CN1599798A - D－丙氨酸的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的特征在于是丝状菌作用于含有DL－丙氨酸的溶液，同化L－丙氨酸，而不产生副产物丙酮酸。因为丝状菌能够从培养液中简便地分离，而且培养液中不含丙酮酸，所以能够有效地制造D－丙氨酸。要从分离液中分离出D－丙氨酸，可以用离子交换树脂等进行处理。作为这种丝状菌，可以使用市售的曲霉属、青霉属、毛霉属、根霉属、卷霉属、枝孢属、木霉属、散囊菌属、毛壳霉属、短柄霉属、地霉属、拟青霉属等。

Description

D-丙氨酸的制造方法
技术领域
本发明涉及用丝状菌同化DL-丙氨酸中含有的L-丙氨酸，生产D-丙氨酸的方法。
背景技术
D-丙氨酸是非天然型氨基酸，是有望用作医药或食品添加剂原料等的化合物。作为D-丙氨酸的制造方法，有例如有机的不对称合成法、发酵法和酶法等由D-丙氨酸以外的化合物制造D-丙氨酸的方法，以及以DL-丙氨酸为原料，利用色谱法的光学拆分法，外消旋体的分级结晶法，利用选择同化法仅回收D-丙氨酸的方法，由于选择同化法能够以廉价的DL-丙氨酸为原料简便地进行批量生产，因此选择同化法的开发进展显著。
作为选择同化法，例如，在特公昭42-20683号公报中公开了一种制造光学活性丙氨酸和丙酮酸的方法，该方法利用具有L-丙氨酸氧化能力的微生物，由DL-丙氨酸生成D-丙氨酸和丙酮酸，然后将其分离。作为该公报中使用的具有L-丙氨酸氧化能力的微生物，使用了除地衣芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、嗜油棒杆菌、凝聚微球菌、克罗斯韦假单胞菌以外，黑曲霉、产黄青霉和热带假丝酵母、浅白色隐球酵母、清酒糖酵母等属于丝状菌和酵母的菌株。实施例中，通过离心分离，除去发酵液中的菌体后，通过离子交换树脂得到D-丙氨酸和丙酮酸。
此外，在特公平8-8878号公报中，公开了在含有DL-丙氨酸作为唯一碳源和唯一氮源的培养基中，利用酵母同化L-丙氨酸，收集D-丙氨酸的方法。通过用特定碳源和特定氮源的培养基培养特定的酵母，能够以数10g/L以上的蓄积浓度制造D-丙氨酸。
另外，作为用酵母选择同化的方法，特公平2-49598号公报中公开了一种D-丙氨酸的制造方法，用能够不经过丙酮酸而选择性地仅分解DL-丙氨酸中的L-丙氨酸的微生物进行同化。
但是，按照特公昭42-20683号公报中记载的方法，用黑曲霉等丝状菌同化L-丙氨酸可得到D-丙氨酸，但是由于在同化的同时生成丙酮酸，因此为了仅分离出D-丙氨酸，其它的分离手段是必需的。特别是，按照该公报的方法进行了碱中和，因此副产物丙酮酸作为不稳定的丙酮酸盐共存，从而产生分解物。而且，使用丝状菌的场合，蓄积浓度的值非常低，为约9g/L。
此外，特公平8-8878号公报和特开平2-49598号记载的方法都使用了酵母，因此要将发酵液中的酵母分离出来，有必要进行精密过滤、超滤、高速离心分离的步骤，实际上也并不容易。
一般来说，酵母的菌体大小为1～5μm左右，由于酵母菌体可通过滤纸，所以不能使用固液分离中所用的过滤法从发酵液中分离酵母菌体，需要进行精密过滤或超滤等使用具有微细孔径的特殊分离膜进行处理，或采用高速离心分离等步骤。与普通的过滤方法相比，使用特殊分离膜的方法透过速度慢，所以处理时间长。此外，用特殊分离膜分离培养液中的菌体时，菌体以外的悬浮微粒、蛋白质、各种微生物代谢物等成分堆积在膜的表面，导致过滤效率降低，此外也会降低价格昂贵的过滤膜的寿命。而且，采用高速离心分离时，装置本身一般较昂贵，而且由于要在高速下进行处理，动力成本必然也很高。
