CN1604783A - 通过rna干扰治疗纤维化疾病的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于治疗纤维化疾病的药物,其中所述的药物含有一种适于通过RNA干扰而抑制与胞外基质形成有关的基因的表达的双链核糖核酸(dsRNA)。
Description
本发明涉及一种治疗纤维化疾病的药物及用途。本发明还涉及一种双链核糖核酸及其用于制备药物的用途。
纤维化疾病在这里被理解为是一种具有在胞外基质(ECM)的合成与分解之间不平衡的特征的疾病。这种不平衡分别地导致胞外基质和***形成和沉淀的增加。ECM由细胞,特别是胶原蛋白,非胶原糖蛋白,弹性蛋白,蛋白聚糖,和糖胺聚糖来生成。纤维化疾病例如包括可以在超出愈合所需的内脏器官或皮肤损伤之后形成的瘢痕。胞外基质的过度形成和沉淀可导致受影响的器官,诸如肺,肾,或肝脏的功能性紊乱或障碍。ECM在肾中,例如,由系膜细胞和间质成纤维细胞形成。在肝脏中,主要由肝星状空泡细胞和门成纤维细胞形成胞外基质。肝星状空泡细胞,通常是休眠的,其可通过伤害被激活,诸如毒素或慢性肝炎引起的伤害。结果它们在成纤维细胞中增殖和转分化,产生了过量的胞外基质分子。设计通过反义寡核苷酸抑制I型胶原蛋白合成的实验仅仅产生对基质生成的轻微抑制,其中的I型胶原蛋白是胞外基质的一种重要的成分。迄今为止尚没有发现有效抑制基质形成的分子生物学方法。
DE100586C1中公开了一种抑制细胞中靶基因表达的方法,其中一个具有双链结构的寡核糖核苷酸被导入到细胞中。在这里双链结构的一个链互补于靶基因。
本发明的任务是克服本领域现有技术中的缺点。具体的,是要获得一种治疗纤维化疾病的有效药物和用途。此外,制备此种适于抑制胞外基质过量生成的药物和活性物质的用途也将被获得。
此任务通过权利要求1,21,22,和43中所述的特征被解决。有利的实施方案产生于权利要求2到20,23到42,以及44到61中的特征。
依据本发明,目的是设计一种含有一种双链核糖核酸(dsRNA)的药物,其适于通过RNA干扰的方式抑制与胞外基质形成有关的基因的表达。
当由一条或两条核糖核酸构成的核糖核酸具有双链结构时,存在dsRNA。并非所有dsRNA的核苷酸必须具有标准的Watson-Crick碱基对。尤其是单链的,非互补的碱基对几乎没有有效的作用,即使有的话。碱基对的最大可能数是包含在dsRNA中的最短链的核苷酸的数目。
通过反义寡核苷酸治疗纤维化疾病的试验使得人们看到利用分子生物学方法治疗该疾病的些许前景。然而,令人惊讶地,人们已经表明通过双链核糖核酸分别有效地抑制***和ECM的新的形成是有可能的。依据本发明,与胞外基质形成有关的基因同时也是导致引起细胞产生胞外基质的因子的形成的基因,或导致转化到产生胞外基质细胞中的基因。此类因子包括血小板源生长因子(PDGF);转化生长因子-β(TGF-β),尤其是TGF-β1,TGF-β2,或TGF-β3;***生长因子(CTGF);或制瘤素-M。这些因子可,例如,启动和维持肝星状空泡细胞和门成纤维细胞的转分化为类似于肌成纤维细胞的表型。与原始细胞相反,此表型显示出增加的增殖率和基质合成,通常同时通过基质-降解蛋白酶降低了胞外基质的分解(纤维溶解)。除了肝星状空泡细胞或门成纤维细胞之外的肝细胞可产生这些因子。
在一个有利的实施方案中,该基因是编码***生长因子CTGF;转化生长因子-β(TGF-β),尤其是TGF-β1,TGF-β2,或TGF-β3;I型或II型TGF-β受体;信号传感器smad-2,smad-3,或smad-4;SARA(用于受体激活的smad锚定器);PDGF;制瘤素-M的基因,与胶原纤维、前胶原、脯氨酰基-4-羟化酶、赖氨酰基-羟化酶、赖氨酰基-氧化酶、N-前肽酶或C-前肽酶的形成有关的基因。Smad-2,smad-3,smad-4,和SARA与通过连接TGE-β到I型或II型TGF-β受体上而触发的信号转导有关。脯氨酰基-4-羟化酶,赖氨酰基-羟化酶,赖氨酰基-氧化酶,N-前肽酶,以及C-前肽酶与从前胶原蛋白-一种前体分子来形成胶原纤维有关。N-前肽酶裂解前胶原的N-末端前肽且C-前肽酶裂解前胶原的C-末端前肽。
当前胶原是α1(I),α2(I),α1(II),α1(III),α1(V),α2(V),α3V),α1(VI),α2(VI),α3(VI),α1(XI),α2(XI),或α3(XI)型时是特别有利的。在每一情况下,括号中的罗马数字表示由前胶原形成的胶原蛋白的类型。在各种情况下的***数字表示前胶原蛋白的链。
纤维化疾病例如可以为,肝脏纤维化,肾或肺的纤维化,例如,在损伤之后,或超出治愈所需的疤痕形成的疤痕组织的形成。
优选的,dsRNA的S1链显示出一个至少部分地与尤其是,少于25个连续核苷酸构成的基因互补的区域。此处的“基因”被理解为是指编码一个蛋白质或肽的双链DNA的DNA链,其与包括所有用于间质转录的转录区域的DNA链互补。对于此基因我们通常只谈及有意义链。S1链可与RNA转录本或其加工产物,诸如在基因表达期间形成的mRNA互补。此处的蛋白质或肽与胞外基质的形成有关。
dsRNA的互补区域可按照递升的优选顺序,具有19到24,20到24,21到23个,且特别优选具有22或23个核苷酸。具有此结构的dsRNA在抑制基因方面是尤其有效的。dsDNA的链S1可按照递升的优选顺序,具有少于30,少于25,21到24个,且尤其优选具有23个核苷酸。这些核苷酸的数目也是dsRNA中碱基对的最大可能的数目。
已经显示,当至少dsRNA的一个末端具有一个由1到4个,尤其是2或3个核苷酸构成的单链突出端时是特别有利的。与在至少一个末端不具有单链突出端的dsRNA相比,此种dsRNA在抑制基因的表达方面显示出优越的效果。在这里,一个末端是其中存在一个5′-和一个3′-链-末端的dsRNA区域。仅仅由S1链构成的dsRNA相应地具有一个环状结构和仅仅一个末端。由S1链和S2链构成的dsRNA具有两个末端。在这里,在每种情况下,一个末端是通过S1链上的一个链末端和S2链上的一个链末端形成的。
单链突出端优选地位于S1链的3′-末端。单链突出端的这种位置进一步增加药物的效率。在一个实例中,dsRNA仅仅在一个末端,尤其是在位于S1链的3′-末端的末端处具有一个单链突出端。在具有两个末端的dsRNA中,另一个末端是平端的,也即没有突出端。为了增强dsRNA的干扰作用,已经令人惊讶地发现在一个末端具有一个突出端对于dsRNA是已经足够了,它不会将稳定性降低到象带有两个突出端时的那种程度。仅仅具有一个突出端的dsRNA已被证明在各种细胞培养基、以及血液、血清和细胞中是充分稳定和特别有效的。当突出端位于S1链的3’末端时,表达的抑制是尤其有效的。
