CN1827775A - 检测新城疫病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测新城疫病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法，尤指一组用以检测各亚型的新城疫病毒的特异性核苷酸序列、含有这些序列的试剂盒、以及用该组序列与试剂盒检测新城疫病毒的方法，属于检验检疫领域。一组用于检测各型新城疫病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQ ID No.1－No.4所示的碱基序列。本发明的有益效果为：快速、敏感、特异、灵敏、操作简单；试剂盒给检测者提供了质量优异的试剂及优化的操作程序，经过简单的培训，检测者就可胜任该项工作。

Description

检测新城疫病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法

技术领域

本发明涉及检测新城疫病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法，尤指一组用以检测各亚型的新城疫病毒的特异性核苷酸序列、含有这些序列的试剂盒、以及用该组序列与试剂盒检测中强毒力新城疫病毒的方法，属于检验检疫领域。

背景技术

新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起的一种急性、败血性、高度接触性传染病，传播迅速，发病率和死亡率高，有时高达100％，一旦爆发，会给养鸡业造成不可估量的经济损失。国际兽医卫生组织将其列为A类传染病，我国也将其列为一类检疫对象。

国家质检总局在2001年下发文件，要求对禽肉出口企业进行每两个月一次的定期监测，该规定要求用鸡胚病毒分离方法。鸡胚病毒分离是一种敏感、特异的方法，但是耗时长，约需3周左右，操作烦琐，只能起到监测作用，不能作快速检测用，不利于快速通关和控制禽肉携带病毒。

技术内容

本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测中强毒力新城疫病毒的核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供一种操作简单、结果准确的用与检测中强毒力新城疫病毒的试剂盒。

本发明的第三各目的是提供一种快捷、准确、方便的检测中强毒力新城疫病毒的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

检测新城疫病毒的特异核苷酸序列，如下：

1)上游引物：5’ATGGCAGGCCYCTTGCRGCTG 3’

2)下游引物：5’CCGAGGCTGCTGTTATYTGTGC 3’

其中Y代表嘧啶，此处为T或C；R代表嘌呤，此处为A或G。

3)探针序列FAM-AAGCGTTTCTGTCTCCTTCCTCCG-TAMRA

4)探针序列FAM-AAACGTTTCTGTCTCCTTCCTCCGG-TAMRA

新城疫病毒(NDV)基因组为单股不分节RNA，编码6种病毒结构蛋白，其中融和蛋白(F)和血凝素—神经氨酸酶(HN)构成囊膜外表面的纤突，是NDV的功能型糖蛋白，在致病和免疫应答过程中起重要作用。由于新城疫弱毒苗的广泛使用，本方法要求仅检出强毒和中等毒力毒株，而对于弱毒苗不得检出。研究表明：新城疫病毒毒力强弱与F蛋白裂解位点区的氨基酸组成密切相关，所以本试剂盒选择新城疫病毒F基因(合成F蛋白)作为靶区域。选择能够反应裂解位点特性且缺乏二级结构的保守区设计多对引物和探针。引物长度一般为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。

检测新城疫病毒的试剂盒，由以下组成成分构成：

1)裂解液：自INVITROGEN公司购买，货号10296

2)RT-PCR反应液

         表1

组分	终浓度
		10×PCR缓冲液	1×PCR缓冲液
TaqE	1u
		引物I	0.2umol/L
引物II	0.2umol/L
		探针	0.1umol/L

