水仙素导致的M期活化正常T细胞增加。
                      发明详述
本发明提供用于治疗细胞增殖失调的组合物和方法。具体的说，本发明提供消除细胞周期G2关卡的化合物，此化合物可用于治疗细胞增殖失调，例如与癌症有关的失调。本发明提供在合适载体或赋形剂中含有一种或多种本发明化合物的药用组合物，这些组合物可含有其它活性成分如DNA损伤剂。本发明提供使用本发明化合物、以及含有本发明化合物的药用组合物的方法，以抑制或杀死增殖细胞，特别是增殖失调的细胞。本发明进一步提供用本发明化合物使细胞选择性对包括DNA损伤剂在内的其它药物或治疗敏感的方法。
定义
除另有说明外，所有本文中使用的技术和科学术语是本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。除另有说明外，本文使用的以下术语具有其被赋予的含义。
术语“消除细胞周期G2关卡”或“抑制细胞周期G2关卡”或“破坏细胞周期G2关卡”或“细胞周期G2关卡的消除作用”任何同等表述是指本发明化合物能够消除细胞停止细胞周期在G2关卡的能力。细胞周期G2关卡的消除作用包括导致G2细胞周期停止条件下的消除作用，例如某些抗癌剂、X射线辐射、伽马射线辐射、UV辐射或高温造成的DNA损伤累积。在所述条件下消除G2关卡被认为是“G2关卡的消除作用”，但更优选是消除“DNA损伤导致的G2关卡”，其中通常理解是DNA损伤导致的G2关卡包括识别DNA损伤和产生通常能引起G2细胞周期停止的信号。细胞周期G2关卡被消除的细胞处于G2关卡的时间缩短，包括从完全没有G2关卡(G2关卡停止)到适当条件下降低G2关卡数分、小时、天、周或更长时间。这样，与本发明化合物接触的细胞具有比通常没有接触本发明化合物的细胞更短的G2关卡时间。例如，G2关卡时间的缩短意味着处于G2具有特定时间如4小时的细胞，与本发明化合物接触后，处于G2会少于4小时，如3.5小时、3小时、2.5小时、2小时、1小时或更短的时间。术语“G2消除作用”或“G2关卡消除作用”或“G2关卡抑制活性”或任何同等表述的意思是任意量的G2关卡消除或抑制作用。
本文使用的术语“凋亡”指程序性细胞死亡以及相关细胞生理学改变，包括核酸片断化、帽蛋白酶活化和染色体压缩等，即本领域技术人员所理解的含义。术语“有丝***紊乱”是指有丝***过程错误造成的细胞死亡。
本文使用的术语“DNA损伤性治疗”和“DNA损伤剂”是指任何直接或间接损伤DNA的治疗方案。具体的DNA损伤剂例子包括烷化剂、亚硝基脲、抗代谢物、植物生物碱、植物提取物和放射性同位素。具体的例子还包括DNA损伤性药物，例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨、S-1(替加氟，5-氯-2，4-二羟基吡啶和1，4，5，6-四氢-4，6-二氧-1，3，5-三嗪-2-羧酸)、5-乙炔基尿嘧啶、***糖基胞嘧啶(ara-C)、5-氮杂胞嘧啶核苷(5-AC)、2′，2′-二氟-2′-脱氧胞苷(dFdC)、嘌呤抗代谢物(巯基嘌呤、硝基咪唑硫嘌呤、硫代鸟嘌呤)、盐酸吉西他滨(健择)、喷司他丁、别嘌醇、2-氟-***糖基-腺嘌呤(2F-ara-A)、羟基脲、硫芥子气(二氯乙硫醚)、双氯乙基甲胺、美法仑、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、噻替派、AZQ、丝裂霉素C、二去水卫矛醇、二溴卫矛醇、磺酸烷基酯(白消安)、亚硝基脲(卡氮芥、氯乙环己亚硝脲、4-甲基氯乙环己亚硝脲或ACNU)，丙卡巴肼、decarbazine、雷别卡霉素、蒽环霉素如多柔比星(阿霉素；ADR)、柔红霉素(盐酸柔红霉素)、伊达比星(盐酸伊达比星)和表柔比星(盐酸表柔比星)、蒽环霉素类似物例如米托蒽醌、放线菌素D、非嵌入拓扑酶抑制剂如表鬼臼毒素(依托泊苷＝VP16，替尼泊苷＝VM-26)、鬼臼毒素、博来霉素(Bleo)、培洛霉素、可与核酸形成加合物的化合物，包括铂衍生物如顺氯氨铂(CDDP)、顺氯氨铂反式类似物、卡铂、异丙铂、四铂和奥沙利铂，以及喜树碱、托泊替康、伊立替康(CPT-11)和SN-38。核酸损伤性治疗的具体例子包括辐射，如紫外(UV)、红外(IR)、或α-射线、β-射线、γ-射线以及环境剧烈变化，如高温。本领域的技术人员可鉴别和使用其它DNA损伤剂和治疗。
术语“本发明化合物”是指具有本文所公开结构和活性的分子。本发明化合物可以是被分离、纯化、大致纯或可为含有其它成分混合物的组合物。含有本发明化合物的组合物其纯度可被测量，例如采用分析化学技术如高效液相色谱(HPLC)。本文提供的组合物可含有一种或多种本发明化合物，与合适的载体、赋形剂、包括DNA损伤剂等的其它活性有效成分相混合。
术语“药用组合物”指适合于患者药学用途(例如作为抗癌剂)的组合物。患者可能是需要治疗细胞增殖失调的人。本发明药用组合物是一种制剂，所述制剂含有至少一种药理学有效剂量的本发明化合物和药学可接受的载体。
本文使用的术语“增殖失调”和“增殖状态”是指任何病理性和非病理性生理状态，它以至少一种细胞异常或不良增殖为特征，包括以不良或不需要的细胞增殖为特征的状态或以缺陷性或异常性的细胞凋亡为特征的细胞存活状态，以及以异常或不良或不需要的细胞存活为特征的状态。术语“分化失调”是指任何病理性和非病理性生理状态，它以分化异常或低分化为特征。
术语“患者”指动物，典型是哺乳动物，例如灵长目(人、无尾猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猕猴)，家养动物(狗和猫)，农场养殖动物(马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。患者包括动物疾病模型(如带瘤小鼠)。
除文中另有明确说明外，本文使用的单数形式“一种”、“该”和“所述”包含了复数形式。因此，例如，提及一种“化合物”包括了许多化合物，述及“一种残基”或  “一种氨基酸”包括一个或多个残基和氨基酸。
对于本文所有目的，本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用整体结合到本文中。
G2关卡消除作用
虽然本发明不限于某一具体作用机制，但是观察到本发明化合物可消除增殖细胞的G2关卡。G2细胞周期关卡限制有丝***的起始直到DNA复制和修复完成，G2关卡的破坏会允许有丝***的不成熟起始先于DNA复制和修复的完成。尽管不希望受限于该理论，但认为在累积有DNA损伤的细胞中，通过本发明化合物消除G2关卡意味着细胞没有机会在G2关卡更正或修复其DNA损伤，而是没有进行DNA修复就通过G2，这会导致有丝***紊乱、凋亡或其它导致细胞抑制或细胞死亡的状态。
一方面，本发明提供消除DNA损伤引起的G2细胞周期停止的方法。正常细胞和DNA损伤细胞具有明显不同的细胞周期响应，特别是其G2关卡。损伤引起的G2关卡包括识别DNA损伤和产生导致细胞周期停止的信号。本发明提供化合物选择性消除DNA损伤引起的G2关卡。
另一方面，本发明提供化合物和药用组合物，使细胞对DNA损伤剂和治疗敏感。本发明提供使细胞对DNA损伤剂和治疗敏感的方法。
再另一方面，本发明提供化合物和药用组合物，选择性指向DNA损伤细胞。本发明进一步提供选择性指向DNA损伤细胞的方法，使细胞与至少一种本发明化合物接触，其量足以消除DNA受损引起的G2关卡。在一实施方案中，将预先存在DNA损伤的细胞用消除G2关卡的本发明化合物处理，DNA损伤细胞度过G2期，导致细胞死亡或抑制(通常是有丝***紊乱或凋亡)。在另一实施方案中，细胞用至少一种DNA损伤剂和至少一种本发明化合物联合处理，与单用DNA损伤剂相比，导致细胞死亡率或抑制率升高。
另一方面，本发明提供化合物和药用组合物，选择性指向具有受损的G1细胞周期关卡的细胞，具体的说是癌细胞。本发明提供一种方法，使细胞与足以消除G2细胞周期关卡剂量的至少一种本发明化合物接触，选择性指向具有受损的G1细胞周期关卡的细胞，具体的说是癌细胞。尽管不希望受限于该理论，但是具有受损G1细胞周期关卡的细胞不会在G1前修复DNA，用本发明化合物消除G2关卡意味着这些细胞不会修复累积的DNA损伤而进行有丝***。DNA损伤后缺少有效的G2关卡对于具有G1关卡缺陷的细胞是致命的。如果细胞没有进行足够的DNA损伤修复而度过G2，这些损伤可能导致有丝***紊乱或细胞凋亡。
一方面，本发明提供化合物，选择性指向癌细胞，并杀死或抑制癌细胞的生长。本发明进一步提供方法，选择性指向癌细胞，并使细胞与足够消除G2关卡剂量的至少一种本发明化合物接触，杀死或抑制癌细胞的生长。许多癌细胞的与G1细胞周期停止关卡有关的基因具有突变，这些基因包括受损的肿瘤抑制基因如p53、Rb、p16IMK4和pl9ARF，和/或是导致癌基因如MDM-2和cyclin D表达的突变。此外，越过G1关卡可导致正常细胞转化为癌细胞，如生长因子过度表达导致的生长因子信号过度转导可导致产生一种状态，其中通过越过G1关卡，生长因子受体和下游信号传导分子引起细胞转化。相反，几乎没有癌症具有被破坏的G2细胞周期停止关卡。因此，在G1关卡受损的癌细胞中常常保留G2关卡。与具有完整G1关卡的正常细胞相比，选择性破坏G2关卡将使具有受损G1关卡的癌细胞对致DNA治疗更敏感，因为度过G1和G2而不修复损伤可导致细胞凋亡和有丝***紊乱。尽管不希望受限于该理论，但是本发明化合物选择性破坏(消除)癌细胞中的G2关卡，因此导致具有受损G1关卡的癌细胞对DNA损伤性治疗更敏感。相应的，本发明提供化合物，使G1关卡受损的癌细胞对致DNA物和治疗敏感。
