L-甲硫氨酸的发酵制造方法
技术领域
本发明涉及一种通过发酵制造L-甲硫氨酸的方法。
背景技术
氨基酸甲硫氨酸在动物饲养方面扮演着极重要的角色。甲硫氨酸是脊椎动物新陈代谢中不能以生物合成方式制造的若干必需氨基酸之一。因此,在动物饲养方面,必须确保饲料内摄入足量的甲硫氨酸。但,传统饲料植物(例如:大豆或谷物植物)内的甲硫氨酸含量经常太低(尤其对饲养猪和家禽而言),为确保最佳动物饲养,动物饲料内最好掺以甲硫氨酸作为添加物。甲硫氨酸对动物饲养的特别重要性亦可归诸于一项事实:除L-半胱氨酸(或L-胱氨酸)之外,甲硫氨酸是新陈代谢中的重要硫源。虽然动物新陈代谢可将甲硫氨酸转化成半胱氨酸,但该新陈代谢不能将半胱氨酸转化成甲硫氨酸。
在现有技术中,以化学合成法制造的甲硫氨酸,年产量>100,000吨。在此方法中,首先由丙烯醛与甲基硫醇反应生成3-甲基硫丙醛,继之该3-甲基硫丙醛再与氰化物、氨及一氧化碳反应生成乙内酰脲,该乙内酰脲最后可水解生成一消旋物(两种异构体D-及L-甲硫氨酸的等摩尔混合物)。因该分子的生物活性型仅代表L-型,饲料内所含的D-型者必须通过代谢脱氨作用及氨基转移作用首先转化成活性L-型者。
通过将消旋物分开或通过乙内酰脲酶以制造对映体纯L-甲硫氨酸的方法虽然已经公开,但由于其成本高,截至目前为止,该方法尚未应用于动物饲料工业。
与甲硫氨酸形成明显对比的是,目前绝大多数其他天然蛋白原氨基酸主要是通过微生物发酵制得。此处,是利用在微生物内以合成该天然氨基酸所用适当生物合成途径的可用性。再者,利用葡萄糖及矿物质盐类等廉价反应物,许多发酵法可将制造成本降至极低且可进一步制得有关具有生物活性的L-型氨基酸。
但,野生型菌株内氨基酸的生物合成途径受到严格的代谢控制以确保氨基酸的制造仅是供细胞自己使用。所以,有效制造方法的重要条件是能够获得在制造预期氨基酸方面产量大幅增加(与野生型微生物相比较)的适当微生物。
此类超量生产氨基酸的微生物可用传统突变/选择法及/或用新的特异性重组技术(代谢工程)制得。在重组技术中,由于其修饰、激活作用或失活作用,首先将可引起氨基酸超量生产的基因或等位基因加以识别。之后将该基因/等位基因引入一微生物菌株内或利用分子生物学技术将其加以失活,以便可实现最佳超量生产。但,经常仅结合数种不同方法才可实现真正有效生产。
在微生物内实施L-甲硫氨酸生物合成非常复杂。该分子的氨基酸本体(amino acid body)是衍生自L-天冬氨酸,该L-天冬氨酸是经由天冬氨酰半醛/天冬氨酰磷酸转化为L-高丝氨酸。继之以三个酶作用步骤,该步骤包括(经由O-琥珀酰高丝氨酸及胱硫醚)用一巯基(该巯基是来自一半胱氨酸分子)替代该分子上的羟基,而形成一高(同型)丝氨酸。在生物合成的最后步骤内,通过将该巯基加以甲基化最后制得L-甲硫氨酸。该甲基是衍生自丝氨酸代谢作用。
表面上,就其本身而言,甲硫氨酸是在微生物代谢作用中由天冬氨酸、丝氨酸及半胱氨酸等氨基酸合成,所以需要的生物合成远较其他氨基酸复杂。除主要合成途径(天冬氨酸-高丝氨酸-高半胱氨酸)之外,半胱氨酸生物合成及(因此)无机硫的繁复固定以及Cl代谢作用亦必须加以最佳协调。
基于这些理由,过去对L-甲硫氨酸的发酵制造法尚未非常深入地加以研究。但,近年来在丝氨酸及半胱氨酸代谢作用的最适化作用方面业已获得决定性的进步,因此L-甲硫氨酸的发酵制造目前亦显示务实状况。所以,在现有技术中最近亦曾述及朝此方向的初步研究工作。
有关L-甲硫氨酸的发酵制造方法,利用下列基因/等位基因可达成L-甲硫氨酸的超量生产,已经现有技术予以公开:
-如同一专利申请人于2002年10月11日所提专利申请内或日
本专利JP 2000139471A中曾述及的metA等位基因。此类
metA等位基因编码O-高丝氨酸转琥珀酰酶,该O-高丝氨酸
转琥珀酰酶受控于L-甲硫氨酸的减低的反馈抑制作用
(reduced feedback inhibition)。如此可导致O-琥珀酰高丝氨
酸的产生与细胞内的甲硫氨酸水平的广泛去偶联现象。
-如日本专利JP 2000139471A中所述的metJ缺失。metJ基因
编码甲硫氨酸代谢作用的中央基因调节子,因此在甲硫氨酸
生物合成基因表达的控制方面担任一重要角色。
现有技术同样提示确保L-丝氨酸及L-半胱氨酸的合成增加的已知方法对L-甲硫氨酸的制造具有正面影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种可使L-甲硫氨酸超量生产的微生物菌株。另一目的是提供一种通过本发明的微生物菌株以制造L-甲硫氨酸的方法。
