CN1617888A - 用于肌内给药的双特异性抗体dna的构建 - Google Patents

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Abstract

通过肌内注射一个或多个编码蛋白链的载体，可以在受试者中产生多链蛋白，也可选择性地在注射部位施加一个或多个电脉冲。优选的多链蛋白是免疫球蛋白。产生抗体的方法有不同的应用，包括体内表达多链蛋白，用于治疗疾病，也可用来引发针对表达蛋白的一个或多个外来抗原决定簇的免疫反应。

Description

用于肌内给药的双特异性抗体DNA的构建
发明背景
本发明涉及体内表达来自肌肉的多链蛋白。
许多遗传变化已经被鉴定能产生疾病(如癌症，肌肉萎缩症和囊肿纤维症)，而功能性外源基因导入细胞(即基因传递)已经成为一种治疗手段。在基因传递中，考虑了不同方法，获得的成功有限。参看Rosenberg等人，New Eng.J.Med.323，570(1990)。
由于病毒载体具有相对高的转染效率，以及由于载体DNA整合到宿主基因组中，从而使载体具有长期表达的能力，因此，病毒载体一直被广泛地用于基因传递。然而，病毒的使用，如原癌基因的激活，无法自我复制的病毒向野生型病毒的反转，病毒蛋白的免疫原性，以及病毒蛋白对表达的转基因的免疫原性的辅助效果都存在一定的风险。
肌细胞在体内能接受并瞬时表达裸DNA，这个发现增加了人们把非病毒载体用于基因传递的兴趣。参看Wolff等人，Science247，1465(1990)；Acsadi等人，Nature 352，815(1991)。细胞对外源DNA的吸收，以及外源DNA在细胞中的表达机制都不明了。此外，转移的效率很低，而一般观察到瞬时表达最多只达几个星期或几个月。尽管基因传递是一个有前途的研究领域，但用来在体内导入基因并获得相当水平的基因产物的新方法是必要的。
发明概述
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种产生蛋白的方法学，这种蛋白在个体的循环***中含有至少两种不同的多肽。该方法包括：往个体肌肉中注射入至少一种编码多肽链的载体，使得肌细胞能吸收这种载体，从而分泌蛋白。编码每一条链的DNA可以位于一个载体或不同的载体上。在一个优选的实施方案中，在肌肉的注射部位施加一个或多个电脉冲，可以增强蛋白的表达。
在一些实施方案中，蛋白包括一个或多个与个体异质的抗原决定簇，因此个体会对表达蛋白产生免疫反应。个体的免疫反应包括在血清中产生针对一个或多个蛋白的外来抗原决定簇的抗体。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种获得蛋白抗体的方法，这种蛋白含有至少两种不同的多肽链。该方法包括：往个体肌肉中注射入至少一种编码多肽链的载体，使得肌细胞能吸收这种载体，从而分泌蛋白。根据这个方法，该蛋白包括一个或多个与个体异质的抗原决定簇，这些抗原决定簇会导致个体产生抗体。在该方法的进一步方面，抗体可以从个体获得，优选的是从循环***获得。编码每一条链的DNA可以位于一个或不同的载体。在一个优选的实施方案中，在肌肉的注射部位施加一个或多个电脉冲，可以增强蛋白的表达。
根据本发明的其他方面，本发明提供了一种免疫方法，该方法包括：往个体肌肉注射入至少一个载体，该载体编码双特异性抗体的轻链和重链。双特异性抗体含有两个结合位点，第一个结合位点特异于个体抗原呈递细胞的细胞表面标记，而第二个结合位点特异于免疫所必需的抗原。注射后，个体肌细胞摄入载体，从而导致双特异性抗体在个体循环***中的分泌。在该方法的进一步方面，抗原被施用给个体，并通过双特异性抗体靶向抗原呈递细胞。编码每一条链的DNA可以位于一个或不同的载体。在一个优选的实施方案中，在肌肉的注射部位施加一个或多个电脉冲，可以增强蛋白的表达。
根据本发明的其他方面，本发明提供了一种免疫方法，该方法包括：往个体肌肉注射入至少一种表达载体，该载体编码抗体融合蛋白，该融合蛋白含有特异于个体抗原呈递细胞表面标记的抗体，该抗体和多肽抗原融合在一起，而该抗原是免疫反应所必需的，在这个方法中，肌细胞摄入载体会导致抗体融合蛋白的分泌。根据这个方法，这种分泌融合蛋白的功能是将抗原靶向个体抗原呈递细胞表面。编码每一条链的DNA可以位于一个或不同的载体。在一个优选的实施方案中，在肌肉的注射部位施加一个或多个电脉冲，可以增强蛋白的表达。
根据本发明另一方面，本发明提供了至少一种检测蛋白生物活性的方法学。该方法包括：往个体肌肉注射入至少一种编码多肽链的表达载体，使得肌细胞能摄入该载体，从而导致蛋白的分泌，然后检测表达蛋白的生物活性。在一个实施方案中，在个体中出现生物活性。在另一个实施方案中，从个体中取出表达蛋白，然后检测活性。编码每条链的DNA可以位于一个或不同的载体。在一个优选的实施方案中，在肌肉的注射部位施加一个或多个电脉冲，可以增强蛋白的表达。
附图简述
图1表示的是小鼠血清中重组免疫球蛋白的表达，根据本发明，该小鼠施用了免疫球蛋白表达载体。图1A是一个图表，它描述的是在第6天，小鼠(BALB/c)中表达的嵌合I-Ed特异性单克隆抗体(mAb)的血清水平，该小鼠肌肉中已经注射了所述的抗体表达载体，紧接着在注射部位进行(+)或不进行(-)电穿孔(EP)。图1B描述的是在图表所示日子中，小鼠(BALB/c和C57BL/6)中表达的嵌合I-Ed特异性抗体的血清水平，该小鼠肌肉中已经注射了combi表达载体(编码重链和轻链)，紧接着在注射部位进行(+)或不进行(-)电穿孔(EP)。图1C描述的是在图表所示日子中，小鼠(BALB/c，Bal.B，B10.D和C57BL/6)中表达的嵌合I-Ed特异性抗体的血清水平，该小鼠肌肉中已经注射了combi表达载体，紧接着在注射部位进行电穿孔。图1D描述的是在图表所示日子中，小鼠(BALB/c和C.B-17)中表达的嵌合IgDa特异性抗体的血清水平，该小鼠肌肉中已经通过肌肉注射共施用了重链和轻链表达载体，紧接着在注射部位进行电穿孔。
图2表示的是根据本发明制备的组装抗体。通过如肌肉注射的方法往小鼠中共施用重链和轻链编码载体，然后在注射部位进行电穿孔，从这种处理的小鼠中获取血清。通过结合蛋白G琼脂糖亲合珠，并洗脱下来，将嵌合的IgDa特异性抗体从血清中浓缩出来。洗脱物在和特异于表达的嵌合IgDa特异性抗体的轻链(抗人的κ链)和重链(抗人的IgG3)的抗体进行Western杂交之前，可以用巯基乙醇(ME)处理一下，也可以不处理。
图3表示的是抗免疫球蛋白抗体在小鼠中的诱导表达，根据本发明，小鼠能表达重组抗体。对图1C和1D所示实验中28天的动物血清在ELISA滴定板上进行分析，并用抗小鼠的IgG1(黑色柱子)和IgG2a抗体(灰色柱子)进行检测，其中ELISA滴定板涂有人IgG3免疫球蛋白。左边的每组代表的是图1C的血清，而右边的一组代表的是图1D的血清。结果表示成抗体终点效价，而误差棒是平均值的标准误差。
图4例证的是小鼠血清mAb的表达或者根据本发明诱导的嵌合抗体。图4A描述的是小鼠中抗IgDa特异抗体的血清水平，该小鼠(BALB/c和C.B-17)共施用了各50μg的pLNOH202bVHT和pLNO0VLT质粒(它们一起编码一个抗IgDa的mAb，其有一个完全的小鼠IgG2b重链和嵌合的轻链(小鼠可变区，人恒定区κ区)，紧接着进行(+EP)或不进行(-EP)电穿孔。具IgDa特异性的小鼠血清IgG2b的动力学特征如图所示。图4B描述的是BALB/c小鼠中4-羟基-3-碘-5-硝基苯乙酸(NIP)特异性抗体的血清水平，该小鼠通过肌内注射共施用了100或10μg(主图)或50μg(插图)的质粒pLNOH2γ2bVHNP和λ1，它们共同编码一个全长的小鼠IgG2bλ1抗NIPmAb，紧接着进行电穿孔，或不进行电穿孔。具NIP特异性的小鼠血清IgG2b的动力学特征如图所示。每组由3-7只小鼠组成，而棒代表的是平均值的标准误差。