除了S1链,dsRNA优选地还具有S2链,即,其由两个单独的单链组成。当S1链(反义链)是23个核苷酸长,S2是21个核苷酸长,且S1链的3’末端具有由两个核苷酸构成的一个单链突出端时,该药物是尤其有效的。位于S1链的5′-末端的dsRNA末端是平截的。S1链可互补于该基因的初级的或已加工的RNA转录本。优选的,根据所附的序列表,dsRNA由具有序列No.3的S2链和具有序列No.4的S1链构成,或由具有序列No.5的S2链和具有序列No.6的S1链构成。此dsRNA在抑制为与胞外间质形成有关的α1(I)型前胶原或CTGF编码的基因的表达方面是尤其有效的。
该药物可以为适于吸入,口服,灌注或注射,尤其是用于静脉内或腹膜内的灌注或注射,或直接灌注或注射到受纤维化疾病影响的组织中的制剂。适于吸入,灌注,或注射的制剂可以最简单地由,尤其是仅仅由,dsRNA和生理可耐受的溶剂,优选生理盐水或生理可耐受的缓冲液,尤其是磷酸盐缓冲盐水溶液构成。令人惊讶地,已经显示仅仅溶解在此缓冲液或溶剂中并给药的dsRNA被表达该基因的细胞吸收。基因的表达以及疾病受到抑制而不需要dsRNA必须被包装在一个特定载体中。dsRNA可存在于一种溶液,尤其是一种生理可耐受的缓冲液或一种生理盐水溶液中的药物中,由胶束结构,优选脂质体,壳体,类衣壳体,或聚合物毫微胶囊或微胶囊包围,或与聚合物毫微胶囊或微胶囊结合。生理可耐受缓冲液可以是一种磷酸缓冲盐水溶液。胶束结构,壳体,类衣壳体,或聚合物毫微胶囊或微胶囊可促进表达基因的细胞中的dsRNA的吸收。聚合物毫微胶囊或微胶囊由至少一种可生物降解的聚合物诸如聚丁基氰基丙烯酸酯构成。聚合物毫微胶囊或微胶囊可转运和释放其中包含的或与其结合的dsRNA。
dsRNA可与一种能使受纤维化疾病影响的器官,尤其是肝脏,肾脏,肺,或皮肤的细胞中的dsRNA被定向吸收的因子相结合。结合是指dsRNA可与因子或,如包围该dsRNA的脂质体或毫微或微胶囊相结合。分子可被包埋在那些使定向吸收(通常所说的靶向)成为可能的脂质体或毫微或微胶囊中。优选的,因子是一种介导与尤其是肝星状空泡细胞或肌成纤维细胞的VI型胶原蛋白受体或PDGFβ-受体连接的因子。肝星状空泡细胞或肌成纤维细胞可被激活。根据所附序列表的序列No.25的环肽C*GRGDSPC*,特别适用于VI型胶原蛋白受体。C*代表半胱氨酸残基,其通过二硫键来诱导肽环的形成。
优选的,该药物至少以一个含有一定量的dsRNA的剂量单位存在,按照递升的优越顺序,其最大剂量为5mg,2.5mg,200pg,100pg,50pg,且最佳剂量为25pg/公斤体重/每天。令人惊讶地,已经显示以此日剂量给药的dsRNA在抑制基因的表达方面显示出杰出的效果,且显示出抗纤维化的活性。剂量单位可设计为用于以单日服剂量给药或口服。在这种情况下,整个日服剂量被包含在一个单剂量单位中。如果剂量单位被设计成每天给药或吸收若干次,则每一剂量包含的dsRNA的量相对地较小以便能够达到总的日剂量。还可以将剂量单位设计成几天一次单一的给药或摄入,例如,以便dsRNA被释放持续几天。剂量单位因而相应地包括多个日剂量。dsRNA以充分的量包含在剂量单位中以抑制与胞外基质形成有关的基因表达。还可以设计药物使得几个单位的药物的总和一起包含充分的量。充分的量也可取决于剂量单位的药物配方。为了确定什么是充分的量,dsRNA可分别以逐步增加的量或剂量来给药。随后,可利用已知的方法评价来自受影响的纤维化组织的样品来评估是否上述基因的表达抑制在此量时发生。此方法可包括,例如,分子生物学的,生物化学的,或免疫学的方法。
此外,本发明的目的是利用双链核糖核酸产生一种药物来治疗纤维化疾病,由此dsRNA适于通过RNA干扰来抑制与胞外基质形成有关的基因的表达。此外,本发明的目的是利用双链核糖核酸来治疗纤维化疾病,由此dsRNA适于通过RNA干扰来抑制与胞外基质形成有关的基因的表达。此外,本发明的目的是双链核糖核酸,它是一种适用于通过RNA干扰来抑制与纤维化疾病中胞外基质形成有关的基因表达的活性因子。
本发明的用途和dsRNA的其它有益的实施方案,参见前面的讨论。
现在将根据图表对本发明进行解释。它们显示:
图1取决于治疗中所用的前胶原-α1(I)-特异性的dsRNA的量,RD细胞的前胶原-α1(I)转录本的相对水平,
图2取决于治疗中所用的CTGF-特异性的dsRNA的量,RD细胞的CTGF转录本的相对水平,
图3取决于治疗中所用的CTGF-特异性的dsRNA的量,CFSC-2G细胞的CTGF转录本的相对水平,以及
图4取决于用CTGF-特异性的dsRNA的治疗,分离自大鼠的肝星状空泡细胞的CTGF转录本的相对水平。
下列具有序列表中序列No.1到No.6的双链寡核糖核苷酸被用于瞬时转染实验:
HCV s5/as5,其S1链互补于丙型肝炎病毒(HCV)基因组的序列:
S2:5′-acg gcu agc ugu gaa ugg ucc gu-3′(序列No.1)
S1:3′-ag ugc cga ucg aca cuu acc agg -5′(序列No.2)
PCA1+2,其S1链与人前胶原α1(I)基因的序列互补,且与来自褐家鼠(Rattus norvegicus)的前胶原α1(I)基因互补,在此区域中与它100%-同源:
S2:5′-caa gag ccu gag cca gca gau cg-3:(序列No.3)
S1:3′-ga guu cuc gga cuc ggu cgu cua-5′(序列No.4)
CTG1+2,其S1链与人CTGF基因的序列互补且与来自褐家鼠(Rattus norvegicus)的CTGF基因互补,在此区域与它100%-同源:
S2:5′-ccu gug ccu gcc auu aca acu gu-3′(序列No.5)
S1:3′-cu gga cac gga cgg uaa ugu uga -5′(序列No.6)
下列细胞被用于实验:
RD细胞:这些是人胚胎横纹肌肉瘤细胞系的细胞。此细胞系可获自美国典型培养物中心(American Type Culture Collection(ATCC))的No.CCL136,P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108,USA。
CFSC-2G细胞:这些是来自大鼠肝星状空泡细胞系的细胞,可获自Dr.Marcos Rojkind(肝脏研究中心,艾伯特爱因斯坦医学院,Bronx,纽约市,纽约,USA)。CFSC干细胞的分离描述在:实验室研究(Laboratory Investigation)65(1991),644-53。CFSC-2G亚克隆的分离和鉴定描述在:Patricia Greenwel等,实验室研究(Laboratory Investigation)69(1993),210-26。