前一个目的可通过由一起始菌株制得的、具有(与该起始菌株相比)增强的yjeH基因产物的活性或yjeH同系物基因产物的活性的微生物菌株而实现。
依照本发明,虽然该基因产物的比活性保持不变,若由于该细胞内基因产物的量增加而使该细胞的总活性增加则yjeH基因产物的活性亦增加,而且每个细胞yjeH基因产物的活性亦增加。
在基因组测序过程中经识别大肠杆菌yjeH基因是开放阅读框(布莱特纳等人,1997,科学杂志277:1453至1462)并编码一包括418个氨基酸的蛋白质。截至目前为止,尚不能确定该yjeH基因具有何种生理功能。以资料库搜寻具有序列同源性的蛋白质(GCG威斯康辛软件包FASTA演算法,遗传学电脑组(GCG)麦迪逊、威斯康辛)也仅能提供极少线索,这是由于其仅与功能同样未定的蛋白质才具有重要的相似之处。
yjeH基因及yjeH基因产物(yjeH蛋白质)的特征是:分别具有SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的序列。就本发明的范围而言,tjeH同系物应理解为序列相同性大于30%(优选大于53%)的基因,利用最佳拟合(BESTFIT)演算法分析(GCG威斯康辛软件包,遗传学电脑组(GCG)麦迪逊,威斯康辛)。特别优选为相同性大于70%的序列。
同样地,应该理解的是,yjeH-同源蛋白质是指序列相同性大于30%(优选大于53%)的蛋白质(最佳拟合演算法分析(GCG威斯康辛软件包,遗传学电脑组(GCG麦迪逊,威斯康辛)。特别优选为相同性大于70%的序列。
因此,yjeH同系物亦指yjeH基因的等位基因变体,尤其功能性变体,该变体是通过核苷酸的缺失、***或取代自SEQ ID NO:1内所描述的序列衍生者,但该特定基因产物的的活性保持不变。
yjeH基因产物活性较起始菌株增强的本发明的微生物可利用标准分子生物学技术产生。
原则上,具有L-甲硫氨酸生物合成途径、可使用重组物方法及可通过发酵培养的任何微生物均可作为适当的起始菌株。此类微生物可以是真菌、酵母或细菌。优选的细菌是真细菌***发育群(phylogenetic group of eubacteria)的细菌。特别优选的是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的微生物,尤其优选为大肠杆菌。
举例而言,通过yjeE基因的增强表达,可实现本发明微生物内yjeH基因产物活性的增加。由于适当启动子的作用,此种情形可涉及微生物内该yjeH基因的拷贝数增加及/或该yjeE基因的表达增强。优选地,表达增强是指该yjeH基因的表达强度至少是起始菌株内的两倍。
微生物内该yjeH基因的拷贝数可利用本领域人员已知的方法予以增加。因此,举例而言,可将该yjeH基因克隆入每个细胞具有多拷贝的质粒载体内(例如:大肠杆菌的pUC19、pBR322、pACYC184)并送入该微生物内。变通的方式是,该yjeH基因的多拷贝可整合在一微生物内的染色体中。可使用的整合方法是:附有温和噬菌体的已知***、整合性质粒或经由同源重组的整合(例如:汉弥尔顿等人,细菌学报171:4617至4622)。
以在启动子控制下将yjeH基因克隆入质粒载体内以增加拷贝数为佳。优选地,将一yjeH基因克隆在一pACYC衍生物例如pACYC184-LH(依照布达佩斯公约保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心,不伦瑞克,德国,1995年8月18日,编号为DSM 10172)内以增加大肠杆菌内拷贝数。
用以表达可以使用的质粒-编码yjeH基因的控制区是天然启动子及操纵子区域。
但,yjeH基因的增强表达尤其亦可通过其他启动子实现。适当的启动子***,例如:gapA基因的组成型甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子或大肠杆菌内的诱导型lac、tac、trc、λ、ara或tet启动子均是本领域已知者(麦克立德斯,1996,微生物评论,60:512至538)。该构建体可依照已知的方式用于质粒上或染色体上。
再者,增强表达可通过特定构建体上最适化序列内所含基固的起始信号(例如:核糖体结合部位)或起始密码子的翻译或者是通过用更经常出现的密码子替代依照“密码子用途”中稀少的密码子。
具有所述修饰的微生物菌株是本发明的优选实施方式。
举例而言,利用覆盖整个yjeH基因的特定引物,通过聚合酶链反应以特异性扩增作用及随后与载体DNA片段的连接作用将一yjeH基因克隆入质粒载体内。
用以克隆一yjeH基因的合适载体是已经含有用以增强表达的启动子,例如:大肠杆菌gapA基因的组成型甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子。
