CN1630720A - 具有葡糖脑苷脂酶活性的双功能融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基本上由免疫球蛋白(Ig)分子和有葡糖脑苷脂酶生物活性的蛋白组成的新葡糖脑苷脂酶双功能融合蛋白,通过双功能融合蛋白的用药,使用基于治疗糖脂贮积失调(例如戈歇病、法布里病和泰-萨二氏疾病)的疗法,其可用于酶替代治疗和/或提高糖脂代谢。
Description
发明领域
本发明涉及基本上由免疫球蛋白(Ig)分子(整个抗体,Ig重链或轻链或其片段)和具有GCR生物活性的蛋白(该术语也包括寡肽)(GCR样蛋白)组成的葡糖脑苷脂酶(GCR)双功能融合蛋白(GCR融合蛋白),利用糖脂贮积失调(例如,戈歇病、法布里病、家族黑矇性白痴)治疗为基础的疗法,通过施用双功能融合蛋白可以进行酶替代治疗和/或提高糖脂代谢。
通过选择性地改变Ig部分的氨基酸序列,可以得到有改良特性,例如,加强的稳定性的GCR融合蛋白。另外,可以提供其中使用的GCR和Ig链为缩短形式的融合蛋白。
本发明也涉及包含此GCR融合蛋白的药物组合物和治疗方法和***以及治疗戈歇病或因糖脂贮积失调引起的其它疾病(例如,法布里病、家族黑矇性白痴)的方法,该方法包括给患有此疾病的对象施用在可药用载体中含有治疗剂量的重组产生的GCR融合蛋白的药物组合物。
发明背景
为了治疗由糖脂贮积失调引起的疾病(象戈歇病、家族黑矇性白痴或法布里病),代替脾切除术或骨髓移植而施用外源β葡糖苷酶来尝试提高罹患此类疾病的生物体内的酶量,这在文献资料中已有描述,其被用于治疗溶酶体贮积缺陷。参看,例如De Duve,C.Fed.Proc.第23卷,第1045页(1964)和Barton,N.W.等.Proc.Natl.Acad.Sci.第87卷,第1913页(1990),其中描述了使用β-葡糖苷酶,尤其是GCR治疗戈歇病和为了得到治疗响应所伴随出现的困难。但是,治疗这些疾病所用酶的剂量是每两周每公斤体重约60单位,这就意味着,治疗一个70公斤的患者每年的平均花费大约是380,000美元,而这仅仅是酶的花费。这是由外源酸性β-葡糖苷酶的短细胞内半衰期造成的。
已经描述了有相当提高的体内半衰期和对特异细胞类型(如肿瘤细胞)有提高的靶向性的抗体-酶融合蛋白。例如,细胞因子白细胞介素2(IL-2)与单克隆抗体重链进行了融合,通过分别使用抗体KS1/4和ch14.18分别形成融合蛋白ch14.18-IL-2和KS1/4-IL-2,在这两个单独的融合蛋白中所述的抗体重链分别与肿瘤抗原上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)或二唾液酸神经节苷酯GD2有免疫活性,参看,例如美国专利号5,650,150。
因此,本发明的目的是找到能有效治疗糖脂贮积失调(如戈歇病、法布里病和泰-萨二氏疾病)的适宜的化合物,它应当允许高效率的用药方式和模式,而且比已知的昂贵治疗方法便宜并在大多数患者(尤其是发展中国家的患者)能负担的价格范围内。本发明的目的是提供治疗戈歇病、法布里病和泰-萨二氏疾病的分子,这些分子可以低剂量用药、在机体内有更长的半衰期而没有明显减弱的活性,并且对那些进行糖脂代谢的特异细胞有更好的靶向性,由此能对这些疾病进行更经济且更有效的治疗。
发明概述
目前已经发现,如果将具有GCR生物活性的蛋白与Ig分子(比如整个抗体、Ig重链或轻链、Ig重链片段例如重链恒定区(CH)或Fc或Fab片段)连在一起,则药效上将有意外的协同作用并且有延长的半衰期。
融合蛋白和特定融合蛋白的修饰是本领域已知的。例如,融合蛋白能有效地阻断蛋白水解酶与其自身蛋白骨架的物理接触,由此阻止降解作用。其他优点包括在特定条件下,可提高在特定表达***中的产量、使靶蛋白正确折叠、增强稳定性、增加循环时间和治疗蛋白的生物学活性。一个此类修饰是利用免疫球蛋白的Fc区。抗体包括两个功能上独立的部分,称为“Fab”的可变区(它与抗原结合)和称为“Fc”的恒定区(它提供与效应子功能(例如补体或吞噬细胞)的连接)。当与某些具有特别短半衰期的蛋白融合时,免疫球蛋白的Fc部分可介导长时的血浆半衰期(Capon,等.,Nature第337期:第525-531页(1989)).
