CN102985109B - 同型二聚体蛋白质构建体 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及重组融合蛋白，如被称为疫苗体的基于人抗体的分子，其能够引发T细胞和B细胞免疫应答。本公开还涉及通过这些特殊的融合蛋白治疗癌症或传染病的方法。

Description

同型二聚体蛋白质构建体
发明领域
本发明涉及新的重组融合蛋白，如被称为疫苗体(Vaccibody)的基于人抗体的分子，其能够引发T细胞和B细胞免疫应答。本发明还涉及通过这些特殊的融合蛋白治疗癌症或传染病例如多发性骨髓瘤或流感的方法。
发明背景
DNA接种是一种在技术上简单的诱发免疫应答的方式。然而，在小动物中的成功还未在临床试验中重复。目前进行数种策略以增加DNA疫苗的效力。
将蛋白质抗原靶向抗原递呈细胞(APC)可以改善T细胞和B细胞应答。重组免疫球蛋白(Ig)分子非常适合此目的。例如，短的抗原表位可以代替Ig恒定结构域中的β链之间的环，同时通过给重组Ig配备对APC上的表面分子特异的可变(V)区获得定向的抗原递送。然而，这样的策略不适合含未识别的表位的较大的抗原，此外，具有短的T细胞表位的重组Ig分子不能诱发针对构象表位的抗体。为克服这些限制，已经生产出基于定向的Ig的同型二聚体DNA疫苗(疫苗体)，其表达大小为至少550aa并保持构象表位的传染性或肿瘤抗原。
趋化因子(C-C基序)配体3(CCL3)是人中的蛋白质，其由CCL3基因编码。CCL3，也被称为巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)，是属于CC趋化因子家族的细胞因子，其参与多形核白细胞的招募和活化中的急性炎症状态。虽然小鼠CCL3是编码69个氨基酸的成熟趋化因子的单拷贝基因，已经将人同系物复制并突变从而产生两个非等位变体，LD78α(CCL3)和LD78β(CCL3-L1)，两者都显示与小鼠CCL3具有74％同源性。
由于缺乏效力，目前还没有DNA疫苗被批准用于人用途。同样，没有可用于数种传染病的有效疫苗。尤其，没有治疗性DNA癌症疫苗被批准用于人用途。
WO2004/076489涉及被称为疫苗体的基于重组人抗体的分子，其能够引发T细胞和B细胞免疫应答。
US20070298051涉及MIP-1-α在增强哺乳动物中对免疫原的免疫应答中的用途。
EP920522涉及多核苷酸载体疫苗，所述多核苷酸载体疫苗包含cDNA目标产物，该目标产物包含编码细胞因子或趋化因子的核苷酸序列。
FredriksenAB等(MolTher2006；13：776-85)涉及将肿瘤抗原靶向抗原递呈细胞的DNA疫苗。
FredriksenAB和BogenB(Blood2007；110：1797-805)涉及小鼠趋化因子独特型融合DNA疫苗。
发明目的
本发明的实施方案的一个目的是提供融合蛋白，所述融合蛋白对甚至是弱的抗原(如来源于例如骨髓瘤细胞的独特型抗原)仍能够引发有效免疫应答。
此外，本发明的实施方案的一个目的是提供多核苷酸，如DNA多核苷酸，所述多核苷酸编码融合蛋白，所述融合蛋白对甚至是弱的抗原(如来源于例如骨髓瘤细胞的独特型抗原)仍能够引发有效免疫应答。这些多核苷酸可以用作针对癌症或传染病的免疫刺激组合物或疫苗，特征在于疾病特异性或疾病相关的抗原。
发明概述
本发明人已经发现，人趋化因子LD78β(其全长和截短版本两者)适合用作将抗原表位靶向APC的表面的靶向单元(targetingunit)。趋化因子或其截短版本以同型二聚体蛋白质构建体的形式结合到APC表面上的趋化因子受体，这有助于两种相同的趋化因子结合从而提供更有效的寻靶和信号传导。同型二聚体构建体还提供将两种相同的抗原表位递送到APC，其又将它们递呈到T细胞。甚至对于相对较大尺寸的同型二聚体蛋白质构建体，细胞仍能够生产并输出完整分子。
所以，在第一方面，本发明涉及两个相同的氨基酸链的同型二聚体蛋白质，每个氨基酸链包含靶向单元，所述靶向单元包含与SEQIDNO：1的氨基酸序列5-70具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和抗原单元，所述靶向单元和所述抗原单元通过二聚化基序连接。
在第二方面，本发明涉及两个相同的氨基酸链的同型二聚体蛋白质，每个氨基酸链包含靶向单元，所述靶向单元包含SEQIDNO：1的氨基酸3-70；以及抗原单元，靶向单元和抗原单元通过二聚化基序连接。
在第三方面，本发明涉及核酸分子，所述核酸分子编码能够形成根据本发明的同型二聚体蛋白质的单体蛋白质。
在另一方面，本发明涉及根据本发明的同型二聚体蛋白质；其用作药物。
在另一方面，本发明涉及核酸分子，所述核酸分子编码能够形成根据本发明的同型二聚体蛋白质的单体蛋白质；所述核酸分子用作药物。
在另一方面，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明的同型二聚体蛋白质。
在另一方面，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包含核酸分子，所述核酸分子编码能够形成根据本发明的同型二聚体蛋白质的单体蛋白质。
在另一方面，本发明涉及宿主细胞，所述宿主细胞包含核酸分子，所述核酸分子编码能够形成根据本发明的同型二聚体蛋白质的单体蛋白质。
在另一方面，本发明涉及制备根据本发明的同型二聚体蛋白质的方法，所述方法包括
a)将根据本发明的核酸分子转染到细胞群中；
b)培养所述细胞群；
c)收集并纯化由所述细胞群表达的同型二聚体蛋白质。
在另一方面，本发明涉及针对癌症或传染病的疫苗，所述疫苗包含免疫学有效量的根据本发明的同型二聚体蛋白质或编码能够形成根据本发明的同型二聚体蛋白质的单体蛋白质的核酸分子，其中所述疫苗能够引发T细胞和B细胞免疫应答，并且其中所述同型二聚体蛋白质包含与所述癌症或传染病相关的抗原单元。
在另一方面，本发明涉及针对癌症或传染病的免疫调节或免疫刺激组合物，其包含免疫学有效量的根据本发明的同型二聚体蛋白质或编码可以形成根据本发明的同型二聚体蛋白质的单体蛋白质的核酸分子，其中所述免疫调节或免疫刺激组合物能够引发T细胞和B细胞免疫应答，并且其中所述同型二聚体蛋白质包含与所述癌症或传染病相关的抗原单元。
在另一方面本发明涉及治疗患者的癌症或传染病的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用根据本发明的同型二聚体蛋白质，或编码可以形成根据本发明的同型二聚体蛋白质的单体蛋白质的核酸分子，其中所述同型二聚体蛋白质包含与所述癌症或传染病相关的抗原单元。
附图说明
图1.用于本研究的融合疫苗。(A)同型二聚体趋化因子-抗原融合蛋白(疫苗体)的示意结构。靶向、二聚化和抗原单元被指示为以不同单元表示的部分。在所有构建体中，二聚化单元和铰链来源于人IgG3。G3S2G3SG接头将铰链外显子h1+h4连接到CH3结构域。GLSGL接头连接CH3和抗原单元，而(G4S)3接头连接抗原单元中的VH和VL。(B)人CCL3同种型的NH2端序列(aa.1-12)，以及它们的点突变对照(C11S，粗体显示)。短横线表示缺失。(C)推定C11S点突变破坏趋化因子结构中的S-S桥(右)。
图2.通过ELISA和蛋白质印迹法表征表达LD78β的疫苗体。通过使用对疫苗体分子的不同组分具有特异性的mAbs在ELISA中测试在第5天收集的瞬时转染的293E细胞的上清。(A)，通过结合DNP-BSA涂层(DNP-BSAcoat)(结合scFv315)和利用生物素化的HP6017(结合CH3二聚化基序)检测来评估具有显示的靶向单元的编码scFv315的疫苗体。(B)，通过结合187.1mAb(结合小鼠Cκ)涂层和利用生物素化的187.1mAb检测来评估具有显示的靶向单元的编码CκCκ的疫苗体，(C)，通过结合MCA878-G(抗-CH3二聚化基序)和利用生物素化的抗-HAmAbH36-4-52检测来评估具有显示的靶向单元的编码HA的疫苗体，(D)，在非还原条件下利用生物素化的HP6017作为探针的疫苗体的蛋白质印迹。左至右，(LD78βFv315)2，(LD78βC11SFv315)2和(LD78β-2Fv315)2。