图5显示，根据本发明，在血清中表达的抗体是生物活性的，具有完整的Fc区，而且能进行正常的糖基化。对小鼠血清或从体外转化细胞上清中纯化出来的相应的mAb(实心的方块)进行检测，检测它们在人补体存在的情况下裂解NIP致敏的51Cr标记的绵羊红细胞(SRBC)的能力，其中小鼠已经注射/电穿孔了编码小鼠IgG2b抗NIP的mAb(空心的方块)的Ig基因。作为阴性对照，不能激活补体的小鼠IgG1抗NIP(克隆N1-G9mIgG1；实心的菱形)也包括在内。根据公式％CI＝[(检测的cpm-自发的cpm值)/(最大cpm值-自发的cpm值)]×100来计算细胞毒性指数(CI)。
图6所示的是，能和B淋巴细胞标记IgD拮抗的抗体根据本发明方法可在循环***中得以表达，从而导致IgDB细胞在个体中耗尽。施用了载体并用电穿孔处理的实验组中的IgD阳性B细胞的百分比降低了。
发明详述
本发明方法是建立在这样一个发现的基础上，肌细胞能支持在肌细胞中不能正常表达的多链蛋白的表达，而这种表达能导致可检测的具活性的异源多聚蛋白在循环***中的释放和积累，和/或被吸引到在个体组织中表达的抗原上。将编码异源多聚体不同多肽的质粒DNA注射入骨骼肌，选择性地在注射部位辅以电穿孔处理，能产生组装的异源多聚体，具有完整的特异性和生物效应功能。体内采用电穿孔应该用低压电脉冲(一个或多个)，以使电流通过DNA注射位点，这对循环***中异源多聚体的表达是有用的。
因此，本发明提供一种方法，用于在个体循环***中产生蛋白，该蛋白含有至少两种不同的多肽链，该方法包括：将至少一种表达载体注射入个体肌肉中，而表达载体编码多肽链。根据这个方法，肌细胞摄入载体DNA导致多肽链产生和蛋白分泌。在一个优选的实施方案中，在肌肉的注射部位施加一个或多个电脉冲，可以增强蛋白的表达。
如本发明使用的那样，“至少一种编码多肽链的表达载体”或“至少一种编码重链和轻链的载体”意思是指用一个载体注射肌肉，该载体编码多链蛋白(或免疫球蛋白的重链和轻链)的所有不同的链，或用不同的载体注射，每一个载体编码多链蛋白的每一条链。在后一种情况中，不同载体优选的是共同施用。
利用本发明的方法，从肌细胞中获得高水平和稳定的的异源多聚体蛋白是可能的。例如，在进行了一次双侧肌用药后的7个多月，小鼠血清中产生IgG2b类的小鼠mAbs，浓度是400ng/mL。小鼠血清IgG2b短的半寿期(大约4-5天)表明小鼠肌细胞在所述时间内能持续产生IgG2b。利用本发明讨论的不同方法可以进一步增加产量水平。
本发明从肌细胞中获得多链蛋白的方法为临床方案提供了一种选择，其中蛋白的直接给药具有治疗价值。因此，为了治疗患者，可以在患某种疾病或处于某种状态的患者体内表达一种特定的多链蛋白，它对某种疾病或状态是有活性的。这种治疗用多链蛋白是本领域众所周知的，包括，例如抗体，胰岛素和血红蛋白。例如，在治疗用多链蛋白是抗体的情况下，如本发明所述，在肌细胞中表达抗体可以作为被动的抗体治疗的一种替代或补充，用于治疗的适应疾病包括如，癌症和自身免疫疾病，如B细胞淋巴瘤(抗CD20mAb，Colombat等人，Blood 97，101-106(2001)，乳癌(抗Her2，Leonard等人，Br.J.Surg.89，262-271(2002))和类风湿关节炎(抗TNFα，Feldmann等人，Joint BoneSpine 69，12-18(2002))。别的可作为例证的抗体列在表1，这些抗体的编码核苷酸序列可以从公共的序列数据库中获得。和mAb的被动用药相比，DNA注射/电穿孔花费少，注射危险低，一次注射便能获得长期的效果，而且副作用比较低或没有副作用。
本发明的方法可用来在个体循环***中获得任何一种多链蛋白。在一个优选的实施方案中，多链蛋白的每一条链以形成配体结合位点或底物结合位点的方式相互作用。因此，多链蛋白可以构成任何不同的异源多聚体，如异源二聚体，异源三聚体等。
通过本发明方法表达的异源多聚体多链蛋白也包括特定多肽的多个拷贝。例如，如本发明显示的那样，即便注射入肌细胞的H-和L-链基因位于不同的质粒，肌细胞也能将重链(H)和轻链(L)组装成四聚体(H+L)2分子。尽管并不希望拘囿于任何理论，但还是认为单个肌细胞体内制造H-和L-链，并在分泌之前组装成(H+L)2分子。重要的是，肌细胞产生的单克隆抗体(mAb)的可变区(V区)看起来是正确的，因为根据本发明产生的血清mAb对其靶抗原(如NIP半抗原，IgD或I-EdI类MHC分子)表示出意料之中的特异性。表达的四聚(H+L)2分子的Fc区看起来折叠和糖基化同样都是正确的，因为由肌细胞产生的mAb能激活补体。因为补体激活要求糖基化(Tao等人，J.Immunol 143，2595-2601(1989))，这结果表明肌细胞产生的Ig适合糖基化。
除了表达免疫球蛋白，本发明也被用来表达其他异源多聚体蛋白，包括MHC分子，如I或II类MHC分子，在这些分子中，两条链形成肽结合口袋。进一步的例子是多链酶，它能结合底物，并且催化底物生成产物。在别的实施方案中，根据本发明，可以表达能结合细胞表面受体的多链蛋白，它能导致细胞内的信号传递。
在这些例子中，通过不同的分子力如离子键，共价键，疏水键，范德华力和氢键的介导，在链之间形成稳定的连接，可以形成功能性配体结合位点或底物结合位点。根据本发明，多链蛋白在肌细胞中的表达保持了链间的相互作用，而且也保持了配体结合位点或底物结合位点的特异性。
配体结合和底物结合的区别并不是绝对的。例如，既能结合配体，也能结合底物的多链蛋白是众所周知的。抗体酶(abzyme)就是这样的例子。根据本发明的方法学，这种多链蛋白也能被肌细胞表达，并且进入循环***。
在本介绍中，交叉使用的术语“多肽”，“肽”和“蛋白”指的是氨基酸残基的多聚体。配体或底物可以是任何类型的有机或无机分子，包括但不限于蛋白，糖蛋白，蛋白聚糖，脂蛋白，核酸，脂类物质及其组合。在这方面，术语“核酸”指的是单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸多聚体，它也包括和天然核苷酸以相似方式行使功能的已知天然核苷酸的类似物。
上下文中的“抗体”指的是一种蛋白，它由1或多个多肽组成，基本上由免疫球蛋白基因或这种基因的片段所编码。可识别的免疫球蛋白基因包括κ，λ，α，γ，δ，ε，μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分成κ或λ链。重链分成γ，μ，α，δ或ε链，它们又分别定义了各类免疫球蛋白：IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。
已知的典型免疫球蛋白(抗体)结构单元包括一个四聚体。每个四聚体由两对完全一样的多肽链组成，一对是轻链(大约25kDa)，一对是重链(大约50-70kDa)。每条链的N末端定义为可变区，由100-110或更多的氨基酸残基组成，主要负责抗原识别。术语“轻链可变区(VL)”和“重链可变区(VH)”分别指的是轻链和重链的这些区域。免疫球蛋白分子的抗原识别位点或配体/底物结合位点由三个高度分叉的链形成，它们位于重链和轻链的V区，即已知的“高变区”或“互补决定区(CDRs)”，它们放置在多个保守的侧翼/连接链之间，即已知的“框架区”。在一个抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间相互放置，形成一个抗原结合表面。这个表面介导靶抗原或配体/底物的识别和结合。许多免疫球蛋白重链和轻链的高变区序列已经被公开，例如，Kabat等人，目的免疫蛋白序列(SEQUENCES OFPROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST)，第4版，U.S.Dept.Health and Human Services.Public Health Service，Bethesda，Md(1987)。“表位”就是抗原能和抗体结合位点相互作用的那一部分。