因此本发明还涉及一包括一附有启动子的yjeH基因的质粒。
进一步地,特别优选的是已经含有可造成对L-甲硫氨酸代谢的反馈抑制作用减弱的基因/等位基因的载体,例如一突变的metA等位基因(德国专利申请DE-A-10247437中曾述及)。使用该载体可由任何微生物菌株直接制备具有高氨基酸超量生产的本发明的微生物菌株,原因在于该质粒亦可减弱微生物内甲硫氨酸代谢的反馈抑制作用。
因此本发明涉及一种质粒,该质粒包括一用以去调节(deregulate)该甲硫氨酸代谢作用的遗传元件和一附有启动子的yjex基因。
利用一常用转化方法(例如:电穿孔作用)将含有yjeH的质粒送入微生物内,并通过对含有质粒的克隆的抗生素抗性加以选择。
因此本发明的另一内容涉及制备本发明微生物菌株的方法,该方法包括将本发明的质粒送入一起始菌株内。
用本发明质粒实施转化作用的特别优选的菌株的染色体具有可同样有利于L-甲硫氨酸制造的等位基因,例如:
-一metJ缺失(如日本专利JP 2000139471A中所述)或
-实现丝氨酸增产的等位基因,例如:反馈抗性(feedback-resistant)serA变体(例如:欧洲专利EP 0620853B1或EP 0931833 A2中所述)
-或实现半胱氨酸增产的基因,例如:反馈抗性cysE变体(例如:专利WO 97/15673中所述)。
L-甲硫氨酸的制造是通过本发明的微生物菌株、于一发酵罐内、依照已知方法实施。
因此本发明的另一内容是一种用以制造L-甲硫氨酸的方法,该方法包括:将本发明的微生物菌株用于发酵并将所制得的L-甲硫氨酸自发酵混合物内取出。
该微生物菌株在发酵罐中生长是采用连续培养(continuousculture)、分批培养(batch culture)或优选地为补料-分批培养(fed-batchculture)。最好在发酵过程中将碳源连续计量加入。
所用合适碳源是糖类、糖醇类或有机酸类。在本发明的方法中尤以使用葡萄糖、乳糖或甘油作为碳源更佳。
碳源以用适当速率计量加入,以使得发酵过程中发酵罐内的碳含量保持在0.1至50克/升范围内为佳,尤以保持在0.5至10克/升范围内更佳。
本发明方法中所用合适氮源是氨、铵盐类及蛋白质水解产物。若用氨校正pH恒定器,在发酵过程中此氦源是以规律间隔计量加入。
可添加的其他培养基添加物是:磷、氮、钠、镁、氮、钾、钙、铁等元素的盐类,及微量(亦即微摩尔浓度)铝、硼、钴、锰、锌及镍等元素的盐类。
该培养基内亦可添加有机酸类(例如:乙酸、柠檬酸)、氨基酸(例如:亮氨酸)及维生素(例如,B1、B12)。
举例而言,可用的复合营养物源是:酵母萃取液、玉米浆、大豆粉或麦芽萃取液。
嗜常温微生物的保温温度以15至45℃为佳,尤以30至37℃更佳。
发酵以在需氧生长情况下实施为佳。氧气是通过压缩空气或通过纯氧送入发酵罐内。
在发酵过程中,发酵培养基的pH以5.0至8.5为佳,尤以7.0更佳。
在制造L-甲硫氨酸的发酵过程中可补入一硫源。优选使用硫酸盐类或硫代硫酸盐类。
依照所述方法发酵的微生物,在生长阶段后,会以分批方式或补料-分批方式分泌L-甲硫氨酸至培养基内,历时10至150小时。
所制L-甲硫氨酸可通过分离氨基酸的适当方法自发酵液内获得(例如:离子交换法、结晶法等)。
兹利用下列实施例对本发明作进一步说明。该菌株W3110ΔJ/pKP450是依照布达佩斯公约,以编号DSM 15421、作为具有一附有yjeH基因的质粒、并适合于根据本发明进行L-甲硫氨酸的制造的细菌菌株寄存在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ),D-38142不伦瑞克,德国。
具体实施方式
实施例1:基本载体pKP228的克隆
为将yjeH基因置于组成型启动子控制之下,首先构建一含有大肠杆菌甘油醛3-脱氢酶所用gapA基因组成型GAPDH启动子的基本载体,为达成此目的,使用引物
GAPDHfw:(SEQ ID NO:3)5’GTC G
AC GCG TGA GGC GAG TCA GTC GCG TAA TGC 3’
Mlu I
GAPDHrev1:(SEQ ID NO:4)5’GAC C
TT AAT TAA GAT CTC ATA TAT TCC ACC AGC TAT TTG TTA G 3’
Pac I Bgl II
