CN1653180A - 不受异亮氨酸抑制的苏氨酸操纵子的核苷酸序列以及使用包含其的转化的宿主细胞生产l－苏氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了第－56至－18位核苷酸片段的全部或部分缺失的大肠杆菌苏氨酸操纵子的核苷酸序列，包含上述核苷酸序列的重组载体、以及包含此重组载体的转化的宿主细胞。本发明还提供了生产L－苏氨酸的方法，包括培养转化的宿主细胞。

Description

不受异亮氨酸抑制的苏氨酸操纵子的核苷酸序列 以及使用包含其的转化的宿主细胞生产L-苏氨酸的方法
技术领域
本发明涉及第-56至-18位核苷酸片段的全部或部分缺失的大肠杆菌苏氨酸操纵子的核苷酸序列、包含上述核苷酸序列的重组载体、以及包含此重组载体的转化的宿主细胞。本发明还提供了生产L-苏氨酸的方法，包括培养转化的宿主细胞。
背景技术
L-苏氨酸是一种广泛用作饲料或食品添加剂的必需氨基酸。此外，L-苏氨酸还用做医学溶液或药物合成的原材料。
L-苏氨酸是使用由大肠杆菌(E.coli)、棒状杆菌(Corynebacteriasp.)、沙雷氏菌(Serratia sp.)、或普罗威登斯菌(Providencia sp.)野生型菌株衍生的突变型菌株通过发酵过程生产的。突变株的例子包括氨基酸类似物或药物抗性突变株，或者二氨基庚二酸、甲硫氨酸、赖氨酸或异亮氨酸的多种营养缺陷型(日本专利公开出版号Hei.2-219582；Appl.Microbiol.Biotechnol.，29：550-553，1988；韩国专利号1992-8365)。
利用重组菌株的发酵过程也可用于生产L-苏氨酸。日本专利公开出版号Hei.5-10076公布了使用沙雷氏菌的重组菌株大规模生产苏氨酸的方法，所述重组菌株包含具有天冬氨酸激酶、高丝氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、和苏氨酸合酶的遗传信息的DNA片段。此外，日本专利公开出版号Hei.1-289493还公开了使用由对甲硫氨酸代谢拮抗物抗性的普罗威登斯菌菌株衍生的基因大量生产L-苏氨酸的方法。
作为通过调控苏氨酸操纵子的表达来生产苏氨酸的方法，已经公开了用tac启动子取代苏氨酸操纵子的启动子(WO 98/04715)以及用大肠杆菌λ噬菌体的cI阻遏物和PR启动子取代苏氨酸操纵子的表达调控区(EP0593792B1)。
大肠杆菌的苏氨酸生物合成操纵子是由基因thrA、thrB、和thrC组成。thrA基因编码天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶，thrB基因编码高丝氨酸激酶，而thrC基因编码苏氨酸合酶。这些基因的前导序列和衰减子位于苏氨酸操纵子之前(Proc.Natl.Acad.Sci.America(1979)，76：1706-1710)。SEQ ID NO：1列出了包含前导序列、衰减子、和结构thr基因的苏氨酸操纵子的核苷酸序列的例子。SEQ ID NO：1第337-339位核苷酸的ATG密码子是苏氨酸操纵子的起始密码子。具体而言，苏氨酸操纵子的表达受到苏氨酸和异亮氨酸二者的胞内水平的调控。这与色氨酸操纵子的调控机制类似(J.Bacteriology(1975)，161-166)。
发明内容
为了构建不受苏氨酸或异亮氨酸抑制的苏氨酸生产菌株，本发明人通过提供包含缺陷型衰减子区的突变型苏氨酸操纵子而实现了本发明的目的。
因此，本发明提供了不受异亮氨酸抑制的苏氨酸操纵子的核苷酸序列。
本发明还提供了包含上述苏氨酸操纵子的核苷酸序列的重组载体。
本发明还提供了包含此重组载体的转化的宿主细胞。
本发明进一步提供了生产L-苏氨酸的方法，包括培养转化的宿主细胞。
依照本发明的一个方面，提供了第-56位至-18位39bp核苷酸片段的全部或部分缺失的大肠杆菌苏氨酸操纵子的核苷酸序列，此区域是苏氨酸操纵子结构基因的衰减子区。在此情况中，从起始密码子ATG的A(+1)开始的上游区的核苷酸序列编为负数，下游区的核苷酸序列编为正数。除非另有说明，否则核苷酸的编号方式如上文所定义。
依照本发明的另一个方面，提供了包含上述大肠杆菌苏氨酸操纵子的核苷酸序列的重组载体。此重组载体可以通过常规方法制备，包括用诸如ApaI和PstI的限制酶消化大肠杆菌苏氨酸操纵子和合适载体，然后进行连接。合适的载体可以是例如噬菌体、质粒、和粘粒。噬菌体和粘粒载体的例子包括pWE15、M13、λEMBL3、λEMBL4、λFIXII、λDASHII、λZAPII、λgt10、λgt11、Charon4A、和Charon21A。质粒载体的例子包括pBR系列、pUC系列、pBluescriptII系列、pGEM系列、pTZ系列、和pET系列。此外，还可以使用能够在诸如大肠杆菌和棒状杆菌的多种宿主细胞中复制的多种穿梭载体。优选的是，使用pECCG122(KFCC 10696)作为克隆载体，它已于1990年6月20日保藏于韩国微生物保存中心(KoreanFederation of Culture Collection，KFCC)。
依照本发明的另一个方面，提供了包含上述重组载体的新微生物。此微生物可以通过常规方法用重组载体转化宿主细胞来制备(Sambrook，J.等人，第二版，1989，冷泉港实验室出版社)。
宿主细胞可以是革兰氏阴性细菌。最优选属于埃希氏杆菌属的细胞。具体而言，依照本发明的优选实施方案，使用大肠杆菌KCCM 10236(韩国专利申请号2001-6976)作为宿主细胞。大肠杆菌KCCM 10236是甲硫氨酸营养缺陷型菌株，而且对苏氨酸类似物(AHV：α-氨基-β-羟基戊酸)、赖氨酸类似物(AEC：S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸)、异亮氨酸类似物(α-氨基丁酸)、和甲硫氨酸类似物(乙硫氨酸)有抗性。此外，大肠杆菌KCCM 10236还在染色体DNA中具有一个额外拷贝的磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因，而且thrA、thrB、和thrC基因中至少有一个以扩增状态存在，因而其L-苏氨酸产量提高。在本发明中，通过使用大肠杆菌KFCC 10236作为宿主细胞证实了上述重组载体的效果。大肠杆菌KFCC 10236已于2000年12月29日保藏于韩国微生物保存中心(KFCC)。
依照本发明的另一方面，提供了生产L-苏氨酸的方法，包括培养转化的宿主细胞并由培养物回收L-苏氨酸。优选的是，使用大肠杆菌KCCM10236/pTHR(+)作为转化的宿主细胞。
本发明生产L-苏氨酸的方法可以在常规条件下进行。虽然异亮氨酸和苏氨酸的胞内水平较高，但是L-苏氨酸的生产并未受到抑制。因此，L-苏氨酸的产量得到提高。
