MXPA04010667A - Implante inyectable de condrocitos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con una composicion implantable y fluible que comprende un material de soporte, tal como diversas formas de esferas o cadenas de colageno o alginato, las cuales pueden soportar la union y crecimiento de condrocito a las mismas, y con un metodo para elaborar una composicion implantable fluible que comprende un material de soporte y condrocitos retenidos sobre el mismo. Ademas, la presente invencion se relaciona con un metodo para el tratamiento eficaz de cartilago de superficie de articulacion movil por el transplante de una composicion fluible que incluye un material de soporte y condrocitos retenidas en el mismo.

Description

IMPLANTE INYECTABLE DE CONDROCITOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo de la implantación de condrocitos, injertado de cartílago, sanado, reparación de articulaciones y prevención de patologías artríticas: En particular, la presente invención se relaciona con una forma nueva de implante y con métodos nuevos de implantación de condroci os y regeneración de cartílago. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Cada año se realizan en los Estados Unidos más de 500,000 procedimientos artroplásticos y sustituciones de articulaciones completas. Aproximadamente se realizan en Europa la misma cantidad de procedimientos similares. Incluidos, en estas .. cantidades están aproximadamente 90,000 sustituciones totales de rodilla y aproximadamente 50,000 procedimientos para reparar defectos en la rodilla, anualmente (en: Praemer A., Furner S., Rice, D.P., Musculoskeletal conditions in the United States, Park Ridge, 111.: American Academy of Orthopaedic Surgeons, 1992, 125). Un método para la regeneración-tratamiento de cartílago podría ser útil y se podría realizar en una etapa más temprana del daño a la articulación lo que podría reducir el número de pacientes que necesiten cirugía de sustitución con Ref . : 159562 una articulación artificial. Mediante tales métodos de tratamiento preventivos, podría disminuir el número de pacientes que desarrollen osteoartritis . Las técnicas utilizadas para recubrir la superficie de la estructura de cartílago en articulaciones dañadas ha intentado principalmente inducir la reparación del cartílago utilizando taladrado subcondral-, abrasión y otros métodos mediante los cuales se produce extirpación del cartílago enfermo y hueso subcondral, dejando expuesto el hueso esponjoso vascularizado (Insall, J., Clin. Orthop. 1974, 101, 61; Ficat R.P. et al. Clin Orthop. 1979, 144, 74; Johnson L.L., En: (McGinty J,B., Ed.) Operative Arthroscopy, New York: Raven Press, 1991, 341) . Coon y Cahn (1966, Science 153:1116) describen una técnica para el cultivo de células sintetizadoras de cartílago . a., partir de sometos de embrión de pollo". Posteriormente, Cahn y Lasher (1967, PNAS USA 58: 1131) utilizaron el sistema para análisis de la relación de la síntesis de ADN como un requisito para la diferenciación de cartílago. Los condrocitos responden tanto a EGF como FGF por crecimiento (Gospodarowicz y Mescher, 1977, J. Cell Physiology 93:117), pero finalmente pierden su función diferenciada (Benya et al., 1978, Cell 15:1313). Los métodos para hacer crecer condrocitos se han descrito y se han utilizado principalmente con ajustes menores como se describe por (Brittberg M. et al., New Engl . J. Med. 1994, 331, 889). Las células que crecen utilizando estos métodos se utilizan como transplantes autólogos dentro de articulaciones de la rodilla en pacientes. La solicitud internacional número PCT/US00/06541 , asignada a Chondros, Inc. de Baltimore, Maryland, describe células que crecen en un microportador . Las. células después se separan del microportador por medio de digestión enzimática. Esta referencia también describe varios polímeros los cuales pueden servir como andamios para células que van a ser utilizadas para implantación. La totalidad del contenido de la solicitud internacional No. PCT/US00/06541 de esta manera se incorpora como referencia. De manera adicional, Kolettas et al. examinó la expresión de moléculas específicas de cartílago tales como colágenos y prpteoglicanos (proteoglucanos) bajo cultivo celular prolongado. Encontró que pese a los cambios morfológicos durante el cultivo en cultivos de monocapa (Aulthouse, A. et al.,, In vitro Cell Dev. Biol,, 1989,25,659; Archer, C. et al., J. Cell Sci . 1990, m97, 361; Haanselmann, H. et al., J. Cell. Sci. 1994, 107, 17; Bonaventure, J. et al., Exp. Cell Res. 1994, 212, 97) cuando se comparan con cultivos en suspensión que crecen sobre geles de agarosa, las esferas de alginato o los cultivos sometidos a agitación circular (reteniendo morfología de células redondas) los marcadores expresados tales como los tipos II y IX de colágenos y los proteoglicanos agregados grandes, agrecano, versicano y proteína del enlace no cambiaron. (Kolettas, E. et al., Science 1995, 108, 1991). 5 Los condrocitos articulares son células derivadas de mesénquima especializadas que se encuentran exclusivamente en el cartílago. El cartílago es un tejido avascular cuyas propiedades físicas dependen de la matriz extracelular producida por los condrocitos. Durante la osificación 0 endocondral , los condrocitos experimentan la duración lo que genera la hipertrofia celular caracterizada por el inicio de expresión de colágeno tipo X (Upholt, W.B. y Olsen, R.R., En: Cartilage Molecular Aspects (Hall, B. & Newman, S, Eds) CRC Boca Ratón 1991, 43; Reichenberger, E. et al., Dev. Biol . J5__1991, .J-48, 562; Kirsch, T. et al., Differentiation, 1992, 52, ~ - 89 ;; -Stephens-'M. et al.,- J.- Cell. -Sci ._J.993.,..103., .1111) . . SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una composición implantable que comprende un material de soporte, 0 preferiblemente un soporte sólido o semisólido que incluye esferas microparticuladas , cadenas, obleas, esferas o una cadena o una combinación de esferas, cadenas, obleas o esferas de cadenas (a continuación denominado como "material de soporte microparticulado" ) . En una modalidad, el material 5 de soporte microparticulado es de tamaño y forma variables.