本发明的另一方面，本发明化合物可选择性指向癌细胞而对正常细胞没有或几乎没有细胞毒性。尽管不希望受限于该理论，但推测G2关卡被本发明化合物消除的正常细胞将不会或几乎不会因无正常运行的G2关卡就进入G2期和经历有丝***而有不良后果；相反，本发明化合物消除DNA损伤细胞中的DNA受损G2关卡被认为有强烈的细胞毒性作用，导致细胞凋亡或有丝***紊乱。这样，本发明提供一种方法，通过使细胞与足以消除G2关卡剂量的至少一种本发明化合物接触，选择性指向DNA损伤细胞例如癌细胞，而对正常(未受损)细胞没有或几乎没有细胞毒性作用。本发明提供含有至少一种本发明化合物的药用组合物，其适合用于选择性指向DNA损伤细胞例如癌细胞的方法，而对正常(未受损)细胞没有或几乎没有细胞毒性效果。
另一方面，本发明化合物可使细胞、具体的说是癌细胞对DNA损伤剂的杀细胞作用敏感，而对正常细胞没有或几乎没有细胞毒性作用。大多数传统抗癌剂无差别的指向增殖细胞，无论它们是癌细胞还是正常细胞，其结果是大多数传统抗癌药物产生副作用，如恶心、腹泻和脱发。相反，本发明化合物选择性指向具有受损G1关卡或其它类型DNA损伤的细胞，并因此对正常细胞没有或几乎没有细胞毒性。
本发明提供一种方法，通过使细胞与足以消除G2关卡剂量的至少一种本发明化合物接触，引起细胞凋亡或有丝***紊乱。本发明进一步提供一种方法，通过使细胞与足以消除G2关卡剂量的至少一种本发明药用组合物接触，引起细胞凋亡或有丝***紊乱。所述细胞可为具有DNA损伤的细胞，优选是癌细胞。
本发明提供一种方法，使细胞与DNA损伤剂或治疗以及足以消除G2关卡剂量的至少一种本发明化合物接触，因而使细胞对DNA损伤剂或治疗敏感，引起细胞凋亡或有丝***紊乱。所述细胞可为癌细胞。此癌细胞可具有受损的G1细胞周期关卡。此DNA损伤剂或治疗可为5-氟尿嘧啶(5-FU)、雷别卡霉素、阿霉素、博来霉素、顺氯氨铂、高温、UV辐射、伽马射线，或其它足以导致损伤的DNA损伤剂或治疗。
一方面，本发明提供一种筛选能消除G2关卡的化合物的方法，该方法为：(a)提供受试化合物；(b)提供细胞群；(c)给予所述细胞处理后可导致细胞在G2/M期累积的药物；(d)给予一部分细胞受试化合物，所述细胞用可导致细胞在G2/M期累积的药物处理过；(e)测定用受试化合物处理后细胞中处于G2/M期细胞的数量；(f)测定单用导致G2/M期细胞累积试剂处理后处于G2/M期细胞的数量；(g)比较(e)数量与(f)数量以确定受试化合物是否消除G2细胞周期关卡。根据这种方法，G2/M期细胞的累积被用作G2细胞周期停止的指标。在一实施方案中，所述药物引起DNA损伤，所述方法用于筛选能消除DNA损伤引起G2关卡的化合物。在另一实施方案中，DNA的量用流式细胞仪测定，例如将DNA用碘化丙锭染色后用FACSTM分析，或用其它同等方法，通过测定每个细胞DNA含量的方法判定细胞周期情况。在一实施方案中，DNA的量在接触步骤后约10到72小时后测量。
本发明提供一种化合物，当给予细胞时其消除G2关卡，优选是DNA损伤引起的G2关卡，在有或没有DNA损伤性治疗时杀死或抑制细胞，其中所述化合物具有以下结构：
Figure A0381847600221
其中1个或2个苯环可被吡嗪、嘧啶、哌嗪、吗啉、环己烷、哌啶(piperizine)或吡啶取代；R1为卤素如溴(Br)、氯(Cl)、氟(F)、碘(I)、氨基(NH2)、硝基(NO2)、羟基(OH)、甲氧基(OCH3)、甲基(CH3)或氢(H)，R2、R3、R4、R5和/或R6为溴(Br)、氯(Cl)、氟(F)、碘(I)、氨基(NH2)、硝基(NO2)、甲基(CH3)、甲氧基(OCH3)、羟基(OH)、CH(CH3)2、CHO、CHOCH3、O(CH2)nCH3、OCO(C6H12)Cl、COOCH3或氢；X1为氮(NH)、氧(O)或硫(sulphate)(S)；X2为氧(O)或硫(S)。说明性实施方案可参见附图，尤其是图3、4、5和6，但本发明化合物不限于这些实施方案。
本发明提供化合物，当给予细胞时消除G2关卡，优选是DNA损伤引起的G2关卡，在有或没有DNA损伤性治疗时杀死或抑制细胞，其中所述化合物具有以下一般结构：
其中1个或2个苯环可被吡嗪、嘧啶、哌嗪、吗啉、环己烷、哌啶或吡啶取代；R1为溴(Br)、氯(Cl)、氟(F)、碘(I)、氨基(NH2)、硝基(NO2)、羟基(OH)、甲氧基(OCH3)、甲基(CH3)或氢(H)，R2为溴(Br)、氯(Cl)、氟(F)、碘(I)、氨基(NH2)、硝基(NO2)、甲基(CH3)、甲氧基(OCH3)、羟基(OH)、CH(CH3)2、CHO、CHOCH3、O(CH2)nCH3、OCO(C6H12)Cl、COOCH3或氢；X1为氮(NH)、氧(O)或硫(S)；X2为氧(O)或硫(S)。说明性实施方案可参见附图，尤其是图3、4、5和6。
本发明提供化合物，在有或没有DNA损伤性治疗时消除G2关卡和/或抑制或杀死癌细胞，其中所述化合物具有以下结构：
Figure A0381847600231
其中对R1到R6位不同分子的取代影响所得化合物的G2关卡消除活性。已经确定了以下构效关系
R1：溴(Br)提供比氯(Cl)、氟(F)或甲基(CH3)更高的活性。
R2：甲基(CH3)或甲氧基(OCH3)提供比羟基(OH)、溴(Br)、氯(Cl)、CH(CH3)2、CHO、CHOCH3、O(CH2)nCH3、OCO(C6H12)Cl或COOCH3或H更高的活性。
R3：甲基(CH3)提供比H或甲氧基(OCH3)更高的活性。
R4：可使用溴(Br)、氟(F)、氯(Cl)或H。
R5：可使用溴(Br)、氟(F)、氯(Cl)或H。
R6：可使用溴(Br)、氟(F)、氯(Cl)或H。
前述列表仅仅是说明性而不是穷尽性的。说明性实施方案可在图3、4、5和6找到。本领域的普通技术人员可根据本公开的教导进行其它的取代和活性测定，以获得本发明的其它化合物。本领域的普通技术人员还清楚，虽然某些取代基可产生比其它结构更高的消除DNA损伤引起G2关卡方面的活性，本发明提供有所有取代和所有活性水平的化合物。对于具体实施方案，本领域的普通技术人员在选择本发明化合物用于所述实施方案时，除了考虑对特定目标的活性之外，要考虑多个因素。本领域的普通技术人员将考虑化合物的活性、利用度、稳定性、合成的难度与效率、用于药用组合物的配制合适性、药力(drugability)、体内、体外或离体与其它化合物的相互作用、杀细胞能力、抑制细胞生长能力、对正常细胞的作用和其它活性。
本发明提供消除G2关卡的化合物，优选为选择性消除DNA损伤引起的细胞周期G2关卡的化合物。提供的化合物在G1关卡缺陷的细胞如癌细胞中选择性消除DNA损伤引起的细胞周期G2关卡，并在用DNA损伤剂处理的细胞中选择性消除DNA损伤引起的G2关卡。本发明提供化合物，使细胞对DNA损伤性治疗敏感。进一步提供的化合物，可单独或与抗癌剂合用抑制异种移植肿瘤生长。本发明提供化合物，单独或与抗癌剂合用可抑制体外癌细胞集落形成。优选本发明提供化合物在有或没有DNA损伤性治疗时，消除G2关卡和/或抑制或杀死癌细胞，包括但不仅限于：
CDBC004：4-氯-苯甲酸4-甲氧基-苯基酯
CBDC401：4-氯-苯甲酸对甲苯酯
CBDC402：4-溴-苯甲酸对甲苯酯
CBDC403：3，4，5-三氟-苯甲酸对甲苯酯
CBDC404：4-氟-苯甲酸4-溴-苯基酯；化合物中含有乙烷
CBDC405：3，4-二氯-苯甲酸对甲苯酯；化合物中含有乙烷
CBDC406：2，4-二氯-苯甲酸对甲苯酯；化合物中含有乙烷
CBDC407：4-氟-苯甲酸对甲苯酯；化合物中含有乙烷
CBDC408：2，3，4，5，6-五氟-苯甲酸对甲苯酯；化合物中含有乙烷
CBDC409：4-氯-苯甲酸3，4-二甲基-苯基酯；化合物中含有乙烷
CBDC410：4-氯-苯甲酸4-羟基-苯基酯；化合物中含有乙烷
CBDC411：4-氟-苯甲酸4-羟基-苯基酯；化合物中含有乙烷
CBDC412：4-溴-苯甲酸4-氟-苯基酯
CBDC413：4-溴-苯甲酸4-三氟甲基-苯基酯
CBDC414：4-溴-苯甲酸4-羟基-苯基酯
CBDC415：4-溴-苯甲酸4-三氟甲氧基-苯基酯
CBDC418：4-溴-苯甲酸6-甲基-吡啶-3-基酯
CBDC440：4-溴-硫代苯甲酸邻-对甲苯酯
CBDC441：4-溴-二硫代苯甲酸对甲苯酯
CBDC442：4-溴-硫代苯甲酸S-对甲苯酯
这些化合物的结构见本文提供的图3、4、5和6以及权利要求。
