CN116948036A - 重组孕马血清***及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了重组血促性素，将eCG或其功能突变体与抗体IgG的FC段连接。与天然提取的eCG相比，重组血促性素能够通过CHO细胞表达，显著降低了动物体病原体污染的风险，另外通过ProteinA亲和层析纯化获得的重组血促性素纯度可达95％以上，有效降低被治疗动物的不良反应。重组血促性素具有与天然提取的血促性素类似的半衰期和活性，重组血促性素有望取代天然提取的血促性素用于动物繁殖育种和相关兽医治疗领域。

Description

重组孕马血清***及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体来说，涉及一种长效重组孕马血清***及其制备方法和应用。

背景技术

孕马血清***，简称血促性素(Pregnant Mare Serum Gonadotropin，PMSG)，又称马绒毛膜***(equine Chorionic Gonadotropin，eCG)，是1930年由Cole和Hart首次在妊娠40～120天怀孕母马血清中发现的一种***[Cole,II.H.&Hart.G.H.:Am.J.Physiol.93,57,1930.]，妊娠马属动物(驴、斑马等)均能分泌此激素。eCG兼具有促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)和***(Luteinizinghormone，LH)的活性[Raacke,I.D.,A.J.Lostroh,J.M.Boda,and C.H.Li,Ada Endocr(Kobenhavn)26:377,1957.]，对各种属动物具有显著的促生殖效果，国内外广泛应用于家畜同期发情、超数***和胚胎移植等产业。

目前国内外获准销售的血促性素无一例外都是从孕马血清中提取的。Rimington于1941年建立了较为简便的血促性素分离方法[Rimington,C,and I.W.Rowlands,BiochemJ 35:736,1941]。该方法首先用偏磷酸沉淀大部分血清杂蛋白，继而用冷乙醇分级沉淀法富集eCG活性成分，可以获得比活性约600IU/mg的eCG粗纯品。以eCG粗纯品为起始原料，序贯使用凝胶过滤层析和离子交换层析法进一步纯化，可获得比活性高达15800IU/mg的精纯品(Gospodarowicz,D.and Papkoff,H.,Endocrinology 80,699 1967)。荷兰Intervet公司自上世纪60年代中期开始血促性素的工业化生产研究，并于70年代正式运用于兽医临床，取得显著的治疗效果。此后，随着分离纯化方法不断优化和改进，目前欧美国家工业化生产的血促性素质量标准已从70年代初的200IU/mg提高至2000-3000IU/mg。我国2017版《兽药质量标准》要求“按干燥品计算，每1mg的效价不得少于2000单位”。

从母马血清中提取血促性素的传统制备工艺具有许多明显的缺陷。首先，马血中的eCG含量仅约40-60IU/ml，生产血促性素需要收集大量马血清。这些原材料的收集工作极其费时、费力。而且，母马发情怀孕具有季节性，通常每年可采集血清的时间仅1.5个月左右，因此，原材料的供应成为产能扩张的关键限制因素。其次，孕马血清中的eCG含量和性质会随着动物个体不同、妊娠时期不同，胎儿基因型不同等因素而呈现巨大差异。例如，随着母马年龄增加，其体内eCG会变得酸性更强。由于生产原材料来源于成千上万头不同的个体，导致不同批次产品难以保持质量一致。此外，虽然实验室经过精制的eCG比活性可达15800IU/mg，但由于精制过程成本高、活性回收率极低，无法推广至商业化生产。目前市售的血促性素产品纯度(约60％)、比活性依然较低(约13.5～54IU/nmol,相当于500～2000IU/mg)，其中含有大量的血清蛋白等杂质。如图1所示，市售的血促性素在SDS-PAGE电泳中显示多条蛋白条带，而重组血促性素仅在70KD处有一条明显的蛋白条带。这些杂质显著增加了动物不良反应的发生率，造成过敏性红肿、发热、注射位点发生溃烂等不良后果。最后，由于无法进行终端灭菌，这种直接从马血中提取的生物制品存在较高的病毒和其他微生物污染风险。

为了克服现有生产工艺的缺陷，许多学者尝试采用基因工程技术生产重组血促性素(reCG)。LEGARDINIER研究了用杆状病毒-昆虫细胞体系表达reCG的可行性(LEGARDINIERet al.,Biological activities of recombinant equine luteinizing hormone/chorionic gonadotropin(eLH/CG)expressed in Sf9 and Mimic insect celllines.Journal of Molecular Endocrinology 2005；34:47-60)。GALET试图将reCG分泌至兔奶中(GALET et al.,Expression of an in vitro biologically active equine LH/CG without C-terminal peptide(CTP)and/or beta26-110 disulphide bridge.JEndocrinol,2001；167(1):117-24)。Colette Galet利用中华仓鼠卵巢细胞(CHO)表达了多种reCG突变体(Colette et al.,Theβ104–109sequence is essential for thesecretion of correctly folded single-chain ba horse LH/CG and for its FSHactivity.Journal of Endocrinology(2009)203,167–174)。Fidler等人则采用毕赤酵母进行reCG的表达(Fidler et al.1998,2003)。大多数此类reCG在体外测试中均表现出良好的生物学活性，然而却几乎完全丧失体内活性。推测其原因是由于reCG体内半衰期过短所致。

eCG属于糖蛋白激素家族成员之一，是由α链和β链通过非共价键装配而成的异源二聚体。通常认为α链负责信号传导，而β链决定了激素的受体特异性。(Pierce JG,Parsons(1981)“Glycoprotein hormones:structure and function,”Biochem.50:465-495)。在其β链的C末端存在一段由28个氨基酸组成的特征性序列(CTP)，该序列富含大量O-糖基化的丝氨酸和苏氨酸。马***(eLH)是由马脑垂体分泌的另一种糖蛋白激素。事实上，eCG和eLH的编码基因序列完全相同，但二者的糖水化合物含量却存在显著差异。eCG的糖水化合物含量高达45％，而eLH的糖水化合物含量约为30％(Harbon-Chabbat et al.1961,Gospodarowicz1972)。与eLH相比较，eCG含有大量多聚乙酰乳糖胺化的O-糖(disialylatedpoly-N-acetyllactosaminyl O-glycans)，是导致其含糖量显著增加的主要原因。此外，eCG和eLH的N-糖末端寡糖基也存在明显不同，eCG以唾液酸化为主，而eLH以硫酸乙酰半乳糖胺为主。(Smith et al.1993,Matsui et al.1994)。这些分子结构上的差异导致eCG的体内半衰期长达40-120小时(BOUSFIELD et al.,Identification of twelve O-glycosylation sites in equine chorionic gonadotropin beta and equineluteinizing hormone ss by solid-phase Edman degradation.Biol Reprod。2001Jan；64(1)：136-47)。去除eCG聚糖链中的末端唾液酸残基，使得其半衰期从6天减少到约1-2小时，并且体内活性几乎完全丧失。(MARTINUK et al.,Effects of carbohydrates on thepharmacokinetics and biological activity of equine chorionic gonadotropin invivo.Biol Reprod.1991Oct；45(4):598-604)。