在这种状况下，希望开发一种更简便，而且收率高的制造D-丙氨酸的选择同化法。
发明公开
本发明对采用选择同化法制造D-丙氨酸的方法进行了详细研究，结果发现使用丝状菌能够以高收率仅同化L-氨基酸，而实质上不产生副产物丙酮酸，而且由于使用丝状菌，培养基的确定、培养条件、以及菌体的分离都非常简便，由于培养基的组成简单且菌体分离容易，所以通过随后的D-丙氨酸的精制步骤，即可得到高纯度的目的物，从而完成了本发明。亦即，本发明提供一种D-丙氨酸的制造方法，其特征在于，使丝状菌作用于含DL-丙氨酸的溶液，同化L-丙氨酸，而实质上不产生副产物丙酮酸。
根据本发明，能够使用丝状菌由DL-丙氨酸有效地制造D-丙氨酸。特别是由于丝状菌的菌体容易分离，因此目的物D-丙氨酸的分离也就简便。此外，同化L-丙氨酸时不产生副产物丙酮酸，所以不需要与D-丙氨酸分离的操作。
发明的最佳实施方式
本发明的第一个方面是一种D-丙氨酸的制造方法，其特征在于，使丝状菌作用于含DL-丙氨酸的溶液，同化L-丙氨酸，而实质上不产生副产物丙酮酸。本发明的特征在于，用丝状菌作用于含DL-丙氨酸的溶液。这是因为丝状菌营养缺陷性少，而且如其名称所示，在培养的条件下形成菌丝，因此能够以小丸状、块状培养，培养液中含有的菌体比较容易分离。此外，由于实质上不产生副产物丙酮酸，即使中和培养液，也不会存在不稳定的丙酮酸盐，随后的D-丙氨酸的分离也就容易。
首先，作为底物的DL-丙氨酸并不限于含有等量的D-丙氨酸和L-丙氨酸的场合，只要含有D-丙氨酸，两者的比例不限。但是，由于选择同化法将L-丙氨酸同化，仅残留D-丙氨酸，因此优选使用D-丙氨酸含量高的底物。
作为本发明中优选使用的丝状菌，是属于曲霉属、青霉属、毛霉属、根霉属、卷霉属、枝孢属、木霉属、散囊菌属(Eurotium)、毛壳霉属、短柄霉属、地霉属、以及拟青霉属，在特定培养条件下作用于DL-丙氨酸，同化L-丙氨酸，且不产生丙酮酸的丝状菌。作为这种丝状菌，优选黑曲霉(Aspergillus niger)IAM 2561、溜曲霉(Aspergillus tamarii)IFO 4099、家蝇卷霉(Circinella muscae)IFO 4457、芽枝状枝孢(Cladosporium cladosporioides)IFO 4459、总状毛霉(Mucor racemosus f.sp.Racemosus)IFO 4581、reesei木霉(Trichoderma reesei)IFO 31326、米根霉(Rhizopus oryzae)、黄曲霉(Aspergillus flavus)IFO 7599、OI-164、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)IFO 4626、IFO 4640、IFO 6223、IFO32030、不明毛霉(Mucor ambiguus)IFO 8092、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)IFO 4574。本发明中，可以单独使用这些丝状菌中的1种，也可以2种以上混合使用。
使这些丝状菌作用于DL-丙氨酸同化L-丙氨酸时，通过选择特定的培养基，能够不产生副产物丙酮酸，而只分离出D-丙氨酸。
