CN1635121A - 鸭瘟疱疹病毒转移载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的是一种鸭瘟疱疹病毒转移载体及其克隆方法。它是利用兼并PCR克隆鸭瘟疱疹病毒UL24、TK和gH基因,在获得以上3个基因序列的基础上,利用PCR克隆鸭瘟疱疹病毒TK基因及其侧翼共2.9kb的DNA序列,将其亚克隆入克隆载体pUC18,构建重组质粒pUC-TK2.9,将1acZ基因表达盒***载体pUC-TK2.9中的TK基因内,构建成的鸭瘟疱疹病毒重组转移载体pUC-TK2.9-1acZ。本产品可用来构建鸭瘟疱疹病毒基因缺失疫苗。可用来构建重组活载体疫苗。
Description
(一)技术领域
本发明涉及的是一种基因工程制品的制备方法,具体地说是一种鸭瘟疱疹病毒转移载体以及它的制备方法。
(二)背景技术
在我国,鸭、鹅是重要的经济禽类。近几年来,养鸭、养鹅在我国的某些地区发展迅速,将成为继养鸡业后第二个实现资源配置和利润合理化的产业。目前,传染病仍然是危害鸭、鹅养殖业健康、持续发展的重要因素之一,加强对鸭、鹅传染病的防治显得尤为重要。鸭瘟是由鸭瘟疱疹病毒引起的鸭、鹅的急性、败血性传染病,以成年鸭、鹅常见,发病率、死亡率高,在我国被列入动物二类传染病。目前国内外防治鸭、鹅传染病仍使用传统的疫苗进行预防接种,与其它疾病的防治手段相比,相对落后。
随着DNA重组技术的发展和利用,基因工程疫苗的研究取得了快速发展,其中重组病毒活载体疫苗成为当前新型疫苗的研究热点。重组病毒活载体疫苗是以病毒作为载体,在真核细胞中表达外源基因,它在病毒病的防治等方面展现了广阔的前景,其中以疱疹病毒作为病毒载体的研究近年来十分活跃。与传统疫苗相比,重组病毒活载体疫苗具有使用安全、免疫力持久、接近动物自然感染的方式,多价苗还可以达到一针预防多病的目的。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种鸭瘟疱疹病毒转移载体及其制备方法。
本发明的产品是是利用兼并PCR克隆鸭瘟疱疹病毒UL24、TK和gH基因,在获得以上3个基因序列的基础上,利用PCR克隆鸭瘟疱疹病毒TK基因及其侧翼共2.9kb的DNA序列,将其亚克隆入克隆载体pUC18,构建重组质粒pUC-TK2.9,将lacZ基因表达盒***载体pUC-TK2.9中的TK基因内,构建成的鸭瘟疱疹病毒重组转移载体pUC-TK2.9-lacZ。
本发明产品中的(1)鸭瘟疱疹病毒TK基因及其侧翼序列的大小为8481个碱基,即8481bp,包含鸭瘟疱疹病毒完整的UL24基因、TK基因、gH基因和UL25、UL21基因的部分序列;鸭瘟疱疹病毒UL24基因大小为1230bp,编码409个氨基酸;TK基因大小为1077bp,编码358个氨基酸;gH基因大小为2505bp,编码834个氨基酸。
本发明产品的核酸序列为:
AGGCCCCGTTCGTATTGCAAAGCTACCGCATCATGTGTCGTTAGTACCTCTTGAATAGGTA
CAGATATAGTCTTAGACCTGTTTTGCAATTCGACCGCAATGAGTCGCAAAAGGGCAGCCT
GGGCTCTATTCGTTGACACGTCTAAGACATGGCGTGTAGCATTTTGTGTTTTTATGTTACGT
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GTACTGCACCTGGCAACAACGTTCCGATCTGAAAATTATTACACATGCGATCCGCATAGAC
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TCTATAAAATTATCCAAATAAGCAGGTAGCTGCTCCACCATTCCTATAGCACTAGACGCGT
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TATCGCGCACTCTAGAGCTGTATAATGACGGACTCTTAAATACAAGCGCCCAGTGGCCTGT
AGTGATACTATAGCAGTAGTCATAAACGTTTTGGACTGCCGTCCATCGCGCTGGTCTAACC
GTTTGGACACAACAGGCCACTCAGTAATCAAACCGTCTTGGAGAGCTTTATACCAAGTAC
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TTCGCGCCTTTCATCATTAGAATCACTTGTTTCTCCCAATTTATCCCCATCGCCGTCTTGTC
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AAACGCATTTCTAATTCGGCTGATATACAGTTATTCTTGATGCTTAAATGATCCAACGCCG
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GTTTCTGTAATAATGCACTAGTGTTTAGTTGGTCTGAATATGGATGCTACAAATCGCAATA
CTCCACCGCCTATTTGTGTCTCTGTATCGCTACAATTAATATCACTGTCTGATGCGACGCCA
TGCTTGCCATCATAACCGTATTCTCCATTAATACCATCTATATTCGTTTTGGGTTCTTCAGT