及大肠杆菌菌株W3110(ATCC27325)的染色体DNA聚合酶链反应。通过琼脂糖凝胶电泳将所制DNA片段加以纯化并随后予以分离出来(奇亚快速凝胶萃取试剂盒,奇亚根公司出品,希尔顿,德国)。之后,用限制酶PacI及MluI将该片段加以处理并克隆入载体pACYCl84-LH内,同样地用PacI/NluI(1995年8月18日以编号DSM10172,依照布达佩斯公约保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ),不伦瑞克)进行裂解。该新构建体定名为pKP228。实施例2:yjeH基因的克隆
通过聚合酶链反应将来自大肠杆菌W3100菌株的yjeH基因加以扩增。使用寡核苷酸
yjeH-fw:(SEQ ID NO:5)
5’-ATT GCT GGT TTG CTG CTT-3’
yjeH-rev:(SEQ ID NO:6)
5’-AGC ACAAAATCG GGT GAA-3’作为特异性引物及使用大肠杆菌菌株W3110(ATCC27325)的染色体DNA作为模板。所制DNA片段用琼脂糖凝胶电泳法(奇亚快速凝胶提取试剂盒,奇亚根公司出品,希尔顿,德国)加以纯化及分离。克隆的实施是通过与一BglII-裂解的pKP228载体(其5’-突出端是利用Klenow酶补平)的钝端连接作用。所述过程是以适当方式将该yjeH基因置于该GAPDH启动子的下游,以使得转录作用自该处引发。所制载体是定名为pKP450。
实施例3:yjeH基因与一反馈抗性metA等位基因的组合
通过聚合酶链反应利用模板pKP466(在专利申请DE-A-10247437述及)及引物
metA-fw:(SEQ ID NO:7)
5”-CGC
CCA TGG CTC CTT TTA GTC ATT CTT-3’
NcoI
metA-rev:(SEQ ID NO:8)
5’-CGC
GAG CTC AGT ACT ATT AAT CCA GCG-3’
SacI
将2002年10月11日同一专利申请人的专利申请DE-A-10247437曾述及的编码一反馈抗性O-高丝氨酸转琥珀酰酶的metA等位基因加以扩增。
在该程序中产生限制核酸内切酶NcoI及SacI的末端裂解部位。所得DNA片段是用相同的核酸内切酶加以消化、纯化及克隆入该NcoI/SacI裂解的pKP450载体内。所制质粒定名为pKP451。
为制备一含有metA等位基因但不含yjeH基因的对照质粒,将该yjeH基因自pKP451缺失。为达成此目的,用Ecl1 36II及PacI将pKP451加以裂解,突出端用Klenow酶加以消化掉并将该载体再连接起来。如此制得的质粒定名为pKP446AC。实施例4:染色体metJ突变的产生
通过聚合酶链反应利用引物
metJ-fw:(SEQ ID NO:9)
5’-GAT CGC GGC CGC TGC AAC GCG GCA TCA TTAAAT TCG A-3’
metJ-rev:(SEQ ID NO:10)
5’-GAT CGC GGC CGC AGT TTC AAC CAG TTAATC AAC TGG-3’及来自大肠杆菌W3110(ATCC27325)的染色体DNA将基因metJ/B加以扩增。用限制核酸内切酶NotI将该包括3.73kb的片段加以纯化、消化并克隆入该NotI-裂解的pACYC184-LH载体内(请参阅实施例1)。继之在内部的AflIII-裂解部位将一卡那霉素抗性盒***metJ基因内。为达成此目的,继之利用Klenow酶通过产生钝端用AflIII实施消化作用。进而通过PvuII限制作用自载体PUK4K(亚美夏姆药物生物技术公司出品,佛莱堡,德国)制得卡那霉素抗性盒并经由连接作用将其***该metJ基因。之后通过NotI限制作用自如此所制的pKP440载体制得呈直线型片段的metJ::kan盒并依照威南斯等人的方法(细菌学报1985,161:1219至1221)以染色体的方式整合在recBC/sbcB菌株JC7623(大肠杆菌基因储存中心CGSC5188)内。在一最后步骤内,通过Pl转导作用(米勒,1972,冷泉港实验室,纽约,第201至205页)最后将该metJ::kan突变转导入W3110(ATCC27325)野生型菌株,因而产生菌株W3110ΔJ。
验证该metJ::kan***作用之后,总是用载有yjeH的质粒或对照质粒将W3110ΔJ菌株加以转化,继之用四环素选择对应转化株。实施例5:用于发酵的生产菌株(producer strain)的预培养物
