WO2003035868A1 - Medikament zur erhöhung der wirksamkeit eines rezeptor-vermittelt apoptose in tumorzellen auslösenden arzeimittels - Google Patents

Medikament zur erhöhung der wirksamkeit eines rezeptor-vermittelt apoptose in tumorzellen auslösenden arzeimittels Download PDF

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WO2003035868A1
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Harald Wajant
Klaus Pfizenmaier
Stefan Limmer
Roland Kreutzer
Hans-Peter Vornlocher
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Ribopharma Ag
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Definitions

  • the invention relates to a medicament and a use for increasing the effectiveness of a receptor-mediated apoptosis in a drug that triggers tumor cells.
  • the invention further relates to a use for the production of such a medicament, a method for increasing the effectiveness of a receptor-mediated apoptosis in an active substance which triggers tumor cells, and a double-stranded ribonucleic acid.
  • DE 101 00 586 C1 discloses a method for inhibiting the expression of a target gene in a cell, in which an oligoribonucleotide with a double-stranded structure is introduced into the cell.
  • One strand of the double-stranded structure is complementary to the target gene.
  • the principle on which inhibition is based is now known as RNA interference.
  • a well-known active ingredient that triggers apoptosis is the tumor
  • TRAIL activates a caspase by binding to TRAIL-Rl and TRAIL-R2, two members of the TNF receptor superfamily that contain a death domain, and thereby triggers apoptosis in tumor cells.
  • mice embryonic fibroblasts which lack the cellular F ICE inhibitor protein (c-FLIP) are particularly sensitive to receptor-mediated apoptosis. However, these cells were not tumor cells.
  • c-FLIP cellular F ICE inhibitor protein
  • splice variants of c-FLIP are known, including a short splice variant c-FLIP-S and a long splice variant c-FLIP-L. From Bin, L. et al. , FEBS Lett 510 (1-2) (2002), pages 37 to 40, it is known that c-FLIP-deficient embryonic mouse fibroblasts become resistant to TRAIL-induced apoptosis by retrovirally mediated transduction of c-FLIP-S.
  • Tumor cells are often not or hardly sensitive to drugs or active substances that trigger apoptosis. Treatment with such drugs therefore often requires co-treatment by radiation or chemotherapy in order to achieve a therapeutic effect of the drug which triggers apoptosis.
  • the co-treatments mentioned are accompanied by strong side effects.
  • the object of the present invention is to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • a medicament, a double-stranded ribonucleic acid and a use for increasing the effectiveness of an apoptosis in tumor cell-inducing medicament are to be provided, which avoids the strong side effects mentioned above.
  • a use for the production of such a medicament and a method for increasing the effectiveness of an apoptosis in an agent which triggers tumor cells are to be provided.
  • a medicament is provided to increase the effectiveness of a receptor-mediated apoptosis in drug which triggers tumor cells, the medicament containing a double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) which is suitable for inhibiting the expression of a c-FLIP gene by means of RNA interference.
  • dsRNA double-stranded ribonucleic acid
  • a dsRNA is present if it consists of a or two ribonucleic acid strands consisting of ribonucleic acid has a double-stranded structure. Not all nucleotides of the dsRNA have to have canonical Watson-Crick base pairings. In particular, individual non-complementary base pairs have little or no effect on the effectiveness. The maximum possible number of base pairs is the number of nucleotides in the shortest strand contained in the dsRNA.
  • the medicament can contain the dsRNA in an amount sufficient to inhibit the expression of the c-FLIP gene in the tumor cells.
  • the drug can also be designed so that several units of the drug together contain the sufficient amount in total. The sufficient amount depends on the form of administration.
  • the dsRNA can be administered in increasing amounts or doses. Then, using a tissue sample taken from the tumor, it can be determined using known methods whether the expression of the c-FLIP gene has been inhibited with this amount. The methods can e.g. are molecular biological, biochemical or immunological methods.
  • RNA interference enables targeted treatment of tumors with few side effects or weak side effects, with drugs that specifically trigger the apoptosis of tumor cells.
  • the drug preferably triggers apoptosis by means of tumor necrosis factor or tumor necrosis factor-related ligands which trigger apoptosis, in particular TRAIL.
  • the effective speed of such a drug can be increased particularly effectively by the method according to the invention.
  • a strand S1 of the dsRNA preferably has a region which is complementary to the c-FLIP gene, at least in sections, and in particular comprises fewer than 25 successive nucleotides.
  • the “c-FLIP gene” is understood to mean the DNA strand of the double-stranded DNA coding for c-FLIP in the tumor cell, which is complementary to a DNA strand which serves as a template during transcription, including all transcribed areas.
  • the c-FLIP gene is therefore generally the sense strand.
  • the strand S1 can thus be complementary to an RNA transcript formed during the expression of the c-FLIP gene or its processing product, such as e.g. an mRNA. For example, be sufficient if the strand S1 is complementary to part of the 3 'untranslated region of the mRNA.
  • the complementary region of the dsRNA can have 19 to 24, preferably 20 to 24, particularly preferably 21 to 23, in particular 22 or 23, nucleotides.
  • a dsRNA with this structure is particularly efficient in inhibiting the c-FLIP gene.
  • the strand S1 of the dsRNA can have less than 30, preferably less than 25, particularly preferably 21 to 24, in particular 23, nucleotides. The number of these nucleotides is also the number of the maximum possible base pairs in the dsRNA.
  • dsRNA has a single-stranded overhang formed from 1 to 4, in particular 2 or 3, nucleotides.
  • a dsRNA has a better effectiveness in inhibiting the expression of the c-FLIP gene than at least one end of a dsRNA without single-stranded overhangs.
  • One end is a region of the dsRNA in which there is a 5 'and a 3' strand end.
  • One only dsRNA existing in strand S1 accordingly has a loop structure and only one end.
  • a dsRNA formed from the strand S1 and a strand S2 has two ends. One end is formed in each case by one end of strand S1 and one end of strand S2.
  • the single-stranded overhang is preferably located at the 3 'end of the strand S1. This localization of the single-stranded overhang leads to a further increase in the efficiency of the drug.