ATTGTTTAGTCCTGTATTTGTCTGTGGTGTAACCAACTGCCCATAACCCCATAGTCGCAAT
AGTCGTACGCTATGGATCCCAGTTGCATTGCCGTGTGGTATGTTCTCGCCTGCCGCAGAAC
TCGTCCCGACGCCTGGCGAAAATTCTTCCCACCAGCGTTTTTTCGCAAGACTGGAAGAATT
TTCGCTGGGTGTACGAGCACATGTCGGGTTCATAATGGCATCATCGATGTCGTCTTTGTCG
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TACATTTAGCCTTCCGGCGCTTACCTTTGGTAGGTATATGATATTCTGATAAACCTGCAAT
AGAGGCTGATAATGCCGCAAAGTTGGAGGATACGCGCCGATGAGCAAATCGTGTAATTCG
GAGTATGTCCAGACCGCGCTGGGCTACAAATACTAGCAACGGACATATTAAAAATTGACT
GCATCCAGGGGGCATGATACGTTCCAACAAGATGGCCGATTCCATCAATTGTCTAATTCCA
GTCCATGTTTGCTGTTGTTTACTTCCTGTTGTCATATTTTTTACAAACTTGCAAGTCTTGAGT
TCCAAAATAATACATATGACATCTGCAGTTTCTGCCTCGCCTGTCTTAATCATGCATATGC
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AAGTGTCTGCAAAGACAGAGTGTGTTCGAATAGCCGCACAATCAGTTTACTGGGCGATCC
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GCGCACTCCAGCTTTGAGGCGACGTGCGACTGAACCGGACGTGTTGGCATCGGTTCGTCTC
TTGGATCCTGCTACGCGTCTACAAGGCCGCTGTTCCGCGTTCTTAAGTGCGGCTGTCGTCG
CTGCGCCAATACATTTCCGATCAAATGTCACTGCGCGACTCTTGCGAACGCTTAATCCGGC
GCGCTTTTTCTGTACCTTCGATGCCATTATGCCTCGTCCGCGTATACCTAGACGGGCCGTAT
GGAACTGGCAAAACCACAACTGGCAAACTGTTGTCGGAGGATACCCTTGCAGCCACTCTT
TATGTTGCCGAGCCAATGGCGTATTGGAGAAATCATTTTGAAGATGTAATAAAGGGCGTA
TACGAAACACAGGAAAGAAAAGCTCGAGGTGACATAGCAACAACTGACGCAAAAGCAAT
TACGGCTGCTCTTCAACTGCAATTTTTCGCACCATACAGTTCCTTTCATACATATGCATCGA
CGTTATTTGGAGTCGAAGCGCCAGAAAGAACACCACCAGATATTACGCTCATAACTGATC
GGCACCCGACCGCCGCATGTCTTTGCTTCCCAGCAGCTCGTTTTGTAGTGGGGGATATGAG
CCTTAATACTCTATTGGCTATGATATCCCTAATTCCTCGCGAACCCCATGGTGGAAATATA
GTAATAATGGATTTGAATGAAGATGAGCATCTTGAACGATTGAGAGCTCGCCAACGTCCT
GGCGAAGCAATTGACGTACGCTTCTTGCGCGTATTACATAATATATATAAGATGTTTGTTA
ATACAATTTGGTATGCCAAACAAGCACCAATAATGTGGGACTGTGATAAATGGGACAAAG
ATTGGAGCTCGGTCCCAATATTTGATGACGATAGAAAGAAAATGTTAGAAGCGCGTGATT
CAGTGCCTATTGTTGGTGGGAAAGAACGGCCAAGTCCATCAACGACTCTCTTGTCACTGTT
CAAAGTACCTGAACTATGTGACGAATCATTTAGACTGCGTAAAGTCCATGAATGGAATCT
GAGATGCGCATTAATTAAGTTGGCGGATTTGAATGCATATTTTATGGACATAAGTGGCAA
GAGCCCCCAAGAGTGTGCCGCTGAAGTACGAGAGGCAACTAACGCGATGGACTTTACGCG
CCTATCTTTTACCATGGCCGAGGATCTGGAACAAGCTGTTAACCAATACAATACCGAGATG
ACAATTAATTGATAAATATATTTGTTTTAAATAAAGCTCTGATGGGCGGTTCTGAAACTAT
GACGCATATGTGTGTTTATTGCCTGCCACATTTGTAAATGCACGCCTTCGCTACTCCCTATT
TGTTTTACTGTTTGGAGACAGTTAGTATATGTTCACGCGAGAATATAATGCGCCATTCCGC
CGAGAGGACCTAGGCGAGCTTTCTGGGACCTCACCGCGGAGCTAGTTTTCTCTACGCGGCC