本发明提供组合物，选择性消除DNA损伤导致的细胞周期关卡。在一实施方案中，化合物CBDC402在G1关卡缺陷的癌细胞中选择性消除DNA损伤引起的细胞周期G2关卡，参见下述实施例1。将Jurkat细胞(人T细胞白血病源细胞系)用一种用作抗癌剂的DNA损伤剂博来霉素处理，导致G2/M期细胞累积，提示博来霉素引起的DNA损伤造成G2细胞周期停止。CBDC402消除博来霉素引起的G2/M期细胞累积，其作用呈剂量依赖性(图1)。秋水仙碱不引起G2细胞周期停止，在另一实施方案中，CBDC402在任何浓度下都不抑制秋水仙碱引起的G2/M期细胞累积(图2)。因此，CBDC402选择性消除DNA损伤引起的细胞周期关卡。
本发明提供组合物，给予细胞时消除DNA损伤引起的G2关卡。在不同实施方案中，化合物CBDC004、CBDC402、CBDC403、CBDC404、CBDC405、CBDC406、CBDC407、CBDC408、CBDC409、CBDC410和CBDC411呈剂量依赖性消除用博来霉素处理的Jurkat细胞中的G2细胞周期关卡(图3a)。不同CBDC化合物消除G2关卡的剂量-反应曲线表明CBDC402在此实施方案中具有最高的活性，而且所有受试CBDC化合物在最高浓度下(50μg/ml)均能消除G2细胞周期关卡。对应不同活性水平的结构见图3b；图3b公开的结构其相应的CBDC命名参见图4。
所述方法提供具有不同G2关卡消除活性的组合物，并进一步提供测定这些活性的方法。在其它实施方案中，测试CBDC化合物的G2关卡消除活性。CBDC化合物被分为高活性、中等活性、普通活性、低活性和无活性，如图5所示。Jurkat细胞中G2关卡消除作用的IC50通过如上所述活性的剂量-反应法测定，并根据其活性分类，如图6所示。在图5和6中，CBDC化合物通过公布其化学结构完全公开，在某些部分中，CBDC化合物通过CBDC命名号码识别。
本发明提供一种组合物，消除由各种DNA损伤剂造成的DNA损伤引起的G2关卡。在一个实施方案中，化合物CBDC004消除由不同抗癌剂激活的DNA损伤引起的G2关卡。人癌细胞(HCT116人结肠癌细胞)在有或没有化合物CBDC004时用博来霉素、阿霉素、喜树碱或顺氯氨铂(CDDP)处理。每种这些抗癌剂引起细胞累积在G2/M细胞周期，并且与CBDC004共同温育可减少G2/M期细胞数目，提示CBDC004消除了博来霉素、阿霉素、喜树碱或顺氯氨铂活化的DNA损伤引起的G2关卡。
本发明提供一种组合物和方法，使细胞对DNA损伤性治疗敏感。在另一个实施方案中，CBDC004使人细胞对各种用作抗癌剂的DNA损伤性治疗的细胞毒性作用敏感。人癌细胞(HCT116细胞)在有或没有化合物CBDC004时用博来霉素、阿霉素、喜树碱或顺氯氨铂处理，并测量处理后的死亡细胞数目。CBDC004使细胞对每种DNA损伤性治疗的毒性作用敏感(图8)。给予细胞本发明化合物使细胞对DNA损伤性治疗敏感，使DNA损伤性治疗更有效。
本发明提供抑制异种移植肿瘤的组合物和方法。在另一实施方案中，CBDC402抑制异种移植肿瘤的生长。将HCT-116人结肠癌细胞移植到重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠皮下后，给予其不同化合物并观察肿瘤生长情况。CBDC402单独可使肿瘤生长轻度减缓，CBDC402加CPT-11(CAMPTOSARX，伊立替康，一种拓扑酶抑制剂)合用可显著降低或抑制肿瘤生长。
本发明提供治疗增殖失调细胞的组合物和方法。具体的说，本发明提供化合物和方法，抑制不同方面具有增殖失调的细胞，包括抑制癌细胞在体外形成集落。本发明化合物单独或与抗癌剂合用在体外抑制癌细胞集落的形成。在一实施方案中，来源于人胃癌细胞系的MK-45细胞接种于多孔板，用CBDC402、CBDC412、CBDC413和CBDC418处理。单独用CBDC402处理明显抑制MK-45细胞集落形成，而用CBDC412处理只轻度抑制集落形成。在一包括CPT-11的实施方案中，加入CBDC402表现为增强CPT-11的效果，导致几乎完全抑制集落形成。
本发明提供组合物和方法，选择性消除DNA损伤引起的G2关卡而不影响M关卡。在一实施方案中，CBDC402选择性消除DNA损伤引起的G2关卡。博来霉素引起G2期活化正常T细胞累积中度增加(图10a)，并且引起G2期Jurkat细胞(白血病T细胞)大量累积(图10b)。CBDC可消除两个细胞系中博来霉素引起的G2期细胞增加(图10a，b)。当活化正常T细胞接受秋水仙碱处理时，会导致M期细胞累积，而CBDC402不影响秋水仙碱引起的M期活化正常T细胞增加。所述实施方案表明CBDC402选择性消除G2细胞周期关卡而不影响M期关卡。
本发明提供合成本发明化合物的方法。在一实施方案中，CBDC412(4-溴-苯甲酸4-氟-苯基酯)按如下所述合成。在一实施方案中，10ml二氧六环、5mmol(1.1g)4-溴-苯甲酰氯和5mmol(0.56g)4-氟-苯酚依次加入到50ml四口烧瓶并在室温下溶解。将溶解在二氧六环中的三乙胺缓慢滴入此溶液并在室温下搅拌三小时。过滤沉淀的晶体并用苯抽提。提取溶液用碳酸氢钠洗涤几次，加入无水镁，将所得溶液干燥并过滤。该溶液在低压下蒸馏并结晶。粗晶为黄白色，重1.37g。一部分结晶(0.5g)溶于苯并用100g硅胶纯化。纯化产物为白色，纯度用液相色谱(LC)确定为99.93％。其结构用NMR确定(见实施例6)。
筛选
本发明提供筛选抑制或消除G2关卡的潜在治疗性化合物(“受试化合物”或“候选化合物”)的组合物和方法。可用于筛选的检测形式是众所周知的。关于不同形式的结合检测的一般描述可参见如BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY，第七版，Stiles和Terr编(1991)；ENZYME IMMUNOASSAY，Maggio编，CRC Press，BocaRaton，Florida(1980)；和“Practice and Theory of EnzymeImmunoassays”in Tijssen，LABORATORY TECHNIQUES INBIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY，Elsevier SciencePublishers，B.V.Amsterdam(1985)。
目标
适于治疗的患者包括正在进行和需要治疗增殖性或分化性失调(如抗癌疗法)的患者。其它合适患者包括如具有发生细胞增殖失调风险的患者。本发明方法因此可用于治疗具有发生细胞增殖失调风险而仍未表现出明显失调症状的患者。风险患者被认为具有遗传易感性或有发生细胞增殖失调的家族史。例如，具有活化癌基因或肿瘤抑制基因具有突变或缺失的患者可为合适患者。因此风险患者可通过对其现有遗传损害进行常规遗传筛查或询问患者家族史而得到鉴别，以确定他们具有所述失调的危险。风险患者的一个具体例子是家族史或其它遗传特征提示具有癌易感性的患者，其中所述肿瘤细胞或抗药肿瘤细胞表达CD40。一个遗传疾病优选具体特例是视网膜神经胶质瘤，这是由于Rb肿瘤抑制基因缺陷引起的。
一般给予“有效剂量”或“足够剂量”的本发明化合物时，其中所述剂量足以产生期望的效果。因此有效量通过检测一个或多个以下方面决定：对于至少一部分包含增殖细胞的细胞(如至少一些目标细胞)，减少细胞增殖、减少细胞数量、抑制增殖增长、抑制细胞数目上升、增加细胞凋亡或减少生存。因此，例如若期望抑制细胞增殖，则有效量是可检测到的减少增殖细胞增殖或增殖细胞数量，或增加细胞凋亡或减少细胞生存的剂量。因此该剂量足以降低目标细胞数量、稳定目标细胞数量或抑制目标细胞数量增加。例如，当失调构成实体肿瘤时，使至少一部分的肿瘤减小肿瘤尺寸、稳定肿瘤尺寸或防止肿瘤进一步生长(例如抑制5-10％或10-20％或更多肿瘤块的细胞生长)是满意的临床终点。当失调构成液体肿瘤时，使其中至少亚群肿瘤细胞减少肿瘤细胞数量，稳定肿瘤细胞数量或抑制肿瘤细胞数量进一步增长(例如抑制5-10％或10-20％或更多细胞生长)是满意的临床终点。
另外，被认为有效的剂量可防止或抑制疾病或失调的进展。例如，特定肿瘤在发展时变得更有侵袭性，包括发展为转移形式。因此，当用量可减少或防止肿瘤变得更有侵袭性或转移时，也认为该剂量是有效的。相应的，抑制或防止失调或疾病恶化，即稳定病情也是满意的临床终点。
对含有液体肿瘤生物样品(如血或组织样品)的检查可确定肿瘤细胞块或数量是否下降，或者抑制肿瘤细胞增殖的作用是否发生。对于固体肿瘤，侵袭性和非侵袭性的成像方法可确定肿瘤尺寸的减小或肿瘤尺寸增加的抑制。受体阳性肿瘤的受体数量下降可被用于评定减少或抑制肿瘤细胞增殖。产生激素的肿瘤，如乳腺癌、睾丸癌或卵巢癌，其激素的产量可用于评定减少或抑制肿瘤增殖。
有效量可客观或主观的减少或降低与失调或疾病有关症状的严重程度或发生频率。例如，一定量的本发明化合物减轻疼痛、恶心或其它不适，或增加食欲或其它主观良好情况是满意的临床终点。
有效量还包括降低另一治疗方案的用量(如剂量)或频率，这被认为是满意的临床终点。例如，用本发明化合物治疗的癌症病人也许需要更少的核酸损伤治疗以抑制癌细胞增殖。在该实例中，与没有用本发明化合物治疗时给予患者的核酸损伤药物剂量频率或剂量相比，有效量包括减少给予患者的核酸损伤药物剂量频率或剂量。