下文将通过实施例更具体的描述本发明。然而，下文实施例仅作举例说明目的，因而本发明不限于此。
实施例
实施例1显示了使用常规L-苏氨酸生产菌株时培养基中的异亮氨酸浓度与L-苏氨酸生物合成之间的关联。由实施例1的菌株克隆苏氨酸操纵子(下文简称为“thr操纵子”)的核苷酸序列(实施例2)。然后，在包含此克隆thr操纵子的pTHR(-)载体上诱发突变(实施例3)，并选择thr操纵子的表达不受异亮氨酸和苏氨酸抑制的菌株(实施例4)。最后，在实施例5中，对选定菌株的thr操纵子进行测序。结果是，thr操纵子中的部分衰减子缺失。
实施例1：培养基中的异亮氨酸浓度与L-苏氨酸生物合成之间的关联
在容积为30升的发酵罐中以补料—分批培养的方式培养大肠杆菌KCCM 10236菌株达77小时，将培养温度维持于32℃，培养pH值为6.5，且通气率为0.5至1.0vvm。使用自动化氨基酸分析仪测定最终培养基中的氨基酸组成和浓度。结果显示于表1。
                          表1
     大肠杆菌KCCM 10236培养基中的氨基酸组成和浓度
    氨基酸   浓度(g/l)     氨基酸   浓度(g/l)
    天冬氨酸     0.00     丙氨酸     0.10
    谷氨酸     1.20     酪氨酸     0.00
    天冬酰胺     0.00     甲硫氨酸     0.38
    丝氨酸     0.07     缬氨酸     0.73
    谷氨酰胺     0.00     苯丙氨酸     0.33
    组氨酸     0.00     异亮氨酸     0.67
    甘氨酸     0.00     亮氨酸     0.59
    苏氨酸     115.20     赖氨酸     0.00
    精氨酸     0.00
为了研究取决于L-异亮氨酸添加量的L-苏氨酸的生产力，将0至0.4g/l的L-异亮氨酸加到发酵培养基中，并将由此得到的培养基在摇瓶中保温48小时。结果显示于表2。
                             表2
    L-异亮氨酸的添加对大肠杆菌KCCM 10236的L-苏氨酸生产力的影响
  L-异亮氨酸的量(g/l)   L-苏氨酸的浓度(g/l)  L-苏氨酸的生产力(％)
         0          18.7         37.4
         0.05          16.8         33.6
         0.10          9.52         19.0
         0.20          8.26         16.5
         0.40          8.35         16.7
如表2所示，在常规苏氨酸生产菌株大肠杆菌KCCM 10236中，随着L-异亮氨酸的量的增加，L-苏氨酸的生产力迅速降低。
实施例2：在大肠杆菌KCCM 10236中克隆thr操纵子的核苷酸序列
由大肠杆菌KCCM 10236扩增并克隆thr操纵子。用于扩增thr操纵子的引物分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所列的thr-F和thr-R。使用GenBank数据库(NCBI)设计引物序列。
使用ExpandTM高保真PCR***(Boehringer Mannheim)扩增5447bp包含启动子区的thr操纵子。PCR反应混合物包含dNTP各200μM、引物各300nM、大肠杆菌KCCM 10236基因组DNA 0.1μg、含15mM MgCl2的1xExpand HF缓冲液、和ExpandTM高保真PCR***酶混合物2.6U。如下进行PCR反应以扩增thr操纵子：95℃5分钟，30个循环的95℃30秒、56℃30秒、以及68℃4分30秒。将PCR反应液于68℃维持10分钟，然后于4℃终止反应。将扩增得到的thr操纵子***克隆载体pGEM-T(Promega，美国)。然后，用包含thr操纵子的克隆载体转化大肠杆菌DH5α以获得pGEM-Thr载体。
用限制酶ApaI和PstI消化pGEM-Thr和pECCG(KFCC 10696)，然后使用常规方法连接thr操纵子和pECCG122载体。用连接产物转化大肠杆菌DH5α，得到pTHR(-)载体。根据序列分析，克隆得到的thr操纵子包含SEQ ID NO：1所列常规thr操纵子的核苷酸序列。
实施例3：THR(-)的突变
为了在thr操纵子上诱发突变，将2μg包含thr操纵子的pTHR(-)DNA溶于200μl含200-500μg/ml N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍的缓冲液(0.1M KH2PO4-1mM EDTA，pH6.0)中，并于37℃保温10-30分钟。使用常规酒精沉淀回收已诱发突变的载体，并用此回收载体转化大肠杆菌W3110(ATCC27325)。然后，将转化后的大肠杆菌W3110培养物涂布于含50mg/l卡那霉素的LB培养基上，以获得在LB培养基上生长的菌落。将菌落复制到含作为异亮氨酸类似物的异亮氨酸氧肟酸和作为苏氨酸类似物的α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)的选择性基本培养基平板上和不含这些类似物的对照基本培养基平板上。选择在选择性基本培养基平板上生长的菌株。复制平板三次后，选择了27个候选菌株。然后，将选定候选菌株再次接种到含作为异亮氨酸类似物的异亮氨酸氧肟酸和作为苏氨酸类似物的α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)的选择性基本培养基平板上，从而再次确认候选菌株在选择性基本培养基平板上的生长。
实施例4：测定不受异亮氨酸抑制的thr操纵子的核苷酸序列以及thr操 纵子对异亮氨酸的抗性
使用常规方法，由在实施例3中得到的27个候选菌株回收已诱发突变的pTHR(*)载体，然后用pTHR(*)载体转化苏氨酸生产菌株大肠杆菌KCCM 10236。将重组大肠杆菌KCCM 10236菌株涂布到含50mg/l卡那霉素的LB培养基上，以获得在LB培养基上生长的菌落。将得到的包含pTHR(*)载体的重组菌株共135株在表3的固体培养基上进行培养。然后，将每种培养物的一满环接种到含有表4的发酵培养基的摇瓶中，并培养48小时。分析L-苏氨酸的累积量。根据分析结果，与亲本菌株大肠杆菌KCCM 10236相比，有两种包含pTHR(*)的菌株生产苏氨酸的水平分别提高了14％和22％。具体而言，将由后一种菌株获得的pTHR(*)载体命名为pTHR(+)载体。在将pTHR(+)载体***大肠杆菌W3110(ATCC27325)后，将得到的菌株命名为大肠杆菌w3110/pTHR(+)，然后于2002年4月16日保藏于韩国微生物保存中心(KFCC)(保藏号KCCM-10371)。