3)RT-PCR酶：自安发玛西亚公司公司购买，货号27-9259-01含量12颗

4)Taq酶：自上海普洛麦格公司购买，5U/ul

5)DEPC水：自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，电阻率≥18.0MΩ.cm

6)阴性对照：灭活尿囊液

7)阳性对照：体外转录的RNA

一种新城疫病毒的检验方法，使用新城疫病毒通用引物和探针，灭活尿囊液为阴性对照，对样本进行RT-PCR反应，并判断结果，其中：

(一)RT-PCR反应的循环条件为：

42℃：30min；

92℃：3min；

92℃：10sec，45℃：30sec 72℃：1min  5个循环

92℃：10sec，60℃：30sec  40个循环，60℃时设置收集荧光。

(二)结果判定标准：

(1)阴性对照的检测结果为阴性；阳性对照的Ct值应小于等于28.0；否则，此次实验视为无效；

(2)Ct值无数值的样本为阴性样本；Ct值≤30.0的样本为阳性；

(3)Ct值大于30.0的样本建议重做：重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。

本发明的有益效果为：1)快速：从样品处理到出结果仅需4小时左右；2)敏感：检测组织脏器和拭子的灵敏度与鸡胚病毒分离基本一致；3)特异：与常见禽类其他病毒不发生交叉反应，而且不仅采用了特异性的引物，还采用了特异性的探针，使该方法的特异性高于传统PCR方法，大大杜绝了非特异性扩增造成的假阴性结果；4)灵敏：由于采用了特异性的荧光探针和高灵敏度的荧光PCR仪，使该方法比传统的PCR方法灵敏度高100～1000倍。对于新城疫病毒尿囊液，稀释至10^-7仍可检出，接近鸡胚病毒分离；5)操作简单：试剂盒给检测者提供了质量优异的试剂及优化的操作程序，经过简单的培训，检测者就可胜任该项工作。

下面结合较佳实施例对本发明作进一步说明，可以帮助本领域的技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明，凡依照本发明的内容所做的任何本领域的等同替换均属于本发明的保护范围之内。

具体实施方式

实施例1.筛选通用引物和探针序列

一.材料：该试验涉及的毒种由北京出入境检验检疫局分离保存，具体如下：

BJ1：NDV标准强毒F48E9

BJ2：NDV野毒  从山东某鸡场发病鸡分离。

BJ3：NDV野毒  从山东某鸡场发病鸡分离。

BJ4：NDV野毒  从某肉鸡场发病鸡群分离。

BJ5：NDV野毒  从内蒙古某发病鸡场分离。

BJ6：NDV野毒  从2002年国际信鸽大赛参赛死亡信鸽分离。

BJ7：NDV野毒  从美国进口发病信鸽分离。

BJ8：NDV疫苗毒Lasota  购自北京生药厂。

BJ9：NDV IV系苗  购自北京生药厂。

BJ10：NDV I系苗  购自北京生药厂。

BJ11：NDV II系苗  购自北京生药厂。

二.方法

(一)设计合成引物和探针序列

新城疫病毒毒力强弱与F蛋白裂解位点区的氨基酸组成密切相关，所以本试剂盒选择新城疫病毒F基因(合成F蛋白)作为靶区域。选择能够反应裂解位点特性且缺乏二级结构的保守区设计多对引物和探针。引物长度一般为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。

引物和探针从不同厂家合成，如上海生工、大连宝生物、国外公司如GIBCO/BRL、IDT等等，要求PAGE纯或HPLC纯，到货时同时提供厂家对该产品的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱。收到引物后做HPLC分析，应该得到单吸收峰图谱、用紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之间，则视为合格引物。

(二)筛选和配对

1.通过引物、探针的筛选实验将上述上游引物和下游引物结合探针位置进行配对，PCR反应体系如表2所示：

          表2 PCR反应体系

组分	终浓度
		RT-PCR beads	0.25粒
TaqE	1.25u
		引物I	0.2umol/L
引物II	0.2umol/L
		探针	0.1umol/L
模板DNA	10ul
		补DEPC水至	25ul

RT-PCR beads为Amersham Pharmacia Biotech Inc的Ready-To-GoTM RT-PCR Beads(Cat.No.27-9259-01)

2.PCR循环参数如下：

42℃：30min；92℃：3min；

92℃：10sec，45℃：30sec 72℃：1min  5个循环

92℃：10sec，60℃：30sec 40个循环，60℃时设置收集荧光；

3.采用上述条件对新城疫病毒的毒株尿囊液10⁵倍稀释提取RNA，选取合适的引物搭配进行扩增，同时对阳性模板(按如下方法获得：用新城疫病毒尿囊液，PBS稀释10-1至10-9，采用异硫氰酸胍—酚—氯仿一步法提取RNA备用。)10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8进行扩增，得到效率和升幅较高的引物及与之配对的探针序列。

三.结果

1)上游引物：5’ATGGCAGGCCYCTTGCRGCTG 3’

2)下游引物：5’CCGAGGCTGCTGTTATYTGTGC 3’