作为上述丝状菌的营养源，可以使用通常使用的碳水化合物、氮源、无机物等可同化的营养源。例如，作为碳源，可以单独使用或者作为混合物使用玉米淀粉、玉米面、淀粉、糊精、麦芽、葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜等。作为氮源，可以单独使用或者作为混合物使用硫酸铵、硝酸钠、大豆粉、玉米浆、谷胶粉、肉汁、脂肉骨粉、酵母提取物、干酵母、棉籽粉、蛋白胨、聚蛋白胨、小麦胚芽、鱼粉、肉粉、脱脂米糠、脱脂肉骨粉、麦芽提取物、玉米谷胶粉等无机或有机氮源。作为无机盐，可以单独使用或作为混合物使用碳酸钙、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、溴化钠、硼酸钠、或磷酸二氢钾、硫酸锌、硫酸镁等各种无机盐。此外，根据需要，也可以添加微量的铁、锰、锌、钴、钼酸等重金属。另外，为了抑制加热灭菌时和培养过程中的发泡，也可添加大豆油、亚麻子油等植物油，十八烷醇等高级醇类，各种硅等消泡剂。对如上所述的营养源的配合比例没有特别的限定，而且可以在宽范围内变动，通过简单的小规模实验，可以容易地根据使用条件决定最适的营养源的组成及配合比例。
本发明中，作为预培养用的培养基，虽然根据使用的丝状菌及其后的培养条件而不同，但优选使用碳源为0～100g/L，更优选为20～80g/L；氮源为0.5～50g/L，更优选为1～15g/L；无机物质为0.5～5g/L，更优选为0.6～2g/L的培养液。
其次，如上所述增殖的丝状菌随后接种于主培养所用的培养基中，制造D-丙氨酸。作为该主培养用的培养基组成，为DL-丙氨酸10～150g/L，含L-丙氨酸的氮源5.0～75g/L，无机盐类0.1～5g/L。即，本发明虽然在预培养中使丝状菌在添加了糖类的培养基中增殖，但在主培养中，可以完全不添加糖类，而制造D-丙氨酸。如果添加糖类，成本增加，而且还必须进行分离糖分的步骤，这是不利的。但是，本发明能够用上述组成进行主培养，因此可以简化精制步骤，而且还可降低配制培养基所需的费用。特别优选用实质上仅以L-丙氨酸作为碳源和氮源，并在其中添加少量无机盐的培养基进行培养。当然，也可以添加上述预培养中所用的营养源，但添加葡萄糖等糖作为碳源的埸合，由于丝状菌在生长中对该糖的利用优先于L-丙氨酸，所以存在实质上延迟L-丙氨酸的同化的趋势。此外，由于通过菌的糖代谢生成了副产物，且残留有未同化的糖，有时以后的精制会变得困难。另外，虽然也可以添加上述预培养中所示的氮源，但这些氮源一般较昂贵，而且会造成培养液的着色，而使以后的精制变得困难。即，优选用实质上仅以L-丙氨酸作为碳源和氮源，并在其中添加少量无机盐的培养基进行培养，为了更好地进行培养，在不出现上述问题的范围内，也可以添加少量的营养源。这样，通过利用适合于特定培养基的丝状菌，由于菌在生长中实质上只利用L-丙氨酸作为碳源和氮源，所以不生成丙酮酸等副产物，即使生成，也控制在极少量，这样就能够得到实质上只含D-丙氨酸的培养液，可以简化精制步骤，使配制培养基所需的费用降低。
另外，作为在主培养的培养基中可以添加的碳源，可以使用玉米淀粉、淀粉、葡萄糖、蔗糖、糖蜜等的1种或2种以上。作为氮源，可以仅使用L-丙氨酸，但也可以使用大豆粉、玉米浆、谷胶粉、肉汁、脂肉骨粉、酵母提取物、干酵母、蛋白胨、聚蛋白胨、小麦胚芽等的1种或2种以上。以上的碳源、氮源不一定必须加入。优选添加的无机盐，有磷酸二氢钾、硫酸镁。
此外，主培养用的培养基优选在培养前用酸或碱调节pH，使灭菌后的pH为5～7左右。
作为本发明的丝状菌的孢子的接种方法，没有特别的限定，通常可以采用将上述孢子悬浮在下述液体中，然后将所得的悬浮液直接接种到发酵用的液体培养基中等进行接种的方法等。