将20毫升LB培养基(10克/升胰蛋白胨、5克/升酵母萃取液、10克/升NaCl)(其中另含有15毫克/升四环素)与该生产菌株接种并于一振荡器内在150转/分钟及温度30℃的情况下加以保温以制得发酵用的预培养物。7小时之后将该整个混合物转移至100毫升SM1培养基(12克/升K2HPO4;3克/升KH2PO4;5克/升(NH4)2SO4;0.3克/升MgSO4×7H2O,0.015克/升CaCl2×2H2O;0.002克/升FeSO4×7H2O;1克/升柠檬酸钠×2H2O;0.1克/升NaCl;1毫升/升微量元素溶液,其中包括0.15克/升Na2MoO4×2H2O;2.5克/升Na3BO3;0.7克/升CoCl2×6H2O;0.25克/升CuSO4×5H2O;1.6克/升MnCl2×4H2O;0.3克/升ZnSO4×7H2O),补充以5克/升葡萄糖;0.5毫克/升维生素B1及15毫克/升四环素。继之在温度30℃及150转/分钟的情况下实施保温17小时。
实施例6:L-甲硫氨酸的发酵制造
所用发酵罐是德国梅尔松根市勃朗生物技术公司出品的BiostatB仪器,其最大培养物体积容量为2升。将含有900毫升SM1培养基(补充以15克/升葡萄糖,10克/升胰蛋白胨,5克/升酵母萃取液,3克/升Na2S2SO3×5H2O,0.5毫克/升维生素B1,30毫克/升维生素B12及15毫克/升四环素)的发酵罐与实施例5内所述预培养物接种(在600nm处的光密度:约为3)。在发酵过程中,将温度调节至32℃并通过计量加入25%氨水将pH保持在7.0恒定不变。用消毒过的压缩空气、在5体积/体积/分钟速率下将该培养物通以气体并在转速为400转/分钟的情况下加以搅拌。待氧饱和度减至50%之后,经由一控制装置将转速增至高速1500转/分钟以保持50%氧饱和度(用在900转/分钟情况下校正至100%饱和度的PO2探针测定的)。当发酵罐内葡萄糖含量由初始的15克/升降至约5至10克/升时,立即计量加入56%葡萄糖溶液。实施补料的流速为6至12毫升/小时,且发酵罐内的葡萄糖浓度是保持在0.5至10克/升恒常不变。葡萄糖是利用YSI(黄泉公司,俄亥俄州,美国)出品的葡萄糖分析仪测定。发酵时间为48小时,的后将试样取出,并通过离心作用将该细胞自培养基中分离出来。通过反相高压液相色谱法、在一LUNA 5μ C18(2)柱上(费诺门奈克斯公司,阿夏芬堡,德国),以流速0.5毫升/分钟,将所得培养物上清液加以分析。用稀释的磷酸(0.1毫升浓磷酸/升)作为洗脱液。培养物上清液内所得L-甲硫氨酸的含量如表1所示。
表1:
菌株 |
基因型(质粒) |
L-甲硫氨酸[克/升] |
W3110ΔJ/pKP228 |
- |
<0.1克/升 |
W3110ΔJ/pKP450 |
YjeH |
0.8克/升 |
W3110ΔJ/pKP451 |
MetAfbr yjeH |
4.8克/升 |
W3110ΔJ/pKP446AC |
MetAfbr |
0/9克/升 |
fbr:反馈抗性
序列表
<110>电化学工业有限公司(国际)
<120>L-甲硫氨酸的发酵制造方法
<130>yjeH
<140>
<141>
<160>10
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>1652
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(141)..(1394)
<400>1
agcacaaaat cgggtgaaaa ccctgattca cctcacattt catcgcaatt tcttcatcgc 60
cgtcataagc gaatctgatt gtgctaccat cgaaaatcta cgcagttgcc caaaatttgg 120
gcgcaatcgg acatcaaccc atg agt gga ctc aaa caa gaa ctg ggg ctg gcc 173
Met Ser Gly Leu Lys Gln Glu Leu Gly Leu Ala
1 5 10
cag ggc att ggc ctg cta tcg acg tca tta tta ggc act ggc gtg ttt 221
Gln Gly Ile Gly Leu Leu Ser Thr Ser Leu Leu Gly Thr Gly Val Phe
15 20 25
gcc gtt cct gcg tta gct gcg ctg gta gcg ggc aat aac agc ctg tgg 269
Ala Val Pro Ala Leu Ala Ala Leu Val Ala Gly Asn Asn Ser Leu Trp
30 35 40
gcg tgg ccc gtt ttg att atc tta gtg ttc ccg att gcg att gtg ttt 317