使用Fc区也已构建了治疗性融合蛋白,其中整合了例如Fc受体结合、蛋白质A结合、补体固着和胎盘转运等功能,这些功能都来自免疫球蛋白的Fc。例如,已经将IgG1抗体的Fc区域与CD30-L的N末端融合,CD30-L是与CD30受体结合的分子,而CD30受体表达在何杰金氏病肿瘤细胞、退行性淋巴瘤细胞、T细胞白血病细胞以及其他恶性细胞类型上(美国专利号5,480,981)。此外,在1996年,据报道,通过表达包含免疫球蛋白Fc部分与靶蛋白的融合蛋白及之后对靶蛋白进行蛋白酶剪切,可以实现某些非突变靶蛋白的有效表达和分泌(WO 96/08570,US 5,541,087)。
与Ig多肽链融合的适宜GCR样蛋白可以具有在美国专利号5,879,680中给出的氨基酸序列和相关DNA序列,或者可以是衍生的截短或突变形式。在美国专利号5,879,680的教导中描述了这些蛋白及其合成方法和条件的范例,但不包括截短和突变形式,其中有关制备和使用的公开特此以参考文献的方式整合入此处。
优选的截短形式是例如由大约1/3到1/2的天然GCR酶的氨基酸序列组成的那些,其中截短自酶的羧基端起始进行。这些截短蛋白可以通过用适宜的试剂(例如限制酶或类似物)从完整长度蛋白上切下所需的链而产生。
在参考的美国专利中描述有鉴定有效的GCR样蛋白(即,适用作与Ig多肽链融合的候选者)以及证明本发明融合化合物的活性的试验;因此可以认为,为了实践本发明,可以容易地鉴定出可用于治疗糖脂贮积失调(例如戈歇病、法布里病和泰-萨二氏疾病)的可选融合蛋白。
本发明提供了能在动物体内水解葡糖脑苷脂的有类GCR活性的新蛋白,该蛋白还具有另外的有利的特性,例如更高的表达水平、更高的溶解度、更好的组织分布、以及对巨噬细胞具有更好的靶向性。这些新蛋白包括Ig分子,象整个抗体或其片段(Ig重链或轻链或重链的片段如CH,Fc或Fab片段)与GCR样蛋白的融合蛋白;这些融合蛋白的在GCR样蛋白或Ig部分中有改变的糖基化的形式;有截短或突变的氨基酸序列并且例如,有降低的亲和力(比如对新生儿Fc受体(FcRn))的GCR融合蛋白形式;以及有特定接头的GCR融合蛋白。
发明详述
本发明的一个目的是提供具有类GCR活性且有改良特性的蛋白,其中所述蛋白是包含Ig分子,象整个抗体、Ig重链或轻链或重链的片段(象CH、Fc或Fab片段)与GCR样蛋白的融合蛋白,其中所述的Ig部分直接地或间接地(通过接头分子)与所述GCR样蛋白共价融合。在优选实施方案中,Ig部分通过它的C-末端直接地或间接地(通过接头分子)与所述GCR样蛋白(在其N-末端)共价融合,且Ig部分与GCR部分都可以是修饰的或突变的,该融合蛋白选自下组:
(I)H2N-Ig-GCR-COOH
(II)H2N-Ig-L-GCR-COOH
15 (III)H2N-Ig-GCRm-COOH
(IV)H2N-Igm-GCR-COOH
(V)H2N-Igm-GCRm-COOH
(VI)H2N-Igm-L-GCR-COOH
(VII)H2N-Ig-L-GCRm-COOH
20 (VIII)H2N-Ig-GCRtrunc-COOH
(IX)H2N-Ig-L-GCRtrunc-COOH
(X)H2N-GCR-Ig-COOH
(XI)H2N-GCR-L-Ig-COOH
(XII)H2N-GCRm-Ig-COOH
25 (XIII)H2N-GCR-Igm-COOH
(XIV)H2N-GCRm-Igm-COOH
(XV)H2N-GCR-L-Igm-COOH
(XVI)H2N-GCRm-L-Ig-COOH
(XVII)H2N-GCRtrunc-Ig-COOH
30 (XVIII)H2N-GCRtrunc-L-Ig-COOH
这里,Ig是指Ig重链或轻链或Ig重链的片段(例如CH、Fc或Fab片段)。GCR是指来自哺乳动物的天然GCR,优选人源的,特别优选人溶酶体来源的;同时也包括源自天然来源的工程化重组GCR。
GCRtrunc是指被截短的但其氨基酸序列未被突变的本发明GCR。截短形式是指具有基本上全部的或仅少许减少的葡糖脑苷脂酶生物学活性的蛋白片段。根据本发明,优选的GCR截短形式是由大约1/3到1/2的在C端缩短的天然葡糖脑苷脂酶氨基酸序列组成的那些。
GCRm是指其氨基酸序列被突变但没被截短的本发明GCR。突变的数量没有限制,但限于不能使分子的生物活性丧失。在优选实施方案中突变程度为5%~30%,在特别优选的实施方案中为5%~20%的氨基酸残基。用本领域已知的方法可以产生有增强GCR生物活性的变体。
根据本发明,GCR、GCRm、GCRtrunc可以是糖基化、未糖基化、部分糖基化或在其糖基化的模式上发生改变的形式。
可以用标准方法,例如通过蛋白质A柱子来纯化GCR融合蛋白。
L是指一连串肽,例如甘氨酸和/或丝氨酸。优选地,此肽接头是长度大约5~25,优选10~20个残基的一连串甘氨酸和丝氨酸肽的混合。特别优选的是可蛋白水解切割的接头,尤其是可以被溶酶体蛋白酶如组织蛋白酶切割的接头。