其中Y代表嘧啶，此处为T或C；R代表嘌呤，此处为A或G。

3)探针序列FAM-AAGCGTTTCTGTCTCCTTCCTCCG-TAMRA

4)探针序列FAM-AAACGTTTCTGTCTCCTTCCTCCGG-TAMRA

探针的5’端和3’端分别连接荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭基团(TAMRA)，委托美国Integrated DNA Technologies，inc合成。该组通用引物和探针序列可用于检测各型新城疫病毒。

实施例2.新城疫病毒通用荧光RT-PCR检测试剂盒

一.荧光RT-PCR反应体系的优化

(一)方法：将实施例1最终得到的引物浓度从0.1umol/L至0.8umol/L以0.1umol/L递增，探针浓度从0.025umol/L至0.2umol/L以0.025umol/L递增。对引物和探针不同浓度的配比进行了比较，其他条件均同表2。

采用上述配比对BJ2毒株(北京出入境检验检疫局保存)尿囊液10^-5稀释所提取的核酸进行扩增，循环条件同表3，每组均采用复管进行实验。

(二)结果：从多次重复实验中发现，不同浓度的引物、探针对于该阳性模板，CT值基本稳定在27.6-28.2，但引物浓度为0.2umol/L，探针浓度为0.1umol/L时荧光增幅较高，所以选定引物浓度为0.2umol/L，探针浓度为0.1umol/L作为新城疫病毒荧光RT-PCR检测试剂盒引物和探针浓度。

二.试剂盒的组成

(一)样本处理试剂：裂解液(购自INVITROGEN公司，货号10296)

(二)核酸扩增试剂：

1.RT-PCR反应液：同表1。

2.RT-PCR酶：含量12颗，0.25颗/test(购自安发玛西亚公司公司，货号27-9259-01)

3.Taq酶：5U/ul(购自上海普洛麦格公司)

4.DEPC水：自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，电阻率≥18.0MΩ.cm

三.对照品

1.阴性对照：灭活阴性尿囊液

2.阳性对照：体外转录的RNA(用新城疫病毒BJ1株尿囊液，PBS稀释10^-1至10^-9，采用异硫氰酸胍—酚—氯仿一步法提取RNA备用。)

其中RT-PCR反应液中的引物序列为：

上游引物：5’ATg gCA ggC C(T/C)C TTg C(A/g)g CTg 3’和

下游引物：5’CCg Agg CTg CTg TTA T(C/T)T gTg C 3’

其中RT-PCR反应液中的探针序列为：

FAM-AA gCg TTT CTg TCT CCT TCC TCC g-TAMRA或

FAM-AA ACg TTT CTg TCT CCT TCC TCC gg-TAMRA

本试剂盒适用于检测各型新城疫病毒。

四.阳性、阴性对照制备及检测：

(一)阴性对照品的制备和检验

1.阴性对照品的制备：委托专业的SPF鸡场孵育SPF鸡胚至12日龄，无菌抽取鸡胚尿囊液。60℃作用1小时灭活。

2.阴性对照品的检验：用合格的本试剂盒检测NDV RNA阴性。

(二)阳性对照品的制备和检验

1.阳性对照品的制备

(1)扩增目的核酸片段

按表3配方配成RT-PCR反应液，加入阳性NDV RNA模板，用PE2400扩增仪进行PCR扩增，扩增条件如下，以期得到大量的目的片段。PCR完毕，用1.8％琼脂糖凝胶电泳的方法检测扩增产物，紫外灯下见到一条分子量大小正确的特异性亮带、无非特异性扩增带，则证明扩增成功，保留PCR产物备用。

     表3 RT-PCR反应体系

组分	终浓度
		引物u	0.2umol/l
引物r	0.2umol/l

RT-PCR酶*	1颗
		RNA模板	8ul
补加DEPC水至	50ul

*)RT-PCR酶：安发玛西亚公司的Ready-To-Go^TM RT-PCR Beads(Cat.No.27-9259-01)

PT-PCR反应循环参数

42℃：30min

94℃：5min

95℃：5sec，55℃：30sec，72℃：60see，40循环

(2)纯化目的核酸片段

采用Promega公司的Wizard PCR Preps DNA Purlfication System(Cat#A7170、Lot#11356102)试剂盒纯化上述PCR产物中的目的核酸片段。再用1.8％琼脂糖凝胶电泳的方法对纯化的扩增产物进行粗略定量。