En una modalidad, el material 'de soporte microparticulado sostiene la unión y crecimiento de 'condrocitos u otros tipos de células al mismo y el cual, en algunas modalidades con condrocitos retenidos sobre la superficie del material de soporte microparticulado es fluible antes o después de la inyección dentro del sitio de implantación. En una modalidad de la presente invención, los condrocitos crecen o se adhieren (a continuación se les denomina colectivamente como "adhieren") en la superficie así como en el material de soporte microparticulado debido a que el material de soporte microparticulado tiene una o más aberturas porosas en la superficie. Cuando se utiliza, la composición implantable de la presente invención opcionalmente incluye de manera adicional uno o más de un adhesivo y/o excipiente tal como un gel, colágeno., pegamento de fibrina, -pegamento ~autó.logo,_ semi^utólogq o. no autólogo así como gel de colágeno, pegamentos cutáneos, pegamentos quirúrgicos y alginatos . La composición implantable de acuerdo con la presente invención se puede administrar entonces a un sujeto (típicamente por inyección) como uno o más de lo siguiente: 1) una mezcla de adhesivo y/o un excipiente y la composición implantable, 2) una capa de la composición implantable, que opcionalmente incluye un adhesivo o un excipiente, seguido por una capa de uno- o más adhesivos, 3) una capa de uno o más adhesivos seguido por una capa de la composición implantable, que opcionalmente incluye un adhesivo o un excipiente, o 4) una capa de la composición implantable libre de adhesivo o un excipiente . La invención también incluye un método para producir una composición implantable que comprende un material de soporte microparticulado y condrocitos u otras células capaces de formar cartílago o de diferenciarse en células que sean capaces de formar cartílago retenidas en las mismas. Se pueden utilizar en la presente invención otras células, tales como células de mesénquima, tales como células de mesénquima, células sanguíneas y células grasas. En otras modalidades, la presente invención incluye un método para producir una composición implantable descrita en lo anterior combinado con un adhesivo o excipiente. Además, la presente ""invención proporciona - un método .para .el. .tratamiento eficaz (por ejemplo, para mejorar el uso de un paciente de una superficie de una articulación dañada) de un cartílago de superficie de articulación móvil por la implantación o transplante de una composición que incluye un material de soporte microparticulado y condrocitos retenidos sobre el mismo y/u opcionalmente dentro del mismo en combinación con un adhesivo o excipiente. Como se utiliza en la presente, el término "aproximadamente" significa más o menos aproximadamente 10 por ciento del valor indicado, de manera que "aproximadamente 20 micrómetros " indica aproximadamente 18 a 22 micrómetros. El tamaño de la partícula se puede determinar por métodos convencionales conocidos por aquellos expertos en la técnica. DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS La figura 1 es una vista lateral de una porción de una cadena de la presente invención con células adheridas y que crecen sobre su superficie. La figura 2 es una vista lateral de una pieza esférica, microesfera o microesfera de la presente invención con células adheridas y que crecen en su superficie. La figura 3 es una representación gráfica del número promedio de células cosechadas a partir de los materiales de soporte probados. La figura 4 es una representación gráfica de la v abiridad · promedio de células cosechadas__a^ partir ^de los materiales de soporte probados. La figura.5 es una representación gráfica de un gel de colágeno heterogéneo formado a partir de esferas de micropartículas empacadas de la presente invención. La figura 6 es una representación gráfica de un material similar a esponja formado a partir de cadenas de la presente invención. La figura 7 es una representación gráfica de un material similar a esponja de colágeno de fibras insolubles secas empacadas dentro de un volumen tridimensional. La figura 8 es una representación gráfica de un gel de colágeno homogéneo y un método para la formación de gel de colágeno. La figura 9 es una representación gráfica de un material similar a esponja, de colágeno, recubierto con una película de colágeno. La figura 10 es una representación gráfica de un aparato utilizado para fabricar pelotas o abalorios de cadena de la presente invención. La figura 11 es una representación gráfica de un procedimiento para la elaboración de pelotas de cadena de la presente invención. La figura 12 es una representación gráfica de un procedimiento para la elaboración de pelotas de cadena de la presente invención así como pelotas de cadena de la presente invención. ..i. .. .....,·La figura 13 es una .representación gráfica de _un aparato utilizado para elaborar piezas esféricas de la presente invención. La figura 14 es una representación gráfica de un procedimiento para la elaboración de piezas esféricas de la presente invención. La figura 15 es una representación gráfica de un procedimiento para la elaboración de piezas esféricas de la presente invención. La figura 16 es una representación gráfica de un aparato utilizado para elaborar obleas de la presente invención.

La figura 17 es una representación gráfica de un procedimiento para la elaboración de una oblea de la presente invención. La figura 18 es una representación gráfica de un procedimiento para la elaboración de obleas de la presente invención. La figura 19 es una vista microscópica de una pelota de cadena y una oblea, cada una formada de una cadena de colágeno, de la presente invención. La figura 20 es una vista microscópica de piezas esféricas de colágeno de la presente invención. La figura 21 es una vista microscópica de condrocitos . La figura 22 es una vista microscópica de condrocitos. _ La figura 23 es una vista microscópica de - condrocitos.— - — _ :. . ^ _ _ DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención incluye una composición implantable que comprende un material de soporte microparticulado el cual puede soportar la unión y/o crecimiento de condrocito sobre o dentro de la superficie del material de soporte microparticulado. La presente invención incluye además un método para elaborar una composición implantable que comprende · un material de soporte microparticulado con condrocitos unidos y/o que crecen sobre el mismo o dentro del mismo. Además, la presente invención incluye un método para el tratamiento eficaz de cartílago de superficie de articulación móvil dañada mediante el transplante o implantación de una composición que incluye un material de soporte microparticulado y condrocitos unidos o que crecen en el mismo o sobre el mismo. El método para el tratamiento eficaz del cartílago de superficie de articulación móvil por implantación o transplante de una composición incluye colocar la composición sobre la superficie o dentro del área que va a ser tratada opcionalmente por inyección, particularmente inyección artroscópica u otra colocación mínimamente invasiva y permitir el crecimiento de condrocito sobre la superficie o dentro del área, por lo que se restaura el tejido de cartílago. En una modalidad, el método encuentra uso particular en el tratamiento del cartílago de las superficies de articulaciones en articulaciones que tienen 'uña cantidad mínima de espacio entre superficies de hueso, tales como, pero sin limitarse a enartrosis del hombro y la cadera y otras articulaciones tales como las articulaciones digitales de las manos y las articulaciones de los pies y raciales tales como la mandíbula. Adicionalmente , en algunas modalidades de la composición y métodos de la presente invención, la presente invención opcionalmente incluye el uso de uno o más adhesivos biocompatibles así como uno o más excipientes. Como se utiliza en la presente como se describe con mayor detalle en lo siguiente, un excipiente es un material biocompatible el cual puede alterar la capacidad de fluidez de la composición implantable. El adhesivo se utiliza para retener la composición de la presente invención en una superficie deseada o en un área deseada qué se va a tratar. En una modalidad, el adhesivo se selecciona de manera que funcione como una barrera hemostática y opcionalmente también afecta la capacidad de fluidez de la composición implantable antes y después de la implantación de una manera similar a un excipiente. Cada componente de la presente invención se discute con mayor detalle en lo siguiente. Para propósitos de descripción únicamente, el colágeno se describe en la presente como un material biodegradable ejemplar para uso como cadenas, piezas esféricas, pelotas de cadenas u obleas, aunque también se pueden utilizar oíros' ~ materiales^" biodegradables adecuados para uso en esta invención. La composición implantable La composición implantable de la presente invención incluye un material de soporte microparticulado (también denominado como "material de soporte" o "biomaterial de colágeno poroso") y células adheridas al mismo o en el mismo, si la superficie del material de soporte es poroso. El material de soporte microparticulado se puede elaborar al Inyectar una solución oxidada de colágeno en un baño de reticulado (como se describe en lo siguiente con referencia a las figuras 10 a 18) . En una de tales modalidades, el colágeno oxidado se fabrica mediante la utilización de técnicas de extracción de pepsina para formar fibras de colágeno las cuales se mantienen a -20 °C. Periódicamente, las fibras se someten a oxidación ácida para oxidar carbohidratos y grupos funcionales hidroxilisina, lo que crea grupos aldehido. El colágeno después se puede precipitar en una solución de NaCl y después se lava con NaCl adicional. Después de precipitación y lavado, el precipitado se lava nuevamente con acetona para formar un polvo de colágeno oxidado, el cual después se puede disolver en ácido para proporcionar la solución de colágeno oxidada adecuada para inyección en un baño de reticulación, en donde se puede llevar a cabo una reación entre: 1) grupos amina y 2) grupos carbohidrato oxidados o hidroxilisina y de esta manera "sé" forma una red reticulada de poliimina. En una modalidad, una ¦ aguja 16, que tiene un extremo a 90 grados y un diámetro de 0.5 milímetros, se puede utilizar para inyectar 0.5-1.5% de solución de colágeno en un baño de reticulado, como se describe con mayor detalle en lo siguiente con referencia a las figuras 10 a 12. Para formar los biomateriales de colágeno porosos, típicamente las cadenas a de colágeno se unen covalentemente a fibrillas por medio de una técnica de reticulado.