在优选实施方案中,Ig部分对带有Fc受体的细胞具特异性。因此,与GCR连接的优选Ig分子片段是Fc区域。免疫球蛋白的Fc区域是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端部分的氨基酸序列。Fc区在决定免疫球蛋白的生物学功能方面特别重要,这些生物学功能称为效应子功能。已知,免疫球蛋白亚类的重链包括4或5个结构域:IgM和IgE有5个重链结构域,IgA、IgD和IgG有4个重链结构域。IgA、IgD和IgG的Fc区是铰链区-CH2区-CH3区的二聚体,在IgM和IgE中它是铰链区-CH2区-CH3区-CH4区的二聚体(参看W.E.Paul,编,1993,Fundamental Immunology,Raven Press,New York)。
如本文中所用,术语“Fc部分”指免疫球蛋白重链恒定区的羧基端部分,或者其类似物或者部分。即,比如,Ig(优选IgG)的免疫球蛋白Fc区,它可以包含至少部份铰链区、CH2区和CH3区。
Fc区可以在其氨基端通过肽键与GCR的羧基端氨基酸连接,或在优选实施方案中,Fc区在其羧基端通过肽键与GCR的氨基端氨基酸连接。
在一些情况下,突变Ig分子,特别是融合蛋白的Fc区中的某些氨基酸是有用的。例如,新生儿Fc受体(FcRn)与IgG结合可以减弱融合蛋白的临床效能。
因此,Fcm是其氨基酸序列被突变和/或糖基化模式被改变的上面所定义的Fc部分。这些修饰的Fc部分可导致融合蛋白具有改良特性。在本文的上下文中,Fcm还包括对FcRn受体有减弱的亲和力的修饰的或突变的Fc部分。例如,已知位于Ig重链CH2和CH3区的连接处的IgG组氨酸(残基310和433)有助于与FcRn受体的pH依赖性结合(Raghavan,等.,Biochemistry 34(45):第14649-57页(1995))。另外,Ile 253和His 435及436(Kim等.,Eur.J.Immunol.第34卷:第2429-34页(1994)),还有残基309(Leu,Val,Gln或Met,在大鼠、小鼠和人IgG中)和311(Gln或Arg,在大鼠、小鼠和人IgG中)(Kabat等.,Sequences of proteins ofimmunological interest,US Department of Health and Human Services,Bethesda,MD,美国(1991))似乎与FcRn受体形成相互作用。因此,本发明的一个目的是提供有增加的体内循环半衰期的融合蛋白,该蛋白在负责与FcRn受体结合的域中有一个或多个氨基酸的突变、缺失或***。
在本发明的优选实施方案中,此GCR融合蛋白包含IgG1的Fc部分,其中所述突变是:253位不是Ile,309位不是Leu、Val、Gln或Met,310位不是His,311位不是Gln或Arg,433位不是His,435位不是His,436位不是His。根据本发明的这些和其它的变体蛋白可以具有与Fc受体增强的结合,增强的稳定性,增加的对正确活性构象的采用,增强的药物动力学特性,增强的合成或其他有益特征。改善GCR融合蛋白的一个具体方法是使用定点透变技术。需重点提出的是,现成有大量不同的定点诱变技术,它们可以用作备选技术以取得类似的结果。在这些技术中进行选择的策略是分子生物学领域技术人员熟知的。类似的,可对目的DNA实施随机和半随机诱变的技术也有很多种。这些技术也是分子生物学领域技术人员所熟知的。
根据本发明的Ig分子和GCR样蛋白也可以通过接头分子连接,其中氨基酸接头的长度可变。本发明的接头(L)是如下所定义的接头分子,其还可以具有蛋白酶切位点。
此肽接头通常是一连串肽,例如甘氨酸和/或丝氨酸。优选地,此肽接头是长度约5~25个,优选10~12个残基的一连串甘氨酸和丝氨酸肽的混合。特别优选的是可蛋白水解切割的接头;特别是能被溶酶体蛋白酶,象组织蛋白酶切割的接头。
优选使用的氨基酸接头L包括下列序列:
1.Ala Ala Ala
2.Ala Ala Ala Ala,
3.Ala Ala Ala Ala Ala,
4.Ser,
5.Ser Ser,
6.Gly Gly Gly,
7.Gly Gly Gly Gly,
8.Gly Gly Gly Gly Gly,
9.Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly,
10.Gly Pro Gly,
11.Gly Gly Pro Gly Gly,
12.Gly Gly Gly Gly Ser,以及,当该接头具有蛋白酶切位点时,
13.Gly Gly Tyr Leu
14.Gly Gly Tyr
15.Gly Phe Ala Leu
16.Gly Pro Arg Leu,和
17.1~16亚部分的任何组合。
其它合适的接头公开于Robinson等.,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA;95,5929.