本发明的方法导致的患者病情改善或治疗益处可能在持续时间上较短，如改善可能持续数小时、天、周或延伸到更长一段时间，如数月或数年。有效量不必消除任何或所有疾病或失调症状。因此，对于有效量，采用任何前面的标准或其它本领域已知的适于决定失调或疾病情况的标准，当存在主观或客观改善患者疾病一段短或长的时间，即达到满意的临床终点。一个剂量有效提供一种或多种本文前面所述或本领域已知的有益效果则被称为“改善”患者的疾病或对患者有“治疗益处”。
本发明化合物的有效量可基于动物研究或选择性人临床试验决定。熟练的技术人员会考虑到不同影响治疗特定病人所需剂量和时间的因素，包括例如一般健康情况、年龄、或者患者性别、失调或疾病的严重性或阶段、以前的治疗、对不期望副作用的敏感性、期望的临床后果以及现有的其它失调或疾病。这些因素可能影响提供足够获得治疗益处的量所需的剂量和时间。剂量范围还需考虑药物动力学，如药用组合物的吸收速度、生物利用率、代谢和清除。此外，剂量或治疗方案可根据患者特别制定，或是根据药物基因组学资料进行调整。
可用本发明化合物处理的细胞包括任何希望抑制或防止其体内、体外或离体增殖的细胞。特定的目标细胞表现为比正常细胞周期G1关卡时间更短或具有受损细胞周期G1关卡，这样这些细胞在有充足时间完成核酸修复前就离开G1关卡。确定候选细胞也可通过使受试细胞与本发明化合物单独接触或联合应用本发明化合物与DNA损伤性治疗，并确定接触的细胞是否表现出增殖降低或细胞死亡增加，优选是细胞凋亡或有丝***紊乱。
所以，本发明化合物对于体内、体外和离体抑制细胞增殖是有效的。照此，对于患有或有危险患失调或生理性疾病的患者，而所述失调或疾病以异常或不良或不需要细胞增殖或细胞生存、或者细胞分化异常或缺陷为特征，对其治疗可单独使用本发明化合物或与直接或间接导致DNA损伤的治疗合用，或与抗增殖治疗合用。
因此，本发明提供抑制细胞增殖的方法，增加细胞对DNA损伤剂或治疗敏感性的方法和增加细胞体内、体外和离体核酸损伤的方法。在一实施方案中，方法包括使细胞(如培养细胞和患者细胞)与足以消除G2关卡剂量的本发明化合物接触。在另一实施方案中，方法包括使细胞与足以增加细胞对DNA损伤剂或治疗敏感性剂量的本发明化合物接触。在另一实施方案中，方法包括使细胞与足以增加细胞核酸损伤剂量的本发明化合物接触。在不同方面，方法进一步包括使细胞与DNA损伤剂接触或使细胞暴露于DNA损伤性治疗。
进一步提供的方法为治疗患者细胞增殖失调或分化失调，包括以不良或多余细胞增殖或细胞生存为特征的疾病，以细胞凋亡不足或异常为特征的疾病，以细胞生存异常或缺陷为特征的疾病，以及以细胞分化异常或不足为特征的疾病。在一实施方案中，方法包括给予患有或有危险患细胞增殖失调的患者以有效治疗细胞增殖失调剂量的本发明化合物。在一方面，所述剂量足以改善患者疾病。在具体方面，改善包括至少一部分目标细胞(如异常增殖的细胞)，细胞增殖降低、细胞数量减少、抑制细胞数量增长、细胞凋亡增加或生存期减少。在另一方面，在给予患者抑制细胞增殖治疗之前、同时或之后给予患者本发明化合物。在其它优选的方面，至少一部分细胞增殖失调的细胞位于血液、***、肺、甲状腺、头颈、脑、淋巴、胃肠道、生殖泌尿道、肾、胰腺、肝、骨、肌肉或皮肤。
在另一实施方案中，方法包括给予患者一定量的本发明化合物以治疗固体肿瘤。在另一实施方案中，方法包括给予患者一定量的本发明化合物以治疗液体肿瘤。在不同方面，在给予肿瘤患者另一抗肿瘤治疗之前、同时或之后给予本发明化合物。
应用本发明化合物治疗增殖性或分化性失调
可采用本文中提供的组合物和方法进行治疗的增殖性或分化性失调包括疾病和非病理性生理状态，包括良性和恶性，以异常或不良细胞的数量、细胞生长和细胞生存为特征。这些失调或状态因此可构成疾病状态，包括所有类型的癌性生长或癌性过程、转移性组织或恶性转移细胞、组织或器官，或可为非病理状态，如偏离正常但不具有典型疾病特征。可根据本发明治疗的非病理性状态一个特殊的例子是伤口修复时组织重新生长形成疤痕。
包含增殖性或分化性失调的细胞可能聚集成细胞块或各自分散。术语“固体肿瘤”是指典型的聚集并形成包块的瘤形成或转移瘤。具体例子包括内脏肿瘤例如胃癌或结肠癌、肝、venal、肺和脑肿瘤/癌。“液体肿瘤”是指造血***的肿瘤，例如淋巴瘤、骨髓瘤、白血病，或者自然扩散的肿瘤，它们通常不形成实体包块。白血病的具体实例包括急性或慢性的成淋巴细胞性白血病、成髓细胞性白血病或多发性骨髓瘤。
这些失调包括瘤或癌症，它们实际上可影响任何细胞或组织类型，如癌、肉瘤、黑素瘤、转移肿瘤或造血性瘤形成性失调。转移性肿瘤可来自多数原发性肿瘤类型，包括但不限于胸、肺、甲状腺、头颈、脑、淋巴、肠胃(口腔、食道、胃、小肠、结肠、直肠)、生殖泌尿道(子宫、卵巢、子宫颈、膀胱、睾丸、***、***)、肾、胰腺、肝、骨、肌肉、皮肤等。
癌是指上皮或内皮组织恶性肿瘤，包括呼吸***癌、消化***癌、生殖泌尿***癌、睾丸癌、乳腺癌、***癌、内分泌***癌和黑素瘤。示例性癌包括子宫颈、肺、***、***、头颈、结肠、肝和卵巢的癌症。该术语还包括癌肉瘤，如由癌性和肉瘤性组织组成的恶性肿瘤。腺癌包括腺组织癌，或是肿瘤形成类腺状结构。
肉瘤是指***起源的恶性肿瘤。示例性肉瘤包括例如淋巴肉瘤、脂肉瘤、骨肉瘤和纤维肉瘤。
本文使用的术语“造血性增殖性失调”是指疾病，它包括增生性/瘤形成性造血性起源的细胞，如来自骨髓、淋巴或红细胞系的细胞或它们的前体细胞。通常这些疾病来自低分化急性白血病，如成红细胞性白血病或急性成巨核细胞性白血病。其它示例性骨髓失调包括但不限于急性早幼粒细胞性白血病(APML)、急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML)；淋巴***的恶性肿瘤包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)(包括B系ALL和T系ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、幼淋巴细胞性白血病(PLL)、毛细胞白血病(HLL)和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。其它恶性淋巴瘤包括但不限于非霍奇金细胞瘤及其变异型、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、巨粒淋巴细胞白血病(LGF)、霍奇金病和里德-斯特恩博格病。
可与本发明化合物联合应用的治疗包括任何本文公开的或本领域已知的抗增殖性、DNA损伤性和抗肿瘤治疗。例如，抗细胞增殖或抗肿瘤治疗可包含放射治疗或外科手术切除，并任意与药物治疗合用。治疗可包括给予化学物质如放射性同位素、药物(如化疗药物)、或基因治疗如抗癌基因(如Rb、DCC、p53等)、显性阴性癌基因或癌基因反义物。本发明化合物可在其它治疗方案之前、同时或之后给予。例如，对抗细胞增殖治疗的候选患者(如放射治疗、化疗、基因治疗、手术切除等)可在开始抗细胞增殖治疗前给予本发明化合物。这样提供了预防性的治疗方法。
组合化学文库
组合化学文库是帮助产生新的化学先导化合物的方法，所述化学先导化合物即抑制或消除G2细胞周期停止关卡的化合物。组合化学文库是不同化学化合物的集合，通过组合数种化学“构建模块”如各种试剂，由化学合成或生物合成产生。例如，如多肽文库这样的线性组合化学文库是通过对于给定的化合物长度(如多肽化合物中氨基酸的数目)，用所有可能途径组合一系列称为氨基酸的化学构建模块而形成。成千上万的化学化合物可通过这样组合性混合化学构建模块合成。例如，***性组合混合100个可互换的化学构建元件可在理论上得到1亿个四聚体化合物或100亿个五聚体化合物。组合化学文库的制备和筛选对于本领域普通技术人员是熟知的，见如美国专利号No.6,004,617；5,985,356。这些组合化学文库包括但不限于肽文库(见例美国专利号NO.5,010,175；Furka(1991)Int.J.Pept.Prot.Res.，37：487-493，Houghton et al，(1991)Nature，354：84-88)。其它建立化学多样性文库的化学包括但不限于类胨(见例WO91/19735)、编码肽(见例WO 93/20242)、随机生物低聚物(见例WO92/00091)和苯并二氮杂(见例美国专利No.5,288,514)、多态体如乙内酰脲、苯并二氮杂和二肽(见例Hobbs(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90：6909 6913)、插烯多肽(见例Hagihara(1992)J.Amer.Chem.Soc.114：6568)、具有β-D葡萄糖骨架的非肽模拟物peptidomimetics(见例Hirschmann(1992)J.Amer.Chem.Soc.114：9217；9218)、小分子化合物文库的类似有机合成(见例CHEN(1994)J.Amer.Chem.Soc.116：2661)、低聚氨基甲酸酯(见例Cho(1993)Science 261：1303)、和/或肽基磷酸酯(见例Campbell(1994)J.Org.Chem.59：658)。还可参见Gordon(1994)J.MED.Chem.37：1385；核酸文库和肽核酸文库见例美国专利No.5,539,083；抗体文库见例Vaughn(1996)NatureBiotechnology 14：309-314；糖类文库见例Liang et al.(1996)Science274：1520-1522，美国专利No.5,593,853；有机小分子文库如类异戊二烯见美国专利5,569,588；噻唑烷酮和间噻唑酮(metathiazanones)见美国专利No.5,549,974；吡咯烷见美国专利Nos.5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物见美国专利No.5,506,337；苯并二氮杂见美国专利No.5,288,514。