  • the dsRNA can also have a single-stranded overhang only at one end, in particular at the end located at the 3 'end of the strand S1. The other end is smooth on a double ended dsRNA, i.e. without overhangs, trained. Surprisingly, it has been shown that an overhang at one end of the dsRNA is sufficient to enhance the interference effect of the dsRNA, without lowering the stability to the same extent as by two overhangs.
  • a dsRNA with only one overhang has proven to be sufficiently stable and particularly effective both in various cell culture media and in blood, serum and cells.
  • the dsRNA preferably has a strand S2, ie it is formed from two individual strands.
  • the medicament is particularly effective if the strand S1 (anti-sense strand) has a length of 23 nucleotides, the strand S2 has a length of 21 nucleotides and the 3 'end of the strand S1 has a single-stranded overhang formed from two nucleotides , The end of the dsRNA located at the 5 'end of the strand S1 is smooth.
  • the strand S1 can be complementary to the primary or processed RNA transcript of the c-FLIP gene.
  • the dsRNA preferably consists of strand S2 with the sequence SEQ ID NO: 1 and strand S1 with the sequence SEQ ID NO: 2 or strand S2 with the sequence SEQ ID NO: 3 and strand S1 with the sequence SEQ ID NO : 4 or the strand S2 with the sequence SEQ ID NO: 1 and the strand S1 with the sequence SEQ ID NO: 7 or the strand S2 with the sequence SEQ ID NO: 3 and the strand S1 with the sequence SEQ ID NO: 8 according to the attached sequence listing.
  • a dsRNA is particularly effective in inhibiting the expression of the c-FLIP gene.
  • the dsRNA can be enclosed in the medicament in a solution, in particular a physiologically compatible buffer or a physiological saline solution, of a micellar structure, preferably a liposome, a capsid, a capsoid or a polymeric nano- or microcapsule, or on a polymeric nanocapsule. or microcapsule bound.
  • the physiologically compatible buffer can be a phosphate-buffered saline solution.
  • a micellar structure, a capsid, a capsoid or a polymeric nano or microcapsule can facilitate the uptake of the dsRNA into the tumor cells.
  • the polymeric nano or microcapsule consists of at least one biodegradable polymer, e.g. Polybutylcyanoacry- lat.
  • the polymeric nano- or microcapsule can transport and release dsRNA contained in or bound to it in the body.
  • the dsRNA can be administered orally, by inhalation, infusion or injection, in particular intravenous, intraperitoneal or intratumoral infusion or injection.
  • the medicament can therefore have a preparation which is suitable for inhalation, oral ingestion, infusion or injection, in particular for intravenous, intraperitoneal or intratumoral infusion or injection.
  • a preparation suitable for inhalation, infusion or injection can consist of a physiologically compatible solvent, preferably a physiological saline solution or a physiologically compatible buffer, in particular a phosphate-buffered salt solution, and the dsRNA.
  • a dsRNA which is only dissolved and administered in such a buffer or solvent is taken up by the tumor cells and inhibits the expression of the c-FLIP gene without the dsRNA having to be packaged in a special vehicle.
  • the medicament is preferably present in at least one administration unit which contains the dsRNA in an amount which has a dosage of at most 5 mg, in particular at most 2.5 mg, preferably at most 200 ⁇ g, particularly preferably at most 100 ⁇ g, preferably at most 50 ⁇ g, in particular allows a maximum of 25 ⁇ g per kg body weight and day. It has been shown that the dsRNA has an excellent effectiveness in inhibiting the expression of the c-FLIP gene even at this dosage.
  • the administration unit can be designed for a single administration or intake per day. Then the entire daily dose is contained in one administration unit. If the administration unit is designed for repeated administration or ingestion per day, the dsRNA is contained therein in a correspondingly smaller amount that enables the daily dose to be reached.
  • the administration unit can also be designed for a single administration or ingestion for several days, e.g. B. by releasing the dsRNA over several days. The administration unit then contains a corresponding multiple of the daily dose.
  • the use of a double-stranded ribonucleic acid suitable for inhibiting the expression of a c-FLIP gene by means of RNA interference is furthermore provided for the manufacture of a medicament for increasing the effectiveness of a receptor-mediated drug which triggers apoptosis in tumor cells.
  • the invention furthermore relates to the use of a double-stranded ribonucleic acid which is suitable for inhibiting the expression of a c-FLIP gene by means of RNA interference intended to increase the effectiveness of a receptor-mediated apoptosis in drug-inducing drug.
  • a method for increasing the effectiveness of a receptor-mediated apoptosis in an active agent which triggers a tumor cell, a double-stranded ribonucleic acid suitable for inhibiting the expression of a c-FLIP gene by means of RNA interference being introduced into the tumor cell.
  • "To be introduced” is understood to mean the absorption into the cell. It can be picked up by the cell itself. However, it can also be imparted by means of auxiliary substances or aids.
  • the invention also relates to a double-stranded ribonucleic acid, one strand S1 of which has a region which is at least partially complementary to the c-FLIP gene.
  • KB cells are from the American Type Culture Collection
  • ATCC ATCC under the ATCC no. CCL-17 available.
  • SV80 cells can be obtained from CLS, 69123 Heidelberg, Germany under order number 0345 HU (ATCC no .: CRL-7725).