为了测定重组菌株大肠杆菌KCCM 10236(pTHR)对L-异亮氨酸的抗性，检查含不同浓度L-异亮氨酸的培养基中的苏氨酸生产力。结果显示于表5。
             表3
  用于苏氨酸生产的固体培养基
    组成     浓度
    葡萄糖     2％
    硫酸镁     2mM
    氯化钙     0.1mM
    磷酸氢二钠     6g/L
    氯化钠     0.5g/L
    氯化铵     1g/L
    磷酸二氢钾     3g/L
    L-甲硫氨酸     0.1g/L
    L-异亮氨酸     0.1g/L
    酵母提取物     10g/L
    琼脂     18g/L
              pH7.2
              表4
  用于苏氨酸生产的液体培养基
    组成     浓度
    葡萄糖     50g/L
    酵母提取物     2g/L
    硫酸铵     17g/L
    硫酸镁     1g/L
    氯化钠     1g/L
    硫酸亚铁     0.01g/L
    硫酸锰     0.01g/L
    L-甲硫氨酸     0.7g/L
    微量元素     1ml/L
    L-异亮氨酸     50mg/L或200mg/L
    碳酸钙     30g/L
    磷酸二氢钾     0.3g/L
    磷酸钾，二价碱     0.6g/L
                               表5
       L-异亮氨酸浓度对包含pTHR(+)的大肠杆菌KCCM 10236中
                      L-苏氨酸生产力的影响
  L-异亮氨酸的量(g/l)   L-苏氨酸浓度(g/l)  L-苏氨酸的生产力(％)
         0         20.2         40.4
         0.05         18.2         36.4
         0.10         17.2         34.4
         0.20         17.5         35.0
         0.40         16.5         33.0
如表2和5所示，与亲本菌株大肠杆菌KCCM 10236相比，取决于L-异亮氨酸浓度增加的L-苏氨酸生产力的降低比率显著减小。由此可见，pTHR(+)载体包含用于L-苏氨酸生物合成的不受L-异亮氨酸抑制的突变型thr操纵子。
实施例5：突变位点的鉴定
为了鉴定实施例4中得到的thr操纵子中的突变位点，分析pTHR(+)载体中thr操纵子的核苷酸序列。为此进行PCR反应，以0.1mg pTHR(+)为模板，2mM thr-F(SEQ ID NO：3)为引物，再加入1μl BigDyeTMTerminator Cycle Sequencing v2.0 Ready Reaction(PE Biosystems)。PCR条件如下：95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃扩增30秒。30个循环后，于4℃终止反应。使用ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(AppliedBiosystems)测定扩增得到的核苷酸序列。根据分析的结果，发现位于结构性thr操纵子前面第-56至-18位的39bp核苷酸序列缺失。得到的thr操纵子核苷酸序列列于SEQ ID NO：2。
研究得到的thr操纵子中苏氨酸的生产力。为此，在装有用于苏氨酸生产的培养基的摇瓶中培养三种菌株：大肠杆菌KCCM 10236、大肠杆菌KCCM 10236/pTHR(+)、和大肠杆菌KCCM 10236/pECCG。评估各菌株的苏氨酸生产力。
具体而言，将三种菌株在含有表3用于苏氨酸生产的培养基的容器中于32℃培养过夜。将得到的每一种单菌落的一满环接种到25ml表4的培养基中，并于32℃以250rpm培养48小时。通过高效液相色谱(HPLC)检测产生的L-苏氨酸的浓度。结果显示于表6。
                            表6
       摇瓶中亲本菌株和选定重组菌株之间苏氨酸产量的比较
 异亮氨酸的浓度(mg/L)         菌株   苏氨酸的浓度(g/L)
         50  大肠杆菌KCCM 10236(亲本菌株)         16.9
        16.2
        16.5
 大肠杆菌KCCM10236/pECCG         16.8
        16.2
        16.5
 大肠杆菌KCCM10236/pTHR(+)         19.8
        20.2
        20.5
         200  大肠杆菌KCCM 10236(亲本菌株)         8.76
        8.39
        9.48
 大肠杆菌KCCM10236/pECCG         8.15
        9.06
        9.24
 大肠杆菌KCCM10236/pTHR(+)         16.1
        16.3
        16.6
如表6所示，与亲本菌株大肠杆菌KCCM 10236相比，重组菌株大肠杆菌KCCM 10236/pTHR(+)的苏氨酸生产力提高了22％。当存在高浓度(200mg/l)异亮氨酸时，亲本菌株大肠杆菌KCCM 10236的苏氨酸生产力降低了46％。另一方面，大肠杆菌KCCM 10236/pTHR(+)的苏氨酸生产力仅仅降低了18.9％。由此可见，包含本发明thr操纵子的菌株增强了对异亮氨酸抑制作用的抗性。
工业适用性
根据上文描述显而易见的是，本发明提供了第-56至-18位的39bp核苷酸片段的全部或部分缺失的大肠杆菌thr操纵子的核苷酸序列，此39bp区段是thr操纵子结构基因的衰减子区。此外，本发明还提供了包含thr操纵子的核苷酸序列的重组载体以及包含重组载体的转化的宿主细胞。
因此，即使存在异亮氨酸，本发明的转化的宿主细胞仍能大量生成L-苏氨酸。
    生物材料国际保藏和存活证明(译文)
保*** 第一制糖株式会社
地址 韩国 汉城市
保藏日 1990年7月3日
保藏号 KFCC-10696
生物材料分类命名 大肠杆菌DH5(pECCG 122保有)
国际保藏单位名称 韩国微生物保存中心