现已有商业性制备组合文库的装置可用(见例美国专利No.6,045,755；5,792,431；357 MPS，390 MPS，Advanced Chem Tech，LouisvilleKY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，FosterCity，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。液相化学也已发展出一些机器人***。这些***包括自动工作站，如Takeda ChemicalIndustries，LTD(Osaka，Japan)发展的自动合成仪，以及许多使用机器手的机器人***(Zymate II，Zymark Corporation，Hopkinton，Mass.；Orca，Hewlett Packard，Palo Alto，Calif.)，它们模仿化学工作者人工进行的合成操作。上述装置都适合用于本发明。对于相关领域的普通专业人员，这些装置的原理和对其实施修改以进行本文所述的操作(如果有的话)是显而易见的。此外，众多组合文库其本身是可商业获得的(见ComGenex，Princeton，N.J.，Asinex，Moscow，Ru，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，ChemStar，Ltd，Moscow，RU，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD等)。
药用组合物的制备和给予
在一实施方案中，本发明化合物与药学可接受的载体(赋形剂)结合，形成药理学组合物。药学可接受的载体可包含生理学可接受的化合物，所述化合物起如稳定、增加和降低本发明中的药用组合物的吸收度或清除率。生理学可接受的化合物可包括糖类如葡萄糖、蔗糖、葡聚糖，抗氧化剂如抗坏血酸、谷胱甘肽，螫合剂，低分子量蛋白，降低本发明化合物清除或水解的成分，或赋形剂或其它稳定剂和/或缓冲剂。清洁剂包括脂质体载体也可作为稳定剂，或增加或降低所述药用组合物的吸收度。本文公开的药学可接受的载体和化合物配制为本领域的普通技术人员所熟知，并在科学和专利文献有详细描述，参见如最新版本的Remington′s Pharmaceutical Science，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania(″Remington′s″)。
其它生理学可接受的化合物包括湿润剂、乳化剂、分散剂或防腐剂，防腐剂在防止微生物生长或作用上特别有用。已知有不同的防腐剂，包括如苯酚和抗坏血酸。本领域的普通技术人员会知道，选择包括生理学可接受化合物的药学可接受的载体取决于例如给予本发明化合物的途径和它的具体理化特性。
在一实施方案中，至少一种本发明化合物的溶液溶解于药学可接受的载体，例如若组合物可溶于水则为水性载体。可用于配制肠内、肠胃外或经粘膜运载药物的水性溶液的例子包括水、盐水、磷酸盐缓冲液、Hank′s溶液、Ringer′s溶液、葡萄糖/盐水、葡萄糖溶液及类似物。为接近生理环境，制剂可包含药学可接受的辅助物质，例如缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、去污剂及类似物。添加物还可包括其它活性成分例如杀菌剂或稳定剂。例如，溶液可含有乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯或油酸合三乙醇胺。这些组合物可用传统公认的灭菌技术灭菌，或采用过滤除菌。所得水溶液可包装后使用，也可进行冷冻干燥，冷冻干燥制剂在给药前用灭菌水配制后使用。这些制剂中的肽浓度可大幅变化，主要根据液体体积、粘度、体重和其它类似因素选择浓度，以与所选的具体给药方式和患者需要一致。
固体制剂可用于肠内(口服)给药。它们可配制为丸剂、片剂、粉末或胶囊剂。对于固体组合物，可使用传统无毒固体载体，包括药用级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁及类似物。对口服给药，药学可接受的无毒组合物通过混合任何常规使用的赋形剂，例如前面所列载体，以及一般10％到95％的活性成分(如肽)而形成。非固体制剂也可用于肠内给药。载体可从不同油中选择，包括石油、动物油、植物油和合成油，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油和类似物。合适的药用赋形剂包括例如淀粉、纤维素、滑石粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、氯化钠、干脱脂乳、甘油、丙二醇、水和乙醇。
本发明化合物当口服给予时可被保护防止消化。这可通过使本发明的一种或多种化合物与某些组分复合使其抗酸性和酶水解作用，或者通过将肽或复合物包装于合适的抵抗载体中，如脂质体。保护化合物不被消化的方法是本领域熟知的，见例Fix(1996)PharmRes.13：1760 1764；Samanen(1996)J.Pharm.Pharmacol.48：119 135；美国专利5,391,377，描述了口服运载治疗药物的脂类成分(脂质体运载在以下进一步详细讨论)。
全身性给药也可通过经粘膜或经皮的方式。对经粘膜或经皮给药，适合的穿透屏障的增透剂可用于配制制剂。这些增透剂是本领域熟知的，对于经粘膜给药，包括胆汁盐和梭链孢酸衍生物。此外，去污剂也可用于增加透过。经粘膜给药可通过鼻喷雾或使用栓剂。见例Sayani(1996)″systemic delivery of peptides and proteins acrossabsorptive mucosae″Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.13：85 184。对局部经皮肤给药，药物被制成油膏、霜剂、软膏、粉末和凝胶。经皮给药***还可包括贴剂。
本发明化合物还可用持续运载或持续释放的方法给药，这些方法可体内运载所述制剂。例如，可持续释放本发明化合物的生物可降解微球体或囊泡或其它生物可降解多聚物结构(见Putney(1998)Nat.Biotechnol.16：153 157)可包括在本发明的制剂中。
对于吸入，可采用任何本领域熟知的***运载本发明化合物，包括干粉气溶胶、液体运载***、空气喷雾器、推进***及类似物。例如，药用制剂可以以气溶胶或气雾的形式给药。对于气溶胶给药，制剂可同表面活性剂和推进剂一起以良好分散的形式供应。在另一实施方案中，运载制剂到呼吸组织的装置是吸入器，制剂在其中汽化。其它液体运载***包括空气喷雾器。
在制备本发明的药物时，可对制剂进行一些改动，以改变药物动力学和生物分布。改变药物动力学和生物分布的一些方法是本领域的普通技术人员熟知的。这些方法的例子包括在某些物质构成的囊泡中保护所述复合物，这些物质包括蛋白、脂(例如脂质体，见下文)、糖或合成多聚物(如上所述)。对药物动力学的一般讨论见Remington′s，Chapters 37-39。
本发明方法使用的化合物和组合物可被单独运载，或作为药用组合物，用任何本领域熟知的其它方法运载，如全身性、区域性或局部性(如直接给予到肿瘤中或定位于肿瘤)方法；通过动脉内、鞘内、(IT)、静脉内(IV)、肠胃外、胸膜腔内、局部、口服或局部给药，如皮下、气管内(如用气溶胶)或经粘膜(如口颊、膀胱、***、子宫、直肠和鼻粘膜)。制备可给药组合物的实际方法对本领域的技术人员是熟知或清楚的，并在科学和专利文献中有详细描述，参见Remington′s。对于“区域性作用”，例如针对特定器官，给药方式之一包括动脉内注射或鞘内(IT)注射，例如针对特定器官如脑和中枢神经***(见Gurun(1997)Anesth Analg.85：317 323)。例如，若希望直接运送本发明中的肽或多肽复合物到脑，颈动脉内注射是首选。如果需要全身高剂量给药，肠胃外给药是首选运载途径。制备可肠胃外给药组合物的实际方法是本领域的普通技术人员熟知或清楚的，并在Remington′s中有详细描述。还可参见Bai(1997)J.Neuroimmunol.80：65 75；Warren(1997)J.Neurol.Sci.152：31 38；Tonegawa(1997)J.Exp.Med.186：507 515。