抗体以完整的免疫球蛋白或许多已经鉴定好的片段形式存在，如那些用不同肽酶消化产生的片段，或通过重组DNA技术产生的片段。抗体片段包括Fab′单体，Fab′2二体，Fv片段，单链Fv(“scFv”)片段等。例如参看Huston等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，85，5879(1988)。抗体片段也包括在轻链和/或重链恒定区中有截短的，或缺失区段的独特抗体形式。可以通过在恒定区或可变区缺失，截短或***形成突变的抗体。
能被本方法表达的多链蛋白可以从这些已知的天然出现的形式中进行修饰(如缺失，添加，突变)，或参与形成多肽，这些多肽在自然属性上并不知道是相关的。多链蛋白包含至少一种多肽，这种多肽是免疫球蛋白超家族的成员。免疫球蛋白基因超家族包括若干类主要的分子。例如，参看Williams和Barclay，免疫球蛋白基因(IMMUNOGLOBULIN GENES)(361页)，Academic出版社，纽约(1989)。
根据本发明方法表达的多链蛋白能形成一个底物结合区，一般都有一个底物结合常数，大于103M-1，更优选的是大于106M-1，甚至于107M-1也是更有选的。根据本发明方法表达的多链蛋白能形成一个配体结合区，对于预选的配体一般有一个结合常数，大于106M-1，更优选的是大于107M-1或108M-1，甚至于109M-1也是更优选的。
编码多链蛋白每条多肽的核酸可以通过本领域众所周知的方法获得，包括从cDNA文库，基因组文库等中克隆。此外，许多目的基因序列可以从公共数据库中获得，这些数据库使得人们在DNA扩增技术如聚合酶链式反应(PCR)的帮助下能合成基因。公共数据库中的序列也能提供有用的信息，用于制备PCR引物，以从合适的cDNA或基因组DNA来源中扩增特定的多肽编码DNA序列。cDNA或基因组DNA可以从动物的细胞或组织中分离，或从公共保藏中心如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(Manassas，VirginiaUSA20108)中的细胞系中分离。
根据本发明，利用单个表达载体或单一载体可以进行多链蛋白的单个多肽的表达。如果每一条链都用单一载体，为了使每个肌细胞能摄入和表达每个载体，载体在注射和电穿孔之前可以进行混合。
术语“表达载体”指的是质粒，病毒，或别的载体，可以在它们中***或整合一段多肽编码核酸，而当载体处于合适的环境中时，能指导多肽的表达。一个合适的载体通常包括启动子，复制起点，poly A识别序列，和核糖体识别位点或内部核糖体进入位点，也可能包括别的调控元件如增强子(组织特异性)。
启动子促进肌细胞中***的编码核酸序列能有效的转录，可以是组成型的，或如果需要，也可以是诱导型的，组织特异的或发育阶段特异的。启动子可以是在肌细胞中正常发挥功能的启动子，如骨骼肌动蛋白启动子(Muscat等人，Mol.Cell.Biol，7，4089(1987))，肌酸激酶启动子(Sternberg等人，Mol.Cell.Biol，8，2896(1988))，肌球蛋白轻链增强子/启动子(Donoghue等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，5847(1991))等。假设启动子在肌细胞中的功能是指导转录，因此正常情况下和肌细胞中表达不相关的启动子可以使用。这样的启动子如人CMV一类的病毒启动子，它们如实施例所描述的那样可用来表达抗体轻链和重链。
一个优选的表达载体包括一个表达盒，其中包括多个内切核酸酶位点，它使得编码不同多肽的DNA以如下方式容易地克隆进表达盒，即把DNA编码序列可操作地连接在载体启动子或别的转录调控元件上。一个优选的表达载体也有一个用于原核细胞的复制起点，和至少一个帮助克隆到这种细胞中的选择标记。本领域的技术人员知道怎样优化表达条件，为了在肌细胞中表达多肽，选择一个正确的载体，该载体中启动子、增强子和别的转录或翻译调控元件组合合适。
本发明的方法学使得能分别从骨骼肌，平滑肌和心肌表达多链蛋白。注射骨骼肌后进行表达是优选的，因为这种肌细胞来源丰富而且容易进入。对于骨骼肌，表达载体可以通过皮肤注射，通过传统的工具如注射器和针头，或通过没有针头或针较少的注射装置注射进骨骼肌。后述的装置是众所周知的，而且，一般都是在皮肤上开一个小孔，通过压力进行转移。对于气压式一次性、针头较少的皮下注射用喷枪，参看Morrow等人的美国专利No 4596556，Parsons的No 4913699和Castellano等人的No.5730723。无针头的气压式喷枪也可通过商业途径获得，例如，参看Bioject Medical Technologies公司(Portland，Oregon)的BIOJECT装置。另一个无针头的装置是一个利用压缩气体将小粒子(如金粒子)转移到皮肤靶区域的biolistic转移装置，和气压的功能一样。Biolistic转移装置的例子是Dupont(Wilmington，Delaware)公司的PDS-1000“基因枪”。
可以把载体在0.9％的NaCl中用药，然而，这有许多溶剂和赋形剂可以加入，而不会影响表达水平。例如，本领域众所周知蔗糖能增加骨骼肌对DNA的摄入。出于许多有利的原因，别的物质也可和载体共转染。例如，P188(Lee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，4524(1992)，已知它能密封电透膜(electropermeabilized membrane)，它能通过增加转染的肌纤维的存活率而对转染效率产生有利的影响。
本发明使用的“电穿孔”意思是指对细胞使用至少一次电脉冲，使得大分子能瞬时穿透细胞膜。本发明的方法在将载体注射入肌细胞后，使用电穿孔增强多链蛋白在个体循环***中的表达水平。Mathiesen等人的美国专利No 6110161提供了一种合适的装置和方法，它们在载体注射入骨骼肌后，可以获得有效的载体电穿孔。如本发明介绍的那样，在离载体注射部位大约1-4mm处放置许多电极，进行电穿孔。电极的确切位置或设计并不是关键的，只要电流能通过注射载体部位的肌纤维。
一旦电极放好以后，就可以对肌肉进行电穿孔，方式是施加一个或多个方形的双极脉冲，这些脉冲具有预定的振幅和持续时间。为了获得想要的表达水平，本领域的技术人员可以根据某个特定的情况来优化转染效率。例如，根据电极间的距离，电压可以大致在0-1500伏。脉冲持续的时间可以是5μs到500ms，脉冲数是1到30000，列中的脉冲频率可以是0.5-10000Hz。总之，如果场强大于约50V/cm，别的参数可以根据想要的实验条件进行变化。在一个优选的实施方案中，进行电穿孔的参数是：约10列脉冲，每列1000个脉冲，每个脉冲的持续时间是400μs，电势是150-170V/cm，而电流极限是50mA。Mathiesen，Gene Therapy 6(4)，508(1999)，和Rizzuto，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(11)，6417(1999)。脉冲可以是单极脉冲，也可以是双极脉冲。总之，短的脉冲持续时间可以和高的场强相组合，反之亦然。高的场强一般能获得有效的转染效率，场强使用下列公式进行计算：E＝V/(2r In(D/r))，如果D＞＞r，通过这个公式就能算出电线之间的场强。在这个公式中，V＝电压＝10V，D＝电线中心的距离＝0.1-0.4cm，r＝电极的直径＝0.06cm。参看Hofmann，“电场中的细胞”，在E.Neumann，A.E.Sowers.& C.A.Jordan(编辑)的“细胞生物学中的电穿孔和电融合”，389-407页(Plenum Publ.Corp.1989)。在10伏时，场强是163-43V/cm(电极之间的距离分别是0.1-0.4cm)。因为D不远大于r，两个平行的大金属板之间的电场更适合用下列公式计算：E＝V/D。这个公式给出了相似的场强，介于100-25V/cm(电极之间的距离分别是0.1-0.4cm)。转染的组织能影响场强和别的参数，因此最佳的条件可以变化。对于本发明认定的有关参数，优化是一种直接的根据经验的检测。