Inicialmente , el colágeno se oxida por ácido peryódico para generar grupos aldehido dentro de la cadena mediante la oxidación de hidrosilisina y residuos azúcar. En una modalidad, el colágeno se puede reticular de una manera descrita por Tardy et al.; patente de E.U.A. No. 4,931,546, cuyo contenido completo se incorpora en la presente como referencia. Como se describe en lo siguiente, las piezas esféricas, cadenas, pelotas de cadenas y obleas después se pueden formar al inyectar un gel de colágeno a través de un tubo capilar. El reticulado se produce a un pH neutro por reacción de grupos aldehido (R-CHO) con grupos amino (R'-NH2) que a su vez genera los reticulados R-CH=N-R' de poliimina, como se describe en la patente de E.U.A. No. 4,931,546. En tal modalidad, las cadenas pueden o no estar reticuladas con glutaraldehído . En una modalidad adicional, una porción de la estructura de ..colágeno se recubre con una cantidad adicional de colágeno para formar una película sobre una porción de la superficie de la estructura. La película funciona como una barrera para evitar la migración celular. La formación de las esferas 22 de colágeno, las cadenas 12, las pelotas de cadenas 12 y las obleas 37 involucran métodos de inyección diferentes de colágeno dentro de un baño de reticulado y cada método se describe con mayor detalle en lo siguiente con referencia a las figuras 10 a 28. En una modalidad, después de inyección en el baño, la acidez del material de soporte de colágeno se neutraliza y se somete a incubación por glicerol. En una modalidad, el material de soporte después se puede secar bajo un flujo de aire y se esteriliza vía radiación, tal como esterilización y, lo que proporciona un material de soporte adecuado para el cultivo celular. Como se utiliza en la presente, un material de soporte está en forma de una cadenas 12, pelotas.de cadena 12 o pelotas 22 u oblea 37 y/o mezclas de los mismos. A. Cadenas En una modalidad, el material de soporte microparticulado comprende .una o más cadenas. Una porción de una cadena es como se muestra en la figura 1. En la modalidad que se muestra en la figura 1, la cadena 12 tiene celdas 11 adheridas a la superficie de la cadena 12. En otra modalidad, la -.-.-cadena _ 12_ se . puede elaborar por cualquier" "matériál* biodegradable tal como colágeno, de manera más específica colágeno ' tipo I, tipo II o tipo III, o una combinación de los mismos en uno o más de los materiales de soporte microparticulados descritos en lo siguiente. Los materiales de soporte también pueden estar reticulados entre sí. Típicamente, las dimensiones del roscado 12 son adecuadas para unión o crecimiento de células de mamífero sobre las mismas o dentro de las mismas (dependiendo de la porosidad de la cadena 12 y el tamaño de las células 11) . La cadena 12 típicamente es de aproximadamente 20 a 400 micrómetros de diámetro. En algunas modalidades de la cadena 12, los poros tienen un diámetro suficiente para permitir la migración de las células, tales como condrocitos, al interior de la cadena 12. La cadena ?2 después se puede utilizar para formar un material similar a esponja, como se muestra en las figuras 6 y 7 como se describe con mayor detalle en lo siguiente o la cadena 12 puede formar, prensar o laminar en pelotas de la cadena 12 (denominada como pelota de cadena 12A, como se muestra en la figura 12) y en algunas modalidades, la cadena 12 puede tener un área superficial total de aproximadamente 30 cm2. La cadena 12 también se puede formar en obleas, como se muestra en la figura 19, y como también se describe con mayor detalle en lo siguiente. En una modalidad, la cadena 12 se puede elaborar al inyectar _un_ma erial biodegradable tal como gel de" colágeno ~a" través de un tubo capilar en un baño de coagulación. La cadena se ¦ vuelve insoluble después de que se produce la reticulación. Como se muestra en las figuras 10, 11 y 12, se puede inyectar una solución de colágeno 13 oxidado, preferiblemente colágeno oxidado 1% dentro de un baño de amortiguador 14 de reticulado, típicamente mediante una aguja 16 que tienen un extremo 90 grados y un diámetro de 0.5 mm. En una modalidad, el colágeno se inyecta en una corriente continua o semicontinua o en una cadena 12. Conforme el colágeno hace contacto con el amortiguador reticulante, el colágeno comienza a solidificar. La pelota de la cadena 12 (que se muestra en la figura 12 como 12A) se puede formar de una cadena de colágeno única la cual retícula sobre sí misma o en cadenas de colágeno reticuladas por separado o fragmentos roscados, los cuales en sí mismos pueden ser reticulados juntos. Un ejemplo de una pelota de cadena 12 en forma de cadena de colágeno reticulada se muestra en la vista microscópica que se presenta en la figura 19. De manera alternativa, en una modalidad en la cual se utilizan las cadenas como un material de soporte, las cadenas 12 se pueden moldear, laminar o presionar en otras formas similares a pelotas " o se pueden conformar en un material similar a esponja, como se describe en lo siguiente. BJ_„ Piezas esféricas En otra modalidad, el material de soporte microparticulado incluye una o más piezas esféricas 22, que se muestran en la figura 2. En la modalidad que se muestra en la figura 2, la pieza esférica 22 tiene células 11 unidas o que crecen dentro de la superficie de la pieza esférica 22 (que depende la porosidad de la pieza esférica 22 y del tamaño de las células 11) . La pieza esférica 22 se puede elaborar de cualquier material biodegradable que incluye colágeno tipo I, tipo II o tipo III o una combinación de los mismos, uno o más de los materiales de soporte microparticulados descritos . en lo siguiente. Típicamente, el diámetro de la pieza esférica 22 es un tamaño que es adecuado para unión y crecimiento de células de mamífero sobre el mismo, habitualmente de 20 a 400 micrómetros de diámetro. Un ejemplo de una pieza esférica 22 formada de colágeno reticulado se muestra en la vista microscópica que se presenta en la figura 20. En otra modalidad, si la pieza esférica 22 tiene porosidad suficiente, las células 11 se pueden unir y/o se pueden hacer crecer dentro de la pieza esférica 22. En una modalidad porosa de la pieza esférica 22, los poros tienen un diámetro suficiente para permitir la migración de las células, tales como los condrocitos dentro del interior de la pieza esférica 22. En una modalidad, la pieza esférica 22 se puede elaborar -de acuerdo con el procedimiento descrito "en la publicación de patente EP 351296 Al para IMEDEX, cuyo contenido completo se incorpora en la presente como referencia. De acuerdo con la publicación de IMEDEX EP, gotitas de colágeno tipo I de la dermis de origen porcino o bovino se forman y recubren a partir de una solución de colágeno. Como se muestra en las figuras 13, 14 y 15, una solución de colágeno 25 oxidado, típicamente de colágeno aproximadamente 0.8% se puede inyectar por la aguja 16 en una solución de amortiguador 14 de reticulado para formar las piezas esféricas 22. En una modalidad, se utiliza aire comprimido 31 para impulsar la solución de colágeno dentro de la aguja 16. Conforme se inyecta colágeno dentro del amortiguador reticulante, un vibrador 29 agita suavemente el dispositivo de inyección lo que provoca que el colágeno descienda desde la aguja de una manera por goteo, formando las gotitas 22 de piezas esféricas. Conforme las gotitas 22 de piezas esféricas hacen contacto por separado con el amortiguador reticulante, la superficie de las gotitas 22 de piezas esféricas retícula, solidifica y se recolecta como piezas esféricas 22 sólidas en el amortiguador reticulante, como se muestra en las figuras 14 y 15. La separación de las piezas esféricas se puede mantener por agitación, y en una modalidad por agitación con una barra magnetizada 27. Las gotitas de colágeno después se separan de la solución conforme solidifican piezas esféricas 22 de colagencT. ~En esta modalidad, el tamaño de las piezas esféricas varía de un diámetro de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 2 mm. En la figura 20 se muestra una vista microscópica de ejemplo de las piezas esféricas de colágeno de la presente invención . C. Obleas Como se muestra adicionalmente en las figuras 16, 17 y 18, una oblea 37 también se puede formar al inyectar un volumen de colágeno 13 oxidado por medio de una aguja 16 en un amortiguador 14 de reticulación que opcionalmente contiene una malla 35 polimérica para la cadena 12 de colágeno para reticulado y sedimentación sobre la misma. En una modalidad de acuerdo con este método, un monofilamento de la cadena 12 continuo o semicontinuo se puede preparar manualmente y se puede empacar dentro de un volumen tridimensional de cualquier tamaño apropiado antes de deshidratación y de esta manera se forma una modalidad alternativa de oblea 37. Un ejemplo de oblea 37 formada de una cadena de colágeno reticulada se muestra en la vista microscópica que se presenta en la figura 19. Una vez formada, la oblea 37 (u otro material de soporte microparticulado que se describe en la presente) se puede integrar en una película de colágeno adicional (una película de colágeno reticulada o sin reticular) . En una modalidad, la oblea 37 se puede integrar en una pelícual de colágeno al _ colocar la oblea 37 sobre uña ~pérí'cuÍa~"de~ colágeno que está contenida en un soporte sólido, tal como una caja de petri . Como se muestra en la figura 9, en una modalidad, las cadenas 12 (después las cadenas 12 se secan y se empacan aleatoriamente en un volumen, como se muestra en la figura 7) se integran en la película 95, la cual forma una barrera celular para impedir la migración de las células. En algunas modalidades, las obleas 37 tienen un área superficial disponible para cultivo de células de hasta aproximadamente 50 cm2.

