CN1665458A - 可注射软骨细胞植入物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有载体材料例如各种形式的胶原或藻酸盐珠或线的可流动可植入组合物，其能支持软骨细胞与其附着并生长，涉及含有载体材料和其上保留的软骨细胞的可流动可植入组合物的制备方法。此外，本发明涉及通过移植包括载体材料和其上保留的软骨细胞的可流动可植入组合物而有效治疗关节表面软骨的方法。

Description

可注射软骨细胞植入物
发明领域
本发明涉及软骨细胞细胞植入，软骨移植，治疗术，关节修补和预防关节炎病变领域。特别地，本发明涉及一种植入物新的形式，并且涉及软骨细胞细胞植入和软骨再生的新的方法。
发明背景
在美国每年实施500,000例以上的关节成形手术和全部关节替代。在欧洲大约实施相同数目的相似手术。这些数目里包括每年大约90,000例全部膝盖替代和50,000例左右修补膝盖缺损的手术(见：Praemer A.，Furner S.，Rice，D.P.，Musculoskeletalconditions in the United States，Park Ridge，Ill.：AmericanAcademy of Orthopaedic Surgeons，1992，125)。软骨再生治疗方法是最有用的，可以在关节损伤的早期阶段实施，这样减少需要人工关节替代手术的患者数目。利用这样的预防性治疗方法，还降低了发生骨关节炎的患者数目。
用来重修受损伤关节中软骨结构表面的技术主要试图利用软骨下钻，磨和其他方法修补软骨，从而切除病灶软骨和软骨下骨，暴露出有血管的骨松质(Insall，J.，Clin.Orthop.1974，101，61；FicatR.P.等，Clin Orthop.1979，144，74；Johnson L.L.，于：(McGintyJ，B.，编著)Operative Arthroscopy，NewYork：Raven Press，1991，341)。
Coon和Cahn(1966，Science 153：1116)描述了培养来自鸡胚体节的软骨合成细胞的技术。后来Cahn和Lasher(1967，PNAS USA 58：1131)利用用于分析涉及DNA合成的***作为软骨分化的必备条件。响应EGF和FGF软骨细胞出现生长(Gospodarowicz和Mescher，1977，J.Cell Physiology 93：117)，但是最后丧失了它们的分化功能(Benya等，1978，Cell 15：1313)。有人描述过培养软骨细胞的方法，并且主要应用根据(Brittberg M.等，New Engl.J.Med.1994，331，889)所述进行较小的调整的方法。使用应用这些方法培养的细胞作为植入到患者膝关节中的自体植入物。
属于马里兰州Chondros，Inc.of Baltimore的国际申请号PCT/US00/06541，描述了在微载体上生长的细胞。然后通过酶促消化从微载体分离细胞。这篇参考文献还描述了能用作要用于植入的细胞的支架结构的各种聚合物。国际申请号PCT/US00/06541的全部内容在这里引作参考。
另外，Kolettas等验证了软骨特异性分子例如胶原和蛋白聚糖在延长的细胞培养下的表达。它们发现，与琼脂糖凝胶、藻酸盐珠上的悬浮培养或旋动培养(保持圆形细胞形态)相比，虽然在单层培养中形态学发生变化(Aulthouse，A.等，In Vitro Cell Dev.Biol，1989，25，659；Archer，C.等，J.Cell Sci.1990，m97，361；Haanselmann，H.等，J.Cell Sci.1994，107，17；Bonaventure，J.等，Exp.Cell Res.1994，212，97)，但是，表达的标记例如II和IX型胶原和大的聚集的蛋白聚糖，聚集蛋白聚糖，多功能蛋白聚糖和连接蛋白没有改变。(Kolettas，E.等，Science 1995，108，1991)。
关节软骨细胞是仅在软骨中发现的特化的由间充质衍生的细胞。软骨细胞是无血管组织，其物理性能取决于软骨细胞产生的胞外基质。在软骨内骨化过程中，软骨细胞经历熟化导致细胞过度生长，特征在于发生X型胶原的表达(Upholt，W.B.和Olsen，R.R.，于：Cartilage Molecular Aspects(Hall，B.& Newman，S，编著)CRCBoca Raton 1991，43；Reichenberger，E.等，Dev.Biol.1991，148，562；Kirsch，T.等，Differentiation，1992，52，89；Stephens，M.等，J.Cell Sci.1993，103，1111)。
发明概述
本发明提供一种可植入组合物，其含有载体材料，优选为固体或半固体材料，包括微颗粒珠，线，干胶片，线团，或者珠，线，干胶片，和/或线团的组合(下文称作″微颗粒载体材料″)。在一个实施方案中，微颗粒载体材料是各种大小和形状的。在一个实施方案中，微颗粒载体材料支撑软骨细胞或其他类型的细胞的附着和生长，在一些具有保持在微颗粒载体材料表面上的软骨细胞的实施方案中，该微颗粒载体材料在注射给植入位点之前和/或之后是可流动的。