GCGGTTCTGTCCCAGGTAAAGCTAACCGGCCAACTTTAGAATGTCGCAGCTTACGGTGCTA
ATATATACAGTCATAGTTTTTGAGGTTGTAAGTGCGGCGTGGATAGGTGTCGGGGAAGAA
GATATGAGTTTAAACTTTACTCATCACGTTATATCGCCAGATGTTCTTCGCCATGCCTTTAC
AGGAATAGTAACGGACAGTGGACCAACTGGGCGTAGCACATCTACAATTCATGTATCGTC
GGTTCTCGGCGCGCCGTACGGAATAAATTCCACCGATCTGAGTAATCTAAAATGGATACA
TGCAACCACAATATTCTTCTTCGTTACCAACCCCAAAGGAACGAAGTTTACAGGTACTTTG
CTATTCGTACCTAGAGAAGCGGGCATAAAATTCAGATCAATTGACTATCCTGACAGCGTTA
TGCTTGCGTCGCCCAATTTTGCACGTTCTCTAGCATGTTCTGCAACGCCGGATAATTTATCA
GAATATGGAAAGATAAAACTTAAAGAACACGTCGACGATATAAAACATGTACGTCCTGTT
CGGCCCAAGCCCAGTGGCTCAAATCCTCCAAAGGACATTGCTAAAATTTCATTTTCTGACA
TACTCCGTCCTTCCGAAGCATTTTTTGATCCCAAAACGCTCCTACCATCAGCACTGGAAAT
CACACGCTTCGTGGATCCACTGGCCTCAGTTTGGCCAGTAGACTATTATAAGACGGCGGA
ATTACGTTTTGGAACTGATCGCGCGGAAGCTGTGGCCAATATTGGAGACACCTTTATGACA
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AGACATGACAGAACTTGGAGCCATTACAGCAGAAGTGTTGGAGCCACAGAACCATATATC
AGAAGGACATCTACAACTTCTATTAATGTTATCCAATGCACAAGAAGAAGACGATGTTTA
TTTCTGGAGACGAATCGTTACACGTGTTGCTTTGATTGCATTTTCTTTCATAACTGAATCAA
GTTCTTCCAAGTTTACAAGTCTGGAGGACTACATAGCAACGGACTTAAATACACGCTTCCT
TGCAACCGCTGTGTGTAAAACTGCATTAACTGGAGACCCTGATACATTTTTTATGCGAACT
GGATTAACATTATCCGAGAAGGCTACCAGTATATTAACTACACGGGTCATAGAATTGGTA
GACGACATACATCGTAAGAGTGATTATGGCAAGCGCGAACCACTAGAAGAAGTACTAAAT
GTACTGCGCCTTGGGTATGGTCTGGCCGGCGATAAACGCCTAGACTCTGCACTAGATAAG
CTCTCAACATCACTTATAAGTAACTTATATTCCGACATCGTAATGCTGCACATGGGATGGA
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TAGCATGGTGAGGGCTCGTTTTGTACTTCTGCTACTAACATCAATGTGTACTGATATACAT
GCGGCCTCTATAAATGTAAACCTGCAAGAAATATTCATTAGCGTTACTGATCGCGGCAATG
ATTTCAGTATGCTGGACCTATTTTCTCCATGTGCCACAGCATTGCGATACGACACACATGA
AGGAATACATAAACTATACGTGCTTAGTTCAATTCCTGATAGGTTACGCCTCGTCGCGGCT
CTAAAATCAGACAAAGATGGAGGAATACATAAAGAAGATAACCTAAATATGCGTGCTGA
GAGGACTATAGGACGCTGGAGGAATCAGGACATAACTGCGATAAAACACTTCCTTCCCGA
ATTATTTGACTGTGGAGAAAGGTTAAATCTGTCGCCAGATAATGGCCTTGTTATGTTGCTG
CCATTGACCCCCAACGGCACTTTTATTATTTCCAGACATTTCCTAGACGTCGGTGTAACAT
ATCGCATTCTAGGCGTAGATGTTAACAACCCTTTATATATAACATTTAAACATGCCGGGTG
TTCGTCCTCTAGTTCCAATATTGCGTCAGTACAACTTCCGCGACCAGGAACAAATACAGAG
TGTCTGTACTGTGGGTGTGTAATCATGCGTTATACATCCACCGGAGCGGTTTTGTATTCTGT
ATATATAGCCGATCTGGCCATGCAGCGCGAATTTATGGCCGGGATAAATTCTTCCACTCCA
TTTTTCAATCCTGCATCATTTGGGGGTGCAGAATCATTACTATTATTTCCTAACGGAACAAT
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ATAGCGGTTGGGGGTATGGCTGTTGCCGTACTTGTCTTTTATGGGATAATTAAACTGATGT