为了获得具有较长半衰期的reCG，Sogayar在专利EP3398609A1描述了一种复杂的糖工程学方法。该方法通过对CHO宿主细胞的蛋白质糖基化相关酶进行改造，使得改造后的CHO细胞所表达的reCG具有与天然eCG相类似的糖链结构。据报道，采用此方案制备的reCG呈现出很好的体内生物学活性。然而，众所周知，蛋白质的糖基化不仅与宿主细胞相关，而且与培养基成分、培养条件、细胞状态等诸多因素密切相关。这些因素无疑对生产工艺的过程控制提出了极大的挑战。

发明内容

本申请首次构建了重组血促性素-FC段融合蛋白，其结构特征可以如下：

1)reCG-FC结构1：eCG的β链羧基末端与IgG抗体的FC段氨基端融合，同时eCG的α链融合在FC段的羧基端，形成eCGβ-FC-eCGα的串联形式，用分子结构式(β-FC-α)₂来表示，分子结构如图3所示。

2)reCG-FC结构2：eCG的β链羧基末端与IgG抗体的FC段氨基端融合，而eCG的α链保持游离。2条β-FC链与2条α链通过非共价键形成异源二聚体结构，用分子结构(α：β-FC)₂来表示，分子结构如图4所示。

为了避免抗体ADCC、CDC等免疫效应对生殖细胞产生不利影响，在抗体FC段的选择上，可选择FC效应较弱的野生型IgG2或IgG4亚型，而如果选择IgG1或者IgG4，需要将抗体FC段特定位点氨基酸进行突变以消除FC效应。例如，运用最广泛的突变方案是将hIgG1抗体第297位(EU编号规则)天冬酰胺突变为丙氨酸(N297A)或其他非天冬酰胺的氨基酸以消除N糖基化位点。其他文献报道的突变方案包括hIgG1抗体L234A/L235A突变；hIgG1抗体的C220S/C226S/C229S/P238S突变；hIg2抗体的V234A/G237A突变；hIgG4抗体的L235A/G237A/E318A突变等。此外，根据“栓-洞”(Ridgway JB et al.,‘knobs-into-holes’engineering ofantibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization.Protein Eng.1996Jul；9(7):617-21)式突变原理，在抗体FC段CH3结构域引入T366Y或T366W突变，同时在抗体铰链区引入C220S/C226S/C229S/P238S突变，则可形成稳定的β-FC-α和α：β-FC单体结构。

优选情况下，可以选择猪或人的抗体FC段与血促性素结合，例如选择猪抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或人抗体IgG1、IgG 2、IgG3、IgG4。更具体的，在一种情况下，将eCG的β链羧基末端与猪抗体IgG1的FC段(CH2-CH3)氨基端融合，同时eCG的α链融合在FC段的羧基端，形成eCGβ-sFC-eCGα的串联二聚体形式，用分子结构式(β-sFC-α)₂来表示，该分子命名为reCG-sFC。为了避免抗体ADCC、CDC等免疫效应对生殖细胞产生不利影响，将猪抗体FC段第297位天冬酰胺突变为丙氨酸(N297A)。在另一种情况下，将eCG的β链羧基末端与人抗体IgG4的FC段(CH2-CH3)氨基端融合，而eCG的α链保持游离。2条β-hFC链与2条α链通过非共价键形成异源四聚体结构，用分子结构(α：β-hFC)₂来表示，该分子命名为reCG-hFC。这两种融合蛋白(reCG-sFC和reCG-hFC)都具有与天然eCG相似的体内和体外生物学活性。其中reCG-hFC在小鼠体内半衰期长达82h，与天然eCG相似。

本发明具体实施方式中列举了eCG蛋白与人IgG4抗体FC段融合的效果，也列举了eCG蛋白与猪IgG1抗体FC段融合的效果。因为不同亚型的IgG抗体具有类似的结构，在不同种属之间具有较高的同源性，因而，本领域技术人员可以预见，所述抗体FC段可来源于不同种属(猪，马，牛，羊，狗，猫，大鼠，小鼠)等，这些种属抗体的FC段的结构、在融合蛋白中起到的作用与本发明实施例中人IgG4和猪IgG1类似。根据本发明，所述抗体FC段也可来源于不同IgG亚型，例如人的IgG1、IgG2、IgG3等。不同种属、不同抗体亚型的FC段融合都在本发明的范围内。

本发明所述抗体FC段，指的是抗体的可结晶段，对于IgG抗体而言，FC段通常指其CH2-CH3结构域。抗体在动物体内的超长的半衰期主要得益于CH2-CH3结构域与FCRn受体的相互作用。eCG蛋白可仅与CH2-CH3结构域融合，但也可与整个恒定区(CH1-CH3结构域)融合。

此外根据不同的运用目的，也可对抗体FC段进行工程化改造。已有大量的文献描述了此类改造。例如，对人抗体IgG1引入S239D/A330L/I332E突变可以增强ADCC效应，引入L234F/L235E/P331S突变可抑制CDC效应，引入N434A突变可延长抗体半衰期等等。本发明中是需要降低或抑制ADCC和CDC效应，本领域任何可实现这一目的的方案都可应用于本发明。

本发明所述的重组血促性素，其中的eCG可以是野生型的，也可以是与eCG具有相同功能的突变序列

本发明所述的重组血促性素，eCG与FC段的连接，可以是末端的直接连接，也可以是通过连接元件(或称为连接子，linker等)进行连接。

本发明还提供了编码所述血促性素的寡聚核酸。

本发明还提供了包含所述寡聚核酸的重组载体。

本发明还提供了包含所述寡聚核酸或重组载体的宿主细胞，宿主细胞可以是原核的，也可以是真核的，优选自中华仓鼠卵巢细胞(CHO)、人肾上皮细胞(HEK293)、非洲绿猴肾细胞(COS-1)、小鼠骨髓瘤细胞(NSO)等，更优选为CHO-K1细胞。