图3.LD78β疫苗体蛋白质结合人细胞上的趋化因子受体。显示的同型二聚体疫苗体蛋白质以25μg/mL与稳定转染有人CCR5(A，B)或人CCR1(C，D)的HEK293细胞混合。通过对scFv315抗原单元具有特异性的生物素化的Ab2.1-4mAb并且随后利用PE-链霉亲和素检测结合的疫苗体蛋白质。粗线：(LD78βFv315)2(A，C)和(LD78β-2Fv315)2(B，D)疫苗体。(A)中的虚线：(LD78β(C11S)Fv315)2。阴影直方图：单独的生物素化的Ab2.1-4mAb和PE-链霉亲和素。
图4.LD78β疫苗体蛋白质结合小鼠趋化因子受体并诱发鼠细胞的趋化作用。(LD78βFv315)2疫苗体(空白直方图)，而不是C11S变体(阴影直方图)结合CD11b+BALB/c脾细胞(A)并且显示对淋巴细胞Esb/MP细胞的趋化活性(B)。
图5.具有LD78β靶向单元的疫苗体有效地将抗原递送到用于MHCII类限制的向CD4+T细胞的递呈的小鼠(A)和人(B)APC。(A)将不同量的纯化的具有scFv315作为抗原单元的疫苗体与经照射(8gy)的BALB/c脾细胞混合，随后加入来自TCR转基因小鼠的Id(λ2315)特异性Th2T细胞。在48小时后，将培养物用3H胸腺嘧啶脉冲24小时。(B)将不同量的来自瞬时转染的293E细胞的含小鼠Cκ的疫苗体上清(表示为CκCκ的摩尔浓度(M))与DR4*01PBMC混合，然后将其照射并与小鼠Cκ特异性T18T细胞混合。48小时后，用3H胸腺嘧啶对平板进行24小时的脉冲。
图6.在用LD78βFv315疫苗体DNA免疫的小鼠中的抗-Id315免疫应答。通过皮内施用DNA并且随后立即进行注射位点的电穿孔来免疫小鼠。疫苗体和对照的类型被指出。测试3周后获得的血清的结合M315骨髓瘤蛋白的抗-IdIgG1(A)或IgG2a(B)抗体。显示多至7只小鼠/组的平均值。P值表示在第4周LD78β对LD78β(C11S)(*)，以及LD78β对(FvNIP)2疫苗体(**)。
图7.通过LD78β-疫苗体诱发CD4+和CD8+流感血凝素特异性T细胞应答。通过皮内施用DNA并且随后立即进行注射位点的电穿孔(Dermavax，Cytopulse，USA)来免疫小鼠(n＝3)。疫苗体和对照的类型被指出。3周后处死小鼠，并且将个体脾细胞混悬液用于ELISPOT测定，所述测定使用MHCII类和I类限制的合成的HA肽，或不相关的肽。评估IFNγ应答。p值表示LD78β对LD78βC11S，以及LD78β对0.9％NaCl(*)，和LD78βC11S对0.9％NaCl(**)。
图8.LD78β疫苗体结合猕猴(rhesusmacaque)CCR5。将疫苗体蛋白质以25μg/mL与稳定转染有猕猴CCR5的HEK293混合。通过对scFv315抗原单元特异的生物素化的Ab2.1-4mAb以及随后的PE-链霉亲和素，检测结合的疫苗体蛋白质。在(A)中粗线表示疫苗体(LD78βFv315)2，而在(B)中表示(LD78β-2Fv315)2。(A)中的虚线表示(LD78β(C11S)Fv315)2疫苗体。在A和B中，阴影直方图表示单独的生物素化的Ab2.1-4mAb和PE-链霉亲和素。
图9.保护以避免致死的流感攻击。用25μgDNA结合电穿孔(DermaVax)经皮内免疫Balb/c小鼠一次，并在14天后用致死剂量的PR8流感病毒(H1N1)攻击(n＝6/组)。
发明详述
需要提高DNA疫苗的效力。在小鼠中有希望的策略是构建DNA，所述DNA编码融合蛋白，所述融合蛋白经由趋化因子受体将抗原靶向抗原递呈细胞(APC)。关键的是将此用以改善DNA疫苗的策略扩展至大动物和人。根据本发明，人MIP-1α趋化因子可以与不同的抗原单元融合。所述融合蛋白分别保持靶向单元和抗原单元的功能活性和构象正确性。融合蛋白可以提高克隆的人CD4+T细胞的应答。此外，因为LD78β融合蛋白结合小鼠趋化因子受体，所以可以在小鼠中测试人DNA疫苗。在质粒注射和皮肤电穿孔后，根据本发明的LD78βDNA融合疫苗在小鼠中诱发提高的T细胞和抗体应答。CD8+T细胞应答尤其被加强，表示有效的交叉致敏。本发明人证明：在体外，与全长LD78β相比，LD78β的两个氨基酸NH2-截短版本具有优异的与小鼠细胞的结合。惊人地，全长版本的LD78β在体内小鼠模型中显示优异的效果。本发明的发明人发现LD78β-疫苗蛋白结合猕猴CCR5，为非人灵长类动物中的定向的DNA免疫创造了条件。
根据本发明疫苗体可以是基于重组Ig的同型二聚体疫苗，每条链由直接结合Ig铰链和CH3的靶向单元构成，该组合诱发共价同型二聚化(图1A)。
虽然小鼠CCL3是编码69个氨基酸的成熟趋化因子的单拷贝基因，人同系物已经被复制和突变从而产生两个非等位变体，LD78α(CCL3)和LD78β(CCL3-L1)，两者都显示与小鼠CCL3具有74％同源性。两个变体享有96％的同源性，差异在于第2位处的S或P以及第39位和第47位处的G和S之间的交换。
根据本发明，人CCL3变体和不同的抗原单元可以被构建并表达为功能蛋白。尤其，本发明涉及利用融合疫苗中的LD78β及其天然同种型将抗原递送靶向抗原递呈细胞。
根据本发明的疫苗体目标在于提高疫苗(免疫刺激组合物)的免疫原性。包含在本发明内的是DNA疫苗，所述DNA疫苗编码融合蛋白，所述融合蛋白将抗原递送靶向专门的抗原递呈细胞上的LD78β受体。
本发明的发明人发现：配备有LD78β或其NH2-截短版本的疫苗体在体外结合表达鼠或猕猴或人CCR1和/或CCR5(LD78β的受体)的细胞，并且在体外产生增强的抗原递送，并且在DNA注射和电穿孔后，与对照、非靶向的疫苗体相比，在体内产生增强的体液和细胞免疫应答。
根据本发明的重组蛋白可以是人抗体样分子，其可以用于治疗多种癌症或传染病，包括多发性骨髓瘤。这些分子(也被称为疫苗体)结合APC并且能够引发T细胞和B细胞免疫应答两者。此外，疫苗体二价结合APC从而促进更有效地引发强的免疫应答。疫苗体包含单体单元的二聚体，所述单体单元由通过二聚化基序(如铰链区)和Cγ3结构域与抗原单元连接(后者位于COOH端或NH2端)的对APC上的表面分子具有特异性的靶向单元组成。本发明还涉及编码该重组蛋白的DNA序列、包含这些DNA序列的表达载体、包含所述表达载体的细胞系、优选通过疫苗体DNA、疫苗体RNA或疫苗体蛋白免疫来治疗哺乳动物，最后涉及包含所述分子的药物和试剂盒。
根据本发明的蛋白质中的二聚化基序可以被构建成包括铰链区和免疫球蛋白结构域(例如Cγ3结构域)，例如羧基端C结构域(CH3结构域)，或与所述C结构域基本同源的序列。所述铰链区可以来源于Ig并且通过形成链间共价键(例如二硫桥)有助于二聚化。此外，它作为结构域之间的柔性间隔区起作用，从而允许两个靶向单元同时结合APC上以可变距离表达的两个靶分子。免疫球蛋白结构域通过非共价相互作用，例如疏水相互作用，促进同型二聚化。在优选的实施方案中，CH3结构域来源于IgG。这些二聚化基序可以与其他多聚化部分(例如来自其他Ig同种型/亚类的)互换。优选地，二聚化基序来源于天然人蛋白，如人IgG。
要理解，二聚化基序可以具有相对于抗原单元和靶向单元的任何取向。在一个实施方案中，抗原单元在二聚化基序的COOH端中，而靶向单元在二聚化基序的N端。在另一个实施方案中，抗原单元在二聚化基序的N端，而靶向单元在二聚化基序的COOH端。
通过引用结合于此的国际申请WO2004/076489公开了核酸序列和载体，可以根据本发明使用该核酸序列和载体。
根据本发明的蛋白质可以适于引发针对任何来源的任何多肽的免疫应答。具有足够长度、包括特异性表位的任何抗原序列可以用作根据本发明的蛋白质中的抗原单元。这样的抗原单元的最小长度可以是约9个氨基酸。因此，在一些实施方案中，抗原单元包含至少9个氨基酸的氨基酸序列，这对应于编码该抗原单元的核酸序列中的至少约27核苷酸。所述抗原序列可以来源于癌症蛋白或传染原。所述癌症序列的实例有端粒酶，更具体地hTERT、酪氨酸酶、TRP-1/TRP-2黑色素瘤抗原、***特异性抗原和独特型。传染原可以是细菌的，例如结核病抗原和来自的布氏菌病(brucellosis)的OMP31，或者可以是病毒来源的，更具体地是HIV来源的序列如例如gp120来源的序列、来自HSV-2的糖蛋白D和流感病毒抗原如血凝素、核蛋白和M2。以疫苗体形式***所述序列也可以导致免疫应答两种武器(arms)的活化。备选地，抗原单元可以是抗体或其片段，如来源于在患有B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤的患者中由骨髓瘤或淋巴瘤细胞(也被称为骨髓瘤/淋巴瘤M组分)产生的单克隆Ig的C端scFv。所述scFv表示独特型抗原。