如本文所用的,“蛋白水解切割位点”是指可以被蛋白水解酶或其他蛋白水解切割试剂所优选切割的氨基酸序列。蛋白水解切割位点包括被蛋白水解酶,尤其是组织蛋白酶或其他溶酶体蛋白酶所识别的氨基酸序列。
本发明的另一个目的是构建其中使用整个抗体的GCR融合蛋白。此融合分子包含抗体重链和轻链的可变区以及与特异抗原结合的表位。例如,GCR可以与抗体重链的C-末端融合。可以用以前所描述的方法来构建编码全抗体融合蛋白的DNA结构(Gillies等.[1991] Hybridoma第10卷:第347-356页)
本发明也涉及编码如上所述以及权利要求书中所描述的任一融合蛋白的DNA分子。
作为优选实施方案,公开了编码如上述以及权利要求书中所限定的融合蛋白的DNA分子,其包含:
(a)信号/前导序列
(b)Ig分子的序列
(c)有GCR生物活性的靶蛋白序列。
以上所提到的本发明的信号序列是编码引起蛋白质跨内质网膜转运的氨基酸序列的多核苷酸。在本发明中有用的信号序列包括抗体轻链信号序列,例如抗体14.18(Gillies等.,Jour.of Immunol.Meth.,125:191,(1989));抗体重链信号序列,例如,MOPC141抗体重链信号序列(Sakano等,Nature 286:5774(1980));以及本领域已知的任何其他信号序列(参看例如,Watson,Nucleic Acids Research 12:5145,(1984))。这些文献都以参考文献的形式并入此处。本领域已很好地描述了信号序列,已知其典型的包括16到30个氨基酸残基,也可能包括更多或更少的氨基酸残基。典型的信号肽由3个区组成:碱性N端区域、中间疏水区域和极性较强的C端区域。中间疏水区域包括4到12个疏水残基,在新生多肽的转运中这些残基使信号肽锚定跨过膜脂双层。转运开始之后,在内质网腔中信号肽通常由称为信号肽酶的细胞酶切除。
信号肽的潜在切割位点通常遵从“(-3,-1)规则”。因此,典型的信号肽在其-1和-3位中有小的中性氨基酸残基,并在此区域中缺少脯氨酸残基。信号肽酶将在-1和+1氨基酸间切下这样的信号肽。因此,DNA编码的信号序列部分可以在分泌过程中从融合蛋白的氨基端切下。这导致分泌出由Ig区和靶蛋白组成的融合蛋白。von Heijne(Nucleic Acids Res.,14:4683,(1986))提供了信号肽序列的详尽讨论。对于在分泌盒(secretioncassette)中的使用,特定信号序列的适宜性可能需要一些常规试验来确定;这是本领域技术人员显而易见的。信号序列也称作“信号肽”、“前导序列”或“前导肽”,这些术语中的每一个都与信号序列有相同的意思,可在此处使用。
本发明也涉及表达载体,它包含可以启动靶蛋白,即GCR融合蛋白表达的所述DNA分子。如本文所用,“载体”指含有能并入寄主细胞并能与寄主细胞基因组重组并整入其中或者能像附加体一样自主复制的核苷酸序列的任何核酸。此类载体包括线性核酸、质粒、噬粒、柯斯质粒、RNA载体、病毒载体或类似的。病毒载体的非限定例子包括反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒。如本文所用,“靶蛋白的表达”可理解为指DNA序列的转录,mRNA转录本的翻译以及折叠成正确有活性构象的蛋白产物的分泌。
根据本发明,可以使用适合于表达本申请限定的融合蛋白的真核宿主细胞,优选哺乳动物宿主细胞。用所述载体转染这样的寄主细胞,及表达、纯化和分离本发明融合蛋白的方法是本领域所熟知的。
因此,根据本发明的方法包括:
(i)构建编码前体蛋白的DNA,所述前体蛋白包含用于分泌的前导序列,Ig部分,GCR、GCRm或GCRtrunc部分以及任选地位于Ig和GCR部分之间的连接序列;
(ii)把所述融合DNA放入适当的表达载体中;
(iii)在真核细胞中表达所述融合蛋白;和
(iv)纯化所述分泌的融合蛋白
本发明还涉及药物组合物,此药物组合物包含至少一个上面或下面所限定的GCR融合蛋白,优选其中IgG的Fc部分在其C-末端氨基酸处通过肽键与GCR样蛋白的N-末端氨基酸相连的融合蛋白,以及可药用载体、稀释剂和赋形剂。此药物组合物可以任选地含有有助于共同治疗GCR缺陷病的其他药物或药剂。
此药物组合物可以是用于静脉内、皮下、肌内、常位注射、常位输注,或者通过口、肺、鼻、经皮肤给药的形式或其他用药形式。可以通过周期性单位给药、连续输注、蠕动传递、快速浓注以及类似的方式来完成给药。途径可以包括