  • the dsRNAs used have the following sequences, designated SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 9 in the sequence listing:
  • dsRNA-Fl which corresponds to nucleotides 472 to 492 of the c-flip-L gene:
  • S2 5'-GUGCCGGGAUGUUGCUAUAGA-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • Sl 3' -AACACGGCCCUACAACGAUAU-5 '(SEQ ID NO: 2)
  • dsRNA-F2 which corresponds to nucleotides 908 to 928 of the c-flip-L gene:
  • S2 5'-CAAGGAGCAGGGACAAGUUAC-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • Sl 3' -AAGUUCCUCGUCCCUGUUCAA-5 '(SEQ ID NO: 4)
  • dsRNA-neo which is complementary to a sequence from the neomycin resistance gene:
  • S2 5 '-GAUGAGGAUCGUUUCGCAUGA-3' (SEQ ID NO: 5)
  • Sl 3 '-UCCUACUCCUAGCAAAGCGUA-5' (SEQ ID NO: 6)
  • dsRNA-F3 which corresponds to nucleotides 472 to 494 of the c-flip-L gene:
  • S2 5 '-GUGCCGGGAUGUUGCUAUAGA-3' (SEQ ID NO: 1)
  • Sl 3 '-AACACGGCCCUACAACGAUAUCU-5' (SEQ ID NO: 7)
  • dsRNA-F4 which corresponds to nucleotides 908 to 930 of the c-flip-L gene:
  • S2 5 '-CAAGGAGCAGGGACAAGUUAC-3' (SEQ ID NO: 3)
  • Sl 3 '-AAGUUCCUCGUCCCUGUUCAAUG-5' (SEQ ID NO: 8) dsRNA control, which is complementary to a sequence from the neomycin resistance gene:
  • S2 5 '-GAUGAGGAUCGUUUCGCAUGA-3' (SEQ ID NO: 5)
  • Sl S'-UCCUACUCCUAGCAAAGCGUACU-S '(SEQ ID NO: 9)
  • Each 10 7 SV80 and KB cells per ml are transiently electroplated twice on consecutive days without (FIG. 1A, FIG. 2A) or with 150 nmol / 1 dsRNA-neo (FIG. 1B, FIG. 2 B), 150 nmol / 1 dsRNA-Fl (Fig. 1 C, Fig. 2 C), 150 nmol / 1 dsRNA-F2 (Fig. 1 D, Fig. 2 D) or a mixture of 75 nmol / 1 each dsRNA-Fl and dsRNA-F2 (Fig. 1 E, Fig. 2 E) have been transfected.
  • a GFP (green fluorescent protein) expression plasmid was added to the electroporation solution in order to be able to check the respective efficiency of the transfection.
  • the cells were harvested one day after the first electroporation. With some of the cells, the transfection efficiency was determined by flow cytometry by measuring the fluorescence intensity. The fluorescence intensity of these cells is shown in FIGS. 1 AE and 2 AE in each case in the left field by a solid thick line. The fluorescence intensity represented by a thin line in the same field is that of the same cells without a GFP expression plasmid.
  • the other part of the cells was electroporated a second time with the same dsRNA as on the first day. The cells were then seeded into the wells of 96-well plates in 100 ⁇ l medium. The next day the cells were incubated with for 9 h each
  • TRAIL Flag-coupled soluble TRAIL
  • TRAIL + ZVAD Flag-coupled soluble cross-linked TRAIL as indicated above in the presence of 20 ⁇ mol / 1 of the caspase inhibitor z-VAD-fmk
  • dsRNA-Fl and dsRNA-F2 (FIG. 1 CE, FIG. 2 CE), but not dsRNA-neo (FIG. 1 B, FIG. 2 B) or electroporation without dsRNA (mock electroporation) (FIG. 1 A, FIG. 2A) have significantly sensitized KB and SV80 cells for TRAIL-Rl and TRAIL-R2 mediated apoptosis.
  • ZVAD has raised awareness of TRAIL-induced apoptosis. This indicates the involvement of caspases (Fig. 1 C-E, Fig. 2 C-E).
  • KB cells were also sensitized to FasL and TNF-induced apoptosis by treatment with dsRNA-Fl and dsRNA-F2.
  • the overhangs are each formed by the 3 'ends of the strands S1 and S2.
  • the double-stranded region has a length of 19 nucleotide pairs. Additional experiments to inhibit FLIP-mRNA expression were carried out with the dsRNAs dsRNA-F3, dsRNA-F4 and dsRNA control performed. In these, only one end of the dsRNA has an overhang formed from two nucleotides at the 3 'end of the S1 strand.
  • the double-stranded region is 21 nucleotides in length.
  • a quantitative analysis has shown that dsRNA-F3 and dsRNA-F4 are about as effective in inhibiting the expression of a GFP-flip fusion protein as dsRNA-Fl and dsRNA-F2.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Medikament zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Rezeptor-vermittelt Apoptose in Tumorzellen auslösenden Arzneimittels, wobei das Medikament eine zu einer Hemmung der Expression eines c-FLIP-Gens geeignete doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) enthält.

Description

Medikament zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Rezeptorvermittelt Apoptose in Tumorzellen auslösenden Arzneimittels
Die Erfindung betrifft ein Medikament und eine Verwendung zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Rezeptor-vermittelt Apoptose in Tumorzellen auslösenden Arzneimittels. Die Erfindung betrifft weiterhin eine Verwendung zur Herstellung eines solchen Medikaments, ein Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Rezeptor-vermittelt Apoptose in Tumorzellen auslösenden Wirkstoffs und eine doppelsträngige Ribonukleinsäure.
Aus der DE 101 00 586 Cl ist ein Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens in einer Zelle bekannt, bei dem ein Oligoribonukleotid mit doppelsträngiger Struktur in die Zelle eingeführt wird. Ein Strang der doppeisträngigen Struktur ist dabei komplementär zum Zielgen. Das der Hemmung zu Grunde liegende Prinzip wird inzwischen als RNA-Interferenz bezeichnet .
Ein bekannter Apoptose auslösender Wirkstoff ist der Tumor
Nekrose Faktor-verwandte Apoptose auslösende Ligand TRAI . TRAIL bewirkt durch Bindung an TRAIL-Rl und TRAIL-R2, zwei eine Todesdomäne enthaltende Mitglieder der TNF-Rezeptor Su- perfamilie, eine Aktivierung einer Caspase und löst dadurch Apoptose in Tumorzellen aus.
Aus Yeh, W.-C. et al . , Immunity 12 (2000), Seiten 633 bis 642 ist es bekannt, dass embryonale Fibroblasten aus der Maus, denen das zelluläre F ICE-Inhibitorprotein (c-FLIP) fehlt, besonders sensitiv gegenüber Rezeptor-vermittelter Apoptose sind. Bei diesen Zellen handelte es sich jedoch nicht um Tumorzellen.