GTAATCTAATTAGAAATGGGGACTTAAAAGAACTGTTAAGCAATGAAGAATGATTTTATA
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AATTTTGCGTAATTTCATAACCAAAAGGATTTCGGTTAATCTAATACATATTGCCCTTCGA
CCCATCATATACGTCCACATTGCCTCAAGTGTTTGCGTCATTGAAACACACAGACTATCAT
TAATTATGACCAATTTCAGTAAACTATTCAAATATATGATCCCGTATACATAACTGATATA
TTAGAATCTTTACTGATATAAATACTAAAACACATTACCCTAATAGACCGGCGTTTTTTAA
GCGGCGATCAATTAACGCGCCAAGTGTCAAAACACCCTTTTGAATATCACATTTTTCATCA
AATATTGACGAGCACATCGCGTCAATTGTAGCGTTTAATATATACGAGTTCCCAAAACATC
TATCAGTGCGTATTGCCGTCTTCATTAAATCATTAGTCGTATAAATTTCTGCGATTATTGAA
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TCGGTAGCCATTTCAAATAACGTTTCTGCATCATCCATCACCGAATCATCTTCATCTGTTGC
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AGATTCGCGAAAAAGTCTATTTGTCGTATCTACTAGCAAATGTATATCTCTGGGCGGTTCT
GGAAACGATTCCGAGTCCGCGCTTAGACTTACGCATAAATGCTCTATGATTGGGTAACAAT
TTGGATAGCCGCCTTTACACAATATATACTGAACCAGCGCAAACTTTTGTGCGCTAGAAAC
TGAACGTCCCATGGAATAACCAACGAATAGTTCCCCAATGTTGCCAAAAGATGCTTCTATT
GCATCGCCAATTCTAGCTCTAGCGTCATTAAATTCGGGTTCGAGACCAAACCAAGTACTAA
TATCCTGAGAGACTACATCCCCAATCCTACAAAATACGGTCCAAAGGGCCCCAAGCGATC
GCGTAGGTTTGAAATTACCGGCACCATATTCCCATATATTAAGCACAGCGGGAATGTATTT
TACTTGCACAAATGAACTGACAGTAGTTTTGCGTGCGCCGCGACGTGAATGTTTTCGAGAA
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GATGTCGCTCGCCATGTCCATGCTTTACCAATACTGTTCCGAAGGAGCGCTTGCCAGTAAT
TATTACATCTGTTTGTTTTGTTTCTTCTCGTACTCCCCTACGTCGAACGGCTATGCGATCAA
ATAGTCCATCGACCATAGCGGCAAGTGACTGCGGCAATGATGTAAGACGCGCCTGCATGA
GCGCAAATGCATTCCTATTTGGTTCGTAAATAAAACCAGAACTTGCATTAGTAATAATTGG
TACATCATATAATTTGATAACTTGATAGTTCGAAAATATATGACCCGTTGATAATATCAGG
CCTGACGATATTTCGAGTGAACCATATACTCAGCGATACACTGGTCGCGAACTTCAACCTC
AAGCGCCCCGCACAAACGAAGTAAGC
本发明鸭瘟疱疹病毒转移载体pUC-TK2.9-lacZ是利用基因工程技术,利用兼并PCR克隆鸭瘟疱疹病毒UL24、TK和gH基因,在获得以上3个基因序列的基础上,利用PCR克隆鸭瘟疱疹病毒TK基因及其侧翼共2.9kb的DNA序列,将其亚克隆入克隆载体pUC18,构建重组质粒pUC-TK2.9,将lacZ基因表达盒***载体pUC-TK2.9中的TK基因内,构建鸭瘟疱疹病毒重组转移载体pUC-TK2.9-lacZ。
采用本发明的方法生产的产品可用于:
①本产品可用来构建鸭瘟疱疹病毒基因缺失疫苗。
②本产品可用来构建重组活载体疫苗。
本发明的产品优点表现在:
①所克隆用于构建转移载体的TK基因及其侧翼序列目前在国内外尚未见报道。
②构建的转移载体为构建重组鸭瘟疱疹病毒搭建一物质平台。
③应用此转移载体可以构建多种重组活载体疫苗,预防鸭鹅等相关禽类的多种传染病。
(四)具体实施方案
上述已对本发明的产品作了具体地描述,本发明的产品可以采用这样的方法来制备:
1)设计扩增UL24、TK和gH基因的引物
根据鸭瘟疱疹病毒UL25、UL24、TK、gH和UL21基因的保守序列,设计兼并引物。
位于TK基因内的兼并引物DP1和DP2:
DP1:5′TCTCGAC(T)GGA(G,C,T)GCA(G,C,T)C(T)AC(T)GG 3′
DP2:5′GCGATTGGA(G)TGG(C,T)CG(T)A(G)TC 3′
位于UL24基因内的兼并引物
DP3 5′CGGCACGA(T)C(T)TTC(T)AA(G)C(T)TC 3′