在一个具体实施方案中，也用于本文所述的实施例中，根据本发明的蛋白质的抗原单元是来源于BALB/c浆细胞瘤MOPC315.4的骨髓瘤蛋白质M315的scFv。M315的λ2315轻链具有在CDR3环中的三个限定的体细胞突变并且在充分限定的***中充当模式独特型T细胞表位(Bogen，Malissen等1986；Bogen和Lambris1989)。
通过疫苗体蛋白、疫苗体DNA或疫苗体RNA免疫，例如在存在或不存在随后的电穿孔的情况下通过肌肉内或皮内注射来进行后两种，都是可行的方法。
根据本发明的蛋白质的靶向单元通过结合趋化因子受体将蛋白质靶向APC。
根据本发明的蛋白质可以通过遗传方法装配，DNA被转染到合适的宿主细胞中，所述宿主细胞如NS0细胞、293E细胞、CHO细胞或COS-7细胞。转染体产生并分泌重组蛋白。
本发明涉及药物，所述药物包含根据本发明的上述基于重组的蛋白、DNA/RNA序列或表达载体。当适当时，该药物还包含药物相容性载体。所述药物的合适载体和剂型是本领域技术人员已知的。合适的载体是例如磷酸盐缓冲的食盐溶液、水、乳液(例如油/水乳液)、湿润剂、无菌溶液等。所述药物可以经口或肠胃外给药。肠胃外给药的方法包括局部给药、动脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、髓内给药、鞘内给药、心室内给药、静脉内给药、腹膜内给药或鼻内给药。合适的剂量由主治医生确定并取决于不同的因素，例如患者的年龄、性别和体重，给药的类型等。此外，本发明涉及针对癌症或传染病的疫苗组合物或免疫刺激组合物，所述疫苗组合物或免疫刺激组合物包含免疫学有效量的核酸或其简并变体，所述核酸编码本发明的分子，其中所述组合物能够引发T细胞和B细胞免疫应答。本发明还涉及试剂盒，所述试剂盒包含疫苗体DNA、RNA或蛋白质，用于诊断、医疗或科学目的。
本发明还涉及制备本发明的重组分子的方法，所述方法包括：将包含本发明的分子的载体转染到细胞群中；培养所述细胞群；收集由所述细胞群表达的重组蛋白质；并纯化表达的蛋白。
上述核苷酸序列可以优选***适于基因疗法的载体，例如在特殊启动子的控制下，并引入到细胞中。在优选的实施方案中，包含所述DNA序列的载体是病毒，例如腺病毒、牛痘病毒或腺相关病毒(adeno-associatedvirus)。反转录病毒是尤其优选的。合适的反转录病毒的实例有例如MoMuLV或HaMuSV。对基因疗法来说，根据本发明的DNA/RNA序列也可以以胶态分散体的形式运送至靶细胞。它们包含例如脂质体或脂质复合体(lipoplex)。
本发明还包括与本文中定义的氨基酸序列或具有本文中定义的具体性质的多肽具有一定程度的序列同一性或序列同源性的多肽或所述多肽内的结构域或基序的用途。本发明尤其包括与SEQIDNO：1具有一定程度的序列同一性的肽或其同系物。此处，术语“同系物”是指与主题氨基酸序列或主题核苷酸序列具有序列同一性的实体，其中所述主题氨基酸序列优选是SEQIDNO：1。
在一方面，同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应当提供和/或编码这样的多肽，所述多肽保持功能活性和/或增强SEQIDNO：1的多肽的活性。
在本文的语境中，同源序列包括可以至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％地相同于主题序列的氨基酸序列。典型地，同系物将含有与主题氨基酸序列相同的活性位点等。虽然同源性也可以用相似性(即，具有相似的化学性质/功能的氨基酸残基)来表示，但是在本发明的语境中，优选用序列同一性来表示同源性。
序列同一性比较可以通过眼睛进行，或者更为通常地，在容易获得的序列比较程序的帮助下进行。这些市售的计算机程序使用复杂的比较算法来比对两个以上的序列，最好地反映了可能导致两个以上的序列之间的差异的进化事件。因此，这些算法与打分***一起运行，所述打分***给相同或相似的氨基酸的对准奖分(rewarding)，并给缺口(gap)的***、缺口延伸和非相似氨基酸的对准罚分(penalising)。比较算法的打分***包括：
i)当每次***缺口时给予罚分(缺口罚分)，
ii)当每次现有的缺口延伸额外位置时给予罚分(延伸罚分)，
iii)当相同的氨基酸对准后给予高分，以及
iv)在非相同的氨基酸对准后给予可变的分数。
大多数比对程序允许改变缺口罚分。然而，优选的是，当使用所述软件用于序列比较时使用缺省值。
根据打分矩阵(也被称为置换矩阵(substitutionmatrix))分配给予非相同氨基酸的对准的分数。在所述置换矩阵中提供的分数反映以下事实：一个氨基酸被另一个氨基酸置换的可能性在进化过程中变化并且取决于被置换的氨基酸的物理/化学性质。例如，极性氨基酸被另一个极性氨基酸置换的可能性高于被疏水氨基酸置换的可能性。因此，打分矩阵将最高分给予相同的氨基酸，将较低的打分给予不相同但是相似的氨基酸，并将甚至更低的打分给予不相同且不相似的氨基酸。最经常使用的打分矩阵是PAM矩阵(Dayhoff等(1978)，Jones等(1992))、BLOSUM矩阵(Henikoff和Henikoff(1992))以及Gonnet矩阵(Gonnet等(1992))。
适于进行所述比对的计算机程序包括但不限于，VectorNTI(InvitrogenCorp.)和ClustalV、ClustalW和ClustalW2程序(HigginsDG&SharpPM(1988)，Higgins等(1992)，Thompson等(1994)，Larkin等(2007)。不同比对工具的选择可以从ExPASy蛋白质组学服务器(www.expasy.org)获得。可以进行序列比对的软件的另一个实例是BLAST(基本局部比对搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool))，该软件可以获得自国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的网页(目前可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/处找到)，并且该软件首先描述于Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215；403-410。
在所述软件生成比对后，可能的是计算％相似性和％序列同一性。所述软件通常将此作为序列比较的部分进行并且产生数值结果。
在一个实施方案中，优选的是使用ClustalW软件用于进行序列比对。优选地，利用ClustalW的比对以以下参数用于成对比对：
欧洲生物信息学研究所(EuropeanBioinformaticsInstitute)使ClustalW2在因特网上可获得：在EMBL-EBI的网页www.ebi.ac.uk，在工具-序列分析-ClustalW2下。目前，ClustalW2工具的准确地址是www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2。
在另一个实施方案中，优选的是使用VectorNTI(Invitrogen)中用于进行序列比对的程序AlignX。在一个实施方案中，以下列缺省设定使用Exp10：
缺口开启罚分：10
缺口延伸罚分：0.05
缺口分离罚分范围(Gapseparationpenaltyrange)：8
打分矩阵：blosum62mt2
因此，本发明还包括如本文所定义的蛋白、多肽、基序或结构域的任何氨基酸序列(尤其是SEQIDNO：1的那些)的变体，同系物和衍生物的用途。