D. Otras formas de material de soporte microparticulado En una modalidad, el gel 85 de colágeno homogéneo se puede elaborar de la manera que se muestra en la figura 8, específicamente por incubación de una solución 83 del material de soporte deseado (tal como colágeno) en un recipiente, tal como el recipiente 86 mostrado. No obstante, en otra modalidad, se puede elaborar una estructura de gel similar a esponja a partir de las piezas esféricas 22 o las cadenas 12. Específicamente, las piezas esféricas 22 y/o las cadenas 12 se pueden empacar juntas para formar una estructura de gel que incluye piezas esféricas 22 o cadenas 12 y gel 54, tal como el que se muestra en las figuras 5, 6, 7 y 8. La porosidad de la estructura de gel se define por el volumen intersticial entre las partículas, el cual típicamente puede variar de 30% a 50% del volumen "total"' de las piezas esféricas 22 y/o cadenas 12 empacadas. En una modalidad, el gel 54 es colágeno. En la figura 5, el material de soporte microparticulado incluye piezas esféricas 22 de la presente invención (aunque el material de soporte microparticulado también puede incluir cadenas 12 y/u obleas 37) , las cuales se empacan en un recipiente 52. En una modalidad, las piezas esféricas 22 después se dispersan dentro de un gel 54 de colágeno.

En la modalidad que se muestra en la figura 6, el soporte microparticulado incluye un moriofilamento de cadena 12 el cual se empaca dentro de un recipiente 62 antes o después de que la cadena 12 haya sido reticulada y, después del secado, forma un monofilamento insoluble seco. En una modalidad, la cadena 12 de la invención se puede empacar en un recipiente antes o durante el reticulado de manera que el roscado se empaca aleatoriamente y se interconecta en el recipiente 72, como se muestra en la figura 7. En una modalidad alternativa, el material de soporte microparticulado (ya sea la cadena 12 o la pieza esférica 22) se puede elaborar de uno o más materiales reabsorbibles adicionales. Tales materiales de soporte microparticulados se pueden preparar a partir de alginato, almidón, hialuronano, -dextrano (Véase Van Wezel, A.'L. 1967, Nature„216 ^64 : 6_5) , celulosa (Véase Reuveny, " S."T'et "alT, '1982 ," Dev. Biol . Stand. 50:115-123); colágeno (Véase R. C. Dean et al., 1985, Large Scale Mammalian Cell Culture Technology, Ed. B.K. Lydersen, Hansen Publishers, New York, N.Y., pp. 145-167) ; o gelatina (Véase Cultisphere, Technical Bulletin, Percell Biolytica AB) , en la medida en que se satisfagan los criterios de dimensión apropiados. Otros criterios pertinentes pueden incluir porosidad del material de soporte, tiempo de degradación del material de soporte y si el material de soporte está reticulado. En una modalidad, el material de soporte microparticulado de la presente invención comprende colágeno combinado con uno o más materiales reabsorbibles adicionales. Además, de acuerdo con la presente invención, el material de soporte microparticulado puede ser no reticulado o reticulado utilizando uno o más agentes de reticulación aparentes para una persona experta en la técnica. Un agente reticulante apropiado incluye glutaraldehído y productos similares.- Preferiblemente, el material de soporte microparticulado incluye un material biodegradable el cual soportará la unión o crecimiento de condrócitos sobre y/o dentro del material de soporte microparticulado y el cual, con el tiempo será absorbido en el tiempo de un paciente que reciba el implante. Además, la presente invención incluye un método para elaborar una composición implantable que incluye agregar condrócitos al material de soporte microparticulado descrito antes. En tal modalidad las piezas esféricas, cadenas o una mezcla de piezas esféricas y cadenas se preparan de acuerdo con la presente invención. Las células adherentes tienen una tendencia natural a adherirse a la superficie del material de soporte microparticulado. No obstante, en otra modalidad, el método comprende además mezclar un adhesivo, tal como uno o más de los adhesivos descritos en lo siguiente, con condrócitos y material de soporte microparticulado. En las modalidades en las cuales se utiliza adhesivo, (1) las células se adhieren al material de soporte con una capa de adhesivo aplicada al material de soportes de las células, (2) se aplican una o más capas de adhesivo sobre las células las cuales se han adherido al material de soporte vía un adhesivo, o (3) -una mezcla de adhesivo y células se adhieren al material de soporte. La presente invención también puede utilizar condrocitos autólogos y/o halogeneicos o bien condrocitos xenogeneicos . En una modalidad, el material de soporte microparticulado puede ser esterilizado por métodos evidentes para aquellos expertos en la técnica, típicamente radiación ß o y así como difusión de óxido de etileno. Como se utiliza en la presente, la composición implantable de la presente invención incluye un material de soporte microparticulado que tiene células adheridas al mismo. La composición implantable opcionalmente incluye "de manera adicional excipientes y adhesivos apropiados, como se describe en la presente. Excipientes Se ha encontrado que en algunas modalidades las partículas separadas de un material de soporte microparticulado que tengan células adheridas al mismo se asocian por fuerzas tales como gravedad y fuerzas de Van Der Waals y de esta manera se forma un sedimento en la parte inferior de un recipiente que contiene el material de soporte microparticulado y las células (es decir, la composición implantable) . Este sedimento tiene una gama de viscosidades que pueden o no ser fluibles o no, dependiendo de muchos factores. Como se utiliza en la presente, el término fluible significa que se puede mover al desplazarse uniformemente sin interrupción de la continuidad, de la manera característica de un fluido. No obstante, en algunas modalidades, la presente invención puede fluir lentamente, por ejemplo, cuando se utiliza un gel viscoso como un excipiente, como se describe en lo siguiente y por lo tanto puede variar desde flujo libre a endurecido. Los factores que afectan la capacidad de fluidez de la presente invención incluyen: 1) la duración de tiempo en que el material de soporte microparticulado y las células permanecen en un recipiente de retención, 2) las dimensiones y formas de las partículas indj.vidualesj.del. material de soporte microparticuládb', ~ y '3T la cantidad de crecimiento celular del material de soporte microparticulado y el material circundante. En consecuencia, con frecuencia es deseable ajustar la capacidad de fluidez de la composición descrita en lo anterior para facilitar la administración, por ejemplo por inyección, de la presente invención a un paciente. Al ajustar la capacidad de fluidez de la composición, los excipientes se pueden combinar directamente con la composición implantable. Los factores que afectan la capacidad de fluidez de un excipiente y por lo tanto la capacidad de fluidez de la composición implantable son apreciados por aquellos habitualmente expertos en la técnica e incluyen pero no se limitan a densidad y viscosidad. Otros factores que pueden alterar la capacidad de fluidez incluyen las características químicas y físicas del adhesivo utilizado y excipientes o aditivos adicionales utilizados en la invención. En algunas modalidades, dado que los materiales de soporte microparticulados