位于gH基因内兼并引物:DP4 5′ATCATCGTACCA(G)TTAGG 3′
位于UL25基因内兼并引物:
DP5 5′AGGCCCTIT(G)TTCG(A)TAT(C)TG 3′
位于UL21基因内兼并引物:
DP6 5′GCTTAC(T)TTC(T)A(G,C,T)T A(G,C,T)TA(G)C(T)GG A(G,C,T)GG 3′
2)通过PCR扩增获得UL24、TK和gH基因的序列
利用设计合成的引物,通过5次兼并PCR分别克隆TK基因的保守序列、TK基因的上游侧翼序列FUL24-TK、FUL24-TK的上游序列FUL25-UL24、TK基因的下游侧翼序列FTK-gH和FTK-gH的下游侧翼序列FgH-UL21,将以上5个片段拼接,共得到8481bp的DNA序列,序列分析表明该序列含有完整的UL24、TK和gH基因。
3)PCR扩增TK基因及其侧翼序列(FTK2.9)
根据所得DNA序列的结果,设计2条引物:
上游引物为5′CCGGAATTCATTTGTCTGTGGTGTAAC 3′,
下游引物为5′CCCAAGCTTAGTGCTGATGGTAGGAG 3′,使用这两条引物,通过PCR克隆大小为2.9kb的PCR产物FTK2.9。
4)重组载体pUC-TK2.9的构建
将FTK2.9通过EcoRI和HindIII酶切位点亚克隆入克隆载体pUC18,形成重组质粒pUC-TK2.9。
5)转移载体pUC-TK2.9-lacZ的构建
将载体pUC-TK2.9用HpaI内切酶切开,并且用小牛碱性磷酸酶去磷酸化。用PstI和EcoRI内切酶酶切质粒pSV-β-Galactosidase,切出lacZ表达盒,并且用T4DNA聚合酶将黏性末端补平。将线性化的pUC-TK2.9和lacZ表达盒平端相连接,构建重组转移载体pUC-TK2.9-lacZ。
Claims (4)
1、鸭瘟疱疹病毒转移载体,其特征是:它是利用兼并PCR克隆鸭瘟疱疹病毒UL24、TK和gH基因,在获得以上3个基因序列的基础上,利用PCR克隆鸭瘟疱疹病毒TK基因及其侧翼共2.9kb的DNA序列,将其亚克隆入克隆载体pUC18,构建重组质粒pUC-TK2.9,将lacZ基因表达盒***载体pUC-TK2.9中的TK基因内,构建成的鸭瘟疱疹病毒重组转移载体pUC-TK2.9-lacZ。
2、根据权利要求1所述的鸭瘟疱疹病毒转移载体,其特征是:(1)鸭瘟疱疹病毒TK基因及其侧翼序列的大小为8481个碱基,即8481bp,包含鸭瘟疱疹病毒完整的UL24基因、TK基因、gH基因和UL25、UL21基因的部分序列;鸭瘟疱疹病毒UL24基因大小为1230bp,编码409个氨基酸;TK基因大小为1077bp,编码358个氨基酸;gH基因大小为2505bp,编码834个氨基酸。
3、根据权利要求1或2所述的鸭瘟疱疹病毒转移载体,其特征是:其核酸序列为:
AGGCCCCGTTCGTATTGCAAAGCTACCGCATCATGTGTCGTTAGTACCTCTTGAATAGGTA
CAGATATAGTCTTAGACCTGTTTTGCAATTCGACCGCAATGAGTCGCAAAAGGGCAGCCT
GGGCTCTATTCGTTGACACGTCTAAGACATGGCGTGTAGCATTTTGTGTTTTTATGTTACGT
GCATCCAAACAAAGAGCTACGAGACCAGGAAACATCTGTGTTATCTCAGTTTGCGGATCA
GCTGCATATAATGAAGCCATATAACGCTCGCAAAGGAACGCGAAATTGCGATTATCGCTT
TTCATGGTTTGGGCCCCCGCGGCCCCGCCATTGGACGCGCCGCGATTTAAGCGATCAGATG
GTACTGCACCTGGCAACAACGTTCCGATCTGAAAATTATTACACATGCGATCCGCATAGAC
ATTCGTATTCCATAATAATTTTCGCATGAGTATCAGTGATGTTATGGTATTTATAGTGGCGC
GTAGCTGAGTTATATCCTCCATAAGAAATAGAGGTTGGGCTCTCCCAAATACGGCCCCGG
CAGCTTTATTTACCTCATCTACATAAGCTCGTTGACTCTTATCAACATCCCTCGCAAGTCCA
TCTGGGGCGGCTACGCCAGGAGACAGCGGCAACACACCATGTTTTATAAGCATAGCTAGA
ACACAATGACCAGAAAGGGCAATTCGTTCCCCACTTCTGGGTTGGATGGCAAACTGACCC
TTAGGTAATCTATCCATATCAAACCTATAACACAAGCGACCGCAATCGGAGGCGAGACGT
TCTATAAAATTATCCAAATAAGCAGGTAGCTGCTCCACCATTCCTATAGCACTAGACGCGT
AGTTAAATGGTTGGCATTTAGTCTTGGCAGATGTAATCCTGTGATGTAGCTGTAGGCATAA
TATCGCGCACTCTAGAGCTGTATAATGACGGACTCTTAAATACAAGCGCCCAGTGGCCTGT
AGTGATACTATAGCAGTAGTCATAAACGTTTTGGACTGCCGTCCATCGCGCTGGTCTAACC
GTTTGGACACAACAGGCCACTCAGTAATCAAACCGTCTTGGAGAGCTTTATACCAAGTAC