在一实施方案中，包含本发明化合物的药用制剂可掺入单分子层或双分子层中，如脂质体，见例美国专利No.6,110,490；6,096,716；5,283,185；5,279,833。脂质体制剂可通过任何方式给药，包括静脉注射和经皮(见例Vutla(1996)J.Pharm.Sci.85：5 8)，经粘膜或口服给药。本发明还提供药用制剂，在该制剂中本发明肽和/或复合物掺入胶束和/或脂质体中(见例Suntres(194)J.Pharm.Pharmacol.46：23 28；Woodle(1992)Pharm.Res.9：260 265)。脂质体和脂质体制剂可根据标准方法制备，而且它们是本领域熟知的，见Remington′s；Akimaru(1995)Cytokines Mol.Ther.1：197 210；Alving(1995)Immunol.Rev.145：531；Szoka(1980)Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467，U.S.Pat.Nos.4,235,871、4,501,728和4,837,028。
药学可接受的制剂可含有约1％到99.9％的活性成分(如本发明化合物)。药用组合物可通过传统熟知的灭菌技术灭菌，或过滤除菌。其它药用制剂和运载***是本领域熟知的，并可用于本发明的方法和组合物(见例Remington′s Pharmaceutical Sciences(1990)18th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA；The Merck Index(1996)12th ed.，Merck Publishing Group，Whitehouse，NJ；Pharmaceutical Principles ofSolid Dosage Forms，Technonic Publishing Co.，Inc.，Lancaster，Pa.，(1993)；以及Poznansky et al.，Drug Delivery Systems，R.L Juliano，ed.，Oxford，N.Y.(1980)，pp.253-3 15)。
本发明药用制剂可被包装为单位剂型以方便用药和保持剂量一致。本文使用的“单位剂型”是指给予需治疗患者的实物上不连续的单位剂量；每单位含有定量的化合物，它与药用载体或赋形剂结合起到期望的作用。
本发明进一步提供药盒，该药盒包含本发明化合物或其药用制剂，任选包装在合适的包装材料中。药盒典型包括标签或使用说明书，包括其成分的描述或其中成分在体外、体内或离体的使用说明。药盒可包括所有所述组分，如两种或两种以上本发明化合物或本发明化合物和致核酸损伤物或抗增殖物。
术语“包装材料”是指容纳药盒组分的物理结构。包装材料可保持成分无菌，并可由通常用于此目的材料(如纸、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿等)制成。标签或使用说明书可包括适当书面说明。本发明的药盒因此可还包括标签或使用说明书，用于以本发明的任何方法使用药盒成分。说明可包括实施本文所述的本发明的任何方法的说明，包括治疗、检测、监控或诊断方法。因此，例如药盒可包含处于包装或分散装置中的本发明化合物，加上用本发明的治疗方法给予该化合物的说明。说明可还包括对于满意的临床终点或可能发生的任何不良症状的指示，或管理机构如FDA对用于人类患者要求的其它信息。
说明书可以是“印刷品”，如在纸或薄纸板上，在药盒中或附在药盒上，或贴在药盒或包装材料上的标志，或粘贴在含有药盒成分的小瓶或试管上。说明书还可包括在计算机可读介质中，例如磁盘(软盘或硬盘)、光学CD如CD或DVD-ROM/RAM、磁带、电子储存介质如RAM和ROM、IC接头和它们的杂合体如磁/光储存介质。
本发明药盒还可包括药物配制用的缓冲剂、或防腐剂或稳定剂。药盒的每个成分可被装入单独容器中，所有不同的容器可在一个包装中。本发明药盒可设计为冷冻储存。
治疗方案：药物动力学
本发明药用组合物可根据给药方法以不同单位剂量形式给药。典型的药用组合物剂量是本领域普通技术人员熟知的。这些剂量在自然情况下是典型推荐的，并可根据具体治疗情况、病人耐受度等调整。足够实现所述目的的化合物或本发明化合物的剂量被定义为“治疗有效剂量”。有效用于所述目标的给药方案和剂量即“剂量方案”取决于各种因素，包括疾病或病情的阶段、疾病或病情的严重性、病人通常的健康情况、病人的身体情况、年龄、药用制剂和活性药物的浓度以及其它类似因素。在计算病人的剂量范围时，还需要考虑给药模式。剂量方案还必须考虑药物动力学，即药用组合物的吸收速度、生物利用度、代谢、清除和类似方面。见最新的Remington′s；Egleton(1997)″Bioavailability and transport of peptidesand peptide drugs into the brain″Peptides 18：1431 1439；Langer(1990)Science 249：1527-1533。
在治疗性应用中，给予患有癌症的病人以组合物，其量足以至少部分控制疾病和/或疾病并发症。例如，在一实施方案中，可溶性药用组合物静脉内注射给药的剂量为以约0.01mg/hr到约1.0mg/hr的速度给药数小时(典型为1、3或6小时)，可以间歇性周期循环，重复数周。可采用相当高的剂量(如至多约10mg/ml)，特别是当药物不进入血流而给予到隔离位置，如体腔或器官腔中，如脑脊髓液(CSF)中。
除非另有规定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于实施或试验本发明，本文还是描述了合适的方法和材料。
本文引用的所有出版物、专利和其它参考资料通过引用整体结合到本文中。若有矛盾，以包括定义的本说明书为准。
                          实施例
以下实施例用以说明，但不限制权利要求要求保护的本发明。
实施例1：在具有G1关卡缺陷的细胞(癌细胞)中选择性消除DNA 损伤引起的细胞周期G2关卡。
化学品和试剂。博来霉素、阿霉素和秋水仙碱购自Wako PureChemical Co.(Osaka，Japan)。这些化学品以10mg/ml的浓度溶解于蒸馏水，储存于4℃。顺氯氨铂购自Nihon Kayaku Co.(Tokyo，Japan)，以5mg/ml浓度溶解于蒸馏水，储存于4℃。喜树碱(Campto)购自SigmaChemical Co.(St.Louis，MO)。碘化丙锭(PI)购自Sigma。植物凝集素购自Life Technologies，Inc.(Grand Island，NY)。白介素2(IL-2)购自Hema-gen Diagnostics Inc。
细胞培养。人T细胞白血病源细胞系Jurkat在37℃/5％CO2下培养于RPMI 1640培养基(Sigma)，其中加入了10％小牛血清(IBL：Immuno-Biological Laboratories，GUNMA，Japan)。人结肠癌源细胞系HCT116在37℃/5％CO2下培养于McCoy′s 5A改良培养基(GibcoBRL)，其中加入了10％小牛血清。正常人外周血淋巴细胞用Ficoll-Paque(Pharmacia)分离，在0.1μg/ml PHA和1μg/ml IL-2存在下培养。
细胞周期分析。用本发明化合物和/或博来霉素、阿霉素、秋水仙碱或顺氯氨铂处理后，细胞的细胞周期阶段用流式细胞仪分析，基本同Kawabe(1997)Nature 385：454-458所述。简单的说，两百万细胞重悬并4℃下温育在300μl Krishan′s溶液(0.1％柠檬酸钠，50μg/mlPI，20g/ml RNase A和0.5％NP-40)中1小时，并用流式细胞仪分析，所述流式细胞仪为有CELLQuestTM程序(Beckton Dickinson)的FACScanTM流式细胞仪(Beckton Dickinson，Mountain View，CA)。
CBDC402消除博来霉素引起的Jurkat细胞细胞周期G2累积。
Jurkat细胞(人T细胞白血病源细胞系)用博来霉素(40μg/ml)或博来霉素加各种浓度(0.2，0.39，0.78，1.56，3.125，6.25，12.5，25和50μg/ml)的化合物CBDC402(4-溴-苯甲酸对甲苯酯)处理24小时。处理后的Jurkat细胞DNA用碘化丙锭染色，每个细胞的细胞周期阶段用流式细胞仪分析。如图1所示，博来霉素处理引起细胞累积在细胞周期G2/M期。CBDC402处理以剂量依赖的方式消除了博来霉素引起的G2/M细胞累积。
Jurkat细胞中的M期关卡未被CBDC402处理消除。
Jurkat细胞用秋水仙碱(5μg/ml)和秋水仙碱加不同浓度(0.2，0.39，0.78，1.56，3.125，6.25，12.5，25和50μg/ml)的化合物CBDC402处理24小时。处理后Jurkat细胞DNA用碘化丙锭染色，每个细胞的细胞周期阶段用流式细胞仪分析。如图2所示，秋水仙碱处理引起G2/M期细胞累积，并且CBDC402在任何浓度下都不消除G2/M累积。