本发明还提供了重组血促性素的制备方法，包括如下步骤：

1)转染后的宿主细胞培养3-20天，收集细胞培养液于5000rpm离心10分钟，收集上清；

2)rProteinA-Sepharose层析柱用缓冲液A充分平衡；

3)将细胞培养液上清上至层析柱进行纯化；

4)样品过完后用至少3倍体积的缓冲液A冲洗层析柱；

5)用缓冲液B冲洗层析柱，同时分步收集洗脱液；

6)每个收集管中加入1/10体积的缓冲液C，调节pH至中性；

7)用紫外吸收法测定各收集管的溶液吸光度，合并具有明显光吸收的组分，得到纯化蛋白。

本发明还提供了上述重组蛋白在制备剂中的应用，所述剂包含有效剂量的重组蛋白和可接受的载体或辅料。载体或辅料是指能够改变有效成分或活性成分进入人体/动物体的方式和在体内的分布、控制有效成分/活性成分释放速度并将有效成分/活性成分输送到靶向器官的体系，是在生产剂和调配剂的处方时使用的赋形剂和附加剂等成分。

本发明还提供了上述重组蛋白在制备动物繁殖育种相关的剂中的应用，所述剂包含有效剂量的重组蛋白和可接受的载体或辅料。

本发明的有益效果：与天然提取的eCG相比，本申请所描述的两种结构的重组血促性素融合蛋白(reCG)具有突出的特点。首先，本发明所述结构的reCG能够通过CHO细胞进行表达，显著降低了动物体病原体污染的风险。其次，通过Protein A亲和层析一步纯化，reCG产品纯度可达95％以上，有利于降低被治疗动物的不良反应。reCG在严格遵循GMP规范的条件下生产，可获得批间质量高度一致的产品。reCG生产过程不涉及偏磷酸等化学物质，有利于环境保护。本发明提供的重组血促性素有望替代天然eCG用于动物繁殖育种和相关兽医治疗领域。

附图说明

图1所示为血促性素市售品与本发明reCG-sFC重组品的还原型SDS-PAGE分析。经灰度扫描分析表明市售品纯度约为60％，而重组品纯度大于90％。

图2所示为糖蛋白激素eCG结构示意图，全蛋白由α链和β链组成。

图3所示为reCG-FC结构1示意图，eCG的β链羧基末端与抗体的FC段(CH2-CH3)氨基端融合，同时eCG的α链融合在FC段的羧基端，形成eCGβ-FC-eCGα的串联形式。

图4所示为reCG-FC结构2示意图，eCG的β链羧基末端与抗体的FC段(CH2-CH3)氨基端融合，而eCG的α链保持游离。2条β-FC链与2条α链通过非共价键形成异源四聚体结构。

图5所示为reCG-hFC融合蛋白SDS-PAGE分析，泳道1表示reCG-hFC融合蛋白非还原状态下仅有一个条带，泳道M是分子量标准，泳道2是reCG-hFC融合蛋白在还原状态下有两个条带，分子量较小的条带是α链，分子量较大的条带是β-FC链。SDS-PAGE分析表明重组蛋白的纯度很高。

图6所示为reCG-sFC融合蛋白SDS-PAGE分析，第1条泳道M是分子量标准，泳道1是reCG-sFC融合蛋白在还原状态下有一个明显的条带，是同源二聚体的一个单体，第二个泳道M是分子量标准，泳道2表示reCG-sFC在非还原状态下的条带是二聚体。SDS-PAGE分析表明重组蛋白的纯度很高。

图7所示为reCG-sFC和reCG-hFC瞬转上清体外LH活性测定结果。reCG-sFC和reCG-hFC表达载体瞬转上清都显示出明显的刺激MLTC细胞分泌孕酮的活性。而pcDNA3.1空载体瞬转上清则未见任何此类活性。

图8所示为reCG-hFC和reCG-sFC融合蛋白体外LH活性测定结果。reCG-hFC的比活性约为460IU/nmol(3800IU/mg)，而reCG-sFC的比活性约为440IU/nmol(3600IU/mg)。

图9所示为reCG-hFC和reCG-sFC体外FSH活性测试结果，在同等剂量下其刺激效果与天然提取的血促性素相当或略高于天然提取的血促性素。

图10所示为reCG-hFC小鼠体内活性测定(子宫增重法)结果，在0.5IU/鼠的给药剂量下重组reCG-hFC融合蛋白即可促进子宫体积显著增加。

图11所示为reCG-hFC小鼠体内活性测定结果，图示为各测试组典型子宫形态图。子宫越肥厚，子宫体积越大说明药物刺激效果越明显。图片上方数字表示试验动物编号。

图12所示为reCG-hFC融合蛋白药-时曲线，reCG-hFC半衰期约为3.42天(82h)。

图13所示为reCG-hFC和reCG-sFC大鼠体内活性测定(卵巢增重法)结果，在同等剂量下其刺激效果与天然提取的血促性素相当。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种重组的血促性素，通过将eCG与抗体的FC段融合，在宿主细胞中表达，所获得的重组血促性素不仅纯度高，而且与通过提取获得的天然eCG具有类似的活性和半衰期。本领域技术人员可以借鉴本文内容以及其他现有技术，适当改进分子结构、工艺参数和辅料组分实现本发明目的。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的范围内。本发明的重组血促性素已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施例仅仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。另外，在本发明中重组蛋白和融合蛋白通常可以互换使用。

对于本申请中涉及的一些英文缩略词、英文全称及其对应的中文含义，说明如下表所示。

本发明中所涉及的基因合成委托苏州金唯智生物科技公司完成，小鼠和大鼠体内药效、药代动力学研究委托苏州基业生物医药科技有限公司完成。各类限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶等工具酶购自宝日医生物技术有限公司。pcDNA3.1质粒购自Invitrogen公司。CHO-K1宿主细胞，小鼠***瘤细胞(MLTC-1)购自美国菌种保藏中心(ATCC)。CD014无血清培养基购自甘肃健顺生物科技有限公司。分析纯磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠等无机化合物都购自国药集团化学试剂有限公司。血促性素市售参考品购自宁波第二激素厂。孕酮定量试剂盒购自深圳安提生物公司。cAMP定量试剂盒购自南京金斯瑞生物科技有限公司。rProteinA Sepharose填料购自通用电气公司(GE)。HRP标记山羊抗人FC多抗，HRP标记山羊抗小鼠FC多抗购自默克-Sigma公司。PMSG-ELISA定量试剂盒(购自ALPCODiagnostics公司)。