总之，载体的转染至少要1或多个电脉冲，电脉冲中电流的场强大约在25-200V/cm。也可以是25-300V/cm。还可以用单一的方形双极脉冲进行转染，脉冲持续的时间是50-5000μs，或通过传递多个方形双极脉冲(2-约30000个)进行转染。在后一种情况下，双极脉冲总的持续时间优选是10-约12000ms。双极脉冲可以至少两列的形式传递。电刺激的频率优选的是0.5-1000Hz。
心肌的转染可以将电极***心肌中DNA的注射部位，也可以将电极放在注射了DNA心肌区域周围的心脏外表面之上或之里。利用***的电极，通过静脉或动脉从心脏的外边或里边将DNA注射进去。在这种情况下，假如有一个载体到达肌细胞所通过的孔，则电极可以是中空的。相似的，可以将DNA注射到含有平滑肌的组织中，而电场可以从外面或里面施加。
对于心肌或平滑肌，场强对穿透细胞是足够大的，但不足以不可逆的损伤组织。在优选的实施方案中，对心脏收缩，可以对脉冲制式进行计时。例如，在心脏舒张期，当心脏被压缩时，可以加上电压。出于这个目的，可以使用一个电穿孔仪，使得电穿孔脉冲制式随着心脏的节律(例如心电图信号)被引发。总之，心肌或平滑肌可采用的场强大小是20-800V/cm，而别的脉冲参数和骨骼肌的相同。
除了电参数，所需的多链蛋白的表达水平可以被不同的方法所影响，这些方法包括，例如，增加注射的肌肉位点数，增加每次注射的质粒数量，通过去掉蛋白中异种或异基因的抗原决定簇以降低免疫原性，或使用进一步优化表达的Ig构建体，载体或启动子。选择特定环境中(例如人的IgG)半寿期更长的免疫球蛋白也能增加个体肌细胞表达的抗体浓度。来自身体任何部位的骨骼肌均可用于这个目的，与心肌或平滑肌一样。此外，任何具肌肉的个体均可用于本方法，包括动物，如哺乳动物(例如人，山羊，绵羊，牛等)。
如本发明所示那样，蛋白的免疫原性可以影响血清中异源多聚体的水平和持久性。本发明发现，小鼠肌细胞表达的完全的鼠源抗体或部分嵌合鼠源抗体(只是轻链的恒定区)在血清中比完全的嵌合抗体(重链和轻链都是人的恒定区)持续的时间长(不是持续若干周，而是持续若干月)。少量的外来东西如小鼠IgG2b异型和人Cλ显然可以被接受，而不会严重危及到长期的血清表达。
然而，人们可以利用免疫原性去改造个体多链蛋白的抗体。因此，本发明提供了一种方法，它可以获得蛋白的抗体，该蛋白包括至少两种不同的多肽链，而且其中该蛋白含有一个或多个外来的抗原决定簇。该方法包括：往个体中注射至少一种编码多肽链的表达载体。根据这个方法，肌细胞摄入载体会导致蛋白分泌。结果，可以从个体中获得抗体。
本发明发明了许多不同的方法，用来产生针对抗原的免疫反应。产生免疫反应的抗原具有一个或多个外来表位。这种反应可用来保护个体免受微生物如细菌，真菌，原生动物，病毒等的感染，个体因此不必暴露在这些感染微生物中。这个免疫方法可以用来保护个体不患癌症，或至少延缓疾病的开始或延缓死亡。在人体存在许多众所周知的能诱发免疫反应的肿瘤相关抗原，这和本发明公开的一样。这些抗原包括癌胚抗原，单克隆免疫球蛋白上的独特型决定簇等。
通过一种方法，就可以表达一种在物质上和多链蛋白的至少一个多肽链相联系的抗原。这可以很方便的完成，只要将编码抗原的DNA放在编码一或两条链的DNA的一端或两端。在多链蛋白是抗体的这种情况下，抗原可以融合形式表达，它可以和抗体的轻链和/或重链的N和C末端之一或两端相融合。然而，编码抗原的DNA也可以放在编码重链或轻链的序列中。
因此，提供了一种对个体进行免疫的方法，该方法包括：往个体肌细胞中注射至少一种表达载体，载体包括编码抗体融合蛋白的核酸，而该融合蛋白包括一个对个体抗原呈递细胞表面标记特异的抗体，抗体融合到多肽抗原上，对于该抗原，免疫反应是必需的。根据这个方法，肌细胞摄入载体会导致抗体融合蛋白的分泌，分泌的融合蛋白的功能是靶向到个体抗原呈递细胞表面的抗原上。在一个优选的实施方案中，在注射部位施加一个或多个电脉冲以增强蛋白的表达。尽管并不希望拘囿于任何理论，但发明人还是相信肌细胞产生和释放的抗体能够循环，并能够结合到抗原呈递细胞表面，因此浓缩的抗原和细胞上的抗体在物质上是相联系的，这对免疫反应的起始是关键的。此外，例如，结合到I类MHC分子会诱导对抗原的无细胞免疫反应性或耐受性。在优选的实施方案中，细胞表面标记是II类MHC分子，B7分子，IgD，Fc受体，CD40或Toll受体。
用另一种方法，可以将抗原和一个双特异性抗体的重链或轻链联系在一起。“双特异抗体”是一种带有两个结合位点的四链抗体，其中一个位点对一个抗原是特异的，而另一个位点对另一个抗原是特异的。在一些情况下，双特异抗体具有两个不同的轻链和两个不同的重链，或具有一条相同的轻链或相同的重链，但不是两条都相同。在这个免疫方法中，双特异抗体具有一个对个体抗原呈递细胞表面标记特异的结合位点，还具有一个对抗原特异的结合位点。可以用一个或多个载体来编码双特异抗体的重链和轻链，通过将表达载体注射入个体的肌细胞并在注射部位施加至少一个电脉冲可以引发免疫反应。
因此，本发明提供了一种对个体进行免疫的方法，该方法包括：往个体肌细胞中注射至少一种表达载体，载体编码双特异性抗体的轻链和重链，而该双特异性抗体的第一个结合位点对个体抗原呈递细胞表面标记特异，第二个结合位点对免疫反应所必需的抗原特异。根据这个方法，肌细胞摄入载体会导致双特异性抗体在个体循环***中的分泌。在这个方法的进一步方面，给个体施用抗原，这样抗原被双特异性抗体靶向到个体抗原呈递细胞。在一个优选的实施方案中，在注射部位施加一个或多个电脉冲以增强蛋白的表达。在优选的实施方案中，细胞表面标记是II类MHC分子，B7分子，IgD，Fc受体，CD40或Toll受体。
用另一种方法，可以将抗体融合到一个信号蛋白上，该信号蛋白在胞内发挥作用。这种信号蛋白是本领域众所周知的，包括如基因表达调节蛋白，参与胞内信号途径(即凋亡信号)的蛋白，能增加其中mAb-融合蛋白被转运的核内体中囊泡内pH的蛋白等一类蛋白。
抗原的给药方式有静脉给药(iv)，肌内给药(im)，皮下给药(subQ)，腹膜内给药(ip)，口服给药或别的已知的给药途径。给药可被任何本领域已知的手段所影响，包括传统的方式如使用注射器和针头，或使用没有针头或针头很少的注射装置。后述的装置是众所周知的，而且，一般都是在皮肤上开一个小孔，通过压力进行转移。也可使用气压式一次性、针头较少的皮下注射用喷枪。抗原也能利用一个利用压缩气体将小粒子(如金粒子)转移到肌肉靶区域的biolistic转移装置进行给药，和气压的功能一样。Biolistic转移装置的例子是Dupont(Wilmington，Delaware)公司的PDS-1000“基因枪”。