Ala Trp Pro Val Leu Ile Ile Leu Val Phe Pro Ile Ala Ile Val Phe
45 50 55
gcg att ctg ggt cgc cac tat ccc agc gca ggc ggc gtc gcg cac ttc 365
Ala Ile Leu Gly Arg His Tyr Pro Ser Ala Gly Gly Val Ala His Phe
60 65 70 75
gtc ggt atg gcg ttt ggt tcg cgg ctt gag cga gtc acc ggc tgg ctg 413
Val Gly Met Ala Phe Gly Ser Arg Leu Glu Arg Val Thr Gly Trp Leu
80 85 90
ttt tta tcg gtc att ccc gtg ggt ttg cct gcc gca cta caa att gcc 461
Phe Leu Ser Val Ile Pro Val Gly Leu Pro Ala Ala Leu Gln Ile Ala
95 100 105
gcc ggg ttc ggc cag gcg atg ttt ggc tgg cat agc tgg caa ctg ttg 509
Ala Gly Phe Gly Gln Ala Met Phe Gly Trp His Ser Trp Gln Leu Leu
110 115 120
ttg gca gaa ctc ggt acg ctg gcg ctg gtg tgg tat atc ggt act cgc 557
Leu Ala Glu Leu Gly Thr Leu Ala Leu Val Trp Tyr Ile Gly Thr Arg
125 130 135
ggt gcc agt tcc agt gct aat cta caa acc gtt att gcc gga ctt atc 605
Gly Ala Ser Ser Ser Ala Asn Leu Gln Thr Val Ile Ala Gly Leu Ile
140 145 150 155
gtc gcg ctg att gtc gct atc tgg tgg gcg ggc gat atc aaa cct gcg 653
Val Ala Leu Ile Val Ala Ile Trp Trp Ala Gly Asp Ile Lys Pro Ala
160 165 170
aat atc ccc ttt ccg gca cct ggt aat atc gaa ctt acc ggg tta ttt 701
Asn Ile Pro Phe Pro Ala Pro Gly Asn Ile Glu Leu Thr Gly Leu Phe
175 180 185
gct gcg tta tca gtg atg ttc tgg tgt ttt gtc ggt ctg gag gca ttt 749
Ala Ala Leu Ser Val Met Phe Trp Cys Phe Val Gly Leu Glu Ala Phe
190 195 200
gcc cat ctc gcc tcg gaa ttt aaa aat cca gag cgt gat ttt cct cgt 797
Ala His Leu Ala Ser Glu Phe Lys Asn Pro Glu Arg Asp Phe Pro Arg
205 210 215
gct ttg atg att ggt ctg ctg ctg gca gga tta gtc tac tgg ggc tgt 845
Ala Leu Met Ile Gly Leu Leu Leu Ala Gly Leu Val Tyr Trp Gly Cys
220 225 230 235
acg gta gtc gtc tta cac ttc gac gcc tat ggt gaa aaa atg gcg gcg 893
Thr Val Val Val Leu His Phe Asp Ala Tyr Gly Glu Lys Met Ala Ala
240 245 250
gca gca tcg crt cca aaa att gta gtg cag ttg ttc ggt gta gga gcg 941
Ala Ala Ser Leu Pro Lys Ile Val Val Gln Leu Phe Gly Val Gly Ala
255 260 265