实施例1构建reCG-hFC和reCG-sFC表达质粒

根据已知的孕马血促性素(eCG)、人抗体重链FC(IgG4)、猪抗体重链FC(sFC)的氨基酸序列，设定宿主为中华仓鼠(CHO)细胞进行密码子优化，然后采用全基因合成法，合成下列各目的基因，优化后的基因序列如下所示。

基因名称	氨基酸序列编号	构建重组载体cDNA序列编号
			eCGA	SEQ ID NO.1	SEQ ID NO.2
eLHB	SEQ ID NO.3	SEQ ID NO.4
			hIgG4-FC(CH2-CH3)	SEQ ID NO.5	SEQ ID NO.6
eLHB-hFC	SEQ ID NO.7	SEQ ID NO.8
			pIgG1-FC	SEQ ID NO.9	SEQ ID NO.10
eLHB-sFC-eCGA	SEQ ID NO.11	SEQ ID NO.12

SEQ ID NO.1：马糖蛋白激素α链(eCGA)氨基酸序列

FPDGEFTTQDCPECKLRENKYFFKLGVPIYQCKGCCFSRAYPTPARSRKTMLVPKNITSESTCCVAKAFIRVTVMGNIKLENHTQCYCSTCYHHKI

为了确保蛋白序列正确的分泌，在本申请实施例的表达体系中，马糖蛋白激素α链(eCGA)N端连接有信号肽序列MDYYRKHAAVILATLSVFLHILHS。在采用不同的表达体系的情况下，信号肽的选择可以不同。

SEQ ID NO.2：构建马糖蛋白激素α链(eCGA)重组载体使用的cDNA序列

SEQ ID NO.3：马***β链(eLHB)氨基酸序列

SRGPLRPLCRPINATLAAEKEACPICITFTTSICAGYCPSMVRVMPAALPAIPQPVCTYRELRFASIRLPGCPPGVDPMVSFPVALSCHCGPCQIKTTDCGVFRDQPLACAPQASSSSKDPPSQPLTSTSTPTPGASRRSSHPLPIKTS-

为了确保蛋白序列正确的分泌，在本申请实施例的表达体系中，马***β链(eLHB)N端连接有信号肽序列METLQGLLLWMLLSVGGVWA。在采用不同的表达体系的情况下，信号肽的选择可以不同。

SEQ ID NO.4：构建马***β链(eLHB)重组载体使用的cDNA序列

SEQ ID NO.5：hIgG4-FC氨基酸序列

ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKSEQ ID NO.6：构建hIgG4-FC重组载体使用的cDNA序列

GAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCTCCTTGCCCAGCCCCTGAATTTCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAAGATCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCTCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGGGAACCCCAGGTGTACACACTGCCTCCAAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGCCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCTGGGAAAG

SEQ ID NO.7：eLHB-hFC融合蛋白氨基酸序列

SRGPLRPLCRPINATLAAEKEACPICITFTTSICAGYCPSMVRVMPAALPAIPQPVCTYRELRFASIRLPGCPPGVDPMVSFPVALMCHCGPCQIKTTDCGVFRDQPLACAPQASSSSKDPPSQPLTSTSTPTPGASRRSSHPLPIKTSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

为了确保蛋白序列正确的分泌，在本申请实施例的表达体系中，eLHB-hFC融合蛋白N端连接有信号肽序列METLQGLLLWMLLSVGGVWA。在采用不同的表达体系的情况下，信号肽的选择可以不同。

SEQ ID NO.8：构建eLHB-hFC融合蛋白重组载体使用的cDNA序列

SEQ ID NO.9：sIgG1-FC氨基酸序列

GTKTKPPCPICPGCEVAGPSVFIFPPKPKDTLMISQTPEVTCVVVKVSKEHAEVQFSWYVDGVEVHTAETRPKEEQFASTYRVVSVLPIQHQDWLKGKEFKCKVNNVDLPAPITRTISKAIGQSREPQVYTLPPPAEEMSRSKVTVTCLVIGFYPPDIHVEWKSNGQPEPEGNYRTTPPQQDVDGTFFLYSKLAVDKARWDHGETFECAVMHEALHNHYTQKSISKTQGK

SEQ ID NO.10：构建sIgG1-FC重组载体使用的cDNA序列

GGCACAAAGACCAAGCCCCCTTGCCCCATCTGTCCTGGATGCGAGGTGGCTGGACCAAGCGTGTTCATCTTTCCACCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCTCAGACACCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGAAGGTGTCCAAGGAGCACGCTGAGGTGCAGTTCAGCTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATACAGCCGAGACCAGGCCCAAGGAGGAGCAGTTTGCTTCTACCTATCGGGTGGTGTCCGTGCTGCCTATCCAGCACCAGGACTGGCTGAAGGGCAAGGAGTTCAAGTGTAAGGTGAACAATGTGGATCTGCCTGCCCCAATCACAAGAACCATCAGCAAGGCTATCGGCCAGTCTCGCGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCTCCACCAGCTGAGGAGATGTCCCGCAGCAAGGTGACAGTGACCTGCCTGGTCATCGGCTTTTATCCTCCAGACATCCATGTGGAGTGGAAGTCTAACGGCCAGCCCGAGCCTGAGGGCAATTACAGAACAACCCCCCCTCAGCAGGACGTGGATGGCACATTCTTTCTGTATTCCAAGCTGGCCGTGGACAAGGCTCGCTGGGATCACGGCGAGACCTTCGAGTGTGCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCATTACACACAGAAGTCTATCTCCAAGACCCAGGGCAAG

SEQ ID NO.11:eLHB-sFC-eCGA融合蛋白氨基酸序列

SRGPLRPLCRPINATLAAEKEACPICITFTTSICAGYCPSMVRVMPAALPAIPQPVCTYRELRFASIRLPGCPPGVDPMVSFPVALMCHCGPCQIKTTDCGVFRDQPLACAPQASSSSKDPPSQPLTSTSTPTPGASRRSSHPLPIKTSGTKTKPPCPICPGCEVAGPSVFIFPPKPKDTLMISQTPEVTCVVVKVSKEHAEVQFSWYVDGVEVHTAETRPKEEQFASTYRVVSVLPIQHQDWLKGKEFKCKVNNVDLPAPITRTISKAIGQSREPQVYTLPPPAEEMSRSKVTVTCLVIGFYPPDIHVEWKSNGQPEPEGNYRTTPPQQDVDGTFFLYSKLAVDKARWDHGETFECAVMHEALHNHYTQKSISKTQGKFPDGEFTTQDCPECKLRENKYFFKLGVPIYQCKGCCFSRAYPTPARSRKTMLVPKNITSESTCCVAKAFIRVTVMGNIKLENHTQCYCSTCYHHKI