存活状态 □存活     □不存活
代理机构盖章
 生物材料国际保藏和存活证明(译文)
保*** 第一制糖株式会社
地址 韩国 汉城市
保藏日 2000年12月29日
保藏号 KCCM-10236
生物材料分类命名 pGmTN-PPC12
国际保藏单位名称 韩国微生物保存中心
存活状态 □存活     □不存活
代理机构盖章
  生物材料国际保藏和存活证明(译文)
保*** CJ株式会社
地址 韩国 汉城市
保藏日 2002年4月11日
保藏号 KCCM-10371
生物材料分类命名 大肠杆菌CJ1122
国际保藏单位名称 韩国微生物保存中心
存活状态 □存活     □不存活
代理机构盖章
                             序列表
<110>CJ株式会社
<120>不受异亮氨酸抑制的苏氨酸操纵子的核苷酸序列以及
     使用包含其的转化的宿主细胞生产L-苏氨酸的方法
<160>4
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>5020
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>1
agcttttcat tctgactgca acgggcaata tgtctctgtg tggattaaaa aaagagtgtc          60
tgatagcagc ttctgaactg gttacctgcc gtgagtaaat taaaatttta ttgacttagg         120
tcactaaata ctttaaccaa tataggcata gcgcacagac agataaaaat tacagagtac         180
acaacatcca tgaaacgcat tagcaccacc attaccacca ccatcaccat taccacaggt         240
aacggtgcgg gctgacgcgt acaggaaaca cagaaaaaag cccgcacctg acagtgcggg         300
cttttttttt cgaccaaagg taacgaggta acaaccatgc gagtgttgaa gttcggcggt         360
acatcagtgg caaatgcaga acgttttctg cgtgttgccg atattctgga aagcaatgcc         420
aggcaggggc aggtggccac cgtcctctct gcccccgcca aaatcaccaa ccacctggtg         480
gcgatgattg aaaaaaccat tagcggccag gatgctttac ccaatatcag cgatgccgaa         540
cgtatttttg ccgaactttt gacgggactc gccgccgccc agccggggtt cccgctggcg         600
caattgaaaa ctttcgtcga tcaggaattt gcccaaataa aacatgtcct gcatggcatt         660
agtttgttgg ggcagtgccc ggatagcatc aacgctgcgc tgatttgccg tggcgagaaa         720
atgtcgatcg ccattatggc cggcgtatta gaagcgcgcg gtcacaacgt tactgttatc         780
gatccggtcg aaaaactgct ggcagtgggg cattacctcg aatctaccgt cgatattgct         840
gagtccaccc gccgtattgc ggcaagccgc attccggctg atcacatggt gctgatggca         900
ggtttcaccg ccggtaatga aaaaggcgaa ctggtggtgc ttggacgcaa cggttccgac         960
tactctgctg cggtgctggc tgcctgttta cgcgccgatt gttgcgagat ttggacggac        1020
gttgacgggg tctatacctg cgacccgcgt caggtgcccg atgcgaggtt gttgaagtcg        1080
atgtcctacc aggaagcgat ggagctttcc tacttcggcg ctaaagttct tcacccccgc        1140
accattaccc ccatcgccca gttccagatc ccttgcctga ttaaaaatac cggaaatcct        1200
caagcaccag gtacgctcat tggtgccagc cgtgatgaag acgaattacc ggtcaagggc        1260
atttccaatc tgaataacat ggcaatgttc agcgtttctg gtccggggat gaaagggatg        1320
gtcggcatgg cggcgcgcgt ctttgcagcg atgtcacgcg cccgtatttc cgtggtgctg        1380
attacgcaat catcttccga atacagcatc agtttctgcg ttccacaaag cgactgtgtg        1440
cgagctgaac gggcaatgca ggaagagttc tacctggaac tgaaagaagg cttactggag        1500
ccgctggcag tgacggaacg gctggccatt atctcggtgg taggtgatgg tatgcgcacc        1560
ttgcgtggga tctcggcgaa attctttgcc gcactggccc gcgccaatat caacattgtc        1620
gccattgctc agggatcttc tgaacgctca atctctgtcg tggtaaataa cgatgatgcg        1680
accactggcg tgcgcgttac tcatcagatg ctgttcaata ccgatcaggt tatcgaagtg        1740
tttgtgattg gcgtcggtgg cgttggcggt gcgctgctgg agcaactgaa gcgtcagcaa        1800
agctggctga agaataaaca tatcgactta cgtgtctgcg gtgttgccaa ctcgaaggct       1860