tta tgg att gcc tgc gtg att ggc tat ctg gcc tgc ttt gcc agt crc 989
Leu Trp Ile Ala Cys Val Ile Gly Tyr Leu Ala Cys Phe Ala Ser Leu
270 275 280
aac att tat ara cag agc ttc gcc cgc ctg gtc tgg tcg cag gcg caa 1037
Asn Ile Tyr Ile Gln Ser Phe Ala Arg Leu Val Trp Ser Gln Ala Gln
285 290 295
cat aat cct gac cac tac ctg gca cgc ctc tct tct cgc cat atc ccg 1085
His Asn Pro Asp His Tyr Leu Ala Arg Leu Ser Ser Arg His Ile Pro
300 305 310 315
aat aat gcc ctc aat gcg gtg ctc ggc tgc tgt gtg gtg agc act ttg 1133
Asn Asn Ala Leu Asn Ala Val Leu Gly Cys Cys Val Val Ser Thr Leu
320 325 330
gtg att cat gct tta gag atc aat ctg gac gct ctt att att tat gcc 1181
Val Ile His Ala Leu Glu Ile Asn Leu Asp Ala Leu Ile Ile Tyr Ala
335 340 345
aat ggc atc ttt att atg att tat ctg tta tgc atg ctg gca ggc tgt 1229
Asn Gly Ile Phe Ile Met Ile Tyr Leu Leu Cys Met Leu Ala Gly Cys
350 355 360
aaa tta ttg caa gga cgt tat cga cta ctg gcg gtg gtt ggc ggg ctg 1277
Lys Leu Leu Gln Gly Arg Tyr Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Leu
365 370 375
tta tgc gtt ctg tta ctg gca atg gtc ggc tgg aaa agt ctc tat gcg 1325
Leu Cys Val Leu Leu Leu Ala Met Val Gly Trp Lys Ser Leu Tyr Ala
380 385 390 395
ctg atc atg ctg gcg ggg tta tgg ctg ttg ctg cca aaa cga aaa acg 1373
Leu Ile Met Leu Ala Gly Leu Trp Leu Leu Leu Pro Lys Arg Lys Thr
400 405 410
ccg gaa aat ggc ata acc aca taatccggcg tttcgacatt aatcctggcg 1424
Pro Glu Asn Gly Ile Thr Thr
415
atcgtcttta tgatcaaggc ggtcgcgctc atcatccttt cgctggtact caccatcaaa 1484
agtattaccg ccaccggtcc cggcgctaaa accgccgcca ggcatgcgag aaaagcgcaa 1544
atgcggcatc aacttcactg tcagatgctt ttgcaccggc ggcaataaaa gtagaagacc 1604
gaggaagtcg gtaaaaaagc ccggtaataa aagcagcaaa ccagcaat 1652
<210>2
<211>418
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>2
Met Ser Gly Leu Lys Gln Glu Leu Gly Leu Ala Gln Gly Ile Gly Leu
1 5 10 15
Leu Ser Thr Ser Leu Leu Gly Thr Gly Val Phe Ala Val Pro Ala Leu
20 25 30
Ala Ala Leu Val Ala Gly Asn Asn Ser Leu Trp Ala Trp Pro Val Leu