为了确保蛋白序列正确的分泌，在本申请实施例的表达体系中，eLHB-sFC-eCGA融合蛋白N端连接有信号肽序列METLQGLLLWMLLSVGGVWA。在采用不同的表达体系的情况下，信号肽的选择可以不同。

SEQ ID NO.12:构建eLHB-sFC-eCGA融合蛋白重组载体cDNA序列

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各编码基因分别用HindIII/XhoI消化，然后与经HindIII/XhoI消化的pcDNA3.1质粒连接。

表1各重组蛋白表达质粒列表

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实施例2细胞转染方法

细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。常用的转染技术包括但不限于生物介导法(慢病毒转染法)、化学介导转染法(包括脂质体转染法、磷酸钙转染法、PEI阳离子聚合物转染法等)、物理转染法(电穿孔转染法、基因枪法、显微注射法等)。在本试验中优选电穿孔转染法。

常用的真核宿主细胞包括但不限于中华仓鼠卵巢细胞(CHO)、人肾上皮细胞(HEK293)、非洲绿猴肾细胞(COS-1)、小鼠骨髓瘤细胞(NSO)等。在本试验中优选CHO-K1细胞进行转染研究。

具体转染方案如下：

1)CHO-K1细胞复苏后，接种至含适量CD014无血清培养基(甘肃健顺)的三角摇瓶中，于37℃，5％二氧化碳，110rpm条件下振荡培养。

2)取适量培养至对数期的CHO-K1细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清；

3)细胞团用适量CD014培养基重悬，使其密度约为1×10⁸细胞/ml。

4)加入适量的质粒溶液，使得质粒终浓度为50μg/ml。

5)取500μl上述质粒/细胞混合悬液转移至4mm间隙的电击杯中，用Bio-Rad公司的Genepulser Xcell电穿孔仪进行电击。电击参数设置为280V，20ms，电击1次。

6)电击结束后，将细胞转移至三角摇瓶中，加入适量新鲜的CD014培养基，然后将三角摇瓶放置在37℃，5％二氧化碳，110rpm条件下振荡培养。

7)连续培养5天后，收集培养上清进行纯化或活性测定。

实施例3稳定高表达工程细胞株的构建方法

为了构建高表达reCG-hFC融合蛋白的工程细胞株，按表1所示，将eCGA-pcDNA3.1质粒和eLHB-hFC-pcDNA3.1质粒等比例混合，然后按照实施例2的步骤，采用电穿孔转染法转染CHO-K1细胞。为了构建高表达reCG-sFC融合蛋白的工程细胞株，将eLHB-sFC-eCGA-pcDNA3.1质粒按照实施例2的步骤，采用电穿孔转染法转染CHO-K1细胞。电击结束后，将细胞转移至三角摇瓶中，加入适量新鲜的CD014培养基，然后将三角摇瓶放置在37℃，5％二氧化碳，110rpm条件下振荡培养过夜。第2天离心收集细胞，然后用含800μg/ml潮霉素B(Hygromycin B)的CD014培养基重悬至密度为2×10⁴细胞/ml，按照200μl/孔接种至96孔培养板中，进行选择培养。14-21天后，陆续可见单克隆生长。采用夹心ELISA法筛选高表达克隆，依次转接种至24孔板、6孔板、摇瓶进行扩大培养。

实施例4纯化reCG-hFC和reCG-sFC融合蛋白

1)缓冲液配制。缓冲液A：10mmol/L磷酸盐，100mmol/L NaCl，pH7.4；缓冲液B：含200mmol/L甘氨酸，150mmol/L NaCl，pH 3.5；缓冲液C：含1mol/LTris-HCl，pH 8.0。

2)细胞培养液于5000rpm离心10分钟，收集上清。

3)rProteinA-Sepharose层析柱(GE公司产品)用缓冲液A充分平衡。

4)将细胞培养上清上至层析柱进行纯化。

5)样品过完后，用至少3倍体积的缓冲液A冲洗层析柱。

6)用缓冲液B冲洗层析柱，同时分步收集洗脱液。

7)每个收集管中加入1/10体积的缓冲液C，以调节pH至中性。

8)用紫外吸收法测定各收集管的溶液吸光度，将明显具有光吸收的组分合并，即得到纯化蛋白溶液，无菌过滤后保存在2-8℃。

实施例5SDS-PAGE纯度分析

参考《精编分子生物学实验指南第四版》(科学出版社)所述“变性(SDS)不连续凝胶电泳：Laemmli凝胶法”进行纯度分析。上样量为1μg，分离胶浓度为12％。如图5、图6所示，非还原状态下reCG-hFC和reCG-sFC融合蛋白都表现为单一条带。reCG-sFC还原后为单一条带，而reCG-hFC还原后，则分离为2条带，分别为eLHβ-hFC链和eCGA链。扫描灰度分析显示，两种融合蛋白的电泳纯度均达到90％以上。

实施例6reCG-sFC和reCG-hFC融合蛋白的LH体外活性测定

根据Rebios所描述的方法(Rebois RV 1982Establishment of gonadotropin-responsive murine leydig tumor cell line.Journal of Cell Biology 94 70–76)，采用小鼠***瘤细胞(MLTC-1)(购自ATCC)进行检测，具体过程如下。

1)处于对数生长期的MLTC-1细胞，按5×10⁴个/孔，接种于96孔板，每孔加200μlRPMI1640完全培养基(含10％FBS)。

2)过夜培养后，吸弃上清，每孔加入200μl RPMI1640基础培养基(不含血清)。

3)再过1小时后，吸弃上清，每孔加入200μl待测样品进行刺激。

4)刺激3小时后，取上清测定孕酮含量。具体测定方法按照孕酮定量试剂盒(深圳安提生物公司)说明书进行操作。

编码reCG-sFC的表达质粒(表1，4#质粒)和编码reCG-hFC(表1，2#、3#质粒)融合蛋白的表达质粒分别采用电穿孔法转染CHO-K1细胞(具体方法参见实施例2)，转染72小时后，取CHO-K1细胞培养上清，2倍梯度稀释，用于刺激MLTC细胞。刺激3小时后，取MLTC细胞培养上清测定孕酮含量。