在本发明的实施方案中，软骨细胞生长或粘着(下文概括称作″粘着″)在微颗粒载体材料表面以及之中，因为微颗粒载体材料表面有一个或多个多孔开口。使用中，本发明的可植入组合物任选地进一步包括一种或多种粘合剂和/或赋形剂，例如凝胶，胶原，血纤蛋白胶，自体的，半自体的和非自体的胶以及胶原凝胶，皮肤胶，手术胶，和藻酸盐。
然后对受者施用根据本发明的可植入组合物(一般通过注射)，作为下面的一种或多种：1)粘合剂和/或赋形剂和可植入组合物的混合物，2)一层可植入组合物，任选地包括粘合剂或赋形剂，接着一层一种或多种粘合剂，3)一层一种或多种粘合剂，接着一层可植入组合物，任选地包括粘合剂或赋形剂，或者4)一层没有粘合剂或赋形剂的可植入组合物。
本发明还包括含有微颗粒载体材料和软骨细胞或者能形成软骨或能分化成能形成保留在其上的软骨的细胞的其他细胞的可植入组合物的制备方法。在本发明中能使用其他细胞，例如间充质细胞，血细胞和脂肪细胞。在其他实施方案中，本发明包括与粘合剂或赋形剂组合的上述可植入组合物的制备方法。此外，本发明提供通过植入或移植包括任选地与粘合剂或赋形剂组合的微颗粒载体材料和其上和/或其中保持的软骨细胞的组合物提供对关节表面软骨有效治疗的方法(例如，增强患者受损伤关节表面的使用)。
如这里使用的，″大约″意思是指定值的正负大约10％，例如″大约20微米″指大约18至22微米。通过本领域技术人员公知的常规方法能测定颗粒的大小。
附图简述
图1是细胞附着在其表面并且在其表面上生长的本发明的线的一部分的侧视图。
图2是细胞附着在其表面并且在其表面上生长的本发明的珠，微球体，或微珠的侧视图。
图3是从试验的载体材料收获的细胞的平均数的图形表示。
图4是从试验的载体材料收获的细胞的平均成活力的图形表示。
图5是本发明充满型微颗粒珠形成的异型胶原凝胶示意图。
图6是本发明的线形成的海绵样材料示意图。
图7是三维体积中填入的干燥的不溶性纤维胶原海绵样材料示意图。
图8是同型胶原凝胶及胶原凝胶形成方法示意图。
图9是用胶原膜包被的胶原海绵样材料的示意图。
图10是用来制备本发明的线团的仪器的示意图。
图11是用来制备本发明的线团的方法的示意图。
图12是用来制备本发明的线团的方法以及本发明的线团的示意图。
图13是用来制备本发明的珠的仪器的示意图。
图14是用来制备本发明的珠的方法的示意图。
图15是用来制备本发明的珠的方法的示意图。
图16是用来制备本发明的干胶片的仪器的示意图。
图17是用来制备本发明的干胶片的方法的示意图。
图18是用来制备本发明的干胶片的方法的示意图。
图19是各自从本发明的胶原线形成的线团和干胶片的显微镜视图。
图20是本发明的胶原珠的显微镜视图。
图21是软骨细胞的显微镜视图。
图22是软骨细胞的显微镜视图。
图23是软骨细胞的显微镜视图。
发明详述
本发明包括一种可植入组合物，其含有能支持软骨细胞在微颗粒载体材料表面之上或之中附着和/或生长的微颗粒载体材料。本发明进一步包括含有软骨细胞在其上或之中附着和/或生长的微颗粒载体材料的可植入组合物的制备方法。此外，本发明包括通过移植或植入包括微颗粒载体材料和在其上和/或其中附着和/或生长的软骨细胞的组合物有效治疗受损关节表面软骨的方法。通过植入或移植组合物而有效治疗关节表面软骨的方法包括，任选地通过注射，特别是关节内注射或者另一种最小侵入性放置，在要治疗区域表面或内部放置组合物，使得软骨细胞在该区域的表面或内部生长，从而修复软骨组织。在一个实施方案中，发现该方法特别用于骨表面之间有小量间隙的关节中关节表面软骨的治疗，例如，但不限于，肩部和髋部球窝关节，和其他关节例如手和脚的指关节和脸部关节例如颌。
另外，在本发明的组合物和方法的一些实施方案中，本发明任选地包括一种或多种生物相容粘合剂以及一种或多种赋形剂的应用。如这里使用和下文更详细描述的，赋形剂是一种能影响可植入组合物的流动性的生物相容材料。使用粘合剂将本发明的组合物保留在要治疗的预期表面上或预期区域中。在一个实施方案中，选择粘合剂，使得它起着止血屏障的功能并且任选地还以和赋形剂类似的方式在植入之前和之后影响可植入组合物的流动性。
下面更详细地讨论本发明的各种成分。只是为了描述的目的，使用这里描述的胶原作为用作线，珠，线团和/或干胶片的例示的可生物降解材料，但是还可以使用适合在本发明中使用的其他可生物降解材料。
可植入组合物
本发明的可植入组合物包括微颗粒载体材料(也称作“载体材料”或“多孔胶原生物材料”)和细胞，所述细胞与载体材料附着，或者，如果载体材料的表面是多孔的，则附着在其中。