CGAATAATACACCCCAACCAGAAGCCGAAGAGCCACCACGTGTTGAATAAATAATAGTTA
ACAAGTCTGTACTCAAATTAGTGTCATAGCGCAATGGTGTATCGTTCTTAACTATCTGTAC
TTCGCGCCTTTCATCATTAGAATCACTTGTTTCTCCCAATTTATCCCCATCGCCGTCTTGTC
GGCTACGTTCATATGATCCATCGATCTCATCAGCCGGCGTCCGTCGCTTCTGCCATAGCAG
CAGCATTCTCCAAATCTGCGATTACTGCTGTTACAGATTTTACTTGCTCTTCTATAGGTTTT
AAACGCATTTCTAATTCGGCTGATATACAGTTATTCTTGATGCTTAAATGATCCAACGCCG
CCGATGCCGCAGTATTCCGTTGTTGTAATATACGTAATCTCTGTATCGCTGTTTCTTCTTCA
TGGCGATTTGCCTGCGATTTTGTCCAGTAGTGCGCTGGCCAATTCGGTGTTATAAAATTCC
TAGAATCTGATATGTAGCCCGCGGAGCTATGTCCTTTGCACATATCAAGTGGGGAGAAAA
AGAATCTTTCCATTGTTGATTATACAAGCCGATAGTTTTAAGAAATCCAATACACTTCTAA
TCGACAGACCCTCGCACAGCTAGTAACAAAAACCGTTGTCAAACAATTCTTTTTAAACACT
CGCGACCAGAACTCCCGCCCATAATAATCAACACTGCCAGACAATAGGATGGTAATATGC
GTTTCTGTAATAATGCACTAGTGTTTAGTTGGTCTGAATATGGATGCTACAAATCGCAATA
CTCCACCGCCTATTTGTGTCTCTGTATCGCTACAATTAATATCACTGTCTGATGCGACGCCA
TGCTTGCCATCATAACCGTATTCTCCATTAATACCATCTATATTCGTTTTGGGTTCTTCAGT
ATTGTTTAGTCCTGTATTTGTCTGTGGTGTAACCAACTGCCCATAACCCCATAGTCGCAAT
AGTCGTACGCTATGGATCCCAGTTGCATTGCCGTGTGGTATGTTCTCGCCTGCCGCAGAAC
TCGTCCCGACGCCTGGCGAAAATTCTTCCCACCAGCGTTTTTTCGCAAGACTGGAAGAATT
TTCGCTGGGTGTACGAGCACATGTCGGGTTCATAATGGCATCATCGATGTCGTCTTTGTCG
ACAATTTTGCACGCATCTTTACTGTATAATTCGGACTCCAATTGAACATACTGGCTACATA
TACATTTAGCCTTCCGGCGCTTACCTTTGGTAGGTATATGATATTCTGATAAACCTGCAAT
AGAGGCTGATAATGCCGCAAAGTTGGAGGATACGCGCCGATGAGCAAATCGTGTAATTCG
GAGTATGTCCAGACCGCGCTGGGCTACAAATACTAGCAACGGACATATTAAAAATTGACT
GCATCCAGGGGGCATGATACGTTCCAACAAGATGGCCGATTCCATCAATTGTCTAATTCCA
GTCCATGTTTGCTGTTGTTTACTTCCTGTTGTCATATTTTTTACAAACTTGCAAGTCTTGAGT
TCCAAAATAATACATATGACATCTGCAGTTTCTGCCTCGCCTGTCTTAATCATGCATATGC
AATCTGGGCGGCGCCTTCCTAAGTTGACTTCAAAAGTCAGCCTCACATCAAATGCAGTTTT
AAGTGTCTGCAAAGACAGAGTGTGTTCGAATAGCCGCACAATCAGTTTACTGGGCGATCC
ACCATTTGAACGAAATTTGTTCAAATCGTTAGCCAGGGCGCCATAAAAACGATTGTGGCA
GCGCACTCCAGCTTTGAGGCGACGTGCGACTGAACCGGACGTGTTGGCATCGGTTCGTCTC
TTGGATCCTGCTACGCGTCTACAAGGCCGCTGTTCCGCGTTCTTAAGTGCGGCTGTCGTCG
CTGCGCCAATACATTTCCGATCAAATGTCACTGCGCGACTCTTGCGAACGCTTAATCCGGC
GCGCTTTTTCTGTACCTTCGATGCCATTATGCCTCGTCCGCGTATACCTAGACGGGCCGTAT
GGAACTGGCAAAACCACAACTGGCAAACTGTTGTCGGAGGATACCCTTGCAGCCACTCTT
TATGTTGCCGAGCCAATGGCGTATTGGAGAAATCATTTTGAAGATGTAATAAAGGGCGTA
TACGAAACACAGGAAAGAAAAGCTCGAGGTGACATAGCAACAACTGACGCAAAAGCAAT
TACGGCTGCTCTTCAACTGCAATTTTTCGCACCATACAGTTCCTTTCATACATATGCATCGA
CGTTATTTGGAGTCGAAGCGCCAGAAAGAACACCACCAGATATTACGCTCATAACTGATC