ctgctcacca atgtacatgg ccttaatctg gaaaactggc aggaagaact ggcgcaagcc       1920
aaagagccgt ttaatctcgg gcgcttaatt cgcctcgtga aagaatatca tctgctgaac       1980
ccggtcattg ttgactgcac ttccagccag gcagtggcgg atcaatatgc cgacttcctg       2040
cgcgaaggtt tccacgttgt cacgccgaac aaaaaggcca acacctcgtc gatggattac       2100
taccatcagt tgcgttatgc ggcggaaaaa tcgcggcgta aattcctcta tgacaccaac       2160
gttggggctg gattaccggt tattgagaac ctgcaaaatc tgctcaatgc aggtgatgaa       2220
ttgatgaagt tctccggcat tctttctggt tcgctttctt atatcttcgg caagttagac       2280
gaaggcatga gtttctccga ggcgaccacg ctggcgcggg aaatgggtta taccgaaccg       2340
gacccgcgag atgatctttc tggtatggat gtggcgcgta aactattgat tctcgctcgt       2400
gaaacgggac gtgaactgga gctggcggat attgaaattg aacctgtgct gcccgcagag       2460
tttaacgccg agggtgatgt tgccgctttt atggcgaatc tgtcacaact cgacgatctc       2520
tttgccgcgc gcgtggcgaa ggcccgtgat gaaggaaaag ttttgcgcta tgttggcaat       2580
attgatgaag atggcgtctg ccgcgtgaag attgccgaag tggatggtaa tgatccgctg       2640
ttcaaagtga aaaatggcga aaacgccctg gccttctata gccactatta tcagccgctg       2700
ccgttggtac tgcgcggata tggtgcgggc aatgacgtta cagctgccgg tgtctttgct       2760
gatctgctac gtaccctctc atggaagtta ggagtctgac atggttaaag tttatgcccc       2820
ggcttccagt gccaatatga gcgtcgggtt tgatgtgctc ggggcggcgg tgacacctgt       2880
tgatggtgca ttgctcggag atgtagtcac ggttgaggcg gcagagacat tcagtctcaa       2940
caacctcgga cgctttgccg ataagctgcc gtcagaacca cgggaaaata tcgtttatca       3000
gtgctgggag cgtttttgcc aggaactggg taagcaaatt ccagtggcga tgaccctgga       3060
aaagaatatg ccgatcggtt cgggcttagg ctccagtgcc tgttcggtgg tcgcggcgct       3120
gatggcgatg aatgaacact gcggcaagcc gcttaatgac actcgtttgc tggctttgat       3180
gggcgagctg gaaggccgta tctccggcag cattcattac gacaacgtgg caccgtgttt       3240
tctcggtggt atgcagttga tgatcgaaga aaacgacatc atcagccagc aagtgccagg       3300
gtttgatgag tggctgtggg tgctggcgta tccggggatt aaagtctcga cggcagaagc       3360
cagggctatt ttaccggcgc agtatcgccg ccaggattgc attgcgcacg ggcgacatct       3420
ggcaggcttc attcacgcct gctattcccg tcagcctgag cttgccgcga agctgatgaa       3480
agatgttatc gctgaaccct accgtgaacg gttactgcca ggcttccggc aggcgcggca       3540
ggcggtcgcg gaaatcggcg cggtagcgag cggtatctcc ggctccggcc cgaccttgtt       3600
cgctctgtgt gacaagccgg aaaccgccca gcgcgttgcc gactggttgg gtaagaacta       3660
cctgcaaaat caggaaggtt ttgttcatat ttgccggctg gatacggcgg gcgcacgagt       3720
actggaaaac taaatgaaac tctacaatct gaaagatcac aacgagcagg tcagctttgc       3780
gcaagccgta acccaggggt tgggcaaaaa tcaggggctg ttttttccgc acgacctgcc       3840
ggaattcagc ctgactgaaa ttgatgagat gctgaagctg gattttgtca cccgcagtgc       3900
gaagatcctc tcggcgttta ttggtgatga aatcccacag gaaatcctgg aagagcgcgt       3960
gcgcgcggcg tttgccttcc cggctccggt cgccaatgtt gaaagcgatg tcggttgtct       4020
ggaattgttc cacgggccaa cgctggcatt taaagatttc ggcggtcgct ttatggcaca       4080