一般,本发明包括这样的药物组合物,其包含有效量的本发明蛋白或衍生产物及可药用稀释料、防腐剂、增溶剂、乳化剂、辅药和/或载体。该组合物可以包括:具有不同缓冲液内容(例如:Tris-HCl,乙酸盐,磷酸盐)、pH和离子强度的稀释液;添加剂例如去污剂和增溶剂(例如Tween80,聚山梨醇酯80)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(如硫柳汞、苯甲醇)和填补物质(如乳糖、甘露醇)。上面和下面提到的术语“肠胃外的”包括皮下、静脉内、关节内、气管内注射和输注技术。优选肠胃外用药。
如本文所用的,术语“可药用载体或赋形剂”指惰性、无毒的液体填充剂、稀释剂、溶剂或溶液,其不与活性化合物或患者发生不良反应。适宜的液体载体为本领域熟知,例如无菌水、盐水、含水的葡萄糖、糖溶液、乙醇、二醇类和油,包括石油、动物、植物或合成来源的那些。这些制剂也可以包含典型用于肠胃外给药的辅药或载体。
关于所述适宜的制剂,需要指出的是,本发明的融合蛋白可以与任何无毒的有机或无机酸最终形成可药用盐,显示出改变的溶解度。无机酸有,例如,盐酸、硫酸、磷酸以及酸式金属盐(如正磷酸一氢钠和硫酸氢钾)。有机酸的例子有,单、双和三羧酸,如,乙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、延胡索酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水杨酸和磺酸。羧基末端氨基酸部分的盐包括与任何适宜的无机或有机碱形成的无毒羧酸盐。这些盐包括,例如,与碱金属如钠和钾,碱土金属如钙和镁,以及有机伯胺、仲胺和叔胺如三烷基胺的盐。
典型地,用于治疗糖脂贮积失调(象戈歇病、家族黑矇性白痴或法布里病)的GCR融合蛋白剂量是每天每公斤体重0.01mg到25mg,优选约0.1到2mg,更优选约0.1到1mg。使用现有技术中已知的诊断工具能测定有效剂量。通常,在上述范围内,对于给定患者最佳治疗容许剂量和给药速率取决于多种因素,例如所用具体活性材料的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、用药时间和途径、清除率或治疗目的。通过用药和观察所期望的治疗结果,本领域技术人员能够确定有效剂量。在治疗过程中剂量也可以变化,开始时使用相对高的剂量,直至出现治疗益处为止,而在维持治疗益处时使用较低剂量。
本发明也涉及通过GCR融合蛋白疗法,治疗各种糖脂贮积失调(例如戈歇病、家族黑矇性白痴或法布里病)以及与这些疾病有关的酶的治疗方法和治疗***。
所述治疗方法就步骤而言包含多种可用于实践本发明的形式。例如,GCR融合蛋白可以与另外的药物和/或添加剂(例如维生素)在混合之后(即同时)给药或者顺序给药,或可以进行单一药物治疗。另外,所述添加剂和/或其它药物可以与融合蛋白分开用药,时间间隔为零至3周,即,第二种活性剂基本上立即在第一种活性剂使用之后使用至在第一种活性剂使用后不超过三周使用。另外,也可以考虑改变顺序,即,可以在使用融合蛋白之前使用添加剂和/或其它药物,或者用相反的顺序用药。
在另一个实施方案,考虑与外科手术相结合使用本发明,所述手术为例如部分或全部摘除脾脏。在这方面,可以在外科手术之后使用本发明方法。作为备选方案,可以在活性剂的给药间隔期实行外科手术。此方法的一个例子是将本发明方法和手术摘除脾脏相联合。
根据本方法的治疗典型地包括以一个或多个给药周期施用活性剂。例如,当进行单独或同时GCR融合蛋白用药时,包括单一脂类贮积疾病药物或前述药物和添加剂和/或另种药物的治疗组合物可以在一个周期中用药持续约2天到约3周。此后,根据执业医生的判断,如果需要的话可以重复此治疗周期。类似地,当考虑相继地使用两个不同药剂时,用药时间也典型地覆盖相同的时期。
两个周期间的间隔可以在约零到2个月内变动。
在另一个实施方案中,本发明描述了治疗戈歇病的方法,包括给患者施用含有一定量的如上所述的GCR融合蛋白的治疗组合物作为支持疗法联合骨髓移植或者外科手术(去除作为重要糖脂贮积位点的器官,例如脾),或者通过对患有糖脂贮积失调的患者进行预先的酶增加治疗来准备成功的基因治疗。
通过酶替换或增加疗法对以上疾病之一实施本发明的支持疗法的情况下,融合蛋白的用药可以与其他操作(即,手术)分开,即所述操作和融合蛋白用药之间的时间间隔可以为零到3周,即操作后(如骨髓移植后或手术后)基本上立即至不超过3周开始施用此药剂,或施用此药剂后基本上立即至不超过3周开始实行手术。另外,可以考虑顺序的变化,即,融合蛋白可以在骨髓移植或外科手术之前用药,或者以相反的顺序用药。