初级的肝星状空泡细胞分离自大鼠肝脏,依据Knook,D.等,Exp.Cell Res.139(1982),第468到471页。
所有的细胞被培养在含有862mg/l 1-丙氨酰基-1-谷氨酰胺和4.5g/l葡萄糖(Invitrogen GmbH,Technology Park Karisruhe,Emmy-Noether Strasse 10,D-76131 Karisruhe)的Dulbecco′Modified Eagle′s培养基(DMEM)中,另外加入了10%热灭活的胎牛血清(FCS),100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素(细胞培养基)。在37℃,在由8%CO2和92%空气构成的潮湿的气氛中的温箱中进行培养。
用dsRNA对RD细胞进行瞬时转染是通过用来自阳离子脂类的负载了DNA的脂质体进行脂转染而达到的。来自Invitrogen的Lipofectamine Plus试剂盒被用于此目的。其包含一种脂转染胺-和一种正试剂。每一转染依据生产商说明平行进行四次。为了进行转染,将大约70,000个RD细胞/孔接种于无菌的12-孔平皿。二十四小时后,5μl的含有相应dsRNA的20μmol/l水溶液被稀释在12-孔平皿中,每2孔100μl的DMEM中。每种情况下加入10μl的正试剂,混合,并在室温下培养15分钟。随后,加入100μl新鲜的1∶25稀释度的在DMEM中的脂转染胺试剂(相当于240μg脂类混合物/ml),混合,且通过室温下温育15分钟使得负载DNA的脂质体的形成成为可能。然后,去除细胞所附的细胞培养基,且洗涤细胞两次,每次每孔用1ml DMEM。每个转染试验用1ml DMEM进行稀释,且按0.6ml/孔转移到细胞上(每个试验2个孔)。在温箱中培养4小时之后,向每个孔中添加1ml的细胞培养基并再培养44个小时。
为进行肝星状空泡细胞和CFSC-2G细胞的瞬时转染,通过寡转染胺将dsRNA(Invitrogen)导入到细胞中。为达到此目的,把分离自大鼠的CFSC-2G或肝星状空泡细胞以20,000细胞/孔的密度接种在无菌的12-孔平皿中。接种24小时后,在每个试验中将4μl的寡转染胺稀释在11μl的DMEM中,且在室温下培养10分钟。此外,在每个试验中将5μl含有dsRNA的20mol/l水溶液稀释在185μl DMEM中(12-孔平皿的2个孔)。将15μl的每一预稀释的寡转染胺移液到稀释的dsRNA中,混合,并在室温下培养20分钟。最后,将1050μl的DMEM加到试验中。在用1ml的DMEM每孔洗涤两次之后,将600μl的每一种所得的混合物添加于细胞中。在温箱中培育4小时之后,向每个孔中添加1ml的细胞培养基并培养44小时。
在所有研究的细胞中的dsRNA对涉及胞外基质形成的基因的转录本水平的作用被通过定量PCR进行测定。在温箱中44小时后,细胞被溶解,利用PeqGold RNAPure试剂盒(PEQLAB Biotechnologie GmbH,Carl-Thiersch-Str.2b,D-91052 Erlangen,Order No.30-1010)依据生产商的说明将其含有的RNA分离出来。
在每一情况下通过利用相同量的RNA(100-1000ng),使用Superscript II(invitrogen GmbH,Technology Park,Karlsruhe,EmmyNoether Strasse 10,D-76131 Karisruhe;目录号18064-014)反转录形成cDNA。100pmol的寡-dT引物和50pmol的随机引物被用作引物。将10μl的RNA(100-1000ng),0.5μl的寡-dT引物(100pmol),和1μl的随机引物(50pmol)在70℃温育10分钟,然后在冰上短暂贮藏。随后,加入7μl逆转录酶混合物(4μl的5X缓冲液;2μl的0.1mol/l DTT;各1μl的10mmol/l dNTP),1μl的Superscript II,和1μl的核糖核酸酶抑制剂RNAsin_(Promega GmbH,Schildkrbtstr.15,D68199 Mannheim)。混合物然后被保持在25℃达10分钟,然后在42℃保持1小时,且最后在70℃保持15分钟。
在被dsRNA转染的细胞中的dsRNA对编码前胶原α1(I)和CTGF的基因表达的作用被通过定量″实时″RT-PCR测定这些基因的转录本的量(转录本水平)来证明。为了做到这一点,在″Light-Cycler″(RocheDiagnostics GmbH)中依据生产商的说明,按照″TaqMan″法(PerkinElmer,Ferdinand-Porsche-Ring 17,D-63110 Rodgau-Jugesheim),利用LightCycler Fast Start DNA MasterHybridization Probes试剂盒(Roche Diagnostics GmbH)对相同体积的所形成的cDNA的特异性cDNA的量进行定量分析。用在5′末端用荧光基团6′-FAM(羧基荧光素)标记,以及在3′末端用猝灭剂分子TAMRA(羧基-四甲基-罗丹明)标记的探针进行检测。荧光基团被光激发。它转移激发能量到3′-侧面的也即直接邻近的猝灭剂分子。在PCR的延伸阶段中,Tag DNA聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性导致探针的水解,且因此也导致荧光基团与猝灭剂分子的空间分离。6′-FAM的荧光的猝灭渐渐地变少了。荧光因此增加并被定量测定。通过利用已知的转录本量或参照cDNA的稀释系列而形成的标准曲线来进行定量分析。此外,测定了管家基因β2-微球蛋白的转录本水平并用作标准。β2-微球蛋白是一种以恒定量结构表达的蛋白质。测定前胶原α1(I)-或CTGF-cDNA的量,表示为与β2微球蛋白-cDNA的量的比率,且用图表显示在图表1到4中,作为相对的转录本水平。
下列的引物和TaqMan探针被用于通过实时RT-PCR来测定前胶原α
1(I)和CTGF在大鼠细胞中的转录本水平:
靶分子 | 5′`引物 | 带有5′-FAM+3′-TAMRA的TaqMan探针 | 3′引物 |
前胶原α1(I) | TCCGGCTCCTGCTCCTCTTA | TTCTTGGCCATGCGTCAGGAGGG | GTATGCAGCTGACTTCAGGGATGT |
CTGF | ATCCCTGCGACCCACACAAG | CTCCCCCGCCAACCGCAAGAT | CAACTGCTTTGGAAGGACTCGC |
β2-微球蛋白 | CCGATGTATATGCTTGCAGAGTTAA | AACCGTCACCTGGGACCGAGACATGTA | CAGATGATTCAGAGCTCCATAGA |