通过将胶原的氧化溶液注射到交联浴中能制备微颗粒载体材料(如下面参照附图10-18描述的)。在一个这样的实施方案中，通过利用胃蛋白酶提取技术制备氧化胶原，形成胶原纤维，在-20℃下保持。周期性地，使纤维进行酸氧化作用，氧化糖和羟赖氨酸官能团，这生成醛基。然后在NaCl溶液中沉淀胶原，之后用另外的NaCl洗涤。沉淀和洗涤之后，用丙酮再次洗涤沉淀，形成氧化胶原粉末，其之后能在酸中溶解，得到适合注射到交联浴中的氧化胶原溶液，其中1)胺基和2)氧化糖和羟赖氨酸基团之间能发生反应，从而形成聚亚胺交联网状结构。在一个实施方案中，针16，有90度末端和0.5毫米直径，能用来将0.5-1.5％胶原溶液注射到交联浴中，如下面参照附图10-12更详细描述的。
为了形成多孔胶原生物材料，一般地，胶原α-链与原纤维通过交联技术共价连接。最初，用高碘酸氧化胶原，通过羟赖氨酸和糖残基的氧化作用在α-链内产生醛基。在一个实施方案中，以Tardy等，美国专利No.4,931,546描述的方法，使胶原交联，该篇专利文献全文引作参考。如下文描述的，通过将胶原凝胶通过毛细管注射，能形成珠，线，线团，和干胶片。在中性pH下，通过醛基(R-CHO)和氨基(R′-NH2)发生反应，接着产生聚亚胺R-CH＝N-R′交联而发生交联，如美国专利No.4,931,546所述。在一个这样的实施方案中，使用戊二醛，线可能交联或者可能不交联。在另一个实施方案中，用另外量的胶原包被胶原结构的一部分，在结构表面的一部分之上形成膜。膜作为防止细胞迁移的屏障发挥功能。
胶原珠22，线12，线团12，和干胶片37的形成涉及将胶原注射到交联浴中的不同的方法，下面参照附图10-18更详细地描述每一种方法。在一个实施方案中，注射到浴中之后，中和胶原载体材料的酸度并且进行甘油温育。在一个实施方案中，然后在空气流下将载体材料干燥并且通过辐射灭菌，例如γ灭菌，得到适合细胞培养的载体材料。
如这里使用的，载体材料形式是线12，线团12或珠22，或干胶片37，和/或其混合物。
A.线
在一个实施方案中，微颗粒载体材料包括一种或多种线。图1给出一种线的一部分。在图1所示的实施方案中，线12有与线12的表面粘着的细胞11。在另一个实施方案中，线12可以由任何可生物降解的材料制成，例如胶原，更具体地I型，II型或III型胶原，或者它们的组合或者下面描述的一种或多种微颗粒载体材料。载体材料还能彼此交联。一般地，线12的大小适合哺乳动物细胞在其上或其中附着和/或生长(取决于线12的孔隙率和细胞11的大小)。线12直径一般是大约20至400微米。在线12的一些实施方案中，孔具有足够的允许细胞例如软骨细胞迁移到线12内部的直径。然后能使用线12形成海棉样材料，如图6和7所示并且下文将更详细地描述，或者线12能形成，压制或轧制成线团12(参考是线团12A，如图12所示)，在一些实施方案中，线12具有大约30cm2的总表面积。线12还能形成干胶片，如图19所示，下文也将更详细地描述。
在一个实施方案中，通过将可生物降解材料例如胶原凝胶通过毛细管注射到凝固浴中能制备线12。发生交联之后线变得不溶。如图10，11和12所示，一般地，通过具有90度末端和0.5mm直径的针，能将氧化胶原13，优选1％氧化胶原的溶液，注射到交联缓冲液14浴中。在一个实施方案中，在连续或半连续束或线12中注射胶原。胶原接触交联缓冲液时，胶原开始固化。从自身交联或者自身能交联在一起的分开交联的胶原线或线片段的单一胶原线能形成线团12(图12中如12A所示)。
图19表示的显微镜视图说明交联的胶原线形式的线团12的例子。
或者，在其中线用作载体材料的一个实施方案中，线12能被模压，轧制或压制成其他团样形状或者形成海棉样材料，如下文所述。
B.珠
在另一个实施方案中，微颗粒载体材料包括一种或多种珠22，如图2所示。在图2所示的实施方案中，珠22有与珠22的表面附着的和/或在其中生长的细胞11(取决于珠22的孔隙率和细胞11的大小)。珠22可以由任何可生物降解的材料制成，包括I型，II型或III型胶原，或者它们的组合或者下面描述的一种或多种微颗粒载体材料。一般地，珠22的直径是适合哺乳动物细胞在其上附着和/或生长的大小，通常直径是20至400微米。图20表示的显微镜视图给出交联胶原形成的珠22的例子。在另一个实施方案中，如果珠22具有足够的孔隙率，则细胞11能附着珠22和/或在珠22中生长。在珠22的多孔实施方案中，孔具有足以允许细胞例如软骨细胞迁移到珠22内部中的直径。
在一个实施方案中，根据IMEDEX的欧洲专利公开351296 A1描写的方法能制备珠22，该专利文献全文引作参考。根据IMEDEX EP专利文献的公开，从胶原溶液中形成和回收来自猪或牛来源真皮的I型胶原小滴。如图13，14，和15所示，用针16能将一般大约0.8％胶原的氧化胶原的溶液25注射到交联缓冲液14中形成珠22。在一个实施方案中，使用压缩空气31驱动胶原溶液进入针16。将胶原注射到交联缓冲液中时，振动器29轻轻振动注射装置，使得胶原以逐滴方式从针滴落，形成珠滴22。因为珠滴22独立接触交联缓冲液，珠滴22表面交联，固化并且在交联缓冲液中收集为固体珠22，如图14和15所示。通过搅拌，且在一个实施方案中，通过磁搅拌棒27，能保持珠分开。然后胶原滴作为固化胶原珠22从溶液中分开。在这个实施方案中，珠大小是直径大约20微米至大约2毫米范围。图20给出本发明的胶原珠的例示的显微镜视图。
C.干胶片