35 40 45
Ile Ile Leu Val Phe Pro Ile Ala Ile Val Phe Ala Ile Leu Gly Arg
50 55 60
His Tyr Pro Ser Ala Gly Gly Val Ala His Phe Val Gly Met Ala Phe
65 70 75 80
Gly Ser Arg Leu Glu Arg Val Thr Gly Trp Leu Phe Leu Ser Val Ile
85 90 95
Pro Val Gly Leu Pro Ala Ala Leu Gln Ile Ala Ala Gly Phe Gly Gln
100 105 110
Ala Met Phe Gly Trp His Ser Trp Gln Leu Leu Leu Ala Glu Leu Gly
115 120 125
Thr Leu Ala Leu Val Trp Tyr Ile Gly Thr Arg Gly Ala Ser Ser Ser
130 135 140
Ala Asn Leu Gln Thr Val Ile Ala Gly Leu Ile Val Ala Leu Ile Val
145 150 155 160
Ala Ile Trp Trp Ala Gly Asp Ile Lys Pro Ala Asn Ile Pro Phe Pro
165 170 175
Ala Pro Gly Asn Ile Glu Leu Thr Gly Leu Phe Ala Ala Leu Ser Val
180 185 190
Met Phe Trp Cys Phe Val Gly Leu Glu Ala Phe Ala His Leu Ala Ser
195 200 205
Glu Phe Lys Asn Pro Glu Arg Asp Phe Pro Arg Ala Leu Met Ile Gly
210 215 220
Leu Leu Leu Ala Gly Leu Val Tyr Trp Gly Cys Thr Val Val Val Leu
225 230 235 240
His Phe Asp Ala Tyr Gly Glu Lys Met Ala Ala Ala Ala Ser Leu Pro
245 250 255
Lys Ile Val Val Gln Leu Phe Gly Val Gly Ala Leu Trp Ile Ala Cys
260 265 270
Val Ile Gly Tyr Leu Ala Cys Phe Ala Ser Leu Asn Ile Tyr Ile Gln
275 280 285
Ser Phe Ala Arg Leu Val Trp Ser Gln Ala Gln His Asn Pro Asp His
290 295 300
Tyr Leu Ala Arg Leu Ser Ser Arg His Ile Pro Asn Asn Ala Leu Asn
305 310 315 320
Ala Val Leu Gly Cys Cys Val Val Ser Thr Leu Val Ile His Ala Leu
325 330 335
Glu Ile Asn Leu Asp Ala Leu Ile Ile Tyr Ala Asn Gly Ile Phe Ile
340 345 350
Met Ile Tyr Leu Leu Cys Met Leu Ala Gly Cys Lys Leu Leu Gln Gly
355 360 365
Arg Tyr Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Leu Leu Cys Val Leu Leu
370 375 380
Leu Ala Met Val Gly Trp Lys Ser Leu Tyr Ala Leu Ile Met Leu Ala
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Gly Leu Trp Leu Leu Leu Pro Lys Arg Lys Thr Pro Glu Asn Gly Ile
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Thr Thr
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gatcgcggcc gcagtttcaa ccagttaatc aactgg 36