下列的引物和TaqMan探针被用于通过实时RT-PCR来测定前胶原α1(I)和CTGF在人细胞中的转录本水平:
靶分子 | 5′`引物 | 带有5′-FAM+3′-TAMRA的TaqMan探针 | 3′引物 |
前胶原α1(I) | CAGAAGAACTGGTACATCAGCAAGA | ACCGATGGATTCCAGTTCGAGTATGGC | GTCAGCTGGATGGCCACAT |
CTGF | AACCGCAAGATCGGCGT | TGCACCGCCAAAGATGGTGCTC | CCGTACCACCGAAGATGCA |
β2-微球蛋白 | TGACTTTGTCACAGCCCAAGATA | TGATGCTGCTTACATGTCTCGATCCCA | AATCCAAATGCGGCATCTTC |
附图1到4显示了dsRNA的作用。为了保证实验中的恒定的转染率,用100nmol/l dsRNA转染所有的细胞。为了做到这一点,将0到100nmol/l的定向抗前胶原α1(I)或CTGF的特异性dsRNA用非特异性的HCV s5/as5 dsRNA补足到100nmol/l的浓度,并在细胞中转染。用0nmol/l特异性ds RNA测定的转录本的水平被专断地定义为100%。
用浓度逐渐增加的定向抗前胶原α1(I)的dsRNA转染RD细胞的结果显示于附图1中。dsRNA的作用取决于浓度。使用100nmol/l PCA1+2dsRNA可将前胶原α1(I)转录本的水平减少到20%。β2-微球蛋白的表达没有被所述dsRNA所改变。这些证明了所使用的dsRNA的特异性。
附图2显示了CTGF基因的相对转录本水平随转染所用的CTG1+2dsRNA浓度的变化。在这里,所使用的dsRNA的作用也取决于浓度。100nmol/l的CTG1+2dsRNA将转录本水平降低到10%,而50nmol的dsRNA则将转录本水平降低到用非特异性的HCV s5/as5 dsRNA处理的细胞的转录本水平的32%。在这里,β2-微球蛋白的表达也没有变化。
附图3显示了转染48小时之后CFSC-2G细胞中CTGF基因的相对转录本水平。在这里,也有转录本水平通过所使用的dsRNA而发生浓度-依赖性的减少。
附图4显示了分别分离自大鼠的肝星状空泡细胞和肌成纤维细胞中CTGF基因的相对转录本水平。将细胞在塑料上培养7天。结果它们已经被激活。用100nmol/l dsRNA转染48小时之后,转录有大约50%的减少。
序列表
<110>Ribopharma AG
<120>通过RNA干扰治疗纤维化疾病的药物
<130>422394EH
<160>25
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>23
<212>RNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>1
acggcuagcu gugaaugguc cgu 23
<210>2
<211>23
<212>RNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>2
ggaccauuca cagcuagccg uga 23
<210>3
<211>23
<212>RNA
<213>人
<400>3
caagagccug agccagcaga ucg 23
<210>4
<211>23
<212>RNA
<213>人
<400>4
aucugcuggc ucaggcucuu gag 23
<210>5
<211>23
<212>RNA
<213>人
<400>5
ccugugccug ccauuacaac ugu 23
<210>6
<211>23
<212>RNA
<213>人
<400>6
aguuguaaug gcaggcacag guc 23
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>褐家鼠
<400>7
tccggctcct gctcctctta 20
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>褐家鼠
<400>8
ttcttggcca tgcgtcagga ggg 23
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>褐家鼠
<400>9
gtatgcagct gacttcaggg atgt 24
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>褐家鼠
<400>10
atccctgcga cccacacaag 20
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>褐家鼠
<400>11
ctcccccgcc aaccgcaaga t 21
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>褐家鼠
<400>12
caactgcttt ggaaggactc gc 22
<210>13
<211>25
<212>DNA
<213>褐家鼠
<400>13
ccgatgtata tgcttgcaga gttaa 25
<210>14
<211>27
<212>DNA
<213>褐家鼠
<400>14
aaccgtcacc tgggaccgag acatgta 27
<210>15
<211>23
<212>DNA
<213>褐家鼠
<400>15
cagatgattc agagctccat aga 23
<210>16
<211>25
<212>DNA
<213>人
<400>16
cagaagaact ggtacatcag caaga 25
<210>17
<211>27
<212>DNA
<213>人
<400>17
accgatggat tccagttcga gtatggc 27
<210>18
<211>19
<212>DNA
<213>人
<400>18
gtcagctgga tggccacat 19
<210>19
<211>17
<212>DNA
<213>人
<400>19
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<211>22
<212>DNA
<213>人
<400>20
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<210>21
<211>19
<212>DNA
<213>人
<400>21
ccgtaccacc gaagatgca 19