se fijan en un defecto por pegamento, la viscosidad también depende del punto en el tiempo de la medición y por lo tanto varía a partir del fluido que se va a fij ar . Los excipientes adecuados incluyen cualquier líquido, suspensión, gel o material similar a gel biocompatible (por ejemplo con condrocitos y con cualquier tejido, en el cual se puede implantar) o un material sólido o semisólido microparticulado, caracterizado por la capacidad de retener condrocitos en la superficie o dentro de la superficie por un período de tiempo para habilitar la unión y/o crecimiento y/o multiplicación de condrocitos en el mismo o sobre el mismo, antes de la implantación y después de la implantación a una superficie que va a ser tratada, y para proporcionar un sistema similar al ambiente natural de condrocitos para optimizar el crecimiento celular así como la diferenciación celular (si es aplicable al tipo particular de célula utilizada) . Preferiblemente, el material de soporte microparticulado incluye un material biodegradable el cual soportará la unión de condrocitos y el crecimiento el cual, con respecto al tiempo será absorbido en el cuerpo del paciente que reciba el implante. Adhesivos En una modalidad, la composición implantable incluye además cualquier adhesivo biocompatible . Tales adhesivos incluyen colágeno o pegamento de fibrina, pegamentos fisiológicos, pegamento autólogo, pegamento autólogo o no autólogo o gel . La composición implantable de la presente invención opcionalmente incluye además uno o más de un adhesivo o excipiente, tal como un gel, pegamentos cutáneos, pegamentos quirúrgicos y alginatos. Un ejemplo específico de un adhesivo aplicable incluye el sellante de _fj,brinas^ JTisseel._ VHMR, disponible de Baxter Healthcare* Corporation 1627 Lake Cook Road, LC-IV Deerfield, IL 60015, EUA. Un material de pegamento orgánico adecuado se puede encontrar comercialmente , tal como por ejemplo TisseelMR o TissucolMR (adhesivo basado en fibrina; Immuno AG, Austria) , proteína adhesiva (catálogo #A-2707, Sigma Chemical, EUA) y el adhesivo médico B de Dow Corning (catálogo #895-3, Dow Corning, EUA) . Como se describe en lo anterior, el adhesivo biocompatible puede ser combinado directamente con el material de soporte microparticulado que tenga células adheridas en el mismo y de esta manera se altera la capacidad de fluidez de la presente invención, como se describe con mayor detalle en lo siguiente. De manera alternativa, el adhesivo se puede aplicar en una capa sobre una superficie que va a ser tratada seguido por una capa de material de soporte microparticulado que tenga células adheridas sobre el mismo. De manera alternativa, el adhesivo se puede aplicar en una capa después de una capa de material de soporte microparticulado que tenga células adheridas sobre el mismo que se aplique a una superficie que va a ser tratada. En otras modalidades, el adhesivo biocompatible , las células y el material de soporte microparticulado se aplican a una superficie que va a ser tratada por separado o en combinación después de que se mezcla. . En una modalidad, en donde el adhesivo se combina directamente con la composición implantable de la presente invención, el adhesivo también proporciona la ventaja de ajustar la capacidad de fluidez de la presente invención para adaptarla a las necesidades particulares de un receptor de condrocitos. El adhesivo altera la capacidad de fluidez de la presente invención de una manera similar a la de los excipientes descritos en lo anterior, dependiendo de las características del adhesivo tales como viscosidad y densidad .

Método de tratamiento La presente invención proporciona un método para el tratamiento eficaz del cartílago de superficie de articulación móvil mediante el implante de una composición a una superficie que va a ser tratada al colocar primero una composición implantable sobre una superficie que va a ser tratada y permitir que los condrocitos se unan y proliferen sobre la superficie. Las células después producen una matriz de cartílago y proliferan y pueblan la matriz de cartílago. En otra modalidad, el método comprende la etapa adicional de cubrir la superficie que va a ser tratada con un parche de recubrimiento, tal como el descrito en la patente de E.U.A. No. 5,857,269, cuyo contenido completo de la cual se incorpora como referencia. El parche de cobertura puede estar unido parcialmente _jL_JLa__superficie_ que se va _a_j:ratar antes de colocar la composición implantable sobre la superficie que se va a tratar, o se puede colocar sobre la superficie después de haber colocado la composición implantable sobre dicha superficie. El parche de cobertura se coloca como un remate sobre el sitio de reparación de manera que los condrocitos transplantados se mantienen en el lugar, pero aún son capaces de tener acceso a nutrientes. En una modalidad, el parche de cobertura es una matriz de colágeno semipermeable que tiene por lo menos una superficie porosa. Si se utiliza, el parche de cobertura, preferiblemente es un material similar a membrana no antigénico fisiológicamente absorbible, sin células. En una modalidad de la presente invención, una superficie porosa del parche de recubrimiento se dirige hacia la superficie que va a ser tratada. Además, en una modalidad, el parche de recubrimiento está en forma similar a lámina y tiene un lado relativamente liso y un lado poroso relativamente rugoso. En esta modalidad, el lado poroso rugoso típicamente está orientado hacia el cartílago defectuoso y promueve el crecimiento de condrocitos mientras que el lado liso típicamente está orientado alejándose del cartílago defectuoso e impide el crecimiento en su interior de tejido. En otra modalidad, el parche de cobertura tiene dos lados lisos de porosidad similar. Dos materiales adecuados para uso como parches de cobertura _ incl yen Chondro-GideMR_ o Bio-GideMR, disponibles comercialmente como membranas de colágeno tipo i/tipo II (Ed. Geistlich Sohne, Wolhusen Suiza) . El material adicional se puede utilizar de acuerdo con la presente invención es Chondro-CellMR, una membrana de matriz de colágeno tipo II disponible comercialmente (Ed. Geistlich Sohne, Suiza). Modalidades hemostáticas En una modalidad, los métodos de la presente invención también incluyen el uso de productos hemostáticos junto con el transplante de la composición implantable y, opcionalmente , con un parche de cobertura. Los productos hemostáticos inhiben la formación de tejido vascular, por ejemplo tales como circuitos capilares que se proyectan dentro del cartílago que se ha establecido durante el procedimiento de transplante autólogo de condrocitos en defectos en el cartílago. Tales productos algunas veces son útiles en reparar defectos de cartílago en huesos en donde los defectos se extienden dentro o debajo de la capa subcondral , algunas veces denominados como defecto de espesor completo. La formación de te ido vascular desde el hueso subyacente tenderá a proyectarse hacia el cartílago nuevo que se va a formar dirigiéndose a la apariencia de las células diferentes a los condrocitos especializados de mesénquima deseados. Las células contaminantes introducidas por la vascularización pueden generar invasión o crecimiento -excesivo_ dent.ro del cartíJLago ... que se va_ a formar por los condrocitos implantados. Aunque la presente invención se puede utilizar junto con un producto