另外，并不是想归咎于具体理论，发明人相信肌细胞表达的双特异抗体能到达循环***，而且通过它的一个结合位点结合到抗原呈递细胞的表面上。施用给个体的抗原在这种抗原呈递细胞表面被浓缩，因此能增强对抗原的免疫反应。
抗原可以和别的缓冲液或合适的液体配制成溶液一块施用。抗原也可和佐剂一块施用，其方法是将抗原和佐剂混合，或将抗原共轭或连接到佐剂上。许多佐剂都是已知的，包括弗氏佐剂(完全和不完全)，铝佐剂，胞壁酰二肽佐剂，BCG，LPS，Ribi佐剂***，TiterMax佐剂等。本领域的技术人员知道在给定的环境中使用那种佐剂。
在另一个实施方案中，不是施用抗原，而是使用表达载体去编码抗原，该载体和双特异抗体用同样的方法，即肌肉注射和电穿孔进行共表达。抗原可以由和编码抗体链的表达载体分开的表达载体编码，也可以由编码至少一条抗体链的载体编码。抗原和抗体可以转染到同一动物的相同或不同的肌细胞中。
在上述的不同的实施方案中，抗体含有临床上批准使用的所有抗体的结合特异性(参看表1)。
表1：已经批准的治疗用单克隆抗体列表
  批准年份   产品名称    靶抗原     公司   适应症 抗体类型
  1986   OrthocloneOKT3，muromonab-CD3   T淋巴细胞表面抗原CD3  Ortho Biotech，Raritan，NJ 器官移植排斥 鼠源的Mab
  1994   ReoPro，abciximab   血小板表面受体gpIIb/IIIa  Centocor，Malvern，PA 冠脉介入和血管成形术 衍生自嵌合Mab的Fab
  1995(只在德国)   Panorex，edrecolomab   17-1a，EpCAM  Centocor，Malvern，PA 大肠直肠癌 鼠源的Mab
  1997   Rituxan，Rituximab   B细胞表面抗原CD20  IDEC Pharma，SanDiego，CA 非何杰金氏淋巴瘤 嵌合Mab
  ReoPro，Abciximab   血小板受体gpIIb/IIIa  Centocor，Malvern，PA 高危不稳定性心绞痛 衍生自嵌合Mab的Fab
  Zenapax，Daclizumab   IL-2受体链(CD25)  Protein DesignLabs，Fremont，CA 肾移植排斥 人源化Mab
  1998   Herceptin，trastuzumab   人表皮生长因子类受体-2(HER-2)  Genentech，S.SanFrancisco，CA 转移性乳癌 人源化Mab
  Remicadeinfliximab   TNF-  Centocor，Malvern，PA 克隆氏症 嵌合Mab
  Simulect，basiliximab   IL-2受体链  Novartix Pharma，EastHanover，NJ 肾移植排斥 嵌合Mab
  Synagis，Palivizumab   呼吸道合胞病毒表面抗原“F”蛋白  MedImmune，Gaithersburg，MD 呼吸道合胞病毒病 人源化Mab
  1999   RemicadeInfliximab   TNF-  Centocor，Malvern，PA 类风湿性关节炎 嵌合Mab
  2000   Mylotarg，GemtuzumabOzogamicin   CD33  CelltechChiroscience，Slough，UK和Wyeth-Ayerst(美国本土产品)，Philadelphia，PA 旧病复发和年老病人中，CD33阳性急性骨髓性白血病的化疗用MAb 和加利车霉素交联的人源化Mab
  2001   Campath，alentuzu-mab(人源化单克隆抗体)   B-淋巴细胞  Millennium，Cambridge，MA和Ilex OncologySan Antonio，TX B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL) 人源化Mab
本发明方法也能用来测试重组抗体的生物性质，而不必制备表达抗体的转化或转导细胞系。因此，用至少一种表达载体注射个体的肌细胞，该表达载体编码抗体的重链和轻链，这样肌细胞对载体的摄入能导致抗体的分泌。也可对个体的生物性质进行原位评估，而不必取出表达抗体，或者从个体中获得表达抗体，然后在任何地方测试他的生物性质。例如，假设个体携带有合适的肿瘤，不必从个体中取出表达的抗体，就可以测试针对特定的肿瘤相关抗原的mAb在肿瘤治疗方面的生物性质。在一个优选的实施方案中，在注射部位给肌肉施加一个或多个电脉冲，以增加蛋白的表达。在一些实施方案中，可以用本领域众所周知的技术如添加，缺失，截短和点突变对编码抗体重链和轻链的DNA进行突变。根据本发明方法，通过表达该蛋白，可评估突变对抗原结合特异性的效果。
就免疫球蛋白而言，将要测试的生物性质包括，例如抗体特异性，补体激活，Fc受体介导的吞噬作用，信号级联放大的诱导等。通过表达直接从个体肌肉中来的基因，可以用更少的时间对重组mAb进行更有效的筛选。可以用本发明的方法对重组的表达抗体在体内展示生物活性的能力进行评估。实施例4(图6)所示的是，根据本发明方法，体内表达特异于B细胞表面标记的抗体能有效地耗尽这群细胞。体内出现的其他类型的生物活性也可用相似的方法进行评估。
本领域的技术人员将会意识到可以对本发明进行不同的修饰，而不用偏离本发明的精神和范围。参照下列不加限制的实施例，本发明将更详细地介绍。
实施例
实施例1：在肌细胞中对表达载体进行电穿孔之后，血清表达特异于I-Ed或IgDa的嵌合人/小鼠抗体
这个实施例显示的是，将在此情况下编码抗体重链和轻链的表达载体注射进骨骼肌后，导致完整的完全抗体的产生，并将抗体释放到个体循环***中去。用载体的混合物注射肌肉，其中每个载体分别编码抗体的重链或轻链，或者用编码两种链的一个载体注射肌肉，然后在注射部位进行电穿孔，紧接着设计一个试验去评估全长抗体的表达。就这点而言，制备了三个表达载体，构建的重链载体含有编码嵌合重链IgG3(鼠的V基因和人的C基因)的DNA，构建的轻链载体含有编码嵌合的人κ轻链(小鼠V基因和人C基因)的DNA，而组合载体(“combi”载体)含有编码嵌合重链和轻链的DNA。
A.抗体VH和VL区
从14-4-4S(ATCC，命名为“HB32”)小鼠杂交瘤中获得轻链和重链的V基因，该杂交瘤能产生一个特异于小鼠II类I-E MHC分子α链(决定簇Ia.7)的小鼠IgG2aκ抗体。Ozato等人，J.Immunol124：533(1980)。因此，14-4-4S是特异于I-Ed的小鼠IgG2a抗体。
关于TP-3抗体，编码14-4-4S轻链和重链V区核酸的克隆，主要采用的是以前Norderhaug等人在J.Immunol.Methods 204，77(1997)中介绍的方法。简而言之，从14-4-4S杂交瘤中制备cDNA，利用一套简并上游引物和下游引物扩增VL和VH基因，其中上游引物和各种不同的免疫球蛋白前导区序列退火，而下游引物和重链的CH1或轻链的Cκ退火。然后对PCR产物进行测序，并且设计与克隆的V区末端退火的特异性PCR引物。设计的这些PCR引物包括限制性酶切位点(下面划线并且是黑体)，其中上游VL引物含有BsmI位点，下游引物含有BsiWI位点，而上游的VH引物含有MfeI位点，下游的VH引物则含有BsiWI位点。引物序列如下：
5′VL(上游)：
5′-GGTG TGCATTCCGACATTGTTCTGACACAGTCTCC-3’(SEQID NO：1)
3′VL(下游)：
5’-A CGTACGTTCTACTCACGCTTGATTTCCAGCTTGGTGCC-3’(SEQ ID NO：2)
5′VH(上游)：
5′-CAGGTC CAATTGCAGCAGTCTGG-3’(SEQ ID NO：3)