不同CBDC化合物消除细胞周期G2关卡。
Jurkat细胞用博来霉素(40μg/ml)和0.2、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25和50μg/ml的不同CBDC化合物处理，培养24小时。测试CBDC化合物004、402、403、404、405、406、407、408、409、410和411。收获细胞，DNA用碘化丙锭染色，并用流式细胞仪测定处于G2/M期细胞的百分比(％ G2/M)。图3表示对于每个浓度的每种CBDC化合物，G2/M细胞的百分比，提供了不同CBDC化合物G2关卡消除作用的剂量-效应曲线。CBDC402表现出最高的活性。所有受试CBDC化合物在最高浓度(50μg/ml)下消除了G2细胞周期关卡。本试验中受试CBDC化合物的结构如图4所示。
其它CBDC化合物按上述方法测试其G2关卡消除活性。如图5所示，化合物被分类为：高活性；中等活性；普通活性；弱活性和无活性。如图6所示，Jurkat细胞中G2关卡消除作用的IC50按上述剂量-效应研究方法测定。
CBDC004消除不同抗癌剂引起的细胞周期G2关卡。
用10μg/ml博来霉素(Bleo)或1μg/ml阿霉素(ADR)或10μg/ml喜树碱(Campto)或2μg/ml顺氯氨铂(CDDP)以及0、2μM、10μM或50μM的CBDC004，处理HCT116结肠癌细胞24小时。DNA用碘化丙锭染色，每个细胞的细胞周期阶段用流式细胞仪分析。如图7所示，每种抗癌剂引起细胞累积在细胞周期G2/M，并且与CBDC004共同温育可减少G2/M细胞数量。这表明CBDC004消除博来霉素、阿霉素、喜树碱或顺氯氨铂活化的G2关卡。
实施例2：使癌细胞对DNA损伤性治疗敏感。
联合治疗的细胞毒活性通过分析HCT116细胞G1期细胞数测定，所述细胞经博来霉素、阿霉素、喜树碱或顺氯氨铂处理，同时没有或有2μM、10μM或50μM的CBDC004。用Krishan′s溶液染色HCT116，并用流式细胞仪分析测定G1期细胞数。死细胞基于其DNA含量鉴别，计算G1期细胞数(％G1)细胞的百分比。如图8所示，博来霉素、阿霉素、喜树碱或顺氯氨铂对HCT116细胞有细胞毒性，CBDC004以剂量依赖的方式增加这些抗癌剂的细胞毒性活性。
实施例3：CBDC402抑制SCID小鼠异种移植肿瘤生长。
HCT-116人结肠癌细胞移植到重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠皮下。当原发肿瘤尺寸达到0.1cm3时(7或8mm，确定为Day1)开始治疗。
抗癌剂CPT-11(CAMPTOSAR，伊立替康，一种拓扑酶抑制剂)和CBDC402通过腹膜注射给药，其治疗方案如下：20mg/kg的CPT-11每周一次；20mg/kg的CBDC402每周两次；40mg/kg的CBDC402每周两次；20mg/kg的CBDC402每周两次加上20mg/kg的CPT-11每周一次；40mg/kg的CBDC402每周两次加上20mg/kg的CPT-11每周一次。给予DMSO作为对照治疗。肿瘤尺寸采用测径器测量，每周三次，体积计算使用公式；重量(mg)＝[宽度(mm)2×长度(mm)]/2。每治疗组(n＝4)肿瘤的平均尺寸对治疗天数作图。如图9所示，DMSO治疗对照小鼠的肿瘤持续生长，CBDC402单独(两个浓度)使肿瘤生长轻度下降，单独CPT-11降低肿瘤生长，CBDC402加上CPT-11合用显著降低或抑制肿瘤生长。
实施例4：人胃癌源细胞系MK-45的集落形成分析。
人胃癌源细胞系MK-45细胞接种在6孔板中，1000细胞/孔。培养过夜后，细胞用10μM不同CBDC化合物、10μg/ml的CPT-11或CBDC化合物和CPT-11合用处理3小时。受试CBDC化合物是：CBDC402、CBDC412、CBDC413和CBDC418。更换培养基并培养细胞14天，之后集落用甲醇固定并用0.1％结晶紫染色。单独用10μM的CBDC402处理3小时明显抑制MK-45细胞集落形成，而10μM的CBDC412导致集落形成轻度抑制，10μM的CBDC413或CBDC418对集落形成没有可观察到的效果。用10μg/ml的CPT-11处理导致集落形成明显抑制，而加入10μM的CBDC402表现为增强10μg/ml的CPT-11的效果，使得集落形成几乎完全抑制。10μg/ml的CPT-11和10μM的CBDC412合用导致集落形成轻度抑制，超过单独使用CPT-11，而10μg/ml的CPT-11和10μM的CBDC413、CBDC418合用。
实施例5：CBDC402特异性消除细胞周期G2关卡
活化正常T细胞和白血病T细胞(Jurkat cells)用引起细胞在G2或M期累积的药物处理，测定CBDC402对细胞通过细胞周期关卡的效果。处理后收获细胞，染色DNA，每个细胞的细胞周期阶段按上述用流式细胞仪分析。在一个实验中，活化正常T细胞没有接受处理(对照)，或用博来霉素、CBDC402或博来霉素和CBDC402合用处理。如图10a所示，博来霉素处理导致G2期细胞少量累积，并且CBDC402消除博来霉素引起的活化正常T细胞G2期增加。在另一个实验中，白血病T细胞(Jurkat细胞)没有接受处理(对照)，或用博来霉素、CBDC402或博来霉素和CBDC402合用处理。如图10b所示，博来霉素导致G2期细胞大量累积，并且CBDC402消除博来霉素引起的白血病T细胞(Jurkat细胞)G2期增加。在另一个实验中，活化正常T细胞没有接受处理(对照)，或用秋水仙碱或秋水仙碱和CBDC420合用处理。如图10c所示，秋水仙碱导致M期细胞累积，并且CBDC402不影响秋水仙碱引起的活化正常T细胞M期增加。这些结果表明CBDC402特异性拮抗G2(而非M期关卡)累积，并表明CBDC402拮抗癌细胞的特异性。
实施例6：4-溴-苯甲酸4-氟-苯基酯的合成。
10ml二氧六环、5mmol(1.1g)4-溴-苯甲酰氯和5mmol(0.56g)4-氟-苯酚依次加入到50ml四口烧瓶中，在室温下溶解。将溶于二氧六环的三乙胺缓慢滴加到所述溶液中，并在室温下搅拌三小时。过滤沉淀的晶体并用苯抽提。抽提溶液用碳酸氢钠洗涤几次，加入无水镁，将所得溶液干燥并过滤。该溶液在低压下蒸馏并结晶。粗晶为黄白色，重1.37g。一部分结晶(0.5g)溶于苯并用100g硅胶(Wako gel C-300，日本)纯化。纯化产物为白色，纯度用液相色谱(LC)确定为99.93％。其结构用NMR确定如下。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.05(2H，d，J＝8.8Hz)，7.83(2H，d，J＝8.8Hz)，7.38-7.29(4H，M)13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ159.72(C-F，d，J＝240Hz)163.95(C＝O)。

Claims (50)

1.一种当给予细胞时可消除细胞周期G2关卡的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
Figure A038184760002C1
其中1个或2个苯环可被吡嗪、嘧啶、哌嗪、吗啉、环己烷、哌啶或吡啶取代；R1为卤素、溴(Br)、氯(Cl)、氟(F)、碘(I)、氨基(NH2)、硝基(NO2)、羟基(OH)、甲氧基(OCH3)、甲基(CH3)或氢(H)；R2、R3、R4、R5和R6为溴(Br)、氯(Cl)、氟(F)、碘(I)、氨基(NH2)、硝基(NO2)、甲基(CH3)、甲氧基(OCH3)、羟基(OH)、CH(CH3)2、CHO、CHOCH3、O(CH2)nCH3、OCO(C6H12)Cl、COOCH3或氢；X1为氮(NH)、氧(O)或硫(S)；X2为氧(O)或硫(S)。
2.权利要求1的化合物，其中所述化合物当给予细胞时，消除DNA损伤引起的G2关卡。
3.权利要求的化合物2，其中所述化合物当给予含有正常细胞和DNA损伤细胞的细胞时，抑制或杀死DNA损伤细胞。
4.权利要求2的化合物，其中所述化合物当给予细胞时，使细胞对DNA损伤剂或治疗敏感。
5.权利要求1的化合物，所述化合物含有至少一种选自以下的化合物：4-氯-苯甲酸4-甲氧基-苯基酯(CDBC004)；4-氯-苯甲酸对甲苯酯(CBDC401)；4-溴-苯甲酸对甲苯酯(CBDC402)；3，4，5-三氟-苯甲酸对甲苯酯(CBDC403)；4-氟-苯甲酸4-溴-苯基酯(CBDC404)；3，4-二氯-苯甲酸对甲苯酯(CBDC405)；2，4-二氯-苯甲酸对甲苯酯(CBDC406)；4-氟-苯甲酸对甲苯酯(CBDC407)；2，3，4，5，6-五氟-苯甲酸对甲苯酯(CBDC408)；4-氯-苯甲酸3，4-二甲基-苯基酯(CBDC409)；4-氯-苯甲酸4-羟基-苯基酯(CBDC410)；4-氟-苯甲酸4-羟基-苯基酯(CBDC411)；4-溴-苯甲酸4-氟-苯基酯(CBDC412)；4-溴-苯甲酸4-三氟甲基-苯基酯(CBDC413)；4-溴-苯甲酸4-羟基-苯基酯(CBDC414)；4-溴-苯甲酸4-三氟甲氧基-苯基酯(CBDC415)；4-溴-苯甲酸6-甲基-吡啶-3-基酯(CBDC418)；4-溴-硫代苯甲酸O-对甲苯酯(CBDC440)；4-溴-二硫代苯甲酸对甲苯酯(CBDC441)；4-溴-硫代苯甲酸S-对甲苯酯(CBDC442)。