如图16，17和18进一步所示，通过用针16将将一定体积的氧化胶原溶液13注射到交联缓冲液14中也能形成片37，所述交联缓冲液14任选地含有胶原线12在其上交联并沉降的聚合物网状物35。在根据该方法的一个实施方案中，能手工制备线12的连续或半连续单丝，并且在脱水之前压缩到任何合适大小的三维体积中，从而形成干胶片37的另一个实施方案。图19代表的显微镜视图给出交联胶原线形成的干胶片37的例子。
一旦形成，干胶片37(或者这里描述的其他微颗粒载体材料)能整合入另外的胶原膜(交联或没有交联的胶原膜)。在一个实施方案中，通过将干胶片37放置到在固体载体例如培养皿中含有的胶原膜上，可将干胶片37整合入胶原膜。如图9所示，在一个实施方案中，线12(线12干燥并且随机压缩在一个体积中之后，如图7所示)整合入膜95，并且形成防止细胞迁移的细胞屏障。
在一些实施方案中，干胶片37有着适合细胞培养的最大大约50cm2的表面积。
D.微颗粒载体材料的其他形式
在一个实施方案中，以图8描述的方式能制备同质胶原凝胶85，即通过在容器例如描述的容器86中温育期望的载体材料(例如胶原)的溶液83。然而，在另一个实施方案中，从珠22或线12能制备海棉样凝胶结构。具体地说，珠22和/或线12能装在一起形成凝胶结构，包括珠22和/或线12和凝胶54，例如如图5，6，7和8所示。
颗粒之间的间隙体积定义为凝胶结构的孔隙率，其范围一般是组装的珠22和/或线12的总体积的30％至50％。在一个实施方案中，凝胶54是胶原。
在图5中，微颗粒载体材料包括本发明的珠22，(尽管微颗粒载体材料还能包括线12和/或干胶片37)，其装在容器52中。在一个实施方案中，珠22然后分散在胶原凝胶54中。
在图6描述的实施方案中，微颗粒载体包括线12的单丝，其在线12交联之前或之后装在容器62中，以及，干燥之后，形成干燥的不溶性单丝。在一个实施方案中，本发明的线12在交联之前或期间能装入容器中，使得线12变得随机装入并且在容器72中相互连接，如图7所示。
在另一个实施方案中，从一种或多种其他可再吸收材料能制备微颗粒载体材料(线12或珠22)。从下面的材料能制备这样的微颗粒载体材料：藻酸盐，淀粉，透明质酸(hyaluronan)，葡聚糖(参见VanWezel，A.L.1967，Nature 216：64：65)；纤维素(参见Reuveny，S.，等，1982，Dev.Biol.Stand.50：115-123)；胶原(参见R.C.Dean等，1985，Large Scale Mammalian Cell Culture Technology.编者B.K.Lydersen，Hansen Publishers，New York，N.Y.，pp.145-167)；或明胶(参见Cultisphere，Technical Bulletin，Percell Biolytica AB)，只要符合合适的大小标准。其他相关的标准包括载体材料的孔隙率，载体材料的降解时间，以及载体材料是否交联。在一个实施方案中，本发明的微颗粒载体材料包括与一种或多种其他可再吸收材料混合的胶原。此外，根据本发明，微颗粒载体材料可以是没有交联的或者使用本领域技术人员显而易见的一种或多种交联剂交联的。合适的交联剂包括戊二醛和类似产物。优选地，微颗粒载体材料包括支持软骨细胞附着微颗粒载体材料和/或在其上或其中生长的可生物降解材料，其随着时间在接受移植入物的患者体内被吸收。
本发明还包括将软骨细胞加给如上所述的微颗粒载体材料的可植入组合物的制备方法。在这样的实施方案中，根据本发明制备珠，线或者珠和线的混合物。粘着性细胞有着与微颗粒载体材料的表面附着的天然倾向。然而，在另一个实施方案中，该方法进一步包括将粘合剂，例如下文描述的一种或多种粘合剂，和软骨细胞和微颗粒载体材料混合。在其中使用粘合剂的实施方案中，(1)细胞与有在细胞之前施用给载体材料的一层粘合剂的载体材料粘连，(2)向不用粘合剂就与载体材料粘连的细胞施用一层或多层粘合剂，或者(3)粘合剂和细胞的混合物与载体材料粘着。本发明还可以使用自体的，和/或同种异体的软骨细胞和/或异种软骨细胞。
在一个实施方案中，通过本领域技术人员显而易见的方法能将微颗粒载体材料灭菌，一般通过β或γ辐射以及环氧乙烷扩散。
如这里使用的，本发明的可植入组合物包括附着细胞的微颗粒载体材料。可植入组合物任选地还包括合适的赋形剂和粘合剂，如这里描述的。
赋形剂
在一些实施方案中发现，通过力，例如重力和范德瓦耳斯力，能使有与其附着的细胞的微颗粒载体材料分开的颗粒变得结合，从而在含有微颗粒载体材料和细胞(即可植入组合物)的容器底部形成沉积物。这种沉积物具有一定范围的粘度，并且可以是可流动的或不可流动的，这取决于很多种因素。如这里使用的，可流动意思是移动或不破坏连续性的流畅运动，如以流体的特征方式。然而，在一些实施方案中，本发明能缓慢流动，例如当使用粘稠凝胶作为赋形剂时，如下文所述，并且范围因此是自由流动至***。影响本发明流动性的因素包括1)微颗粒载体材料和细胞在密封容器中保留的时间，2)微颗粒载体材料各个颗粒的大小和形状和3)在微颗粒载体材料和任何周围材料上生长的细胞的量。