(3)连接反应

用Promega公司的PGEM-T Easy Vertor System II(Cat#A1380、Lot#86893)试剂盒将目的片段与T载体相连接。

      表4.连接反应体系

组  分	体积
		2×buffer	5ul
T-vector	1ul
		PCR product	Xul
T4 DNA Ligase	1ul
		补加去离子水至	10ul

连接反应中将PCR产物与T载体的数量的比值控制在1∶3-3∶1之间，因为此时连接效率最高。连接反应的条件为：4℃过夜，如不立即进行后续步骤，连接产物保存在4℃。

(4)转化

按照Promega公司的PGEM-T Easy Vertor System II的说明书要求，将上述连接产物转化入JM109感受态细胞，然后将转化的感受态细胞涂于含有X-Gal和IPTG的琼脂平板，37℃培养12-16小时。

(5)克隆菌落鉴定

从平板上长出的蓝色、白色菌落中随机挑取3-4个白色菌落，提取质粒，用PCR反应液检测，扩增阳性的为合格的克隆菌落。

(6)质粒扩增

挑取经鉴定为阳性的菌落，用3-5ml液体LB培养基培养，37℃摇床振荡培养12-16小时。

(7)质粒纯化

用Promega公司的Wizard Plus Minipreps DNA Purification System(Cat#A7100、Lot#10454011)试剂盒进行质粒的提纯，用1.0％琼脂糖凝胶电泳的方法对提纯的质粒进行纯度检测。

(8)体外转录

以纯化的质粒为模板，用Promega公司的Ribo MAX^TMLarge Scale RNA ProductionSystem-T7(Cat#P1300、Lot#125575)试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后，即得到制备NDV阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液。

体外转录体系见表5。反应条件为37℃温浴2-4小时。

               表5.T7体外转录体系

组分	终浓度
		5×buffer	20ul
rNTPs(25mMATP，CTP，GTP，TTP)	30ul
		Linear DNA template(5-10ug	Xul
Enzyme Mix(T7)	10ul
		补加Nuclease-Free水至	100ul

2.阳性对照品的检验

用紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值应在1.8-2.0之间，用合格的试剂进行检定应为阳性。

将NDV RNA阳性对照品母液用1×TE进行10倍梯度稀释，得到多个梯度稀释液。各个梯度稀释液用合格NDV荧光检测试剂盒进行Ct值标定，取Ct在22.0～28.0之间的稀释液作为试剂盒的阳性对照，分装后-70℃保存。

实施例3.检测新城疫病毒的方法

一.样本采集、存放及运输

(一)样本采集：所用取样器材必须经高压或干热灭菌。

若样品为活禽，建议取咽喉拭子和泄殖腔拭子：取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮几次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子时将拭子深入泻殖腔转一圈沾取粪便。然后将拭子一起放入盛有2ml PBS(含抗菌素)的试管，充分洗涤拭子，然后在管壁挤干液体，转入无菌离心管中备用。

若样品为新鲜肌肉或脏器，取待检样品2g于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10ml PBS混匀，取上清转入无菌离心管中备用。为使样品的代表性更强，也可取50克肉样，加入50ml无菌的PBS液，用Bagmixer均质器处理后，取上清备用。

若样品为血清、血浆或冷冻组织渗出液，则直接取用。

(二)存放：分离后的样本在2℃-8℃条件下保存应不超过24hr；-70℃以下可长期保存，但应避免反复冻融。

(三)运输：采用冰壶或泡沫箱加冰密封进行运输。

二.样本处理

(一)取n个1.5ml灭菌离心管(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，作好标记。

(二)首先加入600ul裂解液，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200ul；再加入200ul氯仿，混匀器上振荡混匀5sec。

(三)于12,000r/min离心15min(如有条件，于4℃进行离心)。

(四)取与步骤(一)中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400ul异丙醇(-20℃预冷)，作好标记。

(五)吸取步骤(三)各管中的上清液相转移至相应的管中(上清液应至少吸取500ul，注意不要吸出中间层)，颠倒混匀。

(六)12,000r/min离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入600ul 75％乙醇(-20℃预冷)，颠倒洗涤。

(七)12,000r/min离心10min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。

(八)4,000r/min离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，室温干燥3min。

(九)每管加入11ul DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2,000r/min离心5sec，冰上保存备用。

三.RT-PCR扩增

(一)扩增试剂准备：从试剂盒中取出RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2,000r/min离心5sec。设所需PCR管数为n(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：