o barrera hemostática, se ha encontrado que en ciertas modalidades en donde se utiliza un adhesivo o excipiente con la composición implantable de la presente invención, tales como las descritas en lo anterior, el adhesivo o excipiente puede funcionar como una barrera hemostática eficaz. No obstante, la modalidad, una membrana opcional tal como la que se describe en lo anterior, se puede utilizar para evitar que la sangre tenga contacto con la composición implantable. Uno de los tipos de productos de membrana comercial los cuales se pueden utilizar de acuerdo con esta invención es SurgicelMR (Ethicon Ltd. , Reino Unido) , el cual es absorbible después de un período de 7-14 días. Esto es contrario al uso normal de este dispositivo hemostático particular dado que SurgicelMR, como se describe en un inserto de producto de Ethicon Ltd. Otros productos de" membrana incluyen Chondro-GideMR y Bio-GideMR, descritos antes. Para inhibir la revascularización en cartílago, se puede utilizar un material hemostático y actuará como un coagulado artificial similar a gel . Si están presentes eritrocitos dentro del defecto de espesor completo de un cartílago articular que está cubierto por tal barrera hemostática, estos eritrocitos químicamente estarán cambiados a _„_hematina y .por lo_ tanto no serán capaces de inducir crecimiento vascular. Por lo tanto, un producto hemostático utilizado como una barrera inhibidora de revascularización con o sin adhesivos de fibrina, tales como, por ejemplo, SurgicelMR, es eficaz para una modalidad de los métodos como se describe por la presente invención. El procedimiento de implantación de acuerdo con la presente invención se puede llevar a cabo por una técnica artroscópica, miniartrotómica o de cirugía abierta. Se entiende que el defecto o daño puede ser tratado directamente, agrandado ligeramente o esculpido por procedimientos quirúrgicos antes del implante, tal como se describe en la solicitud de patente de E.U.A. No. 09/320,246, cuyo contenido completo se incorpora en la presente como referencia, para alojar la composición implantable. Procedimientos de cultivo Es notable que las células adherentes 11 y 21 tienen un área superficial óptima sobre la cual se unen y proliferan. Si el área superficial de la pieza esférica 22, la oblea 37 o la cadena 12 es demasiado grande o demasiado pequeña en relación a las células (por ejemplo las células 21 u 11) entonces las células no crecerán. Por lo tanto, un área de superficie óptima del material de soporte microparticulado de las piezas esféricas 22 o de la cadena 12 en relación a las células 21 y 11 para unión y crecimiento de las células 21.;. ....11 a_ las piezas esféricas 22 o a la cadena 12 es necesario. Se puede obtener un área de superficie óptima típica, mediante la utilización de la pieza esférica 22 o en la cadena 12 que tenga diámetros de 20 micrómetros a 400 micrómetros de diámetro. A modo de ejemplo, el procedimiento de cultivo para unión o crecimiento de condrocitos y el medio de transplante utilizado en el procedimiento de cultivo y/o la unión y/o el crecimiento de condrocitos se describen cada uno con detalle en lo siguiente, comenzando primero con una descripción de un procedimiento de laboratorio utilizado para procesar la biopsia de cartílago cosechada y para cultivar los condrocitos de acuerdo con la presente invención. Ejemplo 1 - Cosechado y crecimiento de condrocitos El medio de crecimiento (a continuación "el medio de crecimiento") utilizado para transportar y/o procesar la biopsia de cartílago durante el procedimiento de cultivo y para hacer crecer los condrocitos de cartílago, se prepara al mezclar juntos 2.5 mi de sulfato de gentomicina (concentración 70 µp?/1) , 4.0 mi de anfotericina (concentración 2.2 µ?t?/l; nombre comercial FungizoneMR, un antimicótico disponible de Squibb) , 15 ml/1 de ácido ascórbico (300 m/l) , 100 mi de suero bovino fetal (concentración final 20%) , y el resto de medio DMEM/F12 para producir aproximadamente 400 mi de medio de crecimiento. (El mismo _ medio de crecimiento también se utiliza para transportar la biopsia de cartílago del hospital al laboratorio en el cual se extraen y multiplican los condrocitos) . Para un implante autólogo, una biopsia de cartílago primero se cosecha por técnica artroscópica , por ejemplo a partir de un área de apoyo sin peso en una articulación del paciente y se transporta al laboratorio en un medio de crecimiento que contiene suero bovino fetal 20%. La biopsia de cartílago después se trata con una enzima tal como tripsina ' con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) , una enzima proteolítica y agente de unión, para aislar y extraer los condrocitos de cartílago del cartílago. Los condrocitos extraídos después se cultivan en el medio de crecimiento a partir de una cuenta de célula inicial de aproximadamente 50,000 células hasta una cuenta final de aproximadamente 20 millones de condrocitos o más. La sangre que se obtiene del paciente se centrifuga a aproximadamente 3,000 rpm para separar el suero de la sangre de los otros constituyentes de la sangre. El suero sanguíneo separado se guarda y se utiliza en una etapa posterior del procedimiento de cultivo y el procedimiento de transplante. La biopsia de cartílago previamente cosechada de un paciente para transplante autólogo se transporta en el medio de crecimiento descrito antes al laboratorio en donde se _ cultivará. El medio__ de^ crecimiento se decanta para separar la biopsia de cartílago y se desecha cuando llega al laboratorio. La biopsia de cartílago después se lava en DMEM/F12 puro por lo menos tres veces para separar la película de suero bovino fetal sobre la biopsia de cartílago. La biopsia de cartílago después se lava en una composición la cual incluye el medio de crecimiento descrito en lo anterior al cual se le ha agregado 28 mi de tripsina EDTA (concentración, 0.055). En esta composición, la biopsia de cartílago se incuba durante 5 a 10 minutos a 37°C y C02 5%. Después de incubación, la biopsia de cartílago se lava dos o tres veces en el medio de crecimiento, para limpiar la biopsia de cualquier enzima tripsina. Posteriormente el cartílago se pesa. Típicamente, la cantidad mínima de cartílago necesaria para hacer crecer condrocitos de cartílago es de aproximadamente 81-100 mg. Se prefiere una cantidad un poco más grande, tal como 200 ó 300 mg . Después de pesar, el cartílago se coloca en una mezcla de 2 mi de colagenasa (concentración 5000 unidades enzimáticas; una enzima digestiva) en aproximadamente 50 mi de medio DME /F12 puro y se tritura para permitir que la enzima digiera parcialmente el cartílago. Después de triturado, el cartílago triturado se transfiere a un frasco utilizando un embudo y se agregan al frasco aproximadamente 50 mi de la colagenasa y la mezcla DMEM/F12. El cartílago triturado después se incuba durante.17.. a 21.h a 37^C-..y_jC02; 5%~ ... .. .... .... En una modalidad, el cartílago triturado incubado después se filtra utilizando una malla de 40 ym, se centrifuga (a 1054 rpm o 200 veces la gravedad) , durante 10 minutos y se lava dos veces con medio de crecimiento. Después se cuentan los condrocitos para determinar su viabilidad, después de lo cual los condrocitos se incuban en el medio de crecimiento durante por lo menos dos semanas a 37 °C y C02 5%, tiempo durante el cual el medio de crecimiento cambia tres a cuatro veces.