另外,本发明考虑包含包装的***和/或试剂盒,其提供了实施本发明方法所必需的试剂。因此,本发明描述了用于治疗糖脂贮积失调的试剂盒,其包括如下包装,所述包装包括:
(a)包含一定量的上述GCR融合蛋白的治疗组合物;
(b)任选地可用于治疗前述疾病的添加剂或支持药物;和
(c)在治疗戈歇病、家族黑矇性白痴或法布里病的方法中使用这些药剂的指导说明书。
本发明试剂盒中的药剂典型地被配制成本文所述的治疗组合物;因此可以是适合在试剂盒中配给的任何形式。这些形式可以包括液体、粉末、片剂、混悬液以及可用于提供本发明融合蛋白和任选地支持药物和/或添加剂的类似制剂。这些药剂可以提供在适于根据本发明方法单独用药的单独容器中,或者备选地可以在包装中的单一容器内以组合在药物组合物中的形式提供。
包装中可以包含足够根据本文所描述的治疗方法进行一次或多次给药的药剂量。典型地,包装中包含足够满足本文描述的一个治疗周期的量。
本发明的试剂盒也包含包装中所含材料的“使用说明书”。说明书涉及根据本方法治疗糖脂贮积失调时融合蛋白和/或可选择地支持药物和/或添加剂的使用。由于这些方法可以根据疾病阶段和类型、患者和疾病的状况有相当大的改变,说明书可以相应变化以规定用药程序。除了根据本发明方法使用融合蛋白的特征外,本发明不限制说明书的性质。
序列信息
以下氨基酸序列用于本发明
SEQ ID NO:1人溶酶体GCR氨基酸序列(单字母代码)
MAGSLTGLLL LQAVSWASGA RPCIPKSFGY SSVVCVCNAT YCDSFDPPTF
PALGTFSRYE STRSGRRMEL SMGPIQANHT GTGLLLTLQP EQKFQKVKGF
GGAMTDAAAL NILALSPPAQ NLLLKSYFSE EGIGYNIIRV PMASCDFSIR
TYTYADTPDD FQLHNFSLPE EDTKLKIPLI HRALQLAQRP VSLLASPWTS
PTWLKTNGAV NGKGSLKGQP GDIYHQTWAR YFVKFLDAYA EHKLQFWAVT
AENEPSAGLL SGYPFQCLGF TPEHQRDFIA RDLGPTLANS THHNVRLLMLD
DQRLLLPHWA KVVLTDPEAA KYVHGIAVHW YLDFLAPAKA TLGETHRLFP
NTMLFASEAC VGSKFWEQSV RLGSWDRGMQ YSHSIITNLL YHVVGWTDWN
LALNPEGGPN WVRNFVDSPI IVDITKDTFY KQPMFYHLGH FSKFIPEGSQ
RVGLVASQKN DLDAVALMHP DGSAVVVVLN RSSKDVPLTI KDPAVGFLET
ISPGYSIHTY LWRRQ
SEQ ID NO:2人IgG1 Fc区-成熟蛋白编码序列(单字母代码)
EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN
GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL
TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS
RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
SEO ID NO:3人IgG2 Fc区-成熟蛋白编码序列(单字母代码)
ERKCCVECPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE
DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV HQDWLNGKEY
KCKVSNKGLP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV
KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK
以下的实施例更详尽地描述本发明,但并不限定本发明。
实施例1:人源Fc-GCR的表达
用标准技术从寡核苷酸完全合成编码GCR成熟形式的序列。