aatgctgacc catattgcgg gtgataagcc agtgaccatt ctgaccgcga cctccggtga       4140
taccggagcg gcagtggctc atgctttcta cggtttaccg aatgtgaaag tggttatcct       4200
ctatccacga ggcaaaatca gtccactgca agaaaaactg ttctgtacat tgggcggcaa       4260
tatcgaaact gttgccatcg acggcgattt cgatgcctgt caggcgctgg tgaagcaggc       4320
gtttgatgat gaagaactga aagtggcgct agggttaaac tcggctaact cgattaacat       4380
cagccgtttg ctggcgcaga tttgctacta ctttgaagct gttgcgcagc tgccgcagga       4440
gacgcgcaac cagctggttg tctcggtgcc aagcggaaac ttcggcgatt tgacggcggg       4500
tctgctggcg aagtcactcg gtctgccggt gaaacgtttt attgctgcga ccaacgtgaa       4560
cgataccgtg ccacgtttcc tgcacgacgg tcagtggtca cccaaagcga ctcaggcgac       4620
gttatccaac gcgatggacg tgagtcagcc gaacaactgg ccgcgtgtgg aagagttgtt       4680
ccgccgcaaa atctggcaac tgaaagagct gggttatgca gccgtggatg atgaaaccac       4740
gcaacagaca atgcgtgagt taaaagaact gggctacact tcggagccgc acgctgccgt       4800
agcttatcgt gcgctgcgtg atcagttgaa tccaggcgaa tatggcttgt tcctcggcac       4860
cgcgcatccg gcgaaattta aagagagcgt ggaagcgatt ctcggtgaaa cgttggatct       4920
gccaaaagag ctggcagaac gtgctgattt acccttgctt tcacataatc tgcccgccga       4980
ttttgctgcg ttgcgtaaat tgatgatgaa tcatcagtaa                             5020
<210>2
<211>4981
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>突变的苏氨酸操纵子序列
<400>2
agcttttcat tctgactgca acgggcaata tgtctctgtg tggattaaaa aaagagtgtc          60
tgatagcagc ttctgaactg gttacctgcc gtgagtaaat taaaatttta ttgacttagg         120
tcactaaata ctttaaccaa tataggcata gcgcacagac agataaaaat tacagagtac         180
acaacatcca tgaaacgcat tagcaccacc attaccacca ccatcaccat taccacaggt         240
aacggtgcgg gctgacgcgt acaggaaaca cagaaaaaag gtaacgaggt aacaaccatg         300
cgagtgttga agttcggcgg tacatcagtg gcaaatgcag aacgttttct gcgtgttgcc         360
gatattctgg aaagcaatgc caggcagggg caggtggcca ccgtcctctc tgcccccgcc         420
aaaatcacca accacctggt ggcgatgatt gaaaaaacca ttagcggcca ggatgcttta         480
cccaatatca gcgatgccga acgtattttt gccgaacttt tgacgggact cgccgccgcc         540
cagccggggt tcccgctggc gcaattgaaa actttcgtcg atcaggaatt tgcccaaata         600
aaacatgtcc tgcatggcat tagtttgttg gggcagtgcc cggatagcat caacgctgcg         660
ctgatttgcc gtggcgagaa aatgtcgatc gccattatgg ccggcgtatt agaagcgcgc         720
ggtcacaacg ttactgttat cgatccggtc gaaaaactgc tggcagtggg gcattacctc         780
gaatctaccg tcgatattgc tgagtccacc cgccgtattg cggcaagccg cattccggct         840
gatcacatgg tgctgatggc aggtttcacc gccggtaatg aaaaaggcga actggtggtg         900
cttggacgca acggttccga ctactctgct gcggtgctgg ctgcctgttt acgcgccgat         960
tgttgcgaga tttggacgga cgttgacggg gtctatacct gcgacccgcg tcaggtgccc        1020
gatgcgaggt tgttgaagtc gatgtcctac caggaagcga tggagctttc ctacttcggc        1080
gctaaagttc ttcacccccg caccattacc cccatcgccc agttccagat cccttgcctg        1140
attaaaaata ccggaaatcc tcaagcacca ggtacgctca ttggtgccag ccgtgatgaa        1200
gacgaattac cggtcaaggg catttccaat ctgaataaca 1ggcaatgtt cagcgtttct        1260