3′VH(下游)：
5′GA CGTACGACTCACCTGAGGAGACCGTGACTGAGGTT-3’(SEQ ID NO：4)
编码14-4-4S VL和VH区的序列可以从EMBL GenBank公共数据库中获得，登录号分别是AF292646和AF292391。
基本上是用Lunde等人，Nature Biotechnology 17，670(1999)中介绍的方法获得Ig(5a)7.2杂交瘤中的VL和VH区，而杂交瘤能产生一个对鼠源IgD(IgDa)异型特异的鼠单克隆抗体。
B.抗体表达载体
用Norderhaug等人在J.Immunol.Methods 204，77(1997)中介绍的方法制备抗体链表达穿梭载体pLOH2和pLNOκ。
如上述方法制备14-4-4S的VL，用BsmI和BsiWI进行酶切，将酶切片断克隆进用同样的酶消化的载体pLNOκ中，从而得到一个嵌合的人/小鼠κ轻链，它带有来自14-4-4S抗体的VL区和来自载体的人κ恒定区(14-4-4SVL/人Cκ)。如上述方法制备14-4-4S的VH，用MfeI和BsiWI进行酶切，将酶切片断克隆进用同样的酶消化的载体pLNOH2中，从而得到一个嵌合的人/小鼠γ3重链，它带有来自14-4-4S抗体的VH区和来自载体的人γ3恒定区(14-4-4SVH/人γ3)。在Lunde等人的J.Immunol.168，2154-2162(2002)中介绍了这些14-4-4S嵌合抗体重链和轻链穿梭载体。
如Lunde等人在Molecular Immunology 34，1167(1997)中介绍的方法将14-4-4S中使用的γ3重链序列突变，使得其能编码11个氨基酸的肿瘤特异的T细胞表位，这个表位来自小鼠MOPC315肿瘤的骨髓瘤蛋白。参看Bogen和Weiss，Int.Rev.Immunol.10，337(1993)；Bogen等人，Eur.J.Immunol，16，1373(1986)；Bogen等人，Loc.cit.16，1379(1986)。这种突变并不会影响抗体的分泌和折叠。Lunde等人，同上，2002。
用Norderhaug等人在J.Immunol.Methods 204，77(1997)中介绍的方法制备combi载体。简而言之，从pLNOK/14-4-4S VL中分离出一个2.6kb的BglII-BamHI片段，这个片段包括CMV启动子，VL和Cκ，然后把这个片段亚克隆进pLNOH2的用碱性磷酸酶处理的BamHI限制性位点。
用制备抗I-Ed抗体载体相同的方法制备编码人/鼠嵌合的抗小鼠IgDa抗体的载体，只是重链和轻链的可变区是从Ig(5a)7.2杂交瘤中克隆出来的，该杂交瘤能产生一个对鼠源IgD(IgDa)异型特异的单克隆抗体。参看Lunder等人的Nature Biotechnology 17，670(1999)。简而言之，将Ig(5a)7.2(IgDa抗体)的VL克隆进pLNOκ，获得一个嵌合的人/小鼠γ轻链，它带有来自Ig(5a)7.2抗体的VL区和来自载体Ig(5a)7.2的人κ恒定区(VL/人Cκ)。将Ig(5a)7.2的VH克隆进pLNOH2，获得一个嵌合的人/小鼠γ3重链，它带有来自Ig(5a)7.2抗体的VH区和来自载体Ig(5a)7.2的人γ3恒定区(VH/人γ3)。
C.注射和电穿孔
将载体DNA(100μg)肌内注射入不同小鼠，包括Balb/c小鼠(II类MHCI-Ed阳性)，C57BL小鼠(II类MHC I-Ed阴性)，B10-D2小鼠，BALB.B小鼠和C.B.-17小鼠的四头肌。载体DNA在0.9％的NaCl中稀释，并被注射入两块四头肌中(50μg/50μL/四头肌)。一组小鼠注射入combi载体，而另一组小鼠注射了单独重链和轻链载体的混合物。注射后进行电穿孔，将电极放在肌肉的注射部位，施加一个电压，含有10列，每列有1000个脉冲，脉冲长度是2×200μsec(正200μsec和负200μsec)，每个脉冲的间隔是600μs，电流极限是50mA(大约是150-174V/cm)。每一列脉冲有1秒的间隔。在皮肤上使用导电胶。在更大的动物中，电极可被***肌肉中。
D.分析
通过ELISA来检测mAb的水平。参看例如Lauritzsen等人的Scand.J.Immunol.33，647-656(1991)。简而言之，在塑料微量滴定板上(CostarPolystyrene Highbinding)涂上50μl单克隆抗-人IgG3(Sigma，I-9763)(如果要检测嵌合的人IgG3 mAb，应该涂上抗I-Ed和IgD)，在4℃至少过夜，其中50μl IgG3以1∶5000在含有叠氮化合物的PBS中稀释，而为了防止进一步的非特异性结合，滴定板上的小孔用含有0.5％BSA的PBS处理(在室温下至少处理10分钟)，进行封闭。然后用洗脱缓冲液(含有0.1％TWEEN的PBS)冲洗滴定板4次。
使不同天数(如0，7，14，21和28天)获取的小鼠血样品凝结。分离出血清，按1∶5在含有0.2％BSA和0.2％TWEEN的PBS(稀释缓冲液)中稀释。稀释的血清样品加到封闭的微量滴定板上，在37℃培养1h。人IgG3(Sigma，1-4389)作为标准。滴定板孔在洗脱缓冲液中冲洗四遍，然后加入生物素化的抗人IgG3(Sigma，B-3523；按1∶2000稀释在稀释缓冲液中)和生物素化的抗人κ抗体(sigma，B-1393)，滴定板在4℃培养过夜。用洗脱缓冲液冲洗滴定板四遍，然后加入链霉抗生物素-碱性磷酸酶交联剂(Amersham Life Science；按1∶3000稀释在稀释缓冲液中)，平板在37℃培养1h。最后冲洗后，加入磷酸酶底物(Sigma，对硝基苯基磷酸二钠，5mg/片，使用浓度1mg/ml)，滴定板在室温培养10-30min。检测405nm处的光密度。
E.结果
检测C57BL/6小鼠血清中抗体重链，得到的嵌合抗体数量如图1所示。第一次检测血清中的嵌合抗体是在电穿孔后约3-6天。将分别编码嵌合的抗I-Ed的H和L链基因的质粒共同注射，或者单独注射含重链和轻链基因的“combi”质粒，只能诱导出痕量的血清mAb，几乎检测不到(图1A)。然而，在注射完质粒DNA后，紧接着进行体内电穿孔，电穿孔的电压很低，在注射部位的皮肤上施加高频率的电脉冲，血清mAb的水平会显著上升(图1A)。因此，电穿孔能增加来自Ig基因的mAbs的产量，其中Ig基因是以裸露的质粒DNA的形式注射的。此外，就体内随即发生的表达而言，Ig H和L链基因并不必在同一个质粒上。由重链和轻链组成的抗体用ELISA表示。用同一个ELISA对重链和轻链进行检测，得到的结果和图1A所示重链的结果一样。
用嵌合抗体转染具不同遗传背景的小鼠，然后检测I-Ed(通过抗I-EdmAb检测的抗原)的组织表达是否会影响嵌合抗体的表达水平，嵌合抗体在循环***中是能检测到的，从而获得关于表达的嵌合抗体保持它的抗原结合特异性的证据。出于这个目的，将编码衍生自抗体14-4-4S的γ3嵌合重链和人/鼠嵌合轻链的combi载体电穿孔入I-Ed阳性小鼠(Balb/c)和I-Ed阴性小鼠(C57BL/6)的小鼠骨骼肌中，并检测循环***中嵌合抗体的表达水平。图1B显示，嵌合I-Ed抗体在不表达I-Ed的C57BL/b小鼠中是可检测的，而在表达该抗原的BALB/c小鼠中不是可检测的。在表达抗原的小鼠中检测不到抗体说明了产生的抗体是抗原特异的。