如图7所示，与阴性对照组相比，reCG-hFC和reCG-sFC瞬转上清都显示出明显的LH活性。

图8所示，经ProteinA柱亲和纯化的reCG-hFC和reCG-sFC融合蛋白，采用上述LH体外活性测定法检测，结果显示浓度大于3ng/ml的两种重组蛋白均能明显刺激MLTC细胞分泌孕酮，且当reCG-hFC和reCG-sFC融合蛋白浓度在3～100ng/ml之间时，孕酮产量呈明显的剂量依赖性。根据《中华人民共和国药典四部》生物检定统计法(通则1431)进行计算，reCG-hFC的比活性约为460IU/nmol(3800IU/mg)，而reCG-sFC的比活性约为440IU/nmol(3600IU/mg)

实施例7reCG-sFC和reCG-hFC融合蛋白的FSH体外活性测定

根据Minegishi所描述的方法(T Minegishi,S Igarashi,K Nakamura,MNakamura,MTano,H Shinozaki,K Miyamoto and Y Ibuki 1994Functional expressionof the recombinant human FSH receptor.Journal of Endocrinology May；141(2):369-75)，采用转染人FSH受体(hFSHR)的CHO细胞(hFSR-CHO)检测，具体过程如下。

1)处于对数生长期的hFSHR-CHO细胞，按2×10⁴个/孔，接种于96孔板，每孔加200μl DMEM/F12完全培养基(含10％FBS)。

2)过夜培养后，吸弃上清，每孔加入200μl“刺激培养基”(DMEM/F12，含0.5mMIBMX，不含血清)，于37℃孵育15分钟，弃上清。

3)待测样品用“刺激培养基”适当稀释后(最终浓度如图9所示)加至96孔板，每孔200μl于37℃孵育15分钟刺激30分钟。

4)刺激30分钟后，弃上清，加入200μl细胞裂解液裂解细胞。

5)取裂解上清测定cAMP含量，具体测定方法按照cAMP定量试剂盒(南京金斯瑞)说明书操作。其中，血促性素(eCG)市售参考品、reCG-hFC融合蛋白、reCG-sFC融合蛋白每个蛋白平行测定三个浓度，分别为1IU/ml、0.3IU/ml和0.1IU/ml。

如图9所示，经ProteinA柱亲和纯化的reCG-hFC和reCG-sFC融合蛋白，采用上述FSH体外活性测试法测定。reCG-hFC和reCG-sFC两种融合蛋白都能刺激FSHR-CHO细胞产生cAMP，并且同等剂量下，其刺激效果与天然提取的血促性素相当或略高于天然提取的血促性素。

实施例8reCG-hFC融合蛋白在小鼠体内生物活性测定

根据《中华人民共和国药典》“绒促性素生物检定法”进行检定。同一来源、品系、出生15～23日，体重9～13g健康的雌性幼小鼠共64只随机分为8组，每组8只。其中第1组，给予1mg/ml的BSA溶液作为阴性对照组。第2～4组，每只小鼠分别给予2IU，1IU和0.5IU的血促性素对照品(宁波第二激素厂)，第5～8组，每只小鼠分别给予20IU，2IU，1IU和0.5IU的reCG-hFC融合蛋白。所有试验动物采用皮下注射，单次给药方式，给药体积均为0.2ml。给药72小时后，处死小鼠，解剖并分离子宫。分别记录小鼠体重和子宫体重，将每只小鼠的子宫重量(mg)÷小鼠体重(g)×10，得到均一化的子宫重量。

试验结果如图10、图11显示，小鼠单次给予0.5IU重组reCG-hFC融合蛋白，即可使得其子宫重量和体积显著增加。说明reCG-hFC融合蛋白可作为提取获得的天然血促性素的有效替代品。

实施例9reCG-hFC融合蛋白在小鼠体内代谢半衰期测定

体重9～13g健康的雌性幼小鼠5只，每只皮下注射eCG-hFC融合蛋白22.8IU(6μg)。于给药前(0h)，给药后1h、24h、48h、72h、96h、120h、240h各时间点分别采集末梢血20μl用于血药浓度测定。采用商品化PMSG-ELISA定量试剂盒(购自ALPCO Diagnostics公司)，按照产品说明书进行测定。试验结果如图12所示，reCG-hFC融合蛋白在小鼠体内的末端半衰期约为3.42天(82h)。这与文献报道的天然eCG半衰期(60-120小时)相当。(MARTINUK et al.,Effects of carbohydrates on the pharmacokinetics and biological activity ofequine chorionic gonadotropin in vivo.Biol Reprod.1991Oct；45(4):598-604)。

实施例10reCG-sFC和reCG-hFC融合蛋白在大鼠体内生物活性测定(大鼠卵巢增重法)

根据《中华人民共和国兽药典》“血促性素生物检定法”进行检定。同一来源、品系、2l—23日龄，体重40—55g，健康的雌性幼大鼠共72只，随机分为10组，每组8只。其中第1组，给予1mg/ml的BSA溶液作为阴性对照组。第2～4组，每只大鼠分别给予40IU、20IU、和10IU的血促性素对照品(宁波第二激素厂)，第5～7组，每只大鼠分别给予40IU、20IU、和10IU的reCG-hFC融合蛋白，第8-10每只大鼠分别给予40IU、20IU、和10IU的reCG-sFC融合蛋白。所有试验动物采用皮下注射，单次给药方式，给药体积均为0.5ml。给药3天(72h)后，处死大鼠，解剖并分离卵巢。分别记录大鼠体重和卵巢体重，将每只大鼠的卵巢重量(mg)÷大鼠体重(g)×100，得到均一化的卵巢重量(mg)。结果如图13所示，市售对照品、reCG-hFC和reCG-sFC的各剂量组都能显著刺激大鼠卵巢增殖(与阴性对照组相比较P<0.01)。同等剂量条件下，市售对照品、reCG-hFC和reCG-sFC的体内活性无统计学差异。

综上所述，本发明首次获得的重组血促性素，具有和天然血促性素相似的半衰期以及体内体外活性。重组血促性素，与通过提取方式获得的天然血促性素相比，具有更高的纯度，避免了提取血促性素因为含有杂蛋白导致的不良反应。而且重组血促性素的生产过程简单环保，具备成本优势。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州默泉生物有限公司

<120> 重组孕马血清***及其制备和应用

<130> 2022100001

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> equine

<400> 1

Met Asp Tyr Tyr Arg Lys His Ala Ala Val Ile Leu Ala Thr Leu Ser

1 5 10 15

Val Phe Leu His Ile Leu His Ser Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Thr