Es sind mehrere Spleiß-Varianten von c-FLIP bekannt, unter anderem eine kurze Spleiß-Variante c-FLIP-S und eine lange Spleiß-Variante c-FLIP-L. Aus Bin, L. et al . , FEBS Lett 510 (1-2) (2002), Seiten 37 bis 40 ist es bekannt, dass c-FLIP-defiziente embryonalen Mausfi- broblasten durch retroviral vermittelte Transduktion von c- FLIP-S resistent gegenüber TRAIL induzierter Apoptose werden.
Tumorzellen sind häufig nicht oder kaum empfindlich gegenüber Apoptose auslösenden Arzneimitteln bzw. Wirkstoffen. Die Behandlung mit solchen Arzneimitteln erfordert daher häufig ei- ne Co-Behandlung durch Bestrahlung oder Chemotherapie, um eine therapeutische Wirkung des Apoptose auslösenden Arzneimittels zu erreichen. Die genannten Co-Behandlungen gehen jedoch mit starken Nebenwirkungen einher.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Insbesondere soll ein Medikament, eine doppelsträngige Ribonukleinsäure und eine Verwendung zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Apoptose in Tumorzellen auslösenden Arzneimittels bereitgestellt werden, welches die oben genannten starken Nebenwirkungen vermeidet. Weiterhin soll eine Verwendung zur Herstellung eines solchen Medikaments und ein Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Apoptose in Tumorzellen auslösenden Wirkstoffs bereitgestellt werden.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 17, 18, 34 und 47 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 16, 19 bis 33, 35 bis 46 und 48 bis 60.
Erfindungsgemäß ist ein Medikament zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Rezeptor-vermittelt Apoptose in Tumorzellen auslösenden Arzneimittels vorgesehen, wobei das Medikament eine zu einer Hemmung der Expression eines c-FLIP-Gens mittels RNA- Interferenz geeignete doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) enthält. Eine dsRNA liegt vor, wenn die aus einem oder zwei Ribonukleinsäure-Strängen bestehende Ribonukleinsäure eine doppelsträngige Struktur aufweist. Nicht alle Nu- kleotide der dsRNA müssen kanonische Watson-Crick-Basen- paarungen aufweisen. Insbesondere einzelne nicht komplementä- re Basenpaare beeinträchtigen die Wirksamkeit kaum oder gar nicht. Die maximal mögliche Zahl der Basenpaare ist die Zahl der Nukleotide in dem kürzesten in der dsRNA enthaltenen Strang.
Das Medikament kann die dsRNA in einer zu der Hemmung der Expression des c-FLIP-Gens in den Tumorzellen ausreichenden Menge enthalten. Das Medikament kann auch so konzipiert sein, dass mehrere Einheiten des Medikaments zusammen die ausreichende Menge in der Summe enthalten. Die ausreichende Menge hängt von der Verabreichungsform ab. Zur Ermittlung einer ausreichenden Menge kann die dsRNA in steigenden Mengen bzw. Dosierungen verabreicht werden. Danach kann an einer aus dem Tumor entnommenen Gewebeprobe mit bekannten Methoden ermittelt werden, ob bei dieser Menge eine Hemmung der Expression des c-FLIP-Gens eingetreten ist. Bei den Methoden kann es sich z.B. um molekularbiologische, biochemische oder immunologische Methoden handeln.
Überraschenderweise hat es sich gezeigt, dass die gezielte und ausschließliche Hemmung der Expression von c-FLIP durch RNA-Interferenz ausreichend ist, um Tumorzellen für eine Re- zeptor-vermittelte Auslösung einer Apoptose empfänglich bzw. sensitiv zu machen. Das Medikament ermöglicht dadurch eine gezielte und nebenwirkungsarme bzw. nebenwirkungsschwache Be- handlung von Tumoren mit spezifisch die Apoptose von Tumorzellen auslösenden Arzneimitteln.
Vorzugsweise löst das Arzneimittel Apoptose mittels Tumor Ne- krose Faktor oder Tumor Nekrose Faktor-verwandten Apoptose auslösenden Liganden, insbesondere TRAIL, aus. Die Wirksam- keit eines solchen Arzneimittels kann besonders effektiv durch das erfindungsgemäße Verfahren gesteigert werden.
Vorzugsweise weist ein Strang Sl der dsRNA einen zum c-FLIP- Gen zumindest abschnittsweise komplementären, insbesondere aus weniger als 25 aufeinanderfolgenden Nukleotiden bestehenden, Bereich auf. Unter dem "c-FLIP-Gen" wird der DNA-Strang der doppelsträngigen für c-FLIP kodierenden DNA in der Tumorzelle verstanden, welcher komplementär zu einem bei der Tran- skription als Matrize dienenden DNA-Strang einschließlich aller transkribierten Bereiche ist. Bei dem c-FLIP-Gen handelt es sich also im allgemeinen um den Sinn-Strang. Der Strang Sl kann somit komplementär zu einem bei der Expression des c- FLIP-Gens gebildeten RNA-Transkript oder dessen Prozessie- rungsprodukt, wie z.B. einer mRNA, sein. Es kann z.B. ausreichend sein, wenn der Strang Sl komplementär zu einem Teil des 3 ' -untranslatierten Bereichs der mRNA ist.
Der komplementäre Bereich der dsRNA kann 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 24, besonders bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22 oder 23, Nukleotide aufweisen. Eine dsRNA mit dieser Struktur ist besonders effizient in der Inhibition des c-FLIP-Gens. Der Strang Sl der dsRNA kann weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, insbesondere 23, Nukleotide aufweisen. Die Zahl dieser Nukleotide ist zugleich die Zahl der in der dsRNA maximal möglichen Basenpaare.
Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn zumin- dest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist. Eine solche dsRNA weist gegenüber einer dsRNA ohne einzelsträngige Überhänge an mindestens einem Ende eine bessere Wirksamkeit bei der Hemmung der Expression des c-FLIP- Gens auf. Ein Ende ist dabei ein Bereich der dsRNA, in welchem ein 5'- und ein 3 ' -Strangende vorliegen. Eine nur aus dem Strang Sl bestehende dsRNA weist demnach eine Schleifenstruktur und nur ein Ende auf. Eine aus dem Strang Sl und einem Strang S2 gebildete dsRNA weist zwei Enden auf. Ein Ende wird dabei jeweils von einem auf dem Strang Sl und einem auf dem Strang S2 liegenden Strangende gebildet.
Vorzugsweise befindet sich der einzelsträngige Überhang am 3 ' -Ende des Strangs Sl . Diese Lokalisation des einzelsträngi- gen Überhangs führt zu einer weiteren Steigerung der Effizi- enz des Medikaments. Die dsRNA kann auch nur an einem, insbesondere dem am 3 ' -Ende des Strangs Sl gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang aufweisen. Das andere Ende ist bei einer zwei Enden aufweisenden dsRNA glatt, d.h. ohne Überhänge, ausgebildet. Überraschenderweise hat es sich gezeigt, dass zur Verstärkung der Interferenz-Wirkung der dsRNA ein Überhang an einem Ende der dsRNA ausreichend ist, ohne dabei die Stabilität in einem solchen Maße zu erniedrigen wie durch zwei Überhänge. Eine dsRNA mit nur einem Überhang hat sich sowohl in verschiedenen Zellkulturmedien als auch in Blut, Serum und Zellen als hinreichend beständig und besonders Wirksam erwiesen.
Vorzugsweise weist die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 auf, d.h. sie ist aus zwei Einzelsträngen gebildet. Beson- ders wirksam ist das Medikament, wenn der Strang Sl (Anti- sinn-Strang) eine Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21 Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist. Das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA ist dabei glatt ausgebildet. Der Strang Sl kann zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des c-FLIP-Gens komplementär sein. Vorzugsweise besteht die dsRNA aus dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 3 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO: 4 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO : 7 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 3 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO: 8 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll. Eine solche dsRNA ist in der Hemmung der Expression des c-FLIP- Gens besonders wirksam.
Die dsRNA kann in dem Medikament in einer Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer oder einer phy- siologischen Kochsalzlösung, von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegen. Der physiologisch verträgliche Puffer kann eine phosphatge- pufferte Salzlösung sein. Eine micellare Struktur, ein Kapsid, ein Kapsoid oder eine polymere Nano- oder Mikrokapsel kann die Aufnahme der dsRNA in die Tumorzellen erleichtern. Die polymere Nano- oder Mikrokapsel besteht aus mindestens einem biologisch abbaubaren Polymer, z.B. Polybutylcyanoacry- lat . Die polymere Nano- oder Mikrokapsel kann darin enthaltene oder daran gebundene dsRNA im Körper transportieren und freisetzen.
Die dsRNA kann oral, mittels Inhalation, Infusion oder Injek- tion, insbesondere intravenöser, intraperitonealer oder in- tratumoraler Infusion oder Injektion, verabreicht werden. Das Medikament kann daher eine Zubereitung aufweisen, die zur Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbesondere zur intravenösen, intraperitonealen oder intratumoralen Infusion oder Injektion, geeignet ist. Eine zur Inhalation, Infusion oder Injektion geeignete Zubereitung kann im einfachsten Fall aus einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel, vorzugsweise einer physiologischen Kochsalzlösung oder einem physiologisch verträglichen Puffer, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, und der dsRNA bestehen. Es hat sich nämlich überraschenderweise herausgestellt, dass eine lediglich in einem solchen Puffer oder einem solchen Lösungsmittel gelöste und verabreichte dsRNA von den Tumorzellen aufgenommen wird und die Expression des c-FLIP-Gens hemmt, ohne dass die dsRNA dazu in einem besonderen Vehikel verpackt sein muss.
Vorzugsweise liegt das Medikament in mindestens einer Verabreichungseinheit vor, welche die dsRNA in einer Menge enthält, die eine Dosierung von höchstens 5 mg, insbesondere höchstens 2,5 mg, bevorzugt höchstens 200 μg, besonders bevorzugt höchstens 100 μg, vorzugsweise höchstens 50 μg, insbesondere höchstens 25 μg, pro kg Körpergewicht und Tag ermöglicht. Es hat es sich nämlich gezeigt, dass die dsRNA bereits in dieser Dosierung eine ausgezeichnete Effektivität in der Hemmung der Expression des c-FLIP-Gens aufweist. Die Verabreichungseinheit kann für eine einmalige Verabreichung bzw. Einnahme pro Tag konzipiert sein. Dann ist die gesamte Tagesdosis in einer Verabreichungseinheit enthalten. Ist die Verabreichungseinheit für eine mehrmalige Verabreichung bzw. Einnahme pro Tag konzipiert, so ist die dsRNA darin in einer entsprechend geringeren das Erreichen der Tagesdosis ermöglichenden Menge enthalten. Die Verabreichungseinheit kann auch für eine einzige Verabreichung bzw. Einnahme für mehrere Tage konzipiert sein, z. B. indem die dsRNA über mehrere Tage freigesetzt wird. Die Verabreichungseinheit enthält dann ein entsprechend Mehrfaches der Tagesdosis.
Erfindungsgemäß ist weiterhin die Verwendung einer zur Hemmung der Expression eines c-FLIP-Gens mittels RNA-Interferenz geeigneten doppelsträngigen Ribonukleinsäure zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Rezeptor-vermittelt Apoptose in Tumorzellen auslösenden Arzneimittels vorgesehen. Weiterhin ist erfindungsgemäß die Verwendung einer zur Hemmung der Expression eines c-FLIP-Gens mittels RNA-Interferenz geeigneten doppelsträngigen Ribonukleinsäure zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Rezeptor-vermittelt Apoptose in Tumorzellen auslösenden Arzneimittels vorgesehen.