对合成的DNA进行工程化以使其5`端有可与Xmal相容的突出端而在3`端有可与Xhol相容的突出端。
克隆DNA,序列分析证实它编码没有突变的成熟GCR蛋白。
表达载体pdCs-Fc-GCR构建如下。根据Lo等.[Protein Engineering(1998)第11卷:第495页]使含有GCR cDNA的Xmal-Xhol限制性片段与pdCs-Fc载体的Xmal-Xhol片段连接。用由此产生的载体,pdCs-Fc-GCR转染哺乳动物细胞以表达Fc-GCR。这个载体表达人免疫球蛋白γ1链Fc区。
Fc蛋白部分通常还含有糖基化位点。任选地可以用标准方法将这个位点改变为非糖基化序列。
实施例2:转染及Fc-GCR融合蛋白的表达
为进行瞬时转染,将质粒引入BHK细胞。用质粒DNA与磷酸钙共沉淀的方法[Sambrook等.(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual,Cold Spring,Harbor,NY]或者用Lipofectamine Plus(Lifetechnologies,Gaithersburg,MD)根据供应商的方案通过脂质转染法来转染细胞。
为了产生稳定的细胞系,在瞬时转染和稳定细胞系制备中都使用NS/0细胞。
为了得到稳定转染的克隆,用电穿孔法把质粒DNA引入细胞。在PBS中洗约5×106个细胞一次,之后在0.5ml PBS中重悬。然后在冰上于GenePulser Cuvette(0.4cm电极间距,BioRad)中将10μg线性化质粒DNA与细胞一起孵育10分钟。用Gene Pulser(BioRad,Hercules,CA)进行电穿孔,设置为0.25V和500microF。让细胞在冰上恢复10分钟,之后在生长培养基中重悬,然后铺在96孔板上。通过在有100nM氨甲蝶呤(MTX)存在下生长来选择稳定转染的克隆,MTX是在转染后2天引入的。每3天饲喂细胞2到3次以上,在2到3周后出现抗MTX抗性克隆。用抗Fc ELISA法分析来自克隆的上清液以鉴定高产者。在含有100nM MTX的生长培养基中分离并增殖高产克隆。
将BHK和NS/0细胞培养在添加有10%胎牛血清、2nM谷氨酰胺和青霉素/链霉素的Dulbecco修正Eagle培养基中。
为了通过凝胶电泳进行常规鉴定,将条件培养基中的Fc融合蛋白俘获在蛋白质A Sepharose(Repligen,Cambridge,MA)上;然后在有或没有2-巯基乙醇的蛋白样品缓冲液中煮沸使之洗脱。在SDS凝胶上电泳之后,通过考马斯染色显现蛋白条带。为了纯化,在磷酸钠缓冲液(100mMNaH2PO4,pH3和150mM NaCl)中洗脱结合在蛋白质A Sepharose上的融合蛋白。然后,洗脱物立即用0.1体积的2M Tris-HCl(pH8)中和。
实施例3
碳水化合物的表征。
在100mM乙酸钠(pH6.0)中溶解内切糖苷酶H,终浓度为10单位/ml。在50%甘油中提供N-聚糖酶的250单位/ml悬液。将人胎盘酶或者含有GCR活性的癸基-琼脂糖级分的50μl等分试样调整到0.5%SDS/1Mβ-巯基乙醇,然后煮沸2分钟。然后用适当的缓冲液稀释样品至200mM乙酸钠pH6.0(对于内切糖苷酶H)或200mM磷酸钠pH8.5(对于N-聚糖酶),样品最终组成为0.1%SDS,0.7%NP-40和0.02M β-巯基乙醇。再次煮沸样品1分钟,然后加入内切糖苷酶H或N-聚糖酶至终浓度各自为50mu/ml或20U/ml。在37℃消化约16小时。两个去糖基化反应都使用羧肽酶Y作为对照。
实施例4:氨基酸序列分析
如上所描述将用于氨基酸序列分析的样品在SDS凝胶上进行电泳分级分离。然后如Matsudaira(J.B.C.262:10035,1987)所描述方法把其转移到PVDF膜上。典型地,电泳之后,凝胶在转移缓冲液(0.1M CAPS,10%甲醇,pH11.0)中温育10分钟,之后进行电转印(50ma,4小时)。然后,凝胶用HPLC级水洗5分钟,用0.1%考马斯蓝R250(50%甲醇中)染色5分钟,最后用50%甲醇-10%乙酸脱色10分钟。PVDF膜再次用HPLC级水清洗,在氮流下干燥,在-20℃于密封袋中保存直到用于氨基酸测序。