所述序列，尤其是SEQIDNO：1的变体、同系物和衍生物的序列，也可以具有氨基酸残基的缺失、***或置换，其产生沉默的变化并导致在功能上等效的物质。可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性进行有意的氨基酸置换，只要保持该物质的二级结合活性。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；而具有相似亲水性值的、具有不带电的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
本发明还包括可以发生的保守置换(在本文中，置换和替换都用以表示现有氨基酸残基与备选残基的交换)，即同等对同等(like-for-like)的置换，如碱性对碱性，酸性对酸性，极性对极性等。非保守置换也可以发生，即从一个类型的残基置换为另一个类型的残基，或备选地涉及包含非天然氨基酸如鸟氨酸(下文中，被称为Z)，二氨基丁酸鸟氨酸(下文中，被称为B)，正亮氨酸鸟氨酸(下文中，被称为O)，吡啶基丙氨酸，噻吩丙氨酸，萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
可以进行的保守置换，例如在碱性氨基酸的组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)内，酸性氨基酸的组(谷氨酸和天冬氨酸)内，脂肪族氨基酸的组(丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸)内，极性氨基酸的组(谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸)内，芳香族氨基酸的组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)内，羟基氨基酸的组(丝氨酸、苏氨酸)内，大氨基酸的组(苯丙氨酸和色氨酸)内和小氨基酸的组(甘氨酸、丙氨酸)内。
替换也可以通过非天然氨基酸进行，包括；α*和α-二取代的*氨基酸，N-烷基氨基酸*，乳酸*，天然氨基酸的卤素衍生物如三氟酪氨酸*，p-Cl-苯丙氨酸*，p-Br-苯丙氨酸*，p-I-苯丙氨酸*，L-烯丙基-甘氨酸*，β-丙氨酸*，L-α-氨基丁酸*，L-γ-氨基丁酸*，L-α-氨基异丁酸*，L-ε-氨基己酸#，7-氨基庚酸*，L-甲硫氨酸砜#*，L-正亮氨酸*，L-正缬氨酸*，p-硝基-L-苯丙氨酸*，L-羟基脯氨酸#，L-硫代脯氨酸*，苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物如4-甲基-Phe*，五甲基-Phe*，L-Phe(4-氨基)#，L-Tyr(甲基)*，L-Phe(4-异丙基)*，L-Tic(1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)*，L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-苄基)*。为以上讨论(涉及同源或非保守置换)的目的使用记号*，以表示衍生物的疏水性质，而#用以表示衍生物的亲水性质，#*表示两性性质。
除了氨基酸间隔区如甘氨酸或β-丙氨酸残基，变体氨基酸序列还可以包括合适的间隔基团(所述间隔基团可以被***在所述序列的任意两个氨基酸残基之间)，包括烷基如甲基、乙基或丙基。另一种形式的变化涉及存在拟肽形式的一个或多个氨基酸残基，这将被本领域技术人员很好的理解。为避免疑问，“拟肽形式”用于表示变体氨基酸残基，其中α-碳取代基在该残基的氮原子上而不是在α-碳上。制备拟肽形式的肽的方法是本领域中已知的，例如SimonRJ等(1992)，HorwellDC.(1995)。
在一个实施方案中，用于根据本发明的同型二聚体蛋白质的变体靶向单元是这样的变体，所述变体具有SEQIDNO：1的氨基酸5-70的序列，和与其具有至少至少65％，至少70％，至少75％，至少78％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性。
在一方面，优选地，用于本发明的蛋白质或序列是纯化形式的。术语“纯化的”是指给定的组分以高的水平存在。所述组分理想地是存在于组合物中的优势活性组分。
“变体(variant)”或“变体(variants)”是指蛋白、多肽、单元、基序、结构域或核酸。术语“变体”可以与术语“突变体”互换使用。变体分别包括在氨基酸或核苷酸序列中一个或多个位置处的***、置换、颠换、平截和/或倒位。短语“变体多肽”、“多肽”、“变体”和“变体酶”是指具有从SEQIDNO：1的氨基酸序列改变而来的氨基酸序列的多肽/蛋白质。变体多肽包括与SEQIDNO：1或SEQIDNO：1的氨基酸序列5-70具有一定百分比，例如，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的多肽。
“变体核酸”可以包括与能够杂交到本文所示的核苷酸序列的序列互补的序列。例如，变体序列与能够在严格条件下杂交到本文所示的核苷酸序列的序列互补，所述严格条件例如，50℃和0.2XSSC(1XSSC＝0.15MNaCl，0.015M柠檬酸钠，pH7.0)。更具体地，术语变体包括与能够在高度严格条件下杂交到本文所示的核苷酸序列的序列互补的序列，所述高度严格条件例如，65℃和0.1XSSC。变体核酸的熔点(Tm)可以比野生型核酸的Tm低约1、2或3℃。变体核酸包括与编码SEQIDNO：1的核酸或编码可以形成根据本发明的同型二聚体蛋白质的单体蛋白质的核酸具有一定百分比，例如，80％，85％，90％，95％或99％的序列同一性的多核苷酸。
术语“同型二聚体蛋白质”，当用于本文时，是指这样的蛋白，所述蛋白包含两个单独的相同的氨基酸链或亚基，所述两个单独的相同的氨基酸链或亚基通过氢键结合、离子(电荷)相互作用、实际共价二硫键结合或这些相互作用的一些组合保持在一起作为单个的、二体蛋白质。
术语“二聚化基序”，当用于本文时，是指抗原单元和靶向单元之间的氨基酸序列，其包含铰链区和任选的可以有助于二聚化的第二结构域。该第二结构域可以是免疫球蛋白结构域，并且任选地，所述铰链区与所述第二结构域通过接头相连。因此，二聚化基序起连接抗原单元和靶向单元的作用，而且还包含有助于两个单体蛋白二聚化为根据本发明的同型二聚体蛋白质的铰链区。
术语“靶向单元”，当用于本文时，是指这样的单元，所述单元将蛋白与其抗原一起递送到小鼠或人APC，所述小鼠或人APC用于MHCII类限制的向CD4+T细胞的递呈，或者用于通过MHCI类限制提供向CD8+T细胞的交叉递呈。
术语“抗原单元”，当用于本文时，是指能够被抗体或免疫***的其他组分如T细胞上的表面受体特异地识别的任何分子如肽。包含在该定义中的还有能够引发免疫应答的免疫原，如抗体的独特型免疫原。术语“表位”或“抗原表位”用以表示独特的分子表面，如由抗原单元内的短肽序列提供的分子表面。在一些实施方案中，抗原单元包含两个以上的抗原表位。
术语“铰链区”是指如通过形成链间共价键，例如二硫桥而有助于二聚化的同型二聚体蛋白质的肽序列。所述铰链区可以是Ig来源的，如Ig(如IgG3)的铰链外显子h1+h4。
术语″免疫刺激组合物″，当用于本文时，是指能够例如通过活化或抑制淋巴细胞功能，尤其是T细胞功能如T细胞活化来激活免疫***的任何治疗性组合物。
发明的具体实施方案
在一些实施方案中，抗原单元是癌症相关或癌症特异性抗原。
术语“癌症相关抗原”是指任何这样的抗原，所述抗原未必对某种癌症特异，但是在该种癌症的癌细胞的表面上过表达。该术语可以与术语“癌症抗原”互换地使用。
在一些实施方案中，抗原单元是抗原scFv。在一些实施方案中，接头，如(G4S)3接头，连接抗原scFv中的VH和VL。在一些实施方案中，抗原scFv来源于由骨髓瘤或淋巴瘤细胞产生的单克隆Ig。
在一些实施方案中，抗原单元是端粒酶，或其功能部分。在一些实施方案中，端粒酶是hTERT。
在一些实施方案中，抗原单元是黑色素瘤抗原。在一些实施方案中，黑色素瘤抗原是酪氨酸酶，TRP-1或TRP-2。
在一些实施方案中，抗原单元是***癌抗原。在一些实施方案中，***癌抗原是PSA。
在一些实施方案中，抗原单元是***抗原。在一些实施方案中，***抗原选自由以下各项组成的列表：人***状瘤病毒E1、E2、E4、E6和E7。
在一些实施方案中，抗原单元来源于细菌。
在一些实施方案中，细菌来源的抗原单元是结核病抗原.