因此，经常期望调节上文描述的组合物的流动性以有利于施用，例如通过注射对患者施用本发明的组合物。为了调节组合物的流动性，能直接混合赋形剂和可植入组合物。影响赋形剂的流动性从而影响可植入组合物的流动性的因素是本领域技术人员公知的，包括但不限于密度和粘度。影响可流动性的其他因素包括本发明中使用的粘合剂和其他赋形剂或添加剂的化学物理性质。在一些实施方案中，因为在缺陷中用胶将微颗粒载体材料固定，所以粘度还取决于测定的时间点，因此范围跨越液体至固定化的。
合适的赋形剂包括任何生物相容(例如，有可以植入的软骨细胞和任何组织)液体，悬浮液，凝胶或凝胶样材料或微颗粒固体或半固体材料，特征在于对要治疗的表面植入之前或之后，软骨细胞保留在表面之上或之中的能力，保留一定时间使得软骨细胞能在其中或其上附着和/或生长和/或增殖，并且提供与软骨细胞的自然环境类似的***以优化细胞生长以及细胞分化(如果对使用的细胞的特定类型应用)。优选地，微颗粒载体材料包括可生物降解材料，其支持软骨细胞附着和生长，随着时间在接受植入物的患者体内被吸收。
粘合剂
在一个实施方案中，可植入组合物进一步包括任何生物相容粘合剂。这样的粘合剂包括胶原或血纤蛋白胶，生理胶，自体胶，半自体胶和非自体胶或凝胶。本发明的可植入组合物任选地进一步包括一种或多种粘合剂和/或赋形剂，例如凝胶，皮肤胶，手术胶和藻酸盐。可使用的粘合剂的具体例子包括Tisseel VHTM血纤蛋白密封胶，从Baxter Healthcare Corporation 1627 Lake Cook Road，LC-IVDeerfield，IL 60015，美国获得。商业上可购得合适的有机胶材料，例如Tisseel或Tissucol；(以血纤蛋白为基础的粘合剂；ImmunoAG，奥地利)，粘着蛋白(Cat.#A-2707，Sigma Chemical，美国)，和Dow Corning Medical Adhesive B(Cat.#895-3，Dow Corning，美国)。
如上所述，生物相容粘合剂能直接与其上粘着性细胞的微颗粒载体材料混合，从而影响本发明的流动性，如下文更详细地描述的。或者，在要治疗的表面施加一层粘合剂，接着是一层其上粘着性细胞的微颗粒载体材料。或者，在对要治疗的表面施用一层其上粘着性细胞的微颗粒载体材料之后施用一层粘合剂。在其他实施方案中，混合之后分开地或者联合地对要治疗的表面施用生物相容粘合剂，细胞和微颗粒载体材料。
在其中粘合剂直接与本发明的可植入组合物结合的实施方案中，粘合剂还提供将本发明的流动性调节到适合软骨细胞受体的特殊需要的好处。粘合剂以类似于上述赋形剂的方式影响本发明的流动性，这取决于粘合剂的特征，例如粘度和密度。
治疗方法
本发明提供了通过对要治疗的表面植入组合物而有效治疗关节表面软骨的方法，首先将可植入组合物置于要治疗的表面上并且允许软骨细胞与表面附着并且在表面上增殖。细胞然后产生软骨基质，并且使软骨基质增殖和增加。在另一个实施方案中，该方法包括对要治疗的表面覆盖覆盖贴的附加步骤，例如美国专利No.5,857,269中所述，该专利文献全文在此引作参考。
在将可植入组合物置于要治疗的表面上之前覆盖贴可以部分地与要治疗的表面附着，或者在将可植入组合物置于表面之后将覆盖贴置于表面上。覆盖贴盖在修补位点上使得移植的软骨细胞保持在那个部位，但是仍然能够获取营养。在一个实施方案中，覆盖贴是带有至少一层多孔表面的半渗透胶原基层。如果使用，覆盖贴优选是没有细胞的，生理可吸收的，非抗原性膜样材料。在本发明的一个实施方案中，覆盖贴的多孔表面直接向着要治疗的表面。此外，在一个实施方案中，覆盖贴是薄片样形式，具有相对平滑的一侧和相对粗糙的多孔一侧。在这个实施方案中，粗糙多孔侧面一般朝向软骨缺损并且促进软骨细胞向内生长，而平滑侧一般背对软骨缺损并且阻碍其中的组织向内生长。在另一个实施方案中，覆盖贴有相似孔隙率的两个平滑面。
适合用作覆盖贴的两种材料包括Chondro-Gide或Bio-Gide，商业上可购得的I型/II型胶原膜(Ed.Geistlich Sohne，Wolhusen瑞士)。根据本发明能使用的附加材料是Chondro-Cell；一种商业上可购得的I型胶原基质膜(Ed.Geistlich Sohne，瑞士)。
止血剂实施方案
在一个实施方案中，本发明的方法还包括止血剂产品与可植入组合物移植联合应用，和，任选地，和覆盖贴联合应用。止血剂产品抑制血管组织的形成，例如在将软骨细胞自体移植到软骨缺损中的过程中，毛细血管循环突出到生成的软骨中。这样的产物有时用来修复其中缺损延伸到软骨下层之中或之下的骨胳中软骨缺损，有时称作全厚度缺损。骨胳下血管组织的形成倾向于突出到要形成的新的软骨中，导致不是期望的间充质特化软骨细胞的细胞外观。血管形成引入的污染细胞可能有侵入到植入软骨细胞形成的软骨中并且过量生长的危险。
虽然本发明能和止血品或屏障联合使用，但是发现，在其中粘合剂或赋形剂与本发明的可植入组合物例如上文描述的那些一起使用的某些实施方案中，粘合剂或赋形剂能发挥有效止血屏障的功能。然而，在另一个实施方案中，能使用任选的膜，例如上文描述的那些，来防止血液接触可植入组合物。