Darüber hinaus ist ein Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Rezeptor-vermittelt Apoptose in einer Tumorzelle auslösenden Wirkstoffs vorgesehen, wobei eine zu einer Hemmung der Expression eines c-FLIP-Gens mittels RNA-Interferenz geeignete doppelsträngige Ribonukleinsäure in die Tumorzelle eingeführt wird. Unter "eingeführt werden" wird das Aufnehmen in die Zelle verstanden. Das Aufnehmen kann durch die Zelle selbst erfolgen. Es kann aber auch durch Hilfsstoffe oder Hilfsmittel vermittelt werden. Die Erfindung betrifft außerdem eine doppelsträngige Ribonukleinsäure, deren einer Strang Sl einen zum c-FLIP-Gen zumindest abschnittsweise komplemen- tären Bereich aufweist.
Wegen der vorteilhaften Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Verwendungen, des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen doppelsträngigen Ribonukleinsäure wird auf die vorangegangenen Ausführungen verwiesen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnungen beispielhaft erläutert. Es zeigt:
Fig. 1 den Einfluss einer Behandlung von SV80-Zellen mit die Expression des c-FLIP-Gens hemmender dsRNA auf die Empfindlichkeit dieser Zellen gegenüber TRAIL- induzierter Apoptose und
Fig. 2 den Einfluss einer Behandlung von KB-Zellen mit die Expression des c-FLIP-Gens hemmender dsRNA auf die Empfindlichkeit dieser Zellen gegenüber TRAIL- induzierter Apoptose.
KB-Zellen sind von der American Type Culture Collection
(ATCC) unter der ATCC-Nr. CCL-17 zu beziehen. SV80-Zellen können von der Firma CLS, 69123 Heidelberg, Deutschland unter der Bestellnummer 0345 HU (ATCC-Nr. : CRL-7725) bezogen werden.
Die eingesetzten dsRNAs weisen folgende, im Sequenzprotokoll mit SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO : 9 bezeichneten Sequenzen auf:
dsRNA-Fl, welche den Nukleotiden 472 bis 492 des c-Flip-L- Gens entspricht:
S2: 5'-GUGCCGGGAUGUUGCUAUAGA-3' (SEQ ID NO : 1) Sl: 3 ' -AACACGGCCCUACAACGAUAU-5 ' (SEQ ID NO : 2)
dsRNA-F2, welche den Nukleotiden 908 bis 928 des c-Flip-L- Gens entspricht:
S2: 5'-CAAGGAGCAGGGACAAGUUAC-3' (SEQ ID NO : 3) Sl: 3 ' -AAGUUCCUCGUCCCUGUUCAA-5' (SEQ ID NO : 4)
dsRNA-neo, welche zu einer Sequenz aus dem Neomycin- Resistenz-Gen komplementär ist:
S2: 5 ' -GAUGAGGAUCGUUUCGCAUGA-3 ' (SEQ ID NO : 5) Sl: 3 '-UCCUACUCCUAGCAAAGCGUA-5' (SEQ ID NO : 6)
dsRNA-F3, welche den Nukleotiden 472 bis 494 des c-Flip-L- Gens entspricht:
S2: 5 ' -GUGCCGGGAUGUUGCUAUAGA-3 ' (SEQ ID NO : 1) Sl: 3 ' -AACACGGCCCUACAACGAUAUCU-5' (SEQ ID NO : 7)
dsRNA-F4, welche den Nukleotiden 908 bis 930 des c-Flip-L- Gens entspricht:
S2: 5 ' -CAAGGAGCAGGGACAAGUUAC-3 ' (SEQ ID NO : 3) Sl: 3 ' -AAGUUCCUCGUCCCUGUUCAAUG-5 ' (SEQ ID NO : 8) dsRNA-Kontrolle, welche zu einer Sequenz aus dem Neomycin- Resistenz-Gen komplementär ist:
S2: 5 ' -GAUGAGGAUCGUUUCGCAUGA-3 ' (SEQ ID NO: 5) Sl: S'-UCCUACUCCUAGCAAAGCGUACU-S' (SEQ ID NO : 9)
Jeweils 107 SV80- und KB-Zellen pro ml sind mittels Elektro- poration transient zweimal an aufeinanderfolgenden Tagen ohne (Fig. 1 A, Fig. 2 A) oder mit 150 nmol/1 dsRNA-neo (Fig. 1 B, Fig. 2 B) , 150 nmol/1 dsRNA-Fl (Fig. 1 C, Fig. 2 C) , 150 nmol/1 dsRNA-F2 (Fig. 1 D, Fig. 2 D) oder einem Gemisch von jeweils 75 nmol/1 dsRNA-Fl und dsRNA-F2 (Fig. 1 E, Fig. 2 E) transfiziert worden. Bei der jeweils ersten Elektroporation ist der Ξlektroporationslösung ein GFP (green fluorescent protein) -Expressionsplasmid zugesetzt worden, um die jeweilige Effizienz der Transfektion überprüfen zu können. Einen Tag nach der ersten Elektroporation sind die Zellen geerntet worden. Mit einem Teil der Zellen ist die Transfektionseffizienz mittels Messung der Fluoreszenzintensität durchflusszytome- trisch bestimmt worden. Die Fluoreszenzintensität dieser Zellen ist in den Figuren 1 A-E und 2 A-E jeweils im linken Feld durch eine durchgezogene dicke Linie dargestellt. Die im jeweils gleichen Feld durch eine dünne Linie dargestellte Fluo- reszenzintensität ist diejenige der jeweils gleichen Zellen ohne ein GFP-Expressionsplasmid. Um eine möglichst hohe Transfektionseffizienz zu erreichen, ist der andere Teil der Zellen ein zweites mal jeweils mit derselben dsRNA wie am ersten Tag elektroporiert worden. Danach sind die Zellen in je- weils 100 μl Medium in die Vertiefungen von 96-Well-Platten ausgesät worden. Am nächsten Tag sind die Zellen für jeweils 9 h inkubiert worden mit
Flag-gekoppeltem löslichem und mit dem monoklonalen anti Flag-Antikörper M2 quervernetzten TRAIL ("TRAIL"), welches sowohl TRAIL-Rl als auch TRAIL-R2 stimmulieren kann, - agonistischem für TRAIL-Rl ("CCTRl") und/oder TRAIL-R2 (" TR2") spezifischem Kaninchen-Antiserum (1:500) oder
- Flag-gekoppeltem löslichem, wie oben angegeben quervernetztem TRAIL in Gegenwart von 20 μmol/1 des Caspase- Inhibitors z-VAD-fmk ("TRAIL + ZVAD").