为了证明在这些试验中的控制因子是I-Ed表达，而不是小鼠品系的其他遗传特征，在MHC-同类系的BALB.B小鼠和同类系的B10.D2小鼠中检测注射/电穿孔了14-4-4S H和L载体的肌肉，其中BALB.B小鼠除了具有MHC H-2b单元型从而缺乏I-Ed外，和BALB/c完全一样，而同类系的B10.D2小鼠除了具有H-2d单元型从而能表达I-Ed外，和C57B1/6几乎完全一样。如图1C所示，在BALB.B(I-Ed阴性)血清中能检测到mAb，而在能表达I-Ed的BALB/c小鼠血清中检测不到。同样地，图1C所示在不能表达I-Ed的C57BL/6血清中能检测到mAb，而在能表达I-Ed的B10.D2的小鼠血清中检测不到。在不能表达I-Ed的小鼠血清中，14-4-4S抗体的数量上升，这个结果证明了表达有14-4-4S嵌合抗体mAb的血清对其抗原(I-Ed)是特异的。
IgDa抗体表达后可以得到相似的结果，其中可变的H和L链衍生自Ig(5a)7.2杂交瘤(图1D)。在这种情况下，将两个分别编码H和L链的质粒共注射入骨骼肌中，并进行电穿孔。人IgG3 ELISA所示的是C.B-17小鼠血清中的嵌合IgDa抗体，C.B-17小鼠缺乏IgDa，但能表达IgDb。相反，嵌合的IgDa抗体在BALB/c小鼠血清中检测不到，BALB/C小鼠能表达IgDa，但和C.B-17几乎完全一样。C.B-17小鼠中抗IgDamAb的血清水平能达到大约300ng/ml，这要显著高于抗I-EdmAb。不表达IgDa异型的小鼠中血清Ig(5a)7.2抗体的上升，这些结果证明了血清表达的Ig(5a)7.2嵌合抗体对其抗原(IgDa异型)是特异的。
因为mAb和抗原的结合取决于H和L链的正确连接，图1B-D的结果支持肌细胞分泌的mAb是组装好的四聚体，具有正确的特异性，而且mAb达到远端组织，在这里，它被靶抗原表达细胞或组织吸收。对电穿孔动物血清中的免疫球蛋白进行物理分析支持了这些结论。简而言之，蛋白G Sepharose珠和共施用了表达载体的小鼠血清进行一起培养，其中表达载体编码嵌合的抗IgDamAb的重链和轻链，载体是通过肌内注射，然后在注射部位进行电穿孔。将分离的抗体洗脱下来，为了分离重链和轻链，可以用巯基乙醇处理或不用巯基乙醇处理。在凝胶电泳和杂交后，杂交产物用抗人IgG3或抗Cκ抗体进行显影。图2的Western杂交结果显示小鼠血清中的人γ3重链和κ链联系在一起。可以从夹心ELISA中获得相似的结论，ELISA能从处理过的动物血清中鉴定出同样分子大小的重链和轻链(ELISA用抗人γ3作为涂层抗体，而抗人Cκ作为检测抗体)。
如图1B和1C所示，7-14天的C57B1/6小鼠中I-Ed特异性血清mAb突然下降，原因是针对mAb外来部分即人γ3和Cκ(表1)的免疫反应。为了评估这种可能性，使用涂有人IgG3(Sigma，I-4389)的滴定板制备ELISA，用生物素化的抗小鼠IgG1或生物素化的抗小鼠IgG2a检测抗Ig抗体。另外，除了血清是连续稀释之外，ELISA和以前做的一样。
结果显示，抗I-EdmAb的下降和IgG1和IgG2a亚类的小鼠抗人IgG3抗体增加相一致，在注射后28天检测，具有很高的滴度(图3)。不仅可以在mAb水平高的I-Ed阴性品系中检测到IgG3mAb，而且可以在mAb水平很低或检测不到的阳性品系中检测到(图3A和3B)。这个结果表明，尽管事实上嵌合抗体看起来已经被血清迅速的吸收，但是可以在I-Ed阴性品系中产生足量的嵌合I-Ed特异的mAb，以用来对小鼠进行免疫。用嵌合的抗IgDamAb转染28天后的小鼠血清中也出现了抗免疫球蛋白(图3C)。显著的是，和转染了I-Ed抗体的小鼠相比，C.B-17小鼠产生相对较少的抗人IgG3抗体，尤其是IgG2a亚类。这种差异和抗IgDa嵌合mAb的更高血清浓度，不同V区的使用，或Balb/c背景基因的影响有关。
实施例2：去掉异种序列，可以使抗体在体内血清中进行长期表达
从表达的单克隆抗体中去掉异种序列，确定降低的免疫原性是否会增加重组抗体在血清中表达的数量或时间。在第一个实验中，对嵌合IgDa抗体(在这个抗体中，VH衍生自Ig(5a)7.2，而CH衍生自人γ3链)的重链载体进行修饰，去掉人γ3恒定区，并用小鼠的γ2b恒定区取代。产生的载体pLNOH2γ2bVHT(Lunde等人，同上，1999)带有Ig(5a)7.2的可变区，和相应的人/小鼠嵌合轻链载体(pLNOκVLT；Lunde等人，同上，1999)共注射入肌肉中。表达的抗体因此是部分嵌合的，它带有安全的小鼠重链，和嵌合的人/小鼠轻链。
血清分析方法如下：将NIP2.6BSA涂布在滴定板孔上，接着结合小鼠IgD抗NTP，而小鼠IgD抗NTP是从细胞转染子中获得。加入血清样品，使用抗小鼠IgG2b-生物素确定结合性。
关于小鼠CH/人CκIgDa特异性抗体的结果显示，随后的电穿孔对于获得相当地可检测的表达是必需的。而且最好的表达是在不能表达IgDa异型靶抗原的小鼠中获得的(即C.B-17小鼠)。在C.B-17小鼠体内，1-5周后，血清mAb高达750ng/ml，然后开始慢慢下降。甚至在7个月后，在小鼠血清中仍还有-300μg/ml。这种抗体的完全嵌合型具有较低的最大表达水平并且下降得更快(与图1D比较)。这样，通过去除抗体的异种部分，可增加并延长在血清中的存在。
另一相似的试验是表达特异于半抗原NIP的小鼠IgG2b抗体。将克隆进载体pSV2gptVNP(Neuberger，EMBO J.2，1373(1983))的鼠源NIP特异抗体的VH基因克隆到人γ3重链上游，形成载体pLNOH2(Norderhaug等人，J.Immunol.Methods 204，77(1997))。如Eidem等人在J.Immunol.Methods 245，119(2000)中介绍的那样，用小鼠IgG2恒定链序列取代pLNOH2中的人IgG3编码序列，得到载体pLNOH2-γ2b，小鼠IgG2恒定链序列衍生自BALB/c衍生的骨髓瘤细胞系MPC-11。参看Lang等人，Nucleic Acids Res.10，611(1982)。编码鼠源NIPλ轻链的DNA(Celltech limited)被克隆进表达载体，将它和pLNOH2-γ2b共电穿孔进肌肉。结果获得完全的鼠源NIP特异抗体，它带有来自λ的恒定区。
用实施例1所述的方法对Balb/c小鼠肌肉进行电穿孔。在电穿孔后的第0，3，7，14天和第4，5，和8周抽取小鼠血清。除了滴定板是用NIP2.6BSA(即每BSA分子有2.6个NIP分子)涂布，而侦测抗体是抗IgG2b-生物素(Pharmingen，目录号02032D)外，血清的ELISA分析基本上是按照实施例1所述的方法进行的。纯化杂交瘤细胞系产生的抗-NIP抗体，把它当作标准。杂交瘤细胞表达λ1基因，而且通过用相同的NIP特异的重链构建体转染，表达有功能的NIP特异抗体，该构建体是用来对小鼠肌肉进行电穿孔的。参看Eidem，J.Immunol.Methods 245，119(2000)。
在两个独立的实验(图4B和插图)中，对注射和电穿孔过的BALB/c小鼠血清的NIP抗体进行检测，发现在其血清中有显著量的抗NIP的mAb，这是在ELISA中，通过它们结合NIP-BSA的能力来检测的，在2-5周检测到的最大数量是60-100ng/ml。血清抗体水平下降缓慢，但在注射DNA后30周，它的浓度仍有50ng/ml(图4B，插图)。电穿孔对血清中mAb的检测是必要的。注射10和100μg质粒(在每个四方肌中分别是50μg和5μg)的结果相似，但是数量越低，变异性就越高(主图)。图4B插图中的小鼠总共注射了50μg载体。
实施例3：补体介导下，血清中表达的抗体对细胞的裂解