在一些实施方案中，细菌来源的抗原单元是布氏菌病抗原。
在一些实施方案中，抗原单元来源于病毒。
在一些实施方案中，病毒来源的抗原单元来源于HIV。在一些实施方案中，HIV来源的抗原单元来源于gp120或Gag。
在一些实施方案中，抗原单元选自由以下各项组成的列表：流感病毒血凝素(HA)，核蛋白和M2抗原；单纯疱疹2抗原糖蛋白D；和人***状瘤病毒抗原，如选自由以下各项组成的列表的任一个：E1、E2、E6、E7、L1和L2。
在一些实施方案中，二聚化基序包含铰链区并且任选地包含有助于二聚化的另一个结构域，如免疫球蛋白结构域，上述两者任选通过接头连接。
在一些实施方案中，铰链区来自Ig，如来自IgG3。
在一些实施方案中，铰链区具有形成一个、两个或数个共价键的能力。在一些实施方案中，所述共价键是二硫桥。
在一些实施方案中，二聚化基序的免疫球蛋白结构域是羧基端C结构域，或与所述C结构域基本同源的序列。在一些实施方案中，所述羧基端C结构域来源于IgG。
在一些实施方案中，二聚化基序的免疫球蛋白结构域具有同型二聚化的能力。
在一些实施方案中，二聚化基序的免疫球蛋白结构域具有经由非共价相互作用同型二聚化的能力。在一些实施方案中，所述非共价相互作用是疏水相互作用。
在一些实施方案中，二聚化结构域不包括CH2结构域。
在一些实施方案中，二聚化基序由通过接头连接到的人IgG3的CH3结构域的铰链外显子h1和h4组成。
在一些实施方案中，连接所述铰链区和有助于二聚化的另一个结构域如免疫球蛋白结构域的接头是G3S2G3SG接头。
在一些实施方案中，抗原单元和二聚化基序通过接头如GLSGL接头连接。
在一些实施方案中，靶向单元包含SEQIDNO：1的氨基酸3-70。
在一些实施方案中，靶向单元由SEQIDNO：1的氨基酸5-70组成。
在一些实施方案中，靶向单元由SEQIDNO：1的氨基酸3-70组成。
在一些实施方案中，靶向单元由SEQIDNO：1的氨基酸1-70组成。
在一些实施方案中，同型二聚体蛋白质不包括SEQIDNO：1的氨基酸1-70。
在一些实施方案中，靶向单元包含SEQIDNO：2的氨基酸3-70。
在一些实施方案中，靶向单元由SEQIDNO：2的氨基酸5-70组成。
在一些实施方案中，靶向单元由SEQIDNO：2的氨基酸3-70组成。
在一些实施方案中，靶向单元由SEQIDNO：2的氨基酸1-70组成。
在一些实施方案中，同型二聚体蛋白质不包括SEQIDNO：2的氨基酸1-70。
在一些实施方案中，靶向单元由不超过68个氨基酸，如68、67或66个氨基酸组成。
在一些实施方案中，靶向单元在所述靶向单元的第1位和第2位不包括氨基酸序列AP。
在一些实施方案中，同型二聚体蛋白质是第一同型二聚体蛋白质，所述第一同型二聚体蛋白质具有与第二同型二聚体蛋白质的亲和力相比提高的亲和力，所述第二同型二聚体蛋白质与所述第一同型二聚体蛋白质的不同之处仅在于具有由SEQIDNO：2的氨基酸1-70组成的靶向单元；所述提高的亲和力是针对选自CCR1、CCR3和CCR5的任一个趋化因子受体。在一些实施方案中，根据本发明的核酸分子被载体包含。
在一些实施方案中，根据本发明的核酸分子被配制成用于向患者施用以引发所述同型二聚体蛋白质在所述患者中产生。
在一些实施方案中，根据本发明的疫苗或免疫刺激组合物包含药用载体和/或佐剂。
在一些实施方案中，由根据本发明的疫苗或免疫刺激组合物或药物组合物治疗的癌症是多发性骨髓瘤或淋巴瘤、恶性黑色素瘤、HPV诱发的癌症，***癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌和/或肝癌。
在一些实施方案中，由根据本发明的疫苗或免疫刺激组合物或药物组合物治疗的传染病选自由以下各项组成的列表：流感、疱疹、CMV、HPV、HBV、布氏菌病、HIV、HSV-2和结核病。
本发明的编号的实施方案：
1.两个相同的氨基酸链的同型二聚体蛋白质，每个氨基酸链包含靶向单元和抗原单元，所述靶向单元包含与SEQIDNO：1的氨基酸序列5-70具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，所述靶向单元和所述抗原单元通过二聚化基序连接。
2.根据实施方案1所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原单元是抗原scFv。
3.根据实施方案1或2所述的同型二聚体蛋白质，其中接头，如(G4S)3接头，连接所述抗原scFv中的VH和VL。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原scFv来源于由骨髓瘤或淋巴瘤细胞产生的单克隆Ig。
5.根据实施方案1所述的同型二聚体蛋白质，其中抗原单元是端粒酶，或其功能部分。
6.根据实施方案5所述的同型二聚体蛋白质，其中所述端粒酶是hTERT。
7.根据实施方案1所述的同型二聚体蛋白质，其中抗原单元来源于细菌。
8.根据实施方案7所述的同型二聚体蛋白质，其中所述细菌来源的抗原单元选自结核病抗原和布氏菌病抗原。
9.根据实施方案1所述的同型二聚体蛋白质，其中抗原单元来源于病毒。
10.根据实施方案9所述的同型二聚体蛋白质，其中所述病毒来源的抗原单元来源于HIV。
11.根据实施方案10所述的同型二聚体蛋白质，其中所述来源于HIV的抗原单元来源于gp120或Gag。
12.根据实施方案9所述的同型二聚体蛋白质，其中抗原单元选自由以下各项组成的列表：流感病毒血凝素(HA)、核蛋白和M2抗原；和单纯疱疹2抗原糖蛋白D。
13.根据实施方案1所述的同型二聚体蛋白质，其中抗原单元是癌症相关或癌症特异性抗原。
14.根据实施方案13所述的同型二聚体蛋白质，其中所述癌症抗原单元是黑色素瘤抗原，如黑色素瘤抗原酪氨酸酶，TRP-1或TRP2。
15.根据实施方案13所述的同型二聚体蛋白质，其中所述癌症抗原单元是***癌抗原，如***癌抗原PSA。
16.根据实施方案13所述的同型二聚体蛋白质，其中所述癌症抗原单元是***抗原，如选自由以下各项组成的列表的***抗原：E1、E2、E4、E6、E7、L1和L2。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中二聚化基序包含铰链区并且任选地包含有助于二聚化的另一个结构域，如免疫球蛋白结构域，所述铰链区和所述有助于二聚化的另一个结构域任选通过接头连接。
18.根据实施方案17所述的同型二聚体蛋白质，其中所述铰链区来自Ig，如来自IgG3。
19.根据实施方案17-18中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述铰链区具有形成一个、两个或数个共价键的能力。
20.根据实施方案17-19中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述共价键是二硫桥。
21.根据实施方案17-20中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述二聚化基序的免疫球蛋白结构域是羧基端C结构域，或与所述C结构域基本同源的序列。
22.根据实施方案21所述的同型二聚体蛋白质，其中所述羧基端C结构域来源于IgG。
23.根据实施方案17-22中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述二聚化基序的免疫球蛋白结构域具有同型二聚化的能力。
24.根据实施方案17-23中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述免疫球蛋白结构域具有经由非共价相互作用同型二聚化的能力。
25.根据实施方案24所述的同型二聚体蛋白质，其中所述非共价相互作用是疏水相互作用。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述二聚化结构域不包括CH2结构域。
27.根据实施方案1-26中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中二聚化基序由通过接头连接到人IgG3的CH3结构域的铰链外显子h1和h4组成。
28.根据实施方案17-27中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述接头是G3S2G3SG接头。
29.根据实施方案1-28中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原单元和所述二聚化基序通过接头如GLSGL接头连接。
30.根据实施方案1-29中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述靶向单元包含SEQIDNO：1的氨基酸3-70。
31.根据实施方案1-29中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述靶向单元由SEQIDNO：1的氨基酸5-70组成。
32.根据实施方案1-29中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述靶向单元由SEQIDNO：1的氨基酸3-70组成。
33.根据实施方案1-30中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述靶向单元由SEQIDNO：1的氨基酸1-70组成。
34.根据实施方案1-29中任一项所述的同型二聚体蛋白质，所述同型二聚体蛋白质不包括SEQIDNO：1的氨基酸1-70。