                  表6

试剂	RT-PCR反应液	Taq酶
			用量	15ul	0.25ul

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入n/4颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15ul。

(二)加样

在各设定的PCR管中分别加入上述样本处理步骤中制备的RNA溶液各10ul，盖紧管盖，于400r/min离心5sec。将PCR管排好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。

(三)RT-PCR反应

循环条件设置：42℃：30min；

              92℃：3min；

              92℃：10sec，45℃：30sec 72℃：1min  5个循环

              92℃：10sec，60℃：30sec 40个循环，60℃时设置收集荧光。

四.结果判定

(一)结果分析条件设定：读取检测结果，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。

(二)结果判定：

1.质控标准：阴性对照的检测结果为阴性。

            阳性对照的Ct值应小于等于28.0。否则，此次实验视为无效。

2.结果判断：Ct值无数值的样本为阴性样本。Ct值≤30.0的样本为阳性。

Ct值大于30.0的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。

实施例4.特异性和灵敏性试验

将建立的检测新城疫病毒的荧光RT-PCR方法检测不同稀释度的鸡胚感染尿囊液，并与鸡胚分离方法比较，评估该方法的灵敏度；用该方法检测常见禽类病毒，以评估该方法的特异性。

一.材料

新城疫病毒株(见表8)

SPF鸡胚：购自北京实验动物中心。

1日龄SPF雏鸡：本课题组用SPF鸡胚孵化。

二.方法：

1.鸡胚平均死亡时间(MDT)：按OIE(2000)规定的方法进行。

2.脑内致病指数(ICPI)：按OIE(2000)规定的方法进行。

3.敏感性试验：将10株中强毒力新城疫病毒的尿囊液作10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10倍稀释，分成两份，一份做荧光RT-PCR，一份接种10日龄鸡胚，每个稀释度接种5枚，每天观察两次。

4.特异性试验：用荧光RT-PCR检测收集到的所有新城疫病毒株，和常见禽类病毒：禽流感病毒H5、H9亚型、IBDV、IBV、KIBV、CAAV、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒。

三.结果

1.10株中强毒力新城疫病毒尿囊液的不同稀释度用荧光RT-PCR和鸡胚分离检测结果比较：见表7

表7荧光RT-PCR和鸡胚分离检测10株中、强毒力新城疫病毒尿囊液比较

病毒株	鸡胚最小致死量	荧光RT-PCR检测极限
			F48E9ND-154I系Pigeon-NDV-1SNDV-1SNDV-2SNDV-3SNDV-4NM-NDVRJ-NDV	10-910-9未测10-810-910-910-810-910-910-8	10-710-710-710-510-710-710-710-710-710-7

从表7中可以看出，在检测鸡胚尿囊液时，鸡胚病毒分离较荧光RT-PCR敏感。荧光RT-PCR检测鸡胚感染尿囊液的最高稀释度为10^-7，最低为10^-5。

2.荧光RT-PCR对22株不同毒力新城疫病毒株的测定

对22株不同毒力的新城疫病毒进行了测定，其来源、致病力、荧光RT-PCR检测结果见表8。

从表8中可以看出，本发明建立的荧光RT-PCR可以区分中、强毒力新城疫病毒和疫苗弱毒，除一株从大奖赛死鸽分离的新城疫病毒株不能检出外，其他新城疫中强毒都能够检出。另外应用本发明建立的荧光RT-PCR对哈尔滨兽医研究所从全国各地分离的30株新城疫病毒进行检测，除3株从鸟类分离的新城疫病毒和6株新城疫弱毒未检出外，其他24株强毒均能检出。