通过确定血清表达的抗体和它的抗原结合是否能激活补体，对表达抗体的完整性进行评估。用介绍的方法进行补体介导的细胞裂解(CML)。Michaelsen等人，Scand.J.Immunol.32，517-528(1990)；Aase等人，J.Immunol.Methods 136，185-191。简而言之，通过将细胞和兔抗SRBC NIP-15-Fab′片段进行共培养，发现51CR标记的绵羊红细胞(SRBC)对NIP是敏感的。根据本发明，在血清中表达的NIP鼠源抗体的连续稀释液被加到NIP敏感的51CR SRBC中。人血清用作补体来源。从重组细胞中表达的相同NIP抗体以及纯化的NIP抗体被用作对照。根据公式计算细胞毒性指数(CI)：％CI＝[(检测的cpm-自发的cpm)/(最大的cpm-自发的cpm)]×100。图5的结果显示，注射了载体和进行了电穿孔处理的小鼠血清中的抗-NIP mAb能够激活补体，导致红细胞裂解。结果显示，肌肉产生的NIP mAb的Fc区在功能上是激活补体。
实施例4：补体介导下，血清表达的抗体对细胞的裂解
BALB/c小鼠注射了编码抗IgD的DNA，或者没注射，然后进行电穿孔。7天后，将血液收集在肝素溶液中，从而避免了凝结。在同一个样品中加入裂解缓冲液(Becton Dickinson)，裂解红细胞。冲洗细胞，并重悬在含有不同针对细胞标记的抗体的染色缓冲液(PBS和0.5％BSA)中。使用的抗体是FITC-IgD，PerCP-B220/CD45R和PE-TCRCβ，它们分别特异于IgD和B200(在B细胞中)和T细胞受体(在T细胞中)。染色后，冲洗细胞，重悬在固定缓冲液中(PBS和2％低聚甲醛)，用流式细胞仪进行分析。
结果按用这个方法处理或没处理的小鼠血液中T细胞中的B细胞％表示。每个组用5只小鼠。如图所示，当小鼠施用了载体，并进行了电穿孔，将血液中的IgD和B220阳性细胞耗尽。在这种情况下，肌细胞产生后个体中的表达抗体具有生物活性。

Claims (36)

1.至少一种表达载体在制备用于产生蛋白的药物组合物中的应用，其中所述至少一种载体(1)编码含至少两条不同多肽链的蛋白，而且当注入受试者肌肉中时，(2)导致多肽链的产生和蛋白的分泌。
2.至少一种编码药用蛋白的表达载体在制备用来治疗对该蛋白反应的疾病或状态的药物中的应用，其中至少一种载体(1)编码药用蛋白，所述蛋白包括至少两种不同的多肽链，而且当注射入受试者肌肉中时，(2)导致多肽链的产生和药用蛋白的分泌。
3.至少一种表达载体在制备用于在受试者中产生抗体的药物组合物中的应用，其中(1)所述的至少一种载体编码含至少两条不同多肽链的蛋白，其中至少一条链呈现抗原决定簇，并且当注入受试者肌肉中时，(2)所述载体导致多肽链的产生和蛋白的分泌，使得所述的受试者产生针对所述决定簇的抗体。
4.至少一种表达载体在制备用于在受试者中产生针对抗原的抗体的药物组合物中的应用，其中(1)所述的至少一种载体编码双特异抗体的重链和轻链，所述双特异抗体的第一个抗原结合位点特异于受试者抗原呈递细胞表面标记，而第二个抗原结合位点特异于免疫反应所需的抗原，当注射入受试者的肌肉中时，(2)所述载体导致多肽链的产生和蛋白的分泌，而当抗原被施用给受试者时，(3)所述抗原被双特异抗体靶向到抗原呈递细胞，使得所述受试者产生针对所述抗原的抗体。
5.至少一种表达载体在制备用于引发受试者中的抗体的药物组合物中的应用，所述抗体针对融合在抗体重链或轻链上的肽，其中(1)所述载体编码抗体的轻链和重链，所述抗体特异于受试者抗原呈递细胞表面标记，而且当注射入受试者肌肉中时，(2)所述载体导致多肽链的产生和融合在肽上的抗体的分泌，使得所述受试者产生针对该肽的抗体。
6.至少一种表达载体在制备用于检测蛋白的生物活性的药物组合物中的应用，其中(1)所述载体编码一种含有至少两条多肽链的蛋白，而且当被注射入受试者肌肉中时，(2)所述载体导致多肽链的产生和蛋白的分泌，从而检测该蛋白的生物活性。
7.根据权利要求1-3或6任一项所述的应用，其中所述蛋白是免疫球蛋白。
8.根据权利要求7所述的应用，其中所述免疫球蛋白是抗体。
9.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其中所述载体编码全长链。
10.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其中所述受试者是人。
11.根据权利要求4，5或7任一项所述的应用，其中所述免疫球蛋白或抗体具有来自人免疫球蛋白的恒定区序列。
12.根据权利要求4，5或7任一项所述的应用，其中所述免疫球蛋白或抗体具有来自人免疫球蛋白的可变区序列。
13.根据权利要求4，5或7任一项所述的应用，其中所述免疫球蛋白或抗体是鼠源的。
14.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其中所述的注射包括通过针头将载体导入肌肉。
15.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其中所述的注射涉及通过biolistic转移将载体导入肌肉。
16.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其中所述的至少一种载体是至少两种载体，并且其中所述的每一条链由不同的载体编码。
17.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其中所述的应用进一步包括下列步骤：将电极放在所述注射部位附近，使得电流通过电极穿过注射位点，并能瞬时增加肌细胞膜的穿透性。
18.根据权利要求17所述的应用，其中所述的肌细胞膜通透性的瞬时增加可以通过电流实现，其中电流所具有的场强大小是约25-300V/cm。
19.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其中所述的肌肉是骨骼肌。
20.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其中所述的蛋白含有一个或多个受试者外来的抗原决定簇，使得所述产生对受试者中表达的蛋白形成免疫反应。
21.根据权利要求20所述的应用，所述的免疫反应包括在受试者血清中产生抗体，所述抗体针对蛋白上外来的一个或多个抗原决定簇。
22.根据权利要求3-6和20任一项所述的应用，其中所述的抗体是从受试者的液体中获得的。
23.根据权利要求22所述的应用，其中所述的液体是血清。
24.根据权利要求4和5任一项所述的应用，其中所述的细胞表面标记选自II类MHC分子，B7分子，IgD，Fc受体，CD40和Toll受体。
25.根据权利要求4和5任一项所述的应用，其中所述的双特异性抗体由单独的重链和轻链组成。
26.根据权利要求4和5任一项所述的应用，其中所述的双特异性抗体是一条单独的多肽。
27.根据权利要求4所述的应用，其中所述的第二个结合位点特异于一种肽序列，而且其中所述的抗原被改造后含有该多肽序列。
28.根据权利要求4所述的应用，其中所述的抗原通过在受试者中重组表达抗原而得以施用。
29.根据权利要求5所述的应用，其中所述的抗原被融合到抗体的重链上。
30.根据权利要求5所述的应用，其中所述的抗原被融合到抗体的轻链上。
31.根据权利要求6所述的应用，其中所述的生物活性出现在受试者中。
32.根据权利要求6所述的应用，其中所述的蛋白从受试者中获得，而且检测了生物活性。
33.根据权利要求6所述的应用，其中所述的蛋白是抗体。
34.根据权利要求32所述的应用，其中所述的生物活性是抗原特异性。
35.根据权利要求32所述的应用，其中所述的载体编码每个全长轻链和全长重链。
36.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其中编码多肽的所述核酸已被突变。
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