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<211>23
<212>DNA
<213>人
<400>22
tgactttgtc acagcccaag ata 23
<210>23
<211>27
<212>DNA
<213>人
<400>23
tgatgctgct tacatgtctc gatccca 27
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人
<400>24
aatccaaatg cggcatcttc 20
<210>25
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<400>25
Cys Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys
1 5
1
1
Claims (61)
1.治疗纤维化疾病的药物,其中药物含有适于通过RNA干扰而抑制与胞外基质形成有关的基因的表达的双链核糖核酸(dsRNA)。
2.根据权利要求1的药物,其中所述的基因是编码CTGF,TGF-β,I型或II型TGF-β受体,smad-2,smad-3,或smad-4,SARA,PDGF,制瘤素-M的基因;是与胶原纤维,前胶原,脯氨酰基-4-羟化酶,赖氨酰基-羟化酶,赖氨酰基-氧化酶,N-前肽酶,或C-前肽酶形成有关的基因。
3.根据权利要求2的药物,其中所述的前胶原是α1(I)型,α2(I),α1(II),α1(III),α1(V),α2(V),α3(V),α1(VI),α2(VI),α3(VI),α1(XI),α2(XI),或α3(XI)。
4.根据前述权利要求之一的药物,其中所述的纤维化疾病是肝脏纤维化,肾脏或肺的纤维化,或超过了痊愈所需瘢痕形成的瘢痕组织的形成。
5.根据前述权利要求之一的药物,其中dsRNA的S1链具有一个尤其是由至少部分地与所述基因互补的少于25个连续的核苷酸组成的区域。
6.根据前述权利要求之一的药物,其中所述的互补区域具有19到24个,优选20到24个,尤其优选21到23个,特别是22或23个核苷酸。
7.根据前述权利要求之一的药物,其中所述的S1链具有少于30个,优选少于25个,特别优选21到24个,特别是23个核苷酸。
8.根据前述权利要求之一的药物,其中所述dsRNA的至少一个末端具有一个由1到4个,特别是2或3个核苷酸构成的单链突出端。
9.根据权利要求8的药物,其中所述的单链突出端位于S1链的3′末端。
10.根据前述权利要求之一的药物,其中所述dsRNA仅仅在一个末端,特别是在位于S1链的3′-末端的末端具有一个单链的突出端。
11.根据前述权利要求之一的药物,其中所述的dsRNA除S1链之外还具有S2链。
12.根据权利要求11的药物,其中所述的S1链是23个核苷酸长,S2链是21个核苷酸长,且所述S1链的3′-末端具有一个由两个核苷酸组成的单链突出端,而所述的位于S1链5′-末端的dsRNA的末端是平截的。
13.根据前述权利要求之一的药物,其中所述S1链与基因的初级或加工的RNA转录本互补。
14.根据前述权利要求之一的药物,其中根据所附的序列表,所述的dsRNA由具有序列No.3的S2链和具有序列No.4的S1链构成,或由具有序列No.5的S2和具有序列No.6的S1链构成。
15.根据前述权利要求之一的药物,其中所述的药物是一种适于吸入,口服,灌注或注射,特别是适于静脉内或腹膜内灌注或注射,或直接用于灌注或注射到受纤维化疾病影响的组织中的制剂。
16.根据前述权利要求之一的药物,其中所述dsRNA存在于溶液,特别是生理可耐受的缓冲液或生理盐水溶液中的药物中,被一种胶束结构,优选脂质体、壳体、类衣壳体、或一种聚合物毫微胶囊或微胶囊所包围,或与聚合物毫微胶囊或微胶囊结合。
17.根据前述权利要求之一的药物,其中使所述dsRNA与能使dsRNA被定向吸收到受纤维化疾病影响的器官,尤其是肝脏,肾脏,肺或皮肤的细胞中的因子结合。
18.根据权利要求17的药物,其中所述的因子是介导与VI型胶原受体或PDGFβ-受体,尤其是肝星状空泡细胞或肌成纤维细胞的VI型胶原受体或PDGFβ-受体的连接的因子。
19.根据权利要求18的药物,其中所述的因子是环肽C*GRGDSPC*。
20.根据前述权利要求之一的药物,其中所述的药物以至少含有一定量的dsRNA的剂量单位存在,按照递升的优选顺序,最大剂量为5mg,2.5mg,200μg,100μg,50μg,最佳为25μg/公斤体重/天。
21.双链核糖核酸(dsRNA)用于制备治疗纤维化疾病的药物的用途,其中所述的dsRNA适于通过RNA干扰而抑制与胞外基质形成有关的基因的表达。
22.双链核糖核酸(dsRNA)用于治疗纤维化疾病的用途,其中所述的dsRNA适于通过RNA干扰而抑制与胞外基质形成有关的基因的表达。
23.根据权利要求21或22的用途,其中所述基因是编码CTGF,TGF-β,I型或II型TGF-β受体,smad-2,smad-3,或smad-4,SARA,PDGF,制瘤素-M的基因,是与胶原纤维,前胶原,脯氨酰基-4-羟化酶,赖氨酰基-羟化酶,赖氨酰基-氧化酶,N-前肽酶,或C-前肽酶的形成有关的基因。
24.根据权利要求23的用途,其中所述的前胶原是α1(I),α2(I),α1(II),α1(III),α1(V),α2(V),α3(V),α1(VI),α2(VI),α3(VI),α1(XI),α2(XI),或α3(XI)型。
25.根据权利要求21至24之一的用途,其中所述的纤维化疾病是肝脏纤维化,肾脏或肺的纤维化,或超过了痊愈所需的瘢痕形成的瘢痕组织的形成。
26.根据权利要求21至25之一的用途,其中dsRNA的S1链具有一个尤其是由至少部分地与所述基因互补的少于25个连续核苷酸构成的区域。
27.根据权利要求21至26之一的用途,其中所述的互补区域具有19到24个,优选的20到24个,特别优选21到23个,尤其是22或23个核苷酸。
28.根据权利要求21至27之一的用途,其中所述的S1链具有少于30个,优选少于25个,特别优选21到24个,尤其是23个核苷酸。
29.根据权利要求21至28之一的用途,其中所述dsRNA的至少一个末端具有一个由1到4个,尤其是2或3个核苷酸构成的单链突出端。
30.根据权利要求29的用途,其中所述的单链突出端位于S1链的3′末端。
31.根据权利要求21至30之一的用途,其中所述dsRNA仅仅在一个末端,尤其是在位于S1链3′-末端的末端具有一个单链的突出端。
32.根据权利要求21到31之一的用途,其中所述的dsRNA除S1链之外还具有S2链。