35.根据实施方案1-29中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述靶向单元包含SEQIDNO：2的氨基酸3-70。
36.根据实施方案1-29中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述靶向单元由SEQIDNO：2的氨基酸5-70组成。
37.根据实施方案1-29中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述靶向单元由SEQIDNO：2的氨基酸3-70组成。
38.根据实施方案1-29中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述靶向单元由SEQIDNO：2的氨基酸1-70组成。
39.根据实施方案1-29中任一项所述的同型二聚体蛋白质，所述同型二聚体蛋白质不包括SEQIDNO：2的氨基酸1-70。
40.根据实施方案1-32、35-37中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中每个所述靶向单元由不超过68个氨基酸，如68、67或66个氨基酸组成。
41.根据实施方案1-30、35中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述靶向单元在所述靶向单元的第1位和第2位不包括氨基酸序列AP。
42.根据实施方案1-41中任一项所述的同型二聚体蛋白质，所述同型二聚体蛋白质，与其中靶向单元由SEQIDNO：2的氨基酸1-70组成的相同同型二聚体蛋白质相比，具有提高的针对选自CCR1、CCR3和CCR5的任一个趋化因子受体的亲和力。
43.一种核酸分子，所述核酸分子编码能够形成根据实施方案1-42中任一项所述的同型二聚体蛋白质的单体蛋白质。
44.根据实施方案43所述的核酸分子，所述核酸分子被载体包含。
45.根据实施方案43或44所述的核酸分子，所述核酸分子被配制成用于向患者施用以引发所述同型二聚体蛋白质在所述患者中产生。
46.根据实施方案1-42中任一项所述的同型二聚体蛋白质或根据实施方案43或44所述的核酸分子，其用作药物。
47.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案1-42中任一项所述的同型二聚体蛋白质，或根据实施方案43或44所述的核酸分子。
48.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施方案43或44所述的核酸分子。
49.一种制备根据实施方案1-42中任一项所述的同型二聚体蛋白质的方法，所述方法包括：
a)将根据实施方案43或44所述的核酸分子转染到细胞群中；
b)培养所述细胞群；
c)收集并纯化由所述细胞群表达的同型二聚体蛋白质。
50.一种针对癌症或传染病的疫苗，所述疫苗包含免疫学有效量的根据实施方案1-42中任一项所述的同型二聚体蛋白质或编码能够形成所述同型二聚体蛋白质的单体蛋白质的根据实施方案43或44所述的核酸分子，其中所述疫苗能够引发T细胞和B细胞免疫应答，并且其中所述同型二聚体蛋白质包含对所述癌症或传染病特异的抗原单元。
51.根据实施方案50所述的疫苗，所述疫苗还包含药用载体和/或佐剂。
52.根据实施方案50或51所述的疫苗，其中所述癌症是多发性骨髓瘤或淋巴瘤、恶性黑色素瘤、HPV诱发的癌症、***癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和/或肝癌。
53.根据实施方案50或51所述的疫苗，其中所述传染病选自由以下各项组成的列表：结核病、流感、疱疹、CMV、HPV、HBV、HIV、布氏菌病和/或HSV-2。
54.一种治疗患者的癌症或传染病的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用根据实施方案1-42中任一项所述的同型二聚体蛋白质，或编码能够形成所述同型二聚体蛋白质的单体蛋白质的根据实施方案43或44所述的核酸分子，其中所述同型二聚体蛋白质包含对所述癌症或传染病特异的抗原单元。
实施例1
小鼠和细胞系
从Taconic(Ry，Denmark)获得BALB/c小鼠。Id(λ2315)特异性T细胞受体(TCR)转基因小鼠已被描述(参见BogenB等EurJImmunol1992Mar；22(3)：703-9和SnodgrassHR等EurJImmunol1992Aug；22(8)：2169-72)。TCR识别由IgAMOPC315小鼠浆细胞瘤产生的、由I-EdII类分子递呈的λ2315轻链的氨基酸91-101。该研究被国家动物实验委员会(NationalCommitteeforAnimalExperiments)(Oslo，Norway)核准。MOPC315.4(IgA，λ2315)、HEK293和HEK293E细胞来自ATCC。稳定转染有hCCR5和hCCR1的HEK293分别由MarioMellado(Madrid，Spain)和ZackHoward(Frederick，MD)好意提供。稳定转染有猕猴(GenBankAF005660)的HEK293获得自PfizerInc.，(Groton，CT)。鼠淋巴瘤Esb/MP细胞由JoVanDamme(Leuven，Belgium)好意提供。
人MIP1a/CCL3(编码LD78α或LD78β的疫苗体)的克隆
编码成熟LD78α和LD78β(分别为GenBankNM002983和NG004113)的基因扩增自来自健康供体、富含CD14、来源于骨髓的单核细胞的cDNA。
正向引物(BsmI限制位点，斜体表示)为：
LD78α：GGTGCGCATCACTTGCTGCTGAC(SEQIDNO：3)；
LD78β：GGTGCGCACCACTTGCTGCTGAC(SEQIDNO：4)；
反向引物(BsiWI限制位点，斜体表示)为
GAACTCACCTGCAACTCAGCTCCAGGTC(SEQIDNO：5)。使用正向引物(BsmI限制位点，斜体表示)：GGTGCCTTGCTGCTGACACGCC(SEQIDNO：6)克隆68个氨基酸长(3-70)的LD78β-2。
在第11位载有S而不是C残基的点突变的LD78α和LD78β通过快速变化PCR使用以下引物产生：正向CCGACCGCCTCCTGCTTCAG(SEQIDNO：7)和反向CTGAAGCAGGAGGCGGTCGG(SEQIDNO：8)。通过使用BsmI/BsiWI限制位点将扩增的趋化因子基因***疫苗体构建体IlhFpLNOH2的靶向盒(targetingcassette)中(参见FredriksenAB等MolTher2006Apr；13(4)：776-85)。所得的疫苗体构建体编码同型二聚体蛋白质，所述同型二聚体蛋白质具有来源于hCCL3的靶向单元和作为抗原单元的、VH-VL取向的MOPC315scFv，所述两个单元通过同型二聚化基序连接，所述同型二聚化基序由人铰链外显子h1和h4以及IgG3的CH3结构域组成。
将上述疫苗体中的抗原单元(scFv315)与配对的鼠Cκ结构域(TunheimG等，Vaccine2007Jun11；25(24)：4723-34)或来自H1N1A/PuertoRico/8/34(Mt.Sinai)的流感病毒血凝素(HA)互换(G.，稿件在准备中)。
评估疫苗蛋白质的产生
在以下ELISA中测试瞬时转染的293E细胞的上清。scFv315疫苗体：DNP-BSA(结合M315)作为涂层和生物素化的单克隆HP6017(抗-CH3二聚化基序)用于检测；HA疫苗体：MCA878G(抗-CH3二聚化基序)作为涂层和抗-HA生物素化的mABH36-4-52用于检测；小鼠CκCκ疫苗体：187.1mAb(结合小鼠Cκ)作为涂层和生物素化的187.1用于检测。疫苗体蛋白的制备、纯化、量化和蛋白质组学表征
在DNP(结合有M315)琼脂糖凝胶柱上从稳定转染的NS0细胞的上清亲和纯化具有scFv315作为抗原单元的疫苗体蛋白质。将纯化的蛋白质加载到4-20％Tris-甘氨酸凝胶上。转膜后，利用生物素化的HP6017或Ab2-1.4(结合M315)mAbs以及随后的链霉亲和素HRP检测蛋白质。分别通过Bradford和ELISA使用BSA和mCCL3疫苗体(参见FredriksenAB等MolTher2006Apr；13(4)：776-85)作为标准物来量化疫苗体蛋白质。将对应于具有Fv315的LD78β和LD78β-2疫苗体的蛋白质条带从Coomassie染色的聚丙烯酰胺凝胶切下，并如前所述地进行胶内胰蛋白酶消化。
与人和鼠CCR5和CCR1结合
将疫苗体蛋白质以0.2至25μg/mL的浓度用于染色亲本或稳定转染的HEK293细胞或BALB/c脾细胞(由FSC/SSC进行门控并且在CD11b+CD3-细胞上)。通过生物素化的HP6017(结合hIgG3的CH3)或Ab2-1.4(结合M315)mAbs以及随后的链霉亲和素PE检测结合的疫苗体蛋白质。在FACScalibur上分析细胞。
趋化作用测定
如前所述通过24孔transwell平板(Corning)评估体外细胞迁移。将8μm或5μm孔聚碳酸酯膜分别用于HEK293细胞和Esb/MP。重组趋化因子来自Peprotech。结果(重复样品的均值±SE)表示为趋化指数，该指数被定义为相对于自发的细胞迁移(即，在仅存在培养基的情况下)的在趋化因子的存在下迁移细胞数目的增加倍数。
T细胞刺激测定