用Applied Biosystems 470A型气相测序仪完成氨基酸序列分析。该测序仪装备有120A型联机PTH氨基酸分析仪。不用polybrene预处理膜条,直接用03R PTH程序测序。切下含有目的蛋白条带的一片约2×8mm的PVDF膜,置于聚四氟乙烯封条中央,并放入测序仪的柱体中。用这种方法可以将多条PVDF膜堆叠在一起,由此增加可用于测序的蛋白量。与10pmol人胎盘GCR经过电泳、转印到PVDF并进行10圈氨基酸测序之后得到的产量相比较,计算出用于重组GCR测序的初始和重复产量。
用本文中所描述的方法将成熟人胎盘GCR的N-末端氨基酸序列与重组人GCR的N-末端氨基酸序列比较。通过直接化学测序成熟人和重组GCR而确定的N-末端氨基酸是相同的,这表明重组产生的酶中的信号序列得以正确加工。
实施例5:GCR分析
为了进行pH分布图和抑制作用研究,用含有0.15%Triton X-100,2.5μl的β-D-1-14C-葡糖脑苷脂(在50mg/ml牛磺胆酸钠中7.5mg/ml)和样品的100mM磷酸钾缓冲液(总体积为200μl)测量GCR活性。在37℃与环己烯四醇-B-环氧化物预温育30分钟。为了测定Km,在pH5.9下,在含有0.15%Triton X-100和0.125%牛磺胆酸钠的100mM磷酸钾缓冲液中用人工底物4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡糖苷(4MUGP)分析β-葡糖苷酶活性。并用4MUGP监测重组GCR的纯化。
应理解,本文描述的实施例和实施方案只有举例说明目的;本领域技术人员可以基于这些提出不同的修饰或变化,这些修饰或变化都将包括在本申请的精神和界限以及所附权利要求书的范围内。
基于本公开,其他用途对本领域技术人员是显而易见的。
Claims (25)
1.基本上由免疫球蛋白分子(Ig)或者其片段与非免疫球蛋白分子组成的融合蛋白,其中非免疫球蛋白分子是具有葡糖脑苷脂酶生物活性的蛋白(GCR样蛋白)。
2.权利要求1的融合蛋白,其中Ig分子对Fc受体具有特异性。
3.权利要求1或2的融合蛋白,其中Ig分子以其C末端和GCR样蛋白的N末端共价连接。
4.权利要求1到3之任一项的融合蛋白,其中在Ig分子与GCR样蛋白间融合接头分子。
5.权利要求4的融合蛋白,其中接头分子含有蛋白酶切位点。
6.权利要求5的融合蛋白,其中蛋白酶切位点对溶酶体蛋白酶具特异性。
7.权利要求1到6之任一项的融合蛋白,其中GCR样蛋白是GCR。
8.权利要求7的融合蛋白,其中GCR是截短的(GCRtrunc)或者突变的(GCRm)。
9.权利要求7或8的融合蛋白,其中GCR或者GCR样蛋白有改变的糖基化模式或者是非糖基化的。
10.权利要求1到9之任一项的融合蛋白,其中Ig分子是Fc部分。
11.权利要求1到9之任一项的融合蛋白,其中Ig分子是整个抗体。
12.权利要求1到11之任一项的融合蛋白,其中Ig分子或其片段是人为设计的。
13.权利要求12的融合蛋白,其中Ig分子对FcRn受体有减弱的亲和力。
14.权利要求1到13之任一项的融合蛋白,其中融合蛋白内的Ig分子是二聚化的。
15.编码权利要求1到14之任一项的融合蛋白的DNA序列。
16.编码根据权利要求1到14中至少一项的融合蛋白的DNA分子,其包含:
(a)信号/前导序列
(b)Ig分子
(c)有GCR生物活性的靶蛋白序列。
17.包含权利要求15或16的DNA的表达载体。
18.适于表达权利要求1到14中至少一项所限定的融合蛋白的宿主细胞,其包含权利要求17的载体。
19.制备权利要求1到14中至少一项的融合蛋白的方法,所述方法包括:
(a)构建编码前体蛋白的DNA,所述前体蛋白包含用于分泌的前导序列、Ig分子、GCR、GCRm或GCRtrunc部份以及任选地接头序列,
(b)将所述融合DNA放入适当的表达载体中,
(c)在真核细胞中表达所述融合蛋白,和
(d)纯化所述分泌的融合蛋白。
20.药物组合物,其包含权利要求1到14之至少一项的融合蛋白及至少一种可药用载体、稀释剂或赋形剂。
21.权利要求20的药物组合物,其包含至少一种其它的药用有效药物和/或辅药。
22.权利要求1到14之任一项的融合蛋白在制备治疗糖脂贮积失调的药物组合物中的用途。
23.权利要求22的用途,其中糖脂贮积失调选自戈歇病、法布里病和泰-萨二氏疾病。
24.治疗糖脂贮积失调的方法,包括给患有所述疾病的患者施用根据权利要求16或17的药物组合物。
25.权利要求18的方法,其中糖脂贮积失调选自戈歇病、法布里病和泰-萨二氏疾病。
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