Schließlich wurde der Anteil vitaler Zellen mittels Kristall- violett-Färbung bestimmt.
Aus den in den Figuren 1 und 2 dargestellten Ergebnissen ist ersichtlich, dass die Transfektionseffizienz des GFP- Expressionsplasmids in keiner der untersuchten Zelllinien durch die dsRNA beeinflusst worden ist. dsRNA-Fl und dsRNA-F2 (Fig. 1 C-E, Fig. 2 C-E) , nicht aber dsRNA-neo (Fig. 1 B, Fig. 2 B) oder Elektroporation ohne dsRNA (Mock-Elektro- poration) (Fig. 1 A, Fig. 2 A) haben KB- und SV80-Zellen signifikant für eine TRAIL-Rl und eine TRAIL-R2 vermittelte Apoptose sensibilisiert. ZVAD hat die Sensibilisierung für die TRAIL-induzierte Apoptose wieder aufgehoben. Das deutet auf die Beteiligung von Caspasen hin (Fig. 1 C-E, Fig. 2 C- E) .
In einem weiteren nicht dargestellten Experiment sind KB- Zellen durch die Behandlung mit dsRNA-Fl und dsRNA-F2 auch für eine FasL- und TNF-induzierte Apoptose sensibilisiert worden.
Die bei den bisher beschriebenen Experimenten eingesetzten dsRNAs dsRNA-Fl, dsRNA-F2 und dsRNA-neo weisen an beiden Enden jeweils einen aus zwei Nukleotiden gebildeten Überhang auf. Die Überhänge werden jeweils von den 3 ' -Enden der Stränge Sl und S2 gebildet. Der doppelsträngige Bereich weist eine Länge von 19 Nukleotidpaaren auf. Zusätzliche Experimente zur Inhibition der FLIP-mRNA Expression wurden mit den dsRNAs dsRNA-F3 , dsRNA-F4 und dsRNA-Kontrolle durchgeführt. Bei diesen weist nur ein Ende der dsRNA einen aus zwei Nukleotiden gebildeten Überhang am 3 '-Ende des Sl-Stranges auf. Der doppelsträngige Bereich weist eine Länge von 21 Nukleotiden auf, Eine quantitative Analyse hat gezeigt, dass dsRNA-F3 und dsRNA-F4 etwa genauso wirksam in der Inhibition der Expression eines GFP-Flip-Fusionsproteins sind wie dsRNA-Fl und dsRNA-F2.

Claims

Patentansprüche
1. Medikament zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Rezeptor- vermittelt Apoptose in Tumorzellen auslösenden Arzneimit- tels, wobei das Medikament eine zu einer Hemmung der Expression eines c-FLIP-Gens mittels RNA-Interferenz geeignete doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) enthält.
2. Medikament nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel Apoptose mittels Tumor Nekrose Faktor oder Tumor Nekrose Fak- tor-verwandten Apoptose auslösenden Liganden, insbesondere TRAIL, auslöst.
3. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Strang Sl der dsRNA einen zum c-FLIP-Gen zumindest abschnittsweise komplementären, insbesondere aus weniger als 25 aufeinanderfolgenden Nukleotiden bestehenden, Bereich aufweist.
4. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der komplementäre Bereich 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 24, besonders bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22 oder 23, Nukleotide aufweist.
5. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Strang Sl weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, insbesondere 23, Nukleotide aufweist.
6. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist.
7. Medikament nach Anspruch 6, wobei sich der einzelsträngi- ge Überhang am 3 ' -Ende des Strangs Sl befindet.
8. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3 ' -Ende des Strangs Sl gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang aufweist.
9. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 aufweist.
10. Medikament nach Anspruch 9, wobei der Strang Sl eine Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21 Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist, während das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA glatt ausgebildet ist.
11. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Strang Sl zum primären oder prozessierten RNA- Transkript des c-FLIP-Gens komplementär ist.
12. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA aus dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 3 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO : 4 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO: 7 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 3 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO: 8 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll besteht.
13. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA in dem Medikament in einer Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer oder einer physiologischen Kochsalzlösung, von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Kapsid, einem Kap- soid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegt.
14. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament eine Zubereitung aufweist, die zur Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbesondere zur intravenösen, intraperitonealen oder intratumo- ralen Infusion oder Injektion, geeignet ist.
15. Medikament nach Anspruch 14, wobei die Zubereitung, insbesondere ausschließlich, aus einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel, vorzugsweise einer physiologischen Kochsalzlösung oder einem physiologisch verträgli- chen Puffer, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, und der dsRNA besteht.
16. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament in mindestens einer Verabreichungseinheit vorliegt, welche die dsRNA in einer Menge enthält, die eine Dosierung von höchstens 5 mg, insbesondere höchstens 2,5 mg, bevorzugt höchstens 200 μg, besonders bevorzugt höchstens 100 μg, vorzugsweise höchstens 50 μg, insbesondere höchstens 25 μg, pro kg Körpergewicht und Tag ermöglicht.
17. Verwendung einer zur Hemmung der Expression eines c-FLIP-
Gens mittels RNA-Interferenz geeigneten doppelsträngigen Ribonukleinsäure (dsRNA) zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Rezeptor- vermittelt Apoptose in Tumorzellen auslösenden Arzneimit- tels.
18. Verwendung einer zur Hemmung der Expression eines c-FLIP- Gens mittels RNA-Interferenz geeigneten doppelsträngigen Ribonukleinsäure (dsRNA) zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Rezeptor-vermittelt Apoptose in Tumorzellen auslösen- den Arzneimittels.
19. Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, wobei das Arzneimittel Apoptose mittels Tumor Nekrose Faktor oder Tumor Ne- krose Faktor-verwandten Apoptose auslösenden Liganden, insbesondere TRAIL, auslöst.
20. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei ein Strang Sl der dsRNA einen zum c-FLIP-Gen zumindest ab- schnittsweise komplementären, insbesondere aus weniger als 25 aufeinanderfolgenden Nukleotiden bestehenden, Bereich aufweist.
21. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei der komplementäre Bereich 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 24, be- sonders bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22 oder 23, Nukleotide aufweist.
22. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei der Strang Sl weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, insbesondere 23, Nu- kleotide aufweist.
23. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 22, wobei zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist.
24. Verwendung nach Anspruch 23, wobei sich der einzelsträn- gige Überhang am 3 ' -Ende des Strangs Sl befindet .
25. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 24, wobei die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3 ' -Ende des Strangs Sl gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Über- hang aufweist.
26. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 25, wobei die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 aufweist.
27. Verwendung nach Anspruch 26, wobei der Strang Sl eine Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21 Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang auf- weist, während das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA glatt ausgebildet ist.
28. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 27, wobei der Strang Sl zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des c-FLIP-Gens komplementär ist.
29. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 28, wobei die dsRNA aus dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO : 3 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO : 4 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO: 7 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 3 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO : 8 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll besteht.
30. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 29, wobei die dsRNA in einer Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer oder einer physiologischen Kochsalzlösung, von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegt .
31. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 30, wobei die dsRNA in einer Zubereitung vorliegt, die zur Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbesondere zur intravenösen, intraperitonealen oder intratumoralen Infusion oder Injektion, geeignet ist.
32. Verwendung nach Anspruch 31, wobei die Zubereitung, insbesondere ausschließlich, aus einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel, vorzugsweise einer physiologi- sehen Kochsalzlösung oder einem physiologisch verträglichen Puffer, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, und der dsRNA besteht.
33. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 32, wobei die dsRNA in einer Dosierung von höchstens 5 mg, insbesondere höchstens 2,5 mg, bevorzugt höchstens 200 μg, besonders bevorzugt höchstens 100 μg, vorzugsweise höchstens 50 μg, insbesondere höchstens 25 μg, pro kg Körpergewicht und Tag verwendet wird.
34. Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Rezeptor- vermittelt Apoptose in einer Tumorzelle auslösenden Wirkstoffs, wobei eine zu einer Hemmung der Expression eines c-FLIP-Gens mittels RNA-Interferenz geeignete doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) in die Tumorzelle eingeführt wird.
35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei der Wirkstoff Tumor Nekrose Faktor oder Tumor Nekrose Faktor-verwandte Apoptose auslösende Liganden, insbesondere TRAIL, umfasst.
36. Verfahren nach Anspruch 34 oder 35, wobei ein Strang Sl der dsRNA einen zum c-FLIP-Gen zumindest abschnittsweise komplementären, insbesondere aus weniger als 25 aufeinanderfolgenden Nukleotiden bestehenden, Bereich aufweist.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 36, wobei der komplementäre Bereich 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 24, besonders bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22 oder 23, Nukleotide aufweist.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 37, wobei der Strang Sl weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, insbesondere 23, Nukleotide aufweist.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 38, wobei zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesonde- re 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist.
40. Verfahren nach Anspruch 39, wobei sich der einzelsträngi- ge Überhang am 3 ' -Ende des Strangs Sl befindet .
41. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 40, wobei die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3 ' -Ende des Strangs Sl gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang aufweist.
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 41, wobei die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 aufweist.
43. Verfahren nach Anspruch 42, wobei der Strang Sl eine Län- ge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21
Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist, während das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA glatt ausgebildet ist.
44. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 43, wobei der Strang Sl zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des c-FLIP-Gens komplementär ist.
45. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 44, wobei die dsRNA aus dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO : 1 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO : 2 oder dem
Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 3 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO : 4 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO : 1 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO: 7 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 3 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO: 8 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll besteht.
46. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 45, wobei die dsRNA in einer Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer oder einer physiologischen Kochsalz- lösung, von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegt.
47. Doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) , deren einer Strang Sl einen zum c-FLIP-Gen zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist.
48. DsRNA nach Anspruch 47, wobei der komplementäre Bereich aus weniger als 25 aufeinanderfolgenden Nukleotiden bestehenden,
49. DsRNA nach Anspruch 47 oder 48, wobei der komplementäre Bereich 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 24, besonders bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22 oder 23, Nukleotide aufweist .
50. DsRNA nach einem der Ansprüche 47 bis 49, wobei der Strang Sl weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, insbesondere 23, Nukleotide aufweist.
51. DsRNA nach einem der Ansprüche 47 bis 50, wobei zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang auf- weist.
52. DsRNA nach Anspruch 51, wobei sich der einzelsträngige Überhang am 3 ' -Ende des Strangs Sl befindet .
53. DsRNA nach einem der Ansprüche 47 bis 52, wobei die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3 ' -Ende des Strangs Sl gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang aufweist.
54. DsRNA nach einem der Ansprüche 47 bis 53, wobei die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 aufweist.
55. DsRNA nach Anspruch 54, wobei der Strang Sl eine Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21 Nu- kleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist, während das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA glatt ausgebildet ist.
56. DsRNA nach einem der Ansprüche 47 bis 55, wobei der Strang Sl zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des c-FLIP-Gens zumindest abschnittsweise komplementär ist .
57. DsRNA nach einem der Ansprüche 47 bis 56, wobei die dsRNA aus dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 3 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO : 4 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO: 7 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO : 3 und dem Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO : 8 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll besteht.
58. DsRNA nach einem der Ansprüche 47 bis 57, wobei die dsRNA in einer Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer oder einer physiologischen Kochsalzlö- sung, von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegt.
59. DsRNA nach einem der Ansprüche 47 bis 58, wobei die dsRNA in einer Zubereitung vorliegt, die zur Inhalation, oralen
Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbesondere zur intravenösen, intraperitonealen oder intratumoralen Infusion oder Injektion, geeignet ist.
60. DsRNA nach Anspruch 59, wobei die Zubereitung, insbeson- dere ausschließlich, aus einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel, vorzugsweise einer physiologischen Kochsalzlösung oder einem physiologisch verträglichen Puffer, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, und der dsRNA besteht.
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