能根据本发明使用的商售膜产品的一个类型是Surgicel(Ethicon Ltd.，英国)，其在7-14天之后可被吸收。这与这种特殊止血装置例如Surgicel的正常使用相反，如来自EthiconLtd.的产品插页中描述的。其他膜产品包括Chondro-Gide和Bio-Gide；如上所述。
为了抑制再血管化作用到软骨中，能使用止血材料并且起着凝胶样人工凝结物作用。如果关节软骨的全厚度缺损中存在血红细胞，该缺损通过这样的止血屏障覆盖，则这些血细胞化学变化成正铁血红素，因此不能诱导血管生长。因此，用作有或没有血纤白粘合剂的再血管化抑制屏障的止血品，例如Surgicel，对于本发明教导的方法的一个实施方案中有效的。
通过关节内窥镜检查，小的关节切开术，或者开放性外科手术能实施根据本发明的植入操作。
可以理解的是，如美国专利申请No 09/320,246所述，通过在植入之前的手术操作能直接治疗，稍微扩大或造型治疗缺损或损伤，以适应可植入组合物，该篇专利文献全文在这里引作参考。
培养方法
值得注意的是，粘着性细胞11和21具有优化的表面面积，其上用于粘着和增殖。如果珠22，干胶片37或线12的表面面积相对于细胞(例如细胞21或11)太大或太小，则细胞将不生长。这样，微颗粒载体材料珠22或线12相对于细胞21和11的用于细胞21和11与珠22或线12附着并生长的最佳表面面积是必需的。应用直径20微米至400微米的珠22或线12可以实现一般的最佳表面积。
举例来说，下面分别详细描述培养方法，软骨细胞的附着和/或生长以及培养过程和/或软骨细胞的附着和/或生长中使用的移植培养基，首先从用来治疗收集的软骨活组织检查和用来根据本发明培养软骨细胞的实验室方法的描述开始。
实施例1-软骨细胞收集和培养
通过将2.5毫升庆大霉素(gentomycin)硫酸盐(浓度70微摩尔/升)，4.0毫升两性霉素(浓度2.2微摩尔/升；商品名Fungizone，一种从Squibb获得的抗真菌剂)，15毫升1-抗坏血酸(300微摩尔/升)，100毫升胎牛血清(最终浓度20％)，和其余的DMEM/F12培养基混合在一起，产生大约400毫升的生长培养基，来制备用来在培养过程中转移和/或处理软骨活组织检查和用来培养软骨细胞的生长培养基(下文称作″生长培养基″)。(相同的生长培养基还被用来将软骨活组织从医院转移到实验室，在那里提取和繁殖软骨细胞)。
对于自体植入物，首先通过关节内窥镜技术收集软骨活组织，例如，从患者关节的非重量承受区收集，并且在含有20％胎牛血清的生长培养基中转移到实验室。然后使用酶，例如胰蛋白酶乙二胺四乙酸(EDTA)，一种蛋白水解酶和结合试剂，处理软骨活组织，从软骨分离和提取软骨细胞。然后在生长培养基中培养提取的软骨细胞，从最初大约50,000个细胞的量至最终大约二千万个或者更多软骨细胞的量。
以大约3,000rpm将从患者获得的血液离心，将血清和其他血液成分分开。保存分离的血清并且在培养过程和移植过程的后一阶段中使用。
预先从患者收集的用于自体移植的软骨活组织在如上所述的生长培养基中运送到实验室培养。将生长培养基轻轻倒出以分离出软骨活组织，并且在到达实验室之后弃除。然后将软骨活组织在普通DMEM/F12中洗涤至少三次，去除软骨活组织上胎牛血清膜。
然后在其中加入了28毫升胰蛋白酶EDTA(浓度0.055)的包括上述生长培养基的组合物中洗涤软骨活组织。在这个组合物中，将软骨活组织在37℃和5％CO2下温育5-10分钟。温育之后，软骨活组织在生长培养基中洗涤2-3次，洗掉活组织的任何胰蛋白酶。然后对软骨称重。一般地，培养软骨细胞要求的软骨的最小量是大约80-100毫克。优选较大的量，例如200至300毫克。称重之后，将软骨放在大约50毫升普通DMEM/F12培养基中2毫升胶原酶(浓度5000酶单位；消化酶)的混合物中，并且切碎让酶部分消化软骨。切碎之后，使用漏斗将切碎的软骨转移到瓶子中并且向瓶子中加入大约50毫升胶原酶和普通DMEM/F12混合物。然后将切碎的软骨在37℃和5％CO2下温育17-21小时。
在一个实施方案中，然后使用40μm筛孔将温育的切碎的软骨滤过，离心(以1054rpm，或200倍重力)10分钟，并且用生长培养基洗涤两次。然后对软骨细胞计数确定它们的成活力，接着将软骨细胞在生长培养基中在37℃和5％CO2下温育至少两周，其间生长培养基更换3-4次。
然后通过胰蛋白酶作用和离心来从生长培养基取出软骨细胞，并且转移给含有1.25毫升庆大霉素硫酸盐(浓度70微摩尔/升)，2.0毫升两性霉素(浓度2.2微摩尔/升；商品名Fungizone，一种从Squibb获得的抗真菌剂)，7.5毫升1-抗坏血酸(300微摩尔/升)，25毫升自体血清(最终浓度10％)，其余的是DMEM/F12培养基的移植培养基，产生大约300毫升的移植培养基。
实施例2-可植入组合物