              表8不同新城疫病毒株的来源、毒力测定和检测结果

毒株	来源	MDT	ICPI	LRT-PCR
					F48E9	标准毒株	48	1.83	+
BJ2-NDV	从发病鸡分离	50.6	1.85	+
					BJ3-NDV	从发病鸡分离	48	1.94	+
BJ4-NDV	从发病鸡分离	50.6	1.91	+
					BJ5-NDV	从国际信鸽大赛死亡鸽分离			-
BJ6-NDV	从美国进口发病信鸽分离	56.4	1.48	+
					BJ7-NDV	从发病鸡分离	56.4	1.85	+
BJ8-NDV	从正常鸡群分离	64.8	未测	+
					LASOTA	本实验室保存	未测	未测	-
NDV-IV系苗	购自北京生药厂	未测	未测	-
					NDV I系苗	购自北京生药厂	未测	未测	+
NDV II系苗	购自北京生药厂	未测	未测	-
					SNDV-1	从发病鸡分离	55.2	1.69	+
SNDV-2	从发病鸡分离	50.4	1.75	+
					SNDV-3	从发病鸡分离	52.8	1.70	+
SNDV-4	从正常鸡分离	57.6	1.69	+
					SNDV-5	从发病鸡分离	50.4	1.75	+
SNDV-6	从发病鸡分离	48	1.70	+
					SNDV-7	从发病鸡分离	50.4	1.75	+
SNDV-8	从发病鸡分离	50.4	1.725	+
					SNDV-9	从正常鸡分离	＞120	0	-
SNDV-10	从发病鸡分离	52.8	1.73	+
					SNDV-11	从发病鸡分离	52.8	1.74	+

3.荧光RT-PCR检测其他常见禽类病毒

荧光RT-PCR检测其他常见禽类病毒的结果：见表9

从表9中可以看出，建立的荧光RT-PCR检测中强毒力新城疫病毒株方法与常见的禽类病毒无交叉反应，说明设计的引物、探针特异性良好。

                  表9荧光RT-PCR特异性试验

病毒	来源	荧光RT-PCR结果
			禽流感病毒H5亚型禽流感病毒H9亚型IBDVIBV(H52)IBV(H120)KIBVCAAV鸭瘟病毒鸭肝炎病毒	北京出入境检验检疫局分离鉴定北京出入境检验检疫局分离鉴定北京市农科院北京市农科院北京市农科院北京市农科院北京市农科院中国农业大学中国农业大学	---------

                          序列表

<110>中华人民共和国北京出入境检验检疫局

     深圳市匹基生物工程股份有限公司

<120>检测新城疫病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>新城疫病毒(newcastle disease virus)

<220>

<223>新城疫病毒通用引物序列

<400>1

atggcaggcc ycttgcrgct g                21

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>新城疫病毒(newcastle disease virus)

<220>

<223>新城疫病毒通用引物序列

<400>2

ccgaggctgc tgttatytgt gc                     22

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>新城疫病毒(newcastle disease virus)

<220>

<223>新城疫病毒通用探针序列

<400>3

aagcgtttct gtctccttcc tccg                   24

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>新城疫病毒(newcastle disease virus)

<220>

<223>新城疫病毒通用探针序列

<400>4

aaacgtttct gtctccttcc tccgg                  25

Claims (5)

1.一组用于检测各型新城疫病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQ ID No.1-No.4所示的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的一组用于检测各型新城疫病毒的核苷酸序列，其特征在于：所述序列表SEQ ID No.3或SEQ ID No.4的核苷酸序列在5’端和3’端分别连接荧光报告基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA。

3.一种检测新城疫病毒的试剂盒，其特征在于：采用权利要求1或2所述的核苷酸序列作为检测新城疫病毒的引物I、引物II或探针序列。

4.根据权利要求3所述的一种检测新城疫病毒的试剂盒，其特征在于：其组成如下：

1)裂解液；

2)RT-PCR反应液，终浓度配制成：10×PCR缓冲液；1u TaqE；0.2umol/L引物I；0.2umol/L引物II；0.1umol/L探针；0.1umol/L DNTP；

3)RT-PCR酶：0.25颗/test；

4)Taq酶5U/ul；

5)DEPC水；

6)阴性对照：灭活尿囊液；

7)阳性对照体：外转录的RNA。

5.一种检测新城疫病毒的方法，使用权利要求1或2所述的新城疫病毒通用引物或探针，灭活尿囊液为阴性对照，对样本进行RT-PCR反应，并判断结果，其中：

(一)RT-PCR反应的循环条件为：

42℃：30min；

92℃：3min；

92℃：10sec，45℃：30sec 72℃：1min  5个循环

92℃：10sec，60℃：30sec 40个循环，60℃时设置收集荧光；

(二)结果判定标准：

(1)阴性对照的检测结果为阴性；阳性对照的Ct值应小于等于28.0；否则，此次实验视为无效；

(2)Ct值无数值的样本为阴性样本；Ct值≤30.0的样本为阳性；

(3)Ct值大于30.0的样本建议重做：重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。