将BALB/c脾细胞照射(8Gy)并与浓度为20至0.04μg/mL的包含scFv315的疫苗体蛋白质混合，之后体外添加来源于TCR转基因小鼠的极化的Id315特异性Th2细胞。对应于λ2315的序列89-107的Id肽用作阳性对照。
将来自三个不同DR4*01健康供体的人PBMC与来自瞬时转染的293E细胞的上清混合，所述瞬时转染的293E细胞包含带有小鼠CκCκ作为抗原单元的疫苗体蛋白质，之后进行照射(20Gy)并加入T18T细胞克隆，所述T18T细胞克隆识别由DR4*01递呈的鼠Ck的氨基酸40-48。48小时后，利用3H-胸腺嘧啶对平板进行24小时脉冲，之后收集。
小鼠免疫
使用Endofree-mega质粒纯化***(Qiagen)纯化疫苗体DNA。将在无菌0.9％NaCl中的25μL0.5mg/mL的疫苗体DNA溶液经皮内注射到小鼠的下背部两侧，随后使用Dermavax(Cytopulse，Sweden)进行电穿孔。组由3至7只小鼠组成。
抗-Id315抗体测量
在单次免疫的三、四和六周后给小鼠采血。将骨髓瘤蛋白质M315(IgA，λ2)用作涂层，并且在小鼠血清中通过生物素化的抗-小鼠IgG1a或抗-小鼠IgG2aa(BDPharmingen)检测抗-Id315Abs。计算终点滴度。
Elispot测定
将MilliporeMultiscreen平板(Millipore，Billerca，MA，USA)涂布以抗-小鼠IFNγ(AN18)(12μg/ml)，然后用含10％FCS的RPMI-1640(Invitrogen，NY，USA)封闭2h。单个细胞脾细胞单独地制备自3周前用含HA的疫苗体或NaCl进行DNA免疫的小鼠，并且以106、5x105和2.5x105个细胞/孔与以下来自ProImmune(Oxford，UK)的HA来源的肽中的一个一起过夜孵育：SVSSFERFEIPK(氨基酸107-119，I-Ed限制性的)，HNTNGVTAACSHEG(氨基酸126-138，I-Ad限制性的)或IYSTVASSL(氨基酸633-641，Kd限制性的)。在PBS中洗涤平板，并通过在去离子水中进行5分钟孵育裂解粘附的细胞，之后与生物素化的抗-小鼠IFNγ(1μg/ml)(XMG1.2，Pharmingen)和链霉亲和素碱性磷酸酶缀合物(1∶3000)(GEHealthcare，LittleChalfontBuckinghamshire，UK)孵育。通过使用BCIP/NBT试剂盒(ZymedLaboratoriesInc，Carlsbad，CA，USA)检测产生IFNγ的细胞，并利用来自Zeiss的KSEliSpot(版本4.3.56)在ZeissAxioplan2成像***(物镜：Epiplan-Neofluar5x，442320)上进行计数。
用疫苗体-HA构建体接种小鼠。
将小鼠麻醉，剃毛，并在下背部区域的每一侧以25μlDNA(0，5mg/ml)进行皮内接种，随后立即进行皮肤电穿孔(DermaVax/CytoPulse)。14天后，用hypnorm/***(dormicum)将小鼠麻醉，并用20μl流感(A/PuertoRico/8/34(Mt.Sinai)病毒进行攻击(5xLD50)。在攻击后，给小鼠称重并密切监测临床体征。
基于人CCL3的疫苗体的构建和表达
构建具有以下各项的同型二聚体疫苗体：多种基于hCCL3的靶向单元、来源于人Ig的同型二聚化单元和多种抗原单元，如在图1A中所示。采用的LD78α、LD78β、LD78β-2的NH2端氨基酸序列和推定的趋化因子结构LD78β上的C11S点突变(C11S)的效果分别显示在图1B和1C中。除了LD78β-2疫苗体，所有疫苗体都由瞬时转染的293E细胞以可比较的水平表达，LD78β-2疫苗体始终以较低的程度表达(图2A-C)。
通过SDS-PAGE检测具有scFv315作为抗原单元的疫苗体蛋白质的完整性，其中可见约110kDa的单个条带，所述条带在膜印迹后可以用适当的mAbs染色(图2D，未显示其他构建体的数据)。突变的(C11S)疫苗体明显增加的大小可能是由于由S-S键的取消所致的Stokes半径的增加(图1C)。如可预期的，在还原条件下，观察到对应于单体的约55kDA的单个条带(数据未显示)。
因为培养基中的NS0细胞或胎牛血清可能具有CD26活性，这导致LD78β的翻译后修饰，所以进一步确定LD78β疫苗体蛋白质的NH2端氨基酸序列。通过MALDI-TOF质谱分析LD78βIhF和LD78β-2IhF疫苗体蛋白质的胰蛋白酶消化物独有地显示在m/z1988.89和m/z1820.78处的信号，所述信号分别对应于N端肽APLAADTPTACCFSYTSR(SEQIDNO：9)和LAADTPTACCFSYTSR(SEQIDNO：10)(数据未显示)。因此，可以从稳定转染的NS0细胞表达并纯化纯的全长LD78β或NH2截短的LD78β-2疫苗体。
LD78β疫苗体和NH2-截短版本结合人和鼠趋化因子受体
考虑到个体之间CCR5表达的可变性，将稳定转染有hCCR5而不是PBMC的HEK293用于功能研究。LD78β和LD78β-2疫苗体，而不是它们的点突变对应物，结合hCCR5转染的HEK293细胞(图3A、B，和未显示的数据)。NH2截短的LD78β-2疫苗体显示比全长LD78β疫苗体更强的结合。点突变的LD78β(C11S)疫苗体不结合hCCR5转染的细胞(图3A)。LD78β-2而不是LD78β疫苗体，也结合表达hCCR1的HEK293(图3C、D，和未显示的数据)，这与之前的报道一致。亲本、未转染的HEK293细胞没有染色(未显示)。
LD78β疫苗体，而不是其点突变的对应物，结合CD11b+BALB/c脾细胞(图4A)，并且引发Esb/MP细胞的趋化作用(图4B)，因此为在小鼠内测验表达LD78β的疫苗体提供理论基础。
抗原经由趋化因子受体递送到APC改善体外小鼠和人***中的T细胞应答
与表达scFv315抗原单元的LD78β疫苗体混合的BALB/c脾细胞诱导来自TCR转基因小鼠的Id315特异性Th2细胞的增殖(图5A)。其中引入C11S突变的相似疫苗体刺激T细胞的能力降低～100倍。当将等摩尔浓度的LD78β疫苗体和包含CDR3突变的Id肽比较时，发现所述疫苗体在加载用于抗原递呈的APC方面比所述肽更有效达30倍(未显示)。
至于人T细胞应答，将表达鼠CκCκ作为模式抗原的LD78β疫苗体与供体PBMC和在DR4*01的背景中识别鼠Cκ的氨基酸40-48的克隆的T18CD4+T细胞混合。野生型和点突变的LD78β之间的差异不如在小鼠***中显著(图5B)。此外，通过LD78β相对非靶向的NIP特异性疫苗体的优势证明了靶向的抗原递送(图5B)。重要地，LD78β-2疫苗体胜过LD78β疫苗体。使用三个不同的供体观察到相似的结果(未显示)。通过包含scFv315的LD78β疫苗体在小鼠中引发的提高的抗-Id体液应答
M315骨髓瘤蛋白质的VH+VLId是非常弱的自体抗原，实际上，检测抗-Id抗体需要包括使用完全和不完全Freund佐剂的多重免疫在内的广泛免疫方案。因此，我们测试了结合电穿孔、经皮内注射有LD78βscFv315疫苗体DNA的小鼠是否发展出抗-Id抗体。在用编码LD78β的疫苗体免疫的小鼠中检测到抗-Id315IgG1(图6A)和IgG2a(图6B)应答，这进一步证明scFv315的构象完整性在LD78β疫苗体中得到保持(图6)。在接受C11S点突变的疫苗体的小鼠中以显著较低的程度记录到IgG1应答，而对于IgG2a的差异不显著。此外，在已经用非靶向的对照疫苗体(抗-NIP)免疫的小鼠中，观察到IgG1和IgG2a两者的统计上显著较低的Ab应答。这些结果全面地显示靶向的抗原递送提高对弱自体模式肿瘤抗原的抗体应答。
在疫苗体施用后在小鼠中引发流感血凝素特异性CD4+和CD8+T细胞应答
在流感模型中研究CD8+T细胞应答的诱发，其中血凝素(HA)充当靶抗原。已知来自毒株A/PuertoRico/8/34(Mt.Sinai)(H1N1)的HA表达三种BALB/c小鼠(H-2d)应答的表位。这些中的两种是MHCII类限制性的，分别是由I-Ed限制的SVSSFERFEIPK(SEQIDNO：11)(氨基酸107-119)和由I-Ad限制的HNTNGVTAACSHEG(SEQIDNO：12)(氨基酸126-138)。第三种表位，IYSTVASSL(SEQIDNO：13)(氨基酸633-641)，是MHCI类限制性的(Kd)。在单次皮内LD78β疫苗体DNA免疫和电穿孔后，对于靶向的疫苗体对非靶向的(C11S)疫苗体和假免疫(NaCl)，观察到显著增强的对I类表位的IFNγ应答(图7A)。对II类表位的应答轻微提高，但是靶向的作用不显著(在本实验中仅递送了一次免疫)(图7A)。
LD78β疫苗体结合猕猴CCR5
CCR5在包括猴在内的不同的物种中是保守的。人和猕猴CCR5基因具有非常近的氨基酸同源性(98％)。和人一样，猕猴具有两种CCL3同种型。LD78β和LD78β-2疫苗体以依赖剂量的方式结合表达猕猴CCR5的HEK293细胞，而C11S点突变的LD78β不结合相同的细胞(图8，和未显示的数据)。该结果表明：在任何人类应用前，具有意欲用于人应用的LD78β和LD78β-2的疫苗体不仅可以如以上那样在小鼠中测试，而且还可以在猕猴中测试。
LD78β-HA疫苗体而不是LD78β-2-HA疫苗体保护小鼠免于流感。
如在图9中所示，用两种形式的LD78β、LD78β或LD78β-2中的任何一个给小鼠接种。在保护小鼠免于流感感染方面，全长版本的LD78β显示具有优越的效果。
序列：
LD78β(SEQIDNO：1)：
LAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPVIFLTKRRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA
LD78α(SEQIDNO：2)：
LAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPVIFLTKRRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA

Claims (53)

1.两个相同的氨基酸链的同型二聚体蛋白质，每个氨基酸链包含靶向单元和抗原单元，所述靶向单元和所述抗原单元通过二聚化基序连接，其中所述靶向单元由SEQIDNO：1的氨基酸3-70组成，或其中所述靶向单元由SEQIDNO：1的氨基酸1-70组成。
2.根据权利要求1所述的同型二聚体蛋白质，其中所述靶向单元由SEQIDNO：1的氨基酸3-70组成。
3.根据权利要求1所述的同型二聚体蛋白质，其中所述靶向单元由SEQIDNO：1的氨基酸1-70组成。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原单元是抗原scFv。
5.根据权利要求4所述的同型二聚体蛋白质，其中接头连接所述抗原scFv中的VH和VL。
6.根据权利要求5所述的同型二聚体蛋白质，其中所述接头是(G4S)3接头。
7.根据权利要求4所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原scFv来源于由骨髓瘤或淋巴瘤细胞产生的单克隆Ig。
8.根据权利要求1-2中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原单元是端粒酶。
9.根据权利要求8所述的同型二聚体蛋白质，其中所述端粒酶是hTERT。
10.根据权利要求1-2中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原单元来源于细菌。
11.根据权利要求10所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原单元选自结核病抗原和布氏菌病抗原。
12.根据权利要求1-2中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原单元来源于病毒。
13.根据权利要求12所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原单元来源于HIV。
14.根据权利要求13所述的同型二聚体蛋白质，其中所述来源于HIV的抗原单元来源于gp120或Gag。
15.根据权利要求12所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原单元选自由以下各项组成的列表：流感病毒血凝素、核蛋白、流感病毒M2抗原；单纯疱疹2抗原糖蛋白D；和人***状瘤病毒抗原.
16.根据权利要求12所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原单元选自由以下各项组成的列表：人***状瘤病毒抗原E1、人***状瘤病毒抗原E2、人***状瘤病毒抗原E6、人***状瘤病毒抗原E7、人***状瘤病毒抗原L1和人***状瘤病毒抗原L2。
17.根据权利要求1-2中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原单元是癌症相关或癌症特异性抗原。
18.根据权利要求17所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原单元是黑色素瘤抗原。
19.根据权利要求17所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原单元是黑色素瘤抗原酪氨酸酶。
20.根据权利要求17所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原单元是黑色素瘤抗原酪氨酸酶1或黑色素瘤抗原酪氨酸酶2。
21.根据权利要求17所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原单元是***癌抗原。
22.根据权利要求17所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原单元是***癌抗原PSA。
23.根据权利要求17所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原单元来自人***状瘤病毒。
24.根据权利要求17所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原单元选自由以下各项组成的列表的***抗原：E1、E2、E4、E6和E7。
25.根据权利要求1-2中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述二聚化基序包含铰链区。
26.根据权利要求1-2中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述二聚化基序包含铰链区和有助于二聚化的另一个结构域，其中所述另一个结构域是免疫球蛋白结构域。
27.根据权利要求26所述的同型二聚体蛋白质，其中所述铰链区和所述另一个结构域通过接头连接。
28.根据权利要求25所述的同型二聚体蛋白质，其中所述铰链区来自Ig。
29.根据权利要求28所述的同型二聚体蛋白质，其中所述铰链区是来自IgG3。
30.根据权利要求25所述的同型二聚体蛋白质，其中所述铰链区具有形成一个、两个或数个共价键的能力。
31.根据权利要求30所述的同型二聚体蛋白质，其中所述共价键是二硫桥。
32.根据权利要求25所述的同型二聚体蛋白质，其中所述二聚化基序的免疫球蛋白结构域是羧基端C结构域。
33.根据权利要求32所述的同型二聚体蛋白质，其中所述羧基端C结构域来源于IgG。
34.根据权利要求25所述的同型二聚体蛋白质，其中所述二聚化基序的免疫球蛋白结构域具有同型二聚化的能力。
35.根据权利要求25所述的同型二聚体蛋白质，其中所述免疫球蛋白结构域具有经由非共价相互作用进行同型二聚化的能力。
36.根据权利要求35所述的同型二聚体蛋白质，其中所述非共价相互作用是疏水相互作用。
37.根据权利要求1-2中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述同型二聚体蛋白不包括CH2结构域。
38.根据权利要求1-2中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述二聚化基序由通过接头连接到人IgG3的CH3结构域的铰链外显子h1和h4组成。
39.根据权利要求27所述的同型二聚体蛋白质，其中所述接头是G3S2G3SG接头。
40.根据权利要求1-2中任一项所述的同型二聚体蛋白质，其中所述抗原单元和所述二聚化基序通过接头连接。
41.根据权利要求40所述的同型二聚体蛋白质，其中所述接头是GLSGL接头。
42.核酸分子，所述核酸分子编码能够形成根据权利要求1-41中任一项所述的同型二聚体蛋白质的单体蛋白质。
43.根据权利要求42所述的核酸分子，所述核酸分子被载体包含。
44.根据权利要求42或43所述的核酸分子，所述核酸分子被配制用于向患者施用以引发所述同型二聚体蛋白质在所述患者中产生。
45.根据权利要求1-2中任一项所述的同型二聚体蛋白质或根据权利要求42或43所述的核酸分子，其用作药物。
46.药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-2中任一项所述的同型二聚体蛋白质，或根据权利要求42或43所述的核酸分子。
47.宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求42或43所述的核酸分子。
48.制备根据权利要求1-41中任一项所述的同型二聚体蛋白质的方法，所述方法包括：
a)将根据权利要求42或43所述的核酸分子转染到细胞群中；
b)培养所述细胞群；
c)收集并纯化由所述细胞群表达的同型二聚体蛋白质。
49.针对癌症或传染病的疫苗，所述疫苗包含免疫学有效量的根据权利要求1-41中任一项所述的同型二聚体蛋白质或编码能够形成所述同型二聚体蛋白质的单体蛋白质的根据权利要求42或43所述的核酸分子，其中所述疫苗能够引发T细胞和B细胞免疫应答，并且其中所述同型二聚体蛋白质包含对所述癌症或传染病特异的抗原单元。
50.根据权利要求49所述的疫苗，所述疫苗还包含药用载体和/或佐剂。
51.根据权利要求49或50所述的疫苗，其中所述癌症是多发性骨髓瘤或淋巴瘤、恶性黑色素瘤、HPV诱发的癌症、***癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和/或肝癌。
52.根据权利要求49或50所述的疫苗，其中所述传染病选自由以下各项组成的列表：结核病、流感、疱疹、CMV、HPV、HBV、HIV、布氏菌病和/或HSV-2。
53.根据权利要求1-41中任一项所述的同型二聚体蛋白质，或编码能够形成所述同型二聚体蛋白质的单体蛋白质的根据权利要求42或43所述的核酸分子在制备用于预防患者的癌症或传染病的药物中的应用，其中所述同型二聚体蛋白质包含对所述癌症或传染病特异的抗原单元。
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