将选择的载体材料，例如生物相容的，可吸收珠，网或线混合到无菌培养皿中的移植培养基中，用移植培养基来″湿润″载体材料，且在一个实施方案中，将载体材料接触移植培养基1-10小时或更长时间。然后向载体材料移植培养基混合物加入软骨细胞。移植培养基可以是含有HAM F12和15mM Hepes缓冲液和10至20％自体血清的20％最低基本培养基，全都保持在37℃下的CO2培养箱中。
然后让软骨细胞接触载体材料并且在其上或其中生长一段时间，范围是1小时至1周，并且在一个实施方案中，软骨细胞保持在大约37℃的温度下。优选地，软骨细胞与载体材料培养过夜。在一个实施方案中，轻轻搅拌软骨细胞和培养基使得软骨细胞粘着在载体材料的所有的面上并且在其上生长。
在另一个实施方案中，向软骨细胞和载体材料培养基加入另外的载体材料，其间进行搅拌使软骨细胞在新加入的载体材料上又附着并生长。在一些实施方案中，可以向培养物中加入10至40毫克之间的载体材料。在其他实施方案中，载体材料的添加可以重复1-20次。一旦培养期完成，这个阶段能持续大约1天至大约6星期，则可以将含有在载体材料之上或之中附着的软骨细胞的培养基，放到(例如通过注射)缺损部位。
在另一个实施方案中，在培养阶段中，能将载体材料酶促溶解(使用，例如胶原酶)，从而释放细胞。然后从培养基去除酶并且向细胞培养物中加入另外的载体材料。
在后面的步骤中加入的载体材料可以与在前载体材料的类型是一样的或者可以是不同类型的。在一个实施方案中，将细胞从较小的载体材料(20微米)转移给较大的载体材料(400微米)。在另一个实施方案中，将细胞从较大的载体材料转移给较小的载体材料。在另一个实施方案中，将细胞从珠转移给线给干胶片或者具有合适大小和表面积的其任何组合以有利于细胞生长。转移步骤可以重复1-20次。
实施例3-可移植组合物
在另一个实施方案中，悬浮于培养基的软骨细胞可以直接加给载体材料，不用″预先湿润″载体材料。在这种情况下，然后让软骨细胞在载体材料上附着并在其上或之中生长一段时间，范围是大约1小时至大约6星期。优选地，软骨细胞与载体材料培养过夜。在一个实施方案中，轻轻搅拌软骨细胞和培养基使得软骨细胞粘着在载体材料的所有的面上并且在其上生长。
在另一个实施方案中，在培养期间加入另外的载体材料(和原始载体材料相同或不同的载体材料)以扩大细胞培养。在另一个实施方案中，首先通过使用酶例如胰蛋白酶破坏载体材料。然后，将表面积大于破坏的原始载体材料的另外的载体材料加给细胞培养基。在培养期间破坏载体材料的过程可以重复两次或多次。
一旦培养期完成，则可以将含有附着在载体材料之上并在其中或之中生长的软骨细胞的培养基，放到缺损部位。
实施例4-供选择的载体材料试验
对不同的载体材料测试它们对细胞附着和生长提供支持的能力，以及细胞成活力。测试下面的载体材料：从IMEDEX购得的戊二醛交联的胶原线(还没有商业出售)(在图3和4中鉴定为″线+″)；没有戊二醛交联的胶原线(在图3和4中鉴定为″线-″)，如上述公开的IMEDEX专利公开351,296 A1所述；没有戊二醛交联的胶原珠(在图3和4中鉴定为″珠″)。Chondro-Gide膜(作为正对照)，CR-1，IMEDEX膜，和没有膜(作为负对照)也作为比较载体材料进行了测试。
压制胶原线形成圆的不规则形状(例如球形线团)，概略地具有大约0.5厘米直径。即使将线压制成球形，但是这里仍称为″线″。在无菌条件下对珠和两种类型的线的样品称重并且放到12-孔板中。下面表1中给出这些样品的重量，带有各自实验运行编号。
表1
      称重各样品中的载体(mg)
运行号#   珠         线              线没有戊二醛交联    有戊二醛交联
  1       43.5       42.7            41.7
  2       35.8       39.8            39.5
  3       42.4       44.3            40.2
  4       48.6       42              39.2
  5       47.3       41.7            39.1
  6       39.5       36.3            38.6
  7       36.5       35.5            27
  8       37.8       45.3            44
  9       40.3       27.3            35.9
  10      39         44
  11      40         44
  12      40
材料然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，并且检查洗涤溶液的pH，确定载体材料是否引起pH值的变化。向含有载体材料的各个孔和向空的孔加入培养基(DMEM+20％胎牛血清(FCS))(如图3和4所示)。根据常规细胞培养技术制备软骨细胞悬浮液，并且加给对照孔和含有载体材料的孔。软骨细胞与载体材料在37℃下在CO2培养箱中温育三天。三天之后，从孔中去除培养基并且用PBS洗涤载体材料。