GGCACCCGACCGCCGCATGTCTTTGCTTCCCAGCAGCTCGTTTTGTAGTGGGGGATATGAG
CCTTAATACTCTATTGGCTATGATATCCCTAATTCCTCGCGAACCCCATGGTGGAAATATA
GTAATAATGGATTTGAATGAAGATGAGCATCTTGAACGATTGAGAGCTCGCCAACGTCCT
GGCGAAGCAATTGACGTACGCTTCTTGCGCGTATTACATAATATATATAAGATGTTTGTTA
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ATTGGAGCTCGGTCCCAATATTTGATGACGATAGAAAGAAAATGTTAGAAGCGCGTGATT
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CAAAGTACCTGAACTATGTGACGAATCATTTAGACTGCGTAAAGTCCATGAATGGAATCT
GAGATGCGCATTAATTAAGTTGGCGGATTTGAATGCATATTTTATGGACATAAGTGGCAA
GAGCCCCCAAGAGTGTGCCGCTGAAGTACGAGAGGCAACTAACGCGATGGACTTTACGCG
CCTATCTTTTACCATGGCCGAGGATCTGGAACAAGCTGTTAACCAATACAATACCGAGATG
ACAATTAATTGATAAATATATTTGTTTTAAATAAAGCTCTGATGGGCGGTTCTGAAACTAT
GACGCATATGTGTGTTTATTGCCTGCCACATTTGTAAATGCACGCCTTCGCTACTCCCTATT
TGTTTTACTGTTTGGAGACAGTTAGTATATGTTCACGCGAGAATATAATGCGCCATTCCGC
CGAGAGGACCTAGGCGAGCTTTCTGGGACCTCACCGCGGAGCTAGTTTTCTCTACGCGGCC
GCGGTTCTGTCCCAGGTAAAGCTAACCGGCCAACTTTAGAATGTCGCAGCTTACGGTGCTA
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GATATGAGTTTAAACTTTACTCATCACGTTATATCGCCAGATGTTCTTCGCCATGCCTTTAC
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ATTACGTTTTGGAACTGATCGCGCGGAAGCTGTGGCCAATATTGGAGACACCTTTATGACA
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CGACAAATTCAAAACATACATATTGGCAAGTTTCAAAAATTCTGCCGATAACGAATTTCG
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TGCAACCGCTGTGTGTAAAACTGCATTAACTGGAGACCCTGATACATTTTTTATGCGAACT
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GACGACATACATCGTAAGAGTGATTATGGCAAGCGCGAACCACTAGAAGAAGTACTAAAT
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CTCTCAACATCACTTATAAGTAACTTATATTCCGACATCGTAATGCTGCACATGGGATGGA
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GCGGCCTCTATAAATGTAAACCTGCAAGAAATATTCATTAGCGTTACTGATCGCGGCAATG
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GAGGACTATAGGACGCTGGAGGAATCAGGACATAACTGCGATAAAACACTTCCTTCCCGA
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ATAGCGGTTGGGGGTATGGCTGTTGCCGTACTTGTCTTTTATGGGATAATTAAACTGATGT
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TTAGAATCTTTACTGATATAAATACTAAAACACATTACCCTAATAGACCGGCGTTTTTTAA
GCGGCGATCAATTAACGCGCCAAGTGTCAAAACACCCTTTTGAATATCACATTTTTCATCA
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TATCAGTGCGTATTGCCGTCTTCATTAAATCATTAGTCGTATAAATTTCTGCGATTATTGAA
GCGAGACGCGCTATACGTTGTAATTGAATAGACTGGTGTTCCTGGGCCGTGTCCAGGAGA