ggtccgggga tgaaagggat ggtcggcatg gcggcgcgcg tctttgcagc gatgtcacgc        1320
gcccgtattt ccgtggtgct gattacgcaa tcatcttccg aatacagcat cagtttctgc        1380
gttccacaaa gcgactgtgt gcgagctgaa cgggcaatgc aggaagagtt ctacctggaa        1440
ctgaaagaag gcttactgga gccgctggca gtgacggaac ggctggccat tatctcggtg        1500
gtaggtgatg gtatgcgcac cttgcgtggg atctcggcga aattctttgc cgcactggcc        1560
cgcgccaata tcaacattgt cgccattgct cagggatctt ctgaacgctc aatctctgtc        1620
gtggtaaata acgatgatgc gaccactggc gtgcgcgtta ctcatcagat gctgttcaat        1680
accgatcagg ttatcgaagt gtttgtgatt ggcgtcggtg gcgttggcgg tgcgctgctg        1740
gagcaactga agcgtcagca aagctggctg aagaataaac atatcgactt acgtgtctgc        1800
ggtgttgcca actcgaaggc tctgctcacc aatgtacatg gccttaatct ggaaaactgg        1860
caggaagaac tggcgcaagc caaagagccg tttaatctcg ggcgcttaat tcgcctcgtg        1920
aaagaatatc atctgctgaa cccggtcatt gttgactgca cttccagcca ggcagtggcg        1980
gatcaatatg ccgacttcct gcgcgaaggt ttccacgttg tcacgccgaa caaaaaggcc        2040
aacacctcgt cgatggatta ctaccatcag ttgcgttatg cggcggaaaa atcgcggcgt        2100
aaattcctct atgacaccaa cgttggggct ggattaccgg ttattgagaa cctgcaaaat        2160
ctgctcaatg caggtgatga attgatgaag ttctccggca ttctttctgg ttcgctttct        2220
tatatcttcg gcaagttaga cgaaggcatg agtttctccg aggcgaccac gctggcgcgg        2280
gaaatgggtt ataccgaacc ggacccgcga gatgatcttt ctggtatgga tgtggcgcgt        2340
aaactattga ttctcgctcg tgaaacggga cgtgaactgg agctggcgga tattgaaatt        2400
gaacctgtgc tgcccgcaga gtttaacgcc gagggtgatg ttgccgcttt tatggcgaat        2460
ctgtcacaac tcgacgatct ctttgccgcg cgcgtggcga aggcccgtga tgaaggaaaa        2520
gttttgcgct atgttggcaa tattgatgaa gatggcgtct gccgcgtgaa gattgccgaa        2580
gtggatggta atgatccgct gttcaaagtg aaaaatggcg aaaacgccct ggccttctat        2640
agccactatt atcagccgct gccgttggta ctgcgcggat atggtgcggg caatgacgtt        2700
acagctgccg gtgtctttgc tgatctgcta cgtaccctct catggaagtt aggagtctga        2760
catggttaaa gtttatgccc cggcttccag tgccaatatg agcgtcgggt ttgatgtgct        2820
cggggcggcg gtgacacctg ttgatggtgc attgctcgga gatgtagtca cggttgaggc        2880
ggcagagaca ttcagtctca acaacctcgg acgctttgcc gataagctgc cgtcagaacc        2940
acgggaaaat atcgtttatc agtgctggga gcgtttttgc caggaactgg gtaagcaaat        3000
tccagtggcg atgaccctgg aaaagaatat gccgatcggt tcgggcttag gctccagtgc        3060
ctgttcggtg gtcgcggcgc tgatggcgat gaatgaacac tgcggcaagc cgcttaatga        3120
cactcgtttg ctggctttga tgggcgagct ggaaggccgt atctccggca gcattcatta        3180
cgacaacgtg gcaccgtgtt ttctcggtgg tatgcagttg atgatcgaag aaaacgacat        3240
catcagccag caagtgccag ggtttgatga gtggctgtgg gtgctggcgt atccggggat        3300
taaagtctcg acggcagaag ccagggctat tttaccggcg cagtatcgcc gccaggattg        3360
cattgcgcac gggcgacatc tggcaggctt cattcacgcc tgctattccc gtcagcctga        3420
gcttgccgcg aagctgatga aagatgttat cgctgaaccc taccgtgaac ggttactgcc        3480