6.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的4-氯-苯甲酸4-甲氧基-苯基酯(CBDC004)：
Figure A038184760003C1
7.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的4-氯-苯甲酸对甲苯酯(CBDC401)：
Figure A038184760003C2
8.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的4-溴-苯甲酸对甲苯酯(CBDC402)：
Figure A038184760003C3
9.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的3，4，5-三氟-苯甲酸对甲苯酯(CBDC402)：
Figure A038184760003C4
10.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的4-氟-苯甲酸4-溴-苯基酯(CBDC404)：
Figure A038184760004C1
11.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的3，4-二氯-苯甲酸对甲苯酯(CBDC405)：
12.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的2，4-二氯-苯甲酸对甲苯酯(CBDC406)：
Figure A038184760004C3
13.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的4-氟-苯甲酸对甲苯酯(CBDC407)：
Figure A038184760004C4
14.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的2，3，4，5，6-五氟-苯甲酸对甲苯酯(CBDC408)：
15.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的4-氯-苯甲酸3，4-二甲基-苯基酯(CBDC409)：
16.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的4-氯-苯甲酸4-羟基-苯基酯(CBDC410)：
17.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的4-氟-苯甲酸4-羟基-苯基酯(CBDC411)：
18.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的4-溴-苯甲酸4-氟-苯基酯(CBDC412)：
19.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的4-溴-苯甲酸4-三氟甲基-苯基酯(CBDC413)：
20.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的4-溴-苯甲酸4-羟基-苯基酯(CBDC414)：
21.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的4-溴-苯甲酸4-三氟甲氧基-苯基酯(CBDC415)：
22.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的4-溴-苯甲酸6-甲基-吡啶-3-基酯(CBDC418)：
23.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的4-溴-硫代苯甲酸O-对甲苯酯(CBDC440)：
Figure A038184760006C4
24.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的4-溴-二硫代苯甲酸对甲苯酯(CBDC441)：
25.权利要求1的化合物，所述化合物包括具有以下结构的4-溴-硫代苯甲酸S-对甲苯酯(CBDC442)：
Figure A038184760007C2
26.一种药用组合物，所述组合物包含药学可接受的载体和权利要求1的化合物。
27.一种药用组合物，所述组合物包含药学可接受的载体和权利要求2的化合物。
28.一种消除细胞G2关卡的方法，所述方法包括给予细胞至少一种权利要求1的化合物，其给药剂量有效抑制G2关卡。
29.一种杀死或抑制增殖失调性细胞的方法，所述方法包含对至少一种具有增殖失调的细胞给予权利要求1的化合物，其给药剂量有效抑制G2关卡。
30.一种治疗以增殖或分化失调为特征的疾病的方法，所述方法包括给予至少一种权利要求1的化合物，其给药剂量有效治疗所述失调。
31.一种选择性抑制或杀死DNA损伤细胞的方法，所述方法包含对包括正常细胞和DNA损伤细胞的细胞给予权利要求2的化合物，其给药剂量有效抑制DNA损伤引起的G2关卡。
32.权利要求31的方法，其中所述DNA损伤细胞为癌细胞。
33.权利要求31的方法，其中所述DNA损伤细胞为异种移植肿瘤细胞。
34.权利要求31的方法，其中给予权利要求2的化合物使DNA损伤细胞对DNA损伤剂或治疗敏感。
35.权利要求34的方法，其中所述DNA损伤细胞为癌细胞，并且其中给予权利要求2的化合物使癌细胞对DNA损伤剂或治疗敏感。
36.一种筛选可消除DNA损伤引起的G2关卡的非肽化合物的方法，所述方法包括：
(a)提供一种受试化合物；
(b)提供一种细胞；
(c)给予所述细胞DNA损伤剂，导致G2/M期细胞累积；
(d)将受试化合物给予第一个处理部分的DNA损伤剂处理细胞；
(e)测定受试化合物处理后的第一个处理部分的G2/M期细胞数量，其中测定细胞中G2/M期细胞的数量得到处于G2细胞周期停止的细胞数量；
(f)测定第二个未处理部分的DNA损伤剂处理细胞中G2/M期细胞数量，其中测定细胞中G2/M期细胞的数量得到处于G2细胞周期停止的细胞数量；
(g)比较(e)项与(f)项测得的细胞数量，其中(e)步骤中G2/M期细胞数量较低表明，受试化合物消除了第一个处理部分DNA损伤引起的G2细胞周期关卡。
37.权利要求40的方法，其中所述化合物是权利要求1的化合物。
38.权利要求42的方法，其中所述化合物是权利要求2的化合物。
39.一种当给予细胞时消除细胞周期G2关卡的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
Figure A038184760009C1
其中1个或2个苯环可被吡嗪、嘧啶、哌嗪、吗啉、环己烷、哌啶或吡啶取代；R1为卤素、溴(Br)、氯(Cl)、氟(F)、碘(I)、氨基(NH2)、硝基(NO2)、羟基(OH)、甲氧基(OCH3)、甲基(CH3)或氢(H)；R2为溴(Br)、氯(Cl)、氟(F)、碘(I)、氨基(NH2)、硝基(NO2)、甲基(CH3)、甲氧基(OCH3)、羟基(OH)、CH(CH3)2、CHO、CHOCH3、O(CH2)nCH3、OCO(C6H12)Cl、COOCH3或氢；X1为氮(NH)、氧(O)或硫(S)；X2为氧(O)或硫(S)。
40.权利要求39的化合物，其中所述化合物当给予细胞时消除DNA损伤引起的G2关卡。
41.权利要求40的化合物，其中所述化合物当给予含有正常细胞和DNA损伤细胞的细胞时，抑制或杀死DNA损伤细胞。
42.权利要求40的化合物，其中所述化合物当给予细胞时使细胞对DNA损伤剂或治疗敏感。
43.一种消除细胞G2关卡的方法，所述方法包括给予细胞至少一种权利要求39的化合物，其给药剂量有效抑制G2关卡。
44.一种杀死或抑制增殖失调性细胞的方法，所述方法包括对至少一种具有增殖失调的细胞给予权利要求39的化合物，其给药剂量有效抑制G2关卡。
45.一种治疗以增殖或分化失调为特征的疾病的方法，所述方法包括给予至少一种权利要求39的化合物，其给药剂量有效治疗所述失调。
46.一种选择性抑制或杀死DNA损伤细胞方法，所述方法包括对包含正常细胞和DNA损伤细胞的细胞给予权利要求40的化合物，其给药剂量有效抑制DNA损伤引起的G2关卡。
47.权利要求46的方法，其中所述DNA损伤细胞为癌细胞。
48.权利要求46的方法，其中所述DNA损伤细胞是异种移植肿瘤细胞。
49.权利要求46的方法，其中给予权利要求40的化合物使DNA损伤细胞对DNA损伤剂或治疗敏感。
50.权利要求49的方法，其中所述DNA损伤细胞为癌细胞，并且其中给予权利要求40的化合物使癌细胞对DNA损伤剂或治疗敏感。
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