TCGGTAGCCATTTCAAATAACGTTTCTGCATCATCCATCACCGAATCATCTTCATCTGTTGC
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GGAAACGATTCCGAGTCCGCGCTTAGACTTACGCATAAATGCTCTATGATTGGGTAACAAT
TTGGATAGCCGCCTTTACACAATATATACTGAACCAGCGCAAACTTTTGTGCGCTAGAAAC
TGAACGTCCCATGGAATAACCAACGAATAGTTCCCCAATGTTGCCAAAAGATGCTTCTATT
GCATCGCCAATTCTAGCTCTAGCGTCATTAAATTCGGGTTCGAGACCAAACCAAGTACTAA
TATCCTGAGAGACTACATCCCCAATCCTACAAAATACGGTCCAAAGGGCCCCAAGCGATC
GCGTAGGTTTGAAATTACCGGCACCATATTCCCATATATTAAGCACAGCGGGAATGTATTT
TACTTGCACAAATGAACTGACAGTAGTTTTGCGTGCGCCGCGACGTGAATGTTTTCGAGAA
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GATGTCGCTCGCCATGTCCATGCTTTACCAATACTGTTCCGAAGGAGCGCTTGCCAGTAAT
TATTACATCTGTTTGTTTTGTTTCTTCTCGTACTCCCCTACGTCGAACGGCTATGCGATCAA
ATAGTCCATCGACCATAGCGGCAAGTGACTGCGGCAATGATGTAAGACGCGCCTGCATGA
GCGCAAATGCATTCCTATTTGGTTCGTAAATAAAACCAGAACTTGCATTAGTAATAATTGG
TACATCATATAATTTGATAACTTGATAGTTCGAAATATATGACCCGTTGATAATATCAGG
CCTGACGATATTTCGAGTGAACCATATACTCAGCGATACACTGGTCGCGAACTTCAACCTC
AAGCGCCCCGCACAAACGAAGTAAGC
4、一种鸭瘟疱疹病毒转移载体的制备方法,其特征是:
1)设计扩增UL24、TK和gH基因的引物
根据鸭瘟疱疹病毒UL25、UL24、TK、gH和UL21基因的保守序列,设计兼并引物,
位于TK基因内的兼并引物DP1和DP2:
DP1:5′TCTCGAC(T)GGA(G,C,T)GCA(G,C,T)C(T)AC(T)GG 3′
DP2:5′GCGATTGGA(G)TGG(C,T)CG(T)A(G)TC 3′
位于UL24基因内的兼并引物
DP3 5′CGGCACGA(T)C(T)TTC(T)AA(G)C(T)TC 3′
位于gH基因内兼并引物:DP4 5′ATCATCGTACCA(G)TTAGG 3′
位于UL25基因内兼并引物:
DP5 5′AGGCCCTIT(G)TTCG(A)TAT(C)TG 3′
位于UL21基因内兼并引物:
DP6 5′GCTTAC(T)TTC(T)A(G,C,T)T A(G,C,T)TA(G)C(T)GG A(G,C,T)GG 3′
2)通过PCR扩增获得UL24、TK和gH基因的序列
利用设计合成的引物,通过5次兼并PCR分别克隆TK基因的保守序列、TK基因的上游侧翼序列FUL24-TK、FUL24-TK的上游序列FUL25-UL24、TK基因的下游侧翼序列FTK-gH和FTK-gH的下游侧翼序列FgH-UL21,将以上5个片段拼接,共得到8481bp的DNA序列,序列分析表明该序列含有完整的UL24、TK和gH基因;
3)PCR扩增TK基因及其侧翼序列FTK2.9
根据所得DNA序列的结果,设计2条引物:
上游引物为5′CCGGAATTCATTTGTCTGTGGTGTAAC 3′,
下游引物为5′CCCAAGCTTAGTGCTGATGGTAGGAG 3′,使用这两条引物,通过PCR克隆大小为2.9kb的PCR产物FTK2.9;
4)重组载体pUC-TK2.9的构建
将FTK2.9通过EcoRI和HindIII酶切位点亚克隆入克隆载体pUC18,形成重组质粒pUC-TK2.9;
5)转移载体pUC-TK2.9-lacZ的构建
将载体pUC-TK2.9用HpaI内切酶切开,并且用小牛碱性磷酸酶去磷酸化,用PstI和EcoRI内切酶酶切质粒pSV-β-Galactosidase,切出lacZ表达盒,并且用T4DNA聚合酶将黏性末端补平,将线性化的pUC-TK2.9和lacZ表达盒平端相连接,构建重组转移载体pUC-TK2.9-lacZ。
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CN104726469A (zh) * | 2015-04-10 | 2015-06-24 | 青岛蔚蓝生物股份有限公司 | 一种重组鸭瘟病毒转移载体及重组鸭瘟病毒 |
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2004
- 2004-12-08 CN CN 200410044105 patent/CN1635121A/zh active Pending
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