20 25 30

Gln Asp Cys Pro Glu Cys Lys Leu Arg Glu Asn Lys Tyr Phe Phe Lys

35 40 45

Leu Gly Val Pro Ile Tyr Gln Cys Lys Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala

50 55 60

Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Arg Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn

65 70 75 80

Ile Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ala Phe Ile Arg Val

85 90 95

Thr Val Met Gly Asn Ile Lys Leu Glu Asn His Thr Gln Cys Tyr Cys

100 105 110

Ser Thr Cys Tyr His His Lys Ile

115 120

<210> 2

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<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 2

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gtgttcctgc acatcctgca ctccttccca gacggcgagt ttaccacaca ggattgcccc 120

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caccataaga tatgactcga g 381

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<211> 169

<212> PRT

<213> equine

<400> 3

Met Glu Thr Leu Gln Gly Leu Leu Leu Trp Met Leu Leu Ser Val Gly

1 5 10 15

Gly Val Trp Ala Ser Arg Gly Pro Leu Arg Pro Leu Cys Arg Pro Ile

20 25 30

Asn Ala Thr Leu Ala Ala Glu Lys Glu Ala Cys Pro Ile Cys Ile Thr

35 40 45

Phe Thr Thr Ser Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Ser Met Val Arg Val

50 55 60

Met Pro Ala Ala Leu Pro Ala Ile Pro Gln Pro Val Cys Thr Tyr Arg

65 70 75 80

Glu Leu Arg Phe Ala Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Pro Gly Val

85 90 95

Asp Pro Met Val Ser Phe Pro Val Ala Leu Ser Cys His Cys Gly Pro

100 105 110

Cys Gln Ile Lys Thr Thr Asp Cys Gly Val Phe Arg Asp Gln Pro Leu

115 120 125

Ala Cys Ala Pro Gln Ala Ser Ser Ser Ser Lys Asp Pro Pro Ser Gln

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Pro Leu Thr Ser Thr Ser Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Arg Arg Ser

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<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 4

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ggcgtgtggg cctctagagg ccctctgagg cctctgtgca ggcctatcaa cgccaccctg 120

gccgctgaga aggaggcttg cccaatctgt atcacattca ccacatccat ctgcgctggc 180

tactgtccta gcatggtgcg cgtgatgcca gccgctctgc cagctatccc tcagccagtg 240

tgcacctata gggagctgcg gttcgcttcc atcaggctgc caggatgtcc acctggagtg 300

gaccctatgg tgagctttcc agtggccctg atgtgccact gtggcccttg ccagatcaag 360

accacagact gtggcgtgtt tcgggatcag ccactggctt gtgctcctca ggcctccagc 420

tcttccaagg atccaccctc tcagccactg acctccacaa gcaccccaac acctggagct 480

agcaggcgga gctctcatcc actgcccatc aagacctctt gactcgag 528

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<212> PRT

<213> hominine

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Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

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Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

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100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

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Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 6

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<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 6

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tccgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatctcccg gacccccgaa 120

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<210> 7

<211> 398

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 7

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1 5 10 15

Gly Val Trp Ala Ser Arg Gly Pro Leu Arg Pro Leu Cys Arg Pro Ile

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Asn Ala Thr Leu Ala Ala Glu Lys Glu Ala Cys Pro Ile Cys Ile Thr

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Phe Thr Thr Ser Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Ser Met Val Arg Val

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Met Pro Ala Ala Leu Pro Ala Ile Pro Gln Pro Val Cys Thr Tyr Arg

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Glu Leu Arg Phe Ala Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Pro Gly Val

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Asp Pro Met Val Ser Phe Pro Val Ala Leu Met Cys His Cys Gly Pro

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Cys Gln Ile Lys Thr Thr Asp Cys Gly Val Phe Arg Asp Gln Pro Leu

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Pro Leu Thr Ser Thr Ser Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Arg Arg Ser

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Ser His Pro Leu Pro Ile Lys Thr Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

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Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

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Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

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Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

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<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

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<212> PRT

<213> swine

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Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Lys

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Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro Ala Pro

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Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser Arg Glu Pro Gln

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Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr

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<213> artificial

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<223> artificial

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Met Glu Thr Leu Gln Gly Leu Leu Leu Trp Met Leu Leu Ser Val Gly

1 5 10 15

Gly Val Trp Ala Ser Arg Gly Pro Leu Arg Pro Leu Cys Arg Pro Ile

20 25 30

Asn Ala Thr Leu Ala Ala Glu Lys Glu Ala Cys Pro Ile Cys Ile Thr

35 40 45

Phe Thr Thr Ser Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Ser Met Val Arg Val

50 55 60

Met Pro Ala Ala Leu Pro Ala Ile Pro Gln Pro Val Cys Thr Tyr Arg

65 70 75 80

Glu Leu Arg Phe Ala Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Pro Gly Val

85 90 95

Asp Pro Met Val Ser Phe Pro Val Ala Leu Met Cys His Cys Gly Pro

100 105 110

Cys Gln Ile Lys Thr Thr Asp Cys Gly Val Phe Arg Asp Gln Pro Leu

115 120 125

Ala Cys Ala Pro Gln Ala Ser Ser Ser Ser Lys Asp Pro Pro Ser Gln

130 135 140

Pro Leu Thr Ser Thr Ser Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Arg Arg Ser

145 150 155 160

Ser His Pro Leu Pro Ile Lys Thr Ser Gly Thr Lys Thr Lys Pro Pro

165 170 175

Cys Pro Ile Cys Pro Gly Cys Glu Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile

180 185 190

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu

195 200 205

Val Thr Cys Val Val Val Lys Val Ser Lys Glu His Ala Glu Val Gln

210 215 220

Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr Ala Glu Thr Arg

225 230 235 240

Pro Lys Glu Glu Gln Phe Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

245 250 255

Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys

260 265 270

Val Asn Asn Val Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys

275 280 285

Ala Ile Gly Gln Ser Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro

290 295 300

Ala Glu Glu Met Ser Arg Ser Lys Val Thr Val Thr Cys Leu Val Ile

305 310 315 320

Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile His Val Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln

325 330 335

Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val

340 345 350

Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg

355 360 365

Trp Asp His Gly Glu Thr Phe Glu Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu

370 375 380

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Gln Gly Lys Phe

385 390 395 400

Pro Asp Gly Glu Phe Thr Thr Gln Asp Cys Pro Glu Cys Lys Leu Arg

405 410 415

Glu Asn Lys Tyr Phe Phe Lys Leu Gly Val Pro Ile Tyr Gln Cys Lys

420 425 430

Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Arg Lys

435 440 445

Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val

450 455 460

Ala Lys Ala Phe Ile Arg Val Thr Val Met Gly Asn Ile Lys Leu Glu

465 470 475 480

Asn His Thr Gln Cys Tyr Cys Ser Thr Cys Tyr His His Lys Ile

485 490 495

<210> 12

<211> 1506

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 12

aagcttgcca ccatggagac cctgcagggc ctgctgctgt ggatgctgct gtccgtgggc 60

ggcgtgtggg cctctagagg ccctctgagg cctctgtgca ggcctatcaa cgccaccctg 120

gccgctgaga aggaggcttg cccaatctgt atcacattca ccacatccat ctgcgctggc 180

tactgtccta gcatggtgcg cgtgatgcca gccgctctgc cagctatccc tcagccagtg 240

tgcacctata gggagctgcg gttcgcttcc atcaggctgc caggatgtcc acctggagtg 300

gaccctatgg tgagctttcc agtggccctg atgtgccact gtggcccttg ccagatcaag 360

accacagact gtggcgtgtt tcgggatcag ccactggctt gtgctcctca ggcctccagc 420

tcttccaagg atccaccctc tcagccactg acctccacaa gcaccccaac acctggagct 480

agcaggcgga gctctcatcc actgcccatc aagacctctg gcacaaagac caagccccct 540

tgccccatct gtcctggatg cgaggtggct ggaccaagcg tgttcatctt tccacccaag 600

cctaaggaca ccctgatgat ctctcagaca cctgaggtga cctgcgtggt ggtgaaggtg 660

tccaaggagc acgctgaggt gcagttcagc tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataca 720

gccgagacca ggcccaagga ggagcagttt gcttctacct atcgggtggt gtccgtgctg 780

cctatccagc accaggactg gctgaagggc aaggagttca agtgtaaggt gaacaatgtg 840

gatctgcctg ccccaatcac aagaaccatc agcaaggcta tcggccagtc tcgcgagcca 900

caggtgtaca ccctgcctcc accagctgag gagatgtccc gcagcaaggt gacagtgacc 960

tgcctggtca tcggctttta tcctccagac atccatgtgg agtggaagtc taacggccag 1020

cccgagcctg agggcaatta cagaacaacc ccccctcagc aggacgtgga tggcacattc 1080

tttctgtatt ccaagctggc cgtggacaag gctcgctggg atcacggcga gaccttcgag 1140

tgtgccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cattacacac agaagtctat ctccaagacc 1200

cagggcaagt tcccagacgg cgagtttacc acacaggatt gccccgagtg taagctgcgg 1260

gagaacaagt acttctttaa gctgggcgtg ccaatctatc agtgcaaggg ctgctgtttc 1320

tctagagcct accctacccc agctagatcc cgcaagacaa tgctggtgcc caagaatatc 1380

acctctgagt ccacatgctg cgtggccaag gcttttatca gggtgacagt gatgggcaac 1440

atcaagctgg agaatcacac ccagtgctac tgttccacat gttatcacca taagatatga 1500

ctcgag 1506

Claims (16)

1.一种重组血促性素，其特征在于重组血促性素选自以下两种结构的任意一种：

A.结构1，eCG的β链羧基末端与IgG抗体的FC段氨基端融合，同时eCG的α链氨基端融合在FC段的羧基端，形成eCGβ-FC-eCGα的串联形式，分子结构如图3所示；或

B.结构2，eCG的β链羧基末端与IgG抗体的FC段氨基端融合，eCG的α链保持游离，2条β-FC链与2条α链通过非共价键形成异源二聚体结构，分子结构如图4所示。

2.权利要求1所述的重组血促性素，其特征在于结构1包括2条肽链，为同源二聚体，符合以下结构式：(β-FC-α)₂，其中β代表eCG的β链，FC代表IgG抗体的FC段，α代表eCG的α链，下标2代表两个β-FC-α形成二聚体。

3.权利要求1所述的重组血促性素，其特征在于结构2包括4条肽链，为异源四聚体，符合以下结构式：(α：β-FC)₂，其中α代表eCG的α链，FC代表IgG抗体的FC段，β代表eCG的β链，冒号代表α链与β-FC链之间的非共价相互作用，下标2代表两个α：β-FC形成二聚体。

4.权利要求1所述的重组血促性素，其特征在于IgG抗体可以为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任一亚型。

5.权利要求1所述的重组血促性素，其特征在于IgG抗体的FC段选自CH1-CH2-CH3或CH2-CH3。

6.权利要求1所述的重组血促性素，其特征在于IgG抗体选自人、猪、马、牛、羊、狗、猫、大鼠、小鼠的抗体。

7.权利要求1所述的重组血促性素，其特征在于IgG抗体与SEQ ID No.5或SEQ ID No.9具有至少80％的一致性。

8.权利要求1所述的重组血促性素，其特征在于eCG为野生型eCG序列或具有eCG功能的突变序列。

9.权利要求1所述的重组血促性素，其特征在于eCGα链与SEQ ID No.1具有至少80％的一致性，eCGβ链与SEQ ID No.3具有至少80％的一致性。

10.权利要求1所述的重组血促性素，其特征在于融合可以是两个末端直接融合或者通过连接元件融合。

11.编码权利要求1至10任一项所述重组血促性素的寡聚核酸。

12.包含权利要求11所述寡聚核酸的重组载体。

13.包含权利要求11所述寡聚核酸或权利要求12所述重组载体的宿主细胞。

14.权利要求1至10任一项所述重组血促性素的制备方法，包括如下步骤：

(1)培养权利要求13所述的宿主细胞3-20天，收集细胞培养液于5000rpm离心8-15分钟，收集上清；

(2)rProteinA-Sepharose层析柱用缓冲液A充分平衡；

(3)将细胞培养液上清上至层析柱进行纯化；

(4)样品过完后用至少3倍体积的缓冲液A冲洗层析柱；

(5)用缓冲液B冲洗层析柱，同时分步收集洗脱液；

(6)每个收集管中加入1/10体积的缓冲液C，调节pH至中性；

(7)用紫外吸收法测定各收集管的溶液吸光度，合并具有明显光吸收的组分，得到纯化的重组血促性素。

15.一种剂，其特征在于包含有效剂量的权利要求1至10任一项所述的重组血促性素及可接受的载体或辅料。

16.权利要求1至10任一项所述重组血促性素在制备动物繁殖育种相关的剂中的应用。