aggcttccgg caggcgcggc aggcggtcgc ggaaatcggc gcggtagcga gcggtatctc        3540
cggctccggc ccgaccttgt tcgctctgtg tgacaagccg gaaaccgccc agcgcgttgc        3600
cgactggttg ggtaagaact acctgcaaaa tcaggaaggt tttgttcata tttgccggct        3660
ggatacggcg ggcgcacgag tactggaaaa ctaaatgaaa ctctacaatc tgaaagatca        3720
caacgagcag gtcagctttg cgcaagccgt aacccagggg ttgggcaaaa atcaggggct        3780
gttttttccg cacgacctgc cggaattcag cctgactgaa attgatgaga tgctgaagct        3840
ggattttgtc acccgcagtg cgaagatcct ctcggcgttt attggtgatg aaatcccaca        3900
ggaaatcctg gaagagcgcg tgcgcgcggc gtttgccttc ccggctccgg tcgccaatgt        3960
tgaaagcgat gtcggttgtc tggaattgtt ccacgggcca acgctggcat ttaaagattt        4020
cggcggtcgc tttatggcac aaatgctgac ccatattgcg ggtgataagc cagtgaccat        4080
tctgaccgcg acctccggtg ataccggagc ggcagtggct catgctttct acggtttacc        4140
gaatgtgaaa gtggttatcc tctatccacg aggcaaaatc agtccactgc aagaaaaact        4200
gttctgtaca ttgggcggca atatcgaaac tgttgccatc gacggcgatt tcgatgcctg        4260
tcaggcgctg gtgaagcagg cgtttgatga tgaagaactg aaagtggcgc tagggttaaa        4320
ctcggctaac tcgattaaca tcagccgttt gctggcgcag atttgctact actttgaagc        4380
tgttgcgcag ctgccgcagg agacgcgcaa ccagctggtt gtctcggtgc caagcggaaa        4440
cttcggcgat ttgacggcgg gtctgctggc gaagtcactc ggtctgccgg tgaaacgttt        4500
tattgctgcg accaacgtga acgataccgt gccacgtttc ctgcacgacg gtcagtggtc        4560
acccaaagcg actcaggcga cgttatccaa cgcgatggac gtgagtcagc cgaacaactg        4620
gccgcgtgtg gaagagttgt tccgccgcaa aatctggcaa ctgaaagagc tgggttatgc        4680
agccgtggat gatgaaacca cgcaacagac aatgcgtgag ttaaaagaac tgggctacac        4740
ttcggagccg cacgctgccg tagcttatcg tgcgctgcgt gatcagttga atccaggcga        4800
atatggcttg ttcctcggca ccgcgcatcc ggcgaaattt aaagagagcg tggaagcgat        4860
tctcggtgaa acgttggatc tgccaaaaga gctggcagaa cgtgctgatt tacccttgct        4920
ttcacataat ctgcccgccg attttgctgc gttgcgtaaa ttgatgatga atcatcagta        4980
a                                                                        4981
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Thr-F引物序列
<400>3
ctggtcgact ggttacaaca acg
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Thr-R引物序列
<400>4
ggactaacgt aatttccgca gcc                                                23

Claims (9)

1.一段大肠杆菌苏氨酸操纵子的核苷酸序列，所述大肠杆菌缺失全部或部分衰减子。
2.依照权利要求1的核苷酸序列，其为SEQ ID NO：2中所示缺失39bp(第-56至-18位)的苏氨酸操纵子。
3.一种重组载体，其包含依照权利要求1或2的核苷酸序列。
4.依照权利要求3的重组载体，其中用于重组载体的克隆载体是由KFCC10696获得的pECCG122。
5.依照权利要求3的重组载体，其为pTHR(+)。
6.一种转化的宿主细胞，其包含依照权利要求3的重组载体。
7.依照权利要求6的转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌或棒状杆菌。
8.依照权利要求6的转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌KCCM 10236。
9.一种生产L-苏氨酸的方法，其包括：培养依照权利要求6的转化的宿主细胞和由所述培养物回收L-苏氨酸。
CNB038110598A 2002-05-15 2003-05-15 不受异亮氨酸抑制的苏氨酸操纵子的核苷酸序列以及使用包含其的转化的宿主细胞生产l－苏氨酸的方法 Expired - Lifetime CN1297665C (zh)

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