Los condrocitos después se separan por tripsinizacion y centrifugación del medio de crecimiento y se transfieren a un medio de transplante que contiene 1.25 mi de sulfato de gentomicina (concentración, 70 pm/l) , 2.0 mi de anfotericina (concentración, 2.2 ym/l; nombre comercial FungizoneMR, un antimicótico disponible de Squibb), 7.5 mi de ácido 1-ascórbico (300 ym/l) , 25 mi de suero sanguíneo autólogo (concentración final, 10%) y el resto de medio DMEM/F12 para producir aproximadamente 300 mi de medio de transplante. Ejemplo 2 - Composición implantable Un material de soporte de elección, por ejemplo piezas esféricas reabsorbibles biocompatibles, una malla o cadenas se mezcla en un medio de transplante en una caja de petri estéril para "humedecer" el material de soporte con el medio de .transplante y en una modalidad, el material^ de soporte se puede poner en contacto con el medio de transplante durante 1 a 10 horas o más. Se agregan los condrocitos a la mezcla de medio de transplante de material de soporte. El medio de transplante puede ser medio de cultivo esencial mínimo 20% que contiene HAM F12 y amortiguador Hepes 15 mM y 10 a 20% de suero autólogo, la totalidad del cual está contenido en un incubador con C02 a 37°C. Después se permite que los condrocitos se unan y crezcan sobre o dentro el material de soporte durante un período de tiempo que varía de una hora a una semana, y en una modalidad, los condrocitos se mantienen a una temperatura de aproximadamente 37°C. Preferiblemente, los condrocitos se cultivan con el material de soporte durante la noche. En una modalidad, los condrocitos y el medio se agitan suavemente para permitir que los condrocitos se adhieran y crezcan en todos lados del material de soporte. En una modalidad alternativa, se agrega material de soporte adicional a los condrocitos y al cultivo de material de soporte durante la agitación para permitir la unión y crecimiento adicionales de los condrocitos en el material de soporte recién agregado. En algunas modalidades se puede agregar al cultivo entre 10 y 40 mg del material de soporte. En otras modalidades, la adición de material de soporte se puede repetir de 1 a 20 veces. Una vez que ha finalizado el período de _ cultivo, el cual puede . jiurar jie aprc^madamente . un día a aproximadamente seis semanas, el medio que contiene condrocitos se adhiere sobre o dentro del material de soporte y está listo para colocación (por eemplo por inyección) en un sitio defectuoso. En otra modalidad, durante el período de cultivo del material de soporte se puede disolver enzimáticamente (utilizando, por ejemplo colagenasa) y de esta manera se liberan las células. La enzima después se puede separar del cultivo y se puede agregar al cultivo celular material de soporte adicional .

El material de soporte agregado en etapas subsecuentes puede ser del mismo tipo de material de soporte o puede ser un tipo diferente de material de soporte. En una modalidad, las células se pueden transferir desde un material de soporte más pequeño (20 µ??) a uno más grande (400 µp?) . En otra modalidad, las células se pueden transferir de un material de soporte más grande a uno más pequeño. En otra modalidad adicional, las células se pueden transferir desde las piezas esféricas a las cadenas o a las obleas, o cualquier combinación de los anteriores que tengan el tamaño y el área superficial apropiados para facilitar el crecimiento celular. La etapa de transferencia se puede repetir de una a 20 veces. Ejemplo 3 - Composición implantable En otra modalidad, se suspenden .condrocitos en el medio ^y se pueden agregar directamente al_ material_de soporte sin "prehumedecimiento" del material de soporte. En este caso, se permite que los condrocitos se unan y crezcan sobre o dentro del material de soporte durante cierto período de tiempo, que varía de aproximadamente una hora a aproximadamente seis semanas. Preferiblemente, los condrocitos se cultivan con el material de soporte durante la noche. En una modalidad, el condrocito y el medio se agitan suavemente para permitir que los condrocitos se adhieran y crezcan en todos lados de material de soporte.

En una modalidad alternativa, se agrega material de soporte adicional (el material de soporte igual o diferente que el material de soporte original) durante el período de cultivo para expandir el cultivo celular. En otra modalidad, el material de soporte se describe primero mediante la utilización de enzimas tales como tripsina. Después, el material de soporte adicional que tenga un área superficial más grande que el material de soporte original que se ha destruido se agrega al cultivo celular. El procedimiento para destruir el material de soporte se puede repetir dos o más veces durante el período de cultivo. Una vez que el período de cultivo se ha completado, el medio que contiene al condrocito se adhiere y crece sobre o dentro el material de soporte y está listo para .la colocación en un sitio defectuoso. E emplo 4..- Prueba de materiales^ de_ soporte alternativos . . Se prueban diferentes materiales de soporte para determinar su capacidad para proporcionar soporte para unión y crecimiento de células, así como viabilidad celular. Se probaron los siguientes materiales de soporte: cadenas de colágeno de IMEDEX (aún no disponibles comercialmente) reticuladas con glutaraldehído (identificadas como "cadenas +" en las figuras 3 y 4) ; cadenas de colágeno reticuladas sin glutaraldehído (identificadas como "cadena-" en las figuras 3 y 4) como se describe en la publicación de patente de IMEDEX publicada 351,296 Al descrita antes; y piezas esféricas de colágeno reticuladas sin glutaraldehído (identificadas como "piezas esféricas" en las figuras 3 y 4) . Una membrana Chondro - Gi deMR (como un control positivo) , CR-1 y una membrana IMEDEXMR y sin membrana (como un control negativo) también se prueban como materiales de soporte comparativos. Las cadenas de colágeno se presionan para formar formas irregulares redondas (por ejemplo piezas esféricas de cadenas de una forma globular) , que tienen de manera general diámetros de aproximadamente 0.5 cm. Aunque las cadenas se presionan para formar una conformación globular, se les denomina en la presente como "cadenas". Las muestras de las piezas esféricas y de ambos tipos de cadenas se. pesan bajo condiciones -estériles -y se .colocan- en una placa de 12 pozos. En la tabla 1 se muestra el peso de estas muestras con el número de corrida experimental respectivo .