33.根据权利要求32的用途,其中所述的S1链为23个核苷酸长,S2链是21个核苷酸长,且所述S1链的3′-末端具有一个由两个核苷酸构成的单链突出端,而位于S1链的5′-末端的dsRNA末端是平截的。
34.根据权利要求21至33之一的用途,其中所述S1链与基因的初级的或加工的RNA转录本互补。
35.根据权利要求21至34之一的用途,其中根据所附的序列表,所述的dsRNA由具有序列No.3的S2链和具有序列No.4的S1链构成,或由具有序列No.5的S2和具有序列No.6的S1链构成。
36.根据权利要求21至35之一的用途,其中所述的dsRNA存在于适于吸入,口服,注灌或注射,尤其是静脉内或腹膜内灌注或注射,或适于直接灌注或注射到受纤维化疾病组织影响的组织的制剂中。
37.根据权利要求21至36之一的用途,其中所述dsRNA存在于溶液,尤其是生理可耐受的缓冲液或生理盐水溶液中,被一种胶束结构,优选脂质体,壳体,类衣壳体,或一种聚合物毫微胶囊或微胶囊包围,或与聚合物毫微胶囊或微胶囊结合。
38.根据权利要求21至37之一的用途,其中所述的dsRNA是通过口服,吸入,灌注,或注射,尤其是静脉内或腹膜内灌注或注射,或直接灌注或注射到受纤维化疾病影响的组织中而给药的。
39.根据权利要求21至38之一的用途,其中使所述dsRNA与能使dsRNA被定向吸收到受纤维化疾病影响的器官,尤其是肝脏,肾脏,肺,或皮肤的细胞中的因子结合。
40.根据权利要求39的用途,其中所述的因子是介导与VI型前胶原受体或PDGFβ-受体,尤其是肝星状空泡细胞或肌成纤维细胞的VI型前胶原受体或PDGFβ-受体连接的因子。
41.根据权利要求40的用途,其中所述的因子是环肽C*GRGDSPC*。
42.根据权利要求21至41之一的用途,其中按照递升的优选顺序,所述dsRNA的最大使用剂量为5mg,2.5mg,200μg,100μg,50μg,且最佳为25μg/公斤体重/天。
43.适于通过RNA干扰而抑制与纤维化疾病中胞外基质的形成有关的基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)。
44.根据权利要求43的dsRNA,其中所述基因是编码CTGF,TGF-β,I型或II型TGF-β受体,smad-2,smad-3,或smad-4,SARA,PDGF,制瘤素-M的基因,是与胶原纤维,前胶原,脯氨酰基-4-羟化酶,赖氨酰基-羟化酶,赖氨酰基-氧化酶,N-前肽酶,或C-前肽酶形成有关的基因。
45.根据权利要求44的dsRNA,其中所述的前胶原是α1(I),α2(I),α1(II),α1(III),α1(V),α2(V),α3(V),α1(VI),α2(VI),α3(VI),α1(XI),α2(XI),或α3(XI)型。
46.根据权利要求43至45之一的dsRNA,其中所述的纤维化疾病是肝脏纤维化,肾脏或肺的纤维化,或不需要的瘢痕形成。
47.根据权利要求43至46之一的dsRNA,其中dsRNA的S1链具有一个尤其是由至少部分地与所述基因互补的少于25个连续核苷酸构成的区域。
48.根据权利要求43至47之一的dsRNA,其中所述的互补区域具有19到24个,优选20到24个,特别优选43到23个,尤其是22或23个核苷酸。
49.根据权利要求43至48之一的dsRNAa,其中所述的S1链具有少于30个,优选少于25个,特别优选21到24个,尤其是23个核苷酸。
50.根据权利要求43至49之一的dsRNA,其中所述dsRNA的至少一个末端具有一个由1到4个,尤其是2或3个核苷酸构成的单链突出端。
51.根据权利要求50的dsRNA,其中所述的单链突出端位于S1链的3′末端。
52.根据权利要求43至51之一的dsRNA,其中所述dsRNA仅仅在一个末端,尤其是在位于S1链3′-末端的末端具有一个单链的突出端。
53.根据权利要求43至52之一的dsRNA,其中所述的dsRNA除S1链之外还具有S2链。
54.根据权利要求53的dsRNA,其中的S1链为23个核苷酸长,S2链是21个核苷酸长,且所述S1链的3′-末端具有一个由两个核苷酸构成的单链突出端,而位于S1链的5′-末端的dsRNA末端是平截的。
55.根据权利要求43至54之一的dsRNA,其中所述的S1链与基因的初级的或加工的RNA转录本互补。
56.根据权利要求43至55之一的dsRNA,其中根据所附的序列表,所述的dsRNA由具有序列No.3的S2链和具有序列No.4的S1链构成,或由具有序列No.5的S2和具有序列No.6的S1链构成。
57.根据权利要求43至56之一的dsRNA,其中所述的dsRNA存在于适于吸入,口服,灌注或注射,尤其是静脉内或腹膜内灌注或注射,或适于直接灌注或注射到受纤维化疾病影响的组织的制剂中。
58.根据权利要求43至57之一的dsRNA,其中所述dsRNA存在于溶液,尤其是生理可耐受的缓冲液或生理盐水溶液中,被一种胶束结构,优选脂质体,壳体,类衣壳体,或一种聚合物毫微胶囊或微胶囊包围,或与聚合物毫微胶囊或微胶囊结合。
59.根据权利要求43至58之一的dsRNA,其中使所述dsRNA与能使ds RNA被定向吸收到受纤维化疾病影响的器官,尤其是肝脏,肾脏,肺,或皮肤的细胞中的因子结合。
60.根据权利要求59的dsRNA,其中所述因子是介导与VI型骨胶原受体或PDGFβ-受体,尤其是肝星状空泡细胞或肌成纤维细胞的VI型骨胶原受体或PDGFβ-受体连接的因子。
61.根据权利要求60的dsRNA,其中所述的因子是环肽C*GRGDSPC*。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109432047A (zh) * | 2018-10-29 | 2019-03-08 | 中国药科大学 | 一种逆转肺纤维化纳米制剂及其制备方法 |
CN112843253A (zh) * | 2021-01-13 | 2021-05-28 | 上海交通大学 | 一种基因/药物复合脂质制剂及其制备方法和用途 |
Families Citing this family (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19956568A1 (de) | 1999-01-30 | 2000-08-17 | Roland Kreutzer | Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens |
DE10100586C1 (de) | 2001-01-09 | 2002-04-11 | Ribopharma Ag | Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens |
US7829693B2 (en) | 1999-11-24 | 2010-11-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene |
US7423142B2 (en) | 2001-01-09 | 2008-09-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes |
US7767802B2 (en) | 2001-01-09 | 2010-08-03 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes |
US8546143B2 (en) | 2001-01-09 | 2013-10-01 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene |
US7745418B2 (en) | 2001-10-12 | 2010-06-29 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting viral replication |
DE10163098B4 (de) | 2001-10-12 | 2005-06-02 | Alnylam Europe Ag | Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren |
DE10202419A1 (de) | 2002-01-22 | 2003-08-07 | Ribopharma Ag | Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens |
EP3604537B1 (en) | 2003-06-13 | 2021-12-08 | Alnylam Europe AG | Double-stranded ribonucleic acid with increased effectiveness in an organism |
EP1486564A1 (de) * | 2003-06-13 | 2004-12-15 | Ribopharma AG | SiRNA mit erhöhter Stabilität in Serum |
WO2005046565A2 (en) * | 2003-11-17 | 2005-05-26 | Quark Biotech, Inc. | Diagnosis and treatment of kidney fibrosis and other fibrotic diseases |
US20080171051A1 (en) * | 2003-11-26 | 2008-07-17 | Patrick Gerard Johnston | Cancer Treatment |
JP4543189B2 (ja) * | 2004-03-10 | 2010-09-15 | 学校法人日本医科大学 | TGFβ1レセプターII型に対するRNAiとして作用するRNA配列 |
FR2898908A1 (fr) | 2006-03-24 | 2007-09-28 | Agronomique Inst Nat Rech | Procede de preparation de cellules aviaires differenciees et genes impliques dans le maintien de la pluripotence |
US9433684B2 (en) | 2008-08-19 | 2016-09-06 | Nektar Therapeutics | Conjugates of small-interfering nucleic acids |
CN103429270B (zh) | 2008-08-25 | 2016-11-23 | 埃克斯雷德制药有限公司 | 阻止***生长因子的反义核苷酸及其用途 |
US8946172B2 (en) * | 2008-08-25 | 2015-02-03 | Excaliard Pharmaceuticals, Inc. | Method for reducing scarring during wound healing using antisense compounds directed to CTGF |
WO2010033248A2 (en) * | 2008-09-22 | 2010-03-25 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Neutral nanotransporters |
CN102666587A (zh) | 2009-07-02 | 2012-09-12 | 菲布罗根有限公司 | 用于治疗肌营养不良的方法 |
WO2011035065A1 (en) | 2009-09-17 | 2011-03-24 | Nektar Therapeutics | Monoconjugated chitosans as delivery agents for small interfering nucleic acids |
WO2011056234A1 (en) | 2009-11-06 | 2011-05-12 | Fibrogen, Inc. | Treatment for radiation-induced disorders |
WO2011119887A1 (en) | 2010-03-24 | 2011-09-29 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Rna interference in dermal and fibrotic indications |
CA2794187C (en) | 2010-03-24 | 2020-07-14 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Rna interference in ocular indications |
US9944671B2 (en) * | 2010-06-02 | 2018-04-17 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods directed to treating liver fibrosis |
AR083445A1 (es) | 2010-10-14 | 2013-02-27 | Univ Mie | siARN CONTRA LA FIBROSIS |