接着向各个孔中加入酶溶液(0.25％的胰蛋白酶，5,000U/ml的胶原酶)，并且在37℃下温育，以溶解载体材料。显微镜检查各个样品的溶解，一旦溶解，就将孔中的悬浮液转移到离心管中。然后用DMEM漂洗孔并且转移到离心管中。悬浮液以200xg离心10分钟，然后去除上清液。将残留的沉淀物重新悬浮于0.50毫升的DMEM中并且计数细胞。
如表1所示，总共对珠进行12轮，对没有戊二醛的线进行11轮，对有戊二醛的线进行9轮。然后对细胞数和成活力测定结果取平均值，并且在下文和图3和4中给出。
结果表明，从没有戊二醛交联的线(″线-″)收获的细胞的量最高，如图3所示。珠上细胞量与负对照和正对照(Chondro-Gide膜)相等，戊二醛交联的线(″线+″)和CR-1膜上细胞量小得多。另外，结果表明珠上，没有戊二醛的交联的线上和Chondro-Gide膜上生长的软骨细胞的成活力和负对照软骨细胞相等，如图4所示。有戊二醛的交联的线上和膜上生长的软骨细胞的成活力还是比其他载体材料上生长的软骨细胞的低，但是在所有的情况下，发现一些软骨细胞滞留并生长。
更具体地，如图3所示，从不同载体材料收获的细胞量的不同是明显的。从没有戊二醛交联的线(″线-″)上获得细胞最大量。从珠和正对照和负对照实验获得大约相等的量。从其中有戊二醛的交联的线(″线+″)或CR-1膜是载体的孔收获的细胞数目较小。
图4提供收获细胞的成活力。没有戊二醛交联的线(″线-″)结果平均来说细胞具有94％的最大成活力。正对照和负对照实验和珠显示相似的结果，分别是92％，89％和92％细胞成活力。在两种情况下，戊二醛的交联的线(″线+″)或CR-1膜上收获的细胞成活力减小到大约70％  。
另外，为了测定线的大小的机械减小对细胞成活力的影响，机械减小戊二醛交联的线的大小。在该项实验中，从没有机械减小的线收获的细胞的平均成活力是65％，从机械减小的线收获的细胞的平均成活力是78％。
这项比较研究证明了一般胶原珠和线形式的微颗粒载体材料，以及具体而言没有戊二醛交联的这样的珠和线，支持软骨细胞附着和生长的能力。胶原珠-软骨细胞组合物和胶原线-软骨细胞组合物，在各种情况下，含有适合软骨细胞植入的可流动组合物。
实施例5-加入载体材料
在使用胶原微珠的另一个实施例中，以上述方式制备每个珠具有大约0.3mm2表面积的40毫克微珠的三个样品。向每个样品加入十万个软骨细胞。样品以上述方式在生长培养基中培养三天。向第一个样品加入另外10毫克微珠。向第二个样品加入20毫克微珠。向第三个样品加入40毫克微珠。样品在37℃下进一步培养四天。四天之后，向第一个样品加入另外10毫克微珠。向第二个样品加入20毫克微珠。向第三个样品加入40毫克微珠。然后将样品培养一天。
然后对细胞计数，第一个样品得到157,500个细胞，成活力95％(图21所示)，第二个样品347,500个细胞，成活力98％(图22所示)，第三个样品325,000个细胞，成活力98％(图23所示)。这个实施例表明载体材料上培养的细胞的成活力，和加入另外的载体材料之后细胞的增殖。
尽管参照具体实施方案公开了本发明，但显然本领域技术人员不脱离本发明的真实精神和范围可以提出本发明的其他实施方案和变化方案。附加的权利要求书意在解释为包括所有这样的实施方案和等同改变。

Claims (17)

1.一种可流动的并且包含邻近载体材料保留的软骨细胞的可植入组合物。
2.权利要求1的可植入组合物，进一步包含粘合剂。
3.权利要求1的可植入组合物，其中所述载体材料是微颗粒固体或半固体材料。
4.权利要求1的可植入组合物，其中所述载体材料是可生物降解的。
5.权利要求4的可植入组合物，其中所述可生物降解材料是胶原。
6.权利要求5的可植入组合物，其中所述可生物降解材料是交联胶原。
7.权利要求1的可植入组合物，其中所述软骨细胞保留在所述载体材料之上。
8.权利要求1的可植入组合物，其中所述软骨细胞保留在所述载体材料之中。
9.一种可植入组合物的制备方法，包括对载体材料添加软骨细胞，所述载体材料的结构使得软骨细胞与之粘着；及形成所述软骨细胞和所述载体材料的可流动混合物。
10.权利要求9的方法，其中所述形成步骤包括将粘合剂与所述软骨细胞和所述载体材料混合。
11.权利要求9的方法，其中所述方法进一步包括将所述软骨细胞和所述载体材料暴露给有利于所述细胞与所述载体材料粘着的环境条件。
12.权利要求9的方法，其中所述载体材料是微颗粒固体或半固体材料。
13.权利要求9的方法，其中所述载体材料是可生物降解的。
14.权利要求13的可植入组合物，其中所述可生物降解材料是胶原。
15.权利要求9的方法，其中所述软骨细胞保留在所述载体材料之上。
16.权利要求9的方法，其中所述软骨细胞保留在所述载体材料之中。
17.一种通过将权利要求1的可植入组合物注射到要治疗的表面上而有效治疗关节表面软骨的方法，该方法包括下面的步骤：(a)将所述可植入组合物放置在要治疗的表面上；和(b)使所述软骨细胞在所述表面上生长并形成软骨。
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