TABLA 1: Los materiales después se lavan con solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) y se verifica el pH de la solución de lavado__para...determinar -s-i-el -_-mat.er.ial -. de -sopor-te- -generó* un- -cambio en" "el*" valor"~de "pH. Se agrega medio (DME + suero bovino fetal (FCS, por sus siglas en inglés)) 20%) a cada uno de los pozos que contiene materiales de soporte y al pozo vacio (como se muestra en las figuras 3 y 4) . Se prepara una suspensión de condrocitos de acuerdo con técnicas de cultivo de células habituales y se agrega al pozo de control y los pozos que contienen los materiales de soporte. Los condrocitos se incuban con los materiales de soporte durante tres días a 37°C en el incubador de CO2. Después de tres días, el medio se separa de los pozos y los materiales de soporte se lavan con PBS . Después se agrega una solución de enzimas (0.25% de tripsina, 5,000 U/ml de colagenasa) a cada pozo y se incuba a 37°C con el fin de disolver el material de soporte. La disolución de cada muestra se determina microscópicamente y ante la disolución, la suspensión dentro del pozo se transfiere a un tubo de centrífuga. Los pozos después se enjuagan con DMEM y se transfieren al tubo de centrífuga. Las suspensiones se centrifugan durante diez minutos a 200 x g y el sobrenadante se desecha después. El sedimento restante se resuspende en 0.50 mi de DMEM y se cuentan las células. Como se muestra en la tabla 1, se realizan un total de 12 corridas en las esferas, 11 corridas en las cadenas sin glutaraldehído y 9 corridas en las cadenas con glutaraldehído>l. ,Los.--resu"l"tados~cLé~l'a "prüéb*a para el número, de. -céluxas y viabilidad después se promedian como se establece en lo siguiente y en las figuras 3 y 4. Los resultados indican que la mayor cantidad de células se cosechan del reticulado de cadenas sin glutaraldehído ("cadenas -"), como se muestra en la figura 3. La cantidad de células en las esferas es equivalente al control negativo y al control positivo (membrana Chondro- GideMR) y la cantidad de células en las cadenas reticuladas con glutaraldehído ("cadenas +") y la membrana CR-1 es sustancialmente menor. Además, los resultados indican que la viabilidad de condrocitos que crecen en las esferas, esferas reticuladas sin glutaraldehído y la membrana de Chondro-Gide" , son equivalentes para los condrocitos de control negativo, como se: muestra en la figura 4. La viabilidad de los condrocitos que crecen en las cadenas reticuladas con glutaraldehído y la membrana nuevamente es menor que los condrocitos que crecen sobre otros materiales de soporte, pero en todos los casos, se observa cierta retención y crecimiento de condrocitos. De manera más específica, y como se muestra en la figura 3, las diferencias en la cantidad de células cosechadas ' de los diferentes materiales portadoras es evidente. Las cantidades más grandes de células se obtienen de las cadenas reticuladas sin glutaraldehído ("cadenas -"). Se_ obti_enen-cantidades-''apróximadamente iguales de las piezas-esféricas" y en los experimentos de control positivos y negativos. Se cosecha un número más pequeño de células a partir de los pozos en los cuales las cadenas reticuladas con glutaraldehído ("cadenas +") o la membrana CR-1 es el portador . La figura 4 proporciona la viabilidad de las células cosechadas. Las cadenas reticuladas sin glutaraldehído ("cadenas -") resultan en células que tienen una viabilidad máxima de 94%, en promedio. El experimento de control positivo y negativo y las piezas esféricas muestran resultados similares de viabilidad celular de 92%, 89% y 92%, respectivamente. La viabilidad de las células cosechadas a partir de las cadenas reticuladas con glutaraldehído ("cadenas +") o sobre la membrana de CR-1 se reducen en aproximadamente 70%, en ambos casos. De manera adicional, para determinar el efecto de la reducción mecánica del tamaño de las cadenas sobre la viabilidad celular, las cadenas reticuladas con glutaraldehído se reducen de tamaño mecánicamente. En este experimento, sobre el promedio de viabilidad de las células que fueron cosechadas a partir de las cadenas que no han sido reducidas mecánicamente es de 65% y la viabilidad promediada de las células de las cadenas reducidas mecánicamente es de 78% . Este-estudio -comparativo~~démüestra la capacidad-del. material " "de" soporte microparticulado en forma de piezas esféricas y cadenas de colágeno, de manera general y tales piezas esféricas y cadenas reticuladas sin glutaraldehído particularmente, para soportar la unión y el crecimiento de condrocitos. La composición de piezas esféricas de colágeno-condrocitos y la composición de cadenas de colágeno-condrocitos, en cada caso, comprende una composición susceptible de fluir adecuada para la implantación de los condrocitos .

Ejemplo 5 - Adición de material de soporte En otro ejemplo con microesferas de colágeno, tres muestras de 40 mg de microesferas que tienen un área superficial de aproximadamente 0.3 mm2 por pieza esférica se preparan de las maneras descritas antes. Se agregan a cada una de las muestras 100,000 condrocitos. Las muestras se cultivan en medio de crecimiento durante tres días de la manera descrita en lo anterior. La primera muestra, se agregan 10 mg adicionales de microesferas. A la segunda muestra, se agregan 20 mg de microesferas. A la tercera muestra se le agregan 40 mg de microesferas a la muestra. Las muestras después se cultivan durante cuatro días adicionales a 37°C. Después de cuatro días, a la primera muestra se le muestras se cultivan después durante un día. Posteriormente se cuentan las células lo que proporciona 157,500 con 95% de viabilidad en la primera muestra (que se muestra en la figura 21), 347,500 células en la segunda muestra con 98% de viabilidad (que se muestra en la figura 22) y 325,000 células en la tercera muestra con 98% de viabilidad (que se muestra en la figura 23) . Este ejemplo indica la viabilidad de las células cultivadas sobre materiales de soportes y la proliferación de células después de agregar material de soporte adicional. Aunque esta invención se ha descrito con referencia a las modalidades específicas, es evidente que otras modalidades y variaciones de la invención se pueden considerar por las personas expertas en la técnica sin apartarse del verdadero espíritu y alcance de la invención. Las reivindicaciones anexas se pretende que se construyan para incluir la totalidad de tales modalidades y variaciones equivalentes. Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a cabo la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 5 1. Una composición implantable caracterizada porque es capaz de fluir y la cual comprende condrocitos retenidos adyacentes a un material de soporte .
2. 2. La composición implantable de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende un 10 adhesivo.
3. 3. La composición implantable de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el material de soporte es un material microparticulado sólido o semisólido.
4. 4. La composición implantable de conformidad con _15_ _la_ ^reivindicación--!*;7 carac eri"za"da porque el .material - de -··-·- - sopórteles biodegradable.
5. 5. La composición implantable de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el material biodegradable es colágeno. 20
6. 6. La composición implantable de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el material biodegradable es un colágeno reticulado.
7. 7. La composición implantable de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los condrocitos se 25 retienen sobre el material de soporte.
8. 8. La composición implantable de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los condrocitos se retienen en el material de soporte.
9. 9. Un método para producir una composición 5 implantable, caracterizado porque comprende: agregar condrocitos a un material de soporte, el material de soporte está configurado para retener condrocitos adheridos al mismo; y formar una mezcla fluible de condrocitos y material 0 de soporte.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la etapa de formación incluye mezclar un adhesivo con los condrocitos y el material de soporte . 5 _ ___-„
11. 11.;.-J.-:E1—- método"~ ' "de" ~ conformidad^. con— —la" =¦ reivindicación 9, caracterizado porque el método comprende además exponer los condrocitos y el material de soporte a condiciones ambientales que faciliten la adherencia de las células al material de soporte. 0
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el material de soporte es un material microparticulado sólido o semisólido.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el material de soporte 5 es biodegradable .
14. 14. La composición implantable de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el material biodegradable es colágeno.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque los condrocitos se retienen sobre el material de soporte.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque los condrocitos se retienen en el material de soporte.
17. 17. Un método para el tratamiento eficaz de un cartílago de superficie de articulación móvil por la inyección de una composición implantable de conformidad con la reivindicación 1 sobre una superficie a ser tratada, el método está caracterizado porque comprende las etapas de: ._ - -_---_-'(a-)= - col;oeár--;l """composición implantable sobre- Ta —- superficie que va a ser tratada; y (b) permitir que los condrocitos crezcan sobre la superficie y que formen el cartílago.