US20140134181A1 (en) | 2010-11-05 | 2014-05-15 | Kenneth E. Lipson | Treatment Method For Lung Remodeling Diseases |
WO2012106508A1 (en) | 2011-02-02 | 2012-08-09 | Pfizer Inc. | Method of treating keloids or hypertrophic scars using antisense compounds targeting connective tissue growth factor (ctgf) |
WO2016098782A1 (ja) | 2014-12-15 | 2016-06-23 | 株式会社ボナック | TGF-β1発現抑制のための一本鎖核酸分子 |
WO2017100193A1 (en) | 2015-12-10 | 2017-06-15 | Fibrogen, Inc. | Methods for treatment of motor neuron diseases |
ES2941669T3 (es) * | 2016-07-29 | 2023-05-24 | Abion Inc | Composición para el tratamiento o la sensibilización de la enfermedad cancerosa resistente a interferón beta que comprende ARNip de cFLIP |
US20200369759A1 (en) | 2019-05-23 | 2020-11-26 | Fibrogen, Inc. | Methods of treatment of muscular dystrophies |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0737071A1 (en) * | 1993-06-15 | 1996-10-16 | Il- Yang Pharm. Co., Ltd. | Anti-sense oligodeoxynucleotide to fibrogenic cytokines and use thereof |
DE19631919C2 (de) * | 1996-08-07 | 1998-07-16 | Deutsches Krebsforsch | Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur |
US6242569B1 (en) * | 1997-02-05 | 2001-06-05 | Tularik, Inc. | Regulators of apoptosis |
DE19713393C2 (de) * | 1997-04-01 | 2002-12-05 | Apotech Res & Dev Ltd | Flip-Gen und Flip-Protein |
US6506559B1 (en) * | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
AU4411499A (en) * | 1998-06-05 | 1999-12-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Connective tissue growth factor-4 |
JP2002532384A (ja) * | 1998-10-08 | 2002-10-02 | ステイヒテイング・ボール・デ・テヒニシエ・ベテンシヤツペン | 星状細胞のためのペプチドを基剤としたキャリヤーデバイス |
AU765133B2 (en) * | 1998-11-06 | 2003-09-11 | Fibrogen, Inc. | Connective tissue growth factor (CTGF) and methods of use |
JP4634614B2 (ja) * | 1998-12-14 | 2011-02-16 | ユニバーシティー オブ マイアミ | 結合組織成長因子(ctgf)断片とそれを用いた方法および使用 |
DE19956568A1 (de) * | 1999-01-30 | 2000-08-17 | Roland Kreutzer | Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens |
US6436909B1 (en) * | 1999-09-17 | 2002-08-20 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of transforming growth factor-β expression |
GB9927444D0 (en) * | 1999-11-19 | 2000-01-19 | Cancer Res Campaign Tech | Inhibiting gene expression |
NZ553687A (en) * | 2000-03-30 | 2010-03-26 | Whitehead Biomedical Inst | RNA sequence-specific mediators of RNA interference |
PT1407044E (pt) * | 2000-12-01 | 2008-01-02 | Max Planck Ges Zur Forderung W | Moléculas curtas de arn que medeiam a interferência de arn |
-
2002
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-
2007
- 2007-05-11 US US11/747,549 patent/US20080070856A1/en not_active Abandoned
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109432047A (zh) * | 2018-10-29 | 2019-03-08 | 中国药科大学 | 一种逆转肺纤维化纳米制剂及其制备方法 |
CN112843253A (zh) * | 2021-01-13 | 2021-05-28 | 上海交通大学 | 一种基因/药物复合脂质制剂及其制备方法和用途 |
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