作为上述孢子的悬浮方法，例如，可以采用下述方法：在琼脂斜面培养基上生长，在形成了该孢子的丝状菌的菌体中加入液体，进行混合的方法。另外，作为上述液体，通常使用无菌水，但作为在生物化学领域中使用的液体，也可以使用例如添加了少量(例如，相对于液体总量，为0.01-0.1g/L)Tween-80(注册商标)等Tween类表面活性剂、Triton X系列(注册商标等)等Triton类表面活性剂、酰基脱水山梨醇等的无菌水。这样，可以更有效地将孢子分散在无菌水中，从而得到均匀的悬浮液。
用所述培养基培养本菌株，原则上可以按照一般制造D-氨基酸时通常使用的液体培养进行。液体培养的场合，可以采用静置培养、搅拌培养、振荡培养或通气培养中的任何一种实施。本发明中，特别优选振荡培养、深部通气搅拌培养。在培养中，优选好氧培养，空气的导入量优选为0.1-2vvm；更优选为0.5-1.2vvm。对于满足这种条件的培养装置，没有特殊的限定，优选用通入空气或纯氧气，或者两者的混合气体的同时搅拌的搅拌式反应器、或空气提升式反应器中的任意一种进行培养。特别是空气提升式反应器，菌丝不会缠绕在搅拌叶片上，在防止菌丝本身破损的方面也很优良。
而且，作为培养操作，可以通过导入空气或氧气进行连续培养；每次用新的培养液进行批式培养；或者供给新的培养液进行半批式培养。
另一方面，底物DL-丙氨酸只要以20-400g/L，尤其是40-200g/L的浓度供给反应液即可，可以在反应开始时加入全量，也可以分次添加。在这种场合，底物的浓度为10-150g/L，更优选为20-100g/L。如果降至10g/L以下，则会降低D-丙氨酸的生产效率，反之，如果浓度超过150g/L，会使丝状菌的生长变得困难。
对培养的温度没有特定的限制，只要在同化L-丙氨酸，且实质上不抑制本菌株增殖的范围即可，一般来说，20-40℃，优选30-50℃的范围内的温度合适。
培养时间可以根据L-丙氨酸同化的时间推移、反应器的种类等综合判断。例如，在上述曲霉属、青霉属、毛霉属、根霉属、卷霉属、枝孢属、木霉属、散囊菌属、毛壳霉属、短柄霉属、地霉属、拟青霉属的丝状菌的场合，采用分批式实施时，L-丙氨酸在20-200小时，更优选在40-120小时内可以完全同化。另一方面，该丝状菌即使经过连续操作，L-丙氨酸同化活性的降低也很少，因此，可以在分批式、或半批式中再使用，或连续使用。连续使用时，可通过随时间经过检查该菌的L-丙氨酸同化活性，适当地调整培养时间。
本发明中，使丝状菌作用于含DL-丙氨酸的溶液，同化L-丙氨酸而实质上不产生副产物丙酮酸，可以得到含有D-丙氨酸的溶液。另一方面，伴随着该L-丙氨酸的同化，L-丙氨酸分解为氨、二氧化碳、草酸、水等。因此，通过在用酸类中和同化所产生的氨的同时进行，或者在用碱中和同化所产生的草酸的同时进行，可将培养基的pH控制在适合于丝状菌同化L-丙氨酸的中性附近，更具体是控制pH在4-8，更适合控制在5-7。因为本发明中使用的丝状菌不产生副产物丙酮酸，上述副产物的中和处理实质上是可以实现的。也就是说，正如由丙酮酸的结构可知的那样，因为它是一种通过脱羧而非常容易分解的化合物，培养基中生成丙酮酸的场合，如果为了处理其他副产物而进行中和处理等，则同时也中和处理了丙酮酸，而与氨和草酸的盐共存。因为该丙酮酸盐很容易分解，在处理副产物盐时也发生分解，所以实质上不能将副产物从培养液中分离。即，按照本发明，使用了不产生副产物丙酮酸的丝状菌，因此以后的D-丙氨酸的精制步骤非常容易，而且收率高。另外，本申请说明书中的“实质上不产生副产物”丙酮酸是指完全不产生副产物丙酮酸，或该副产物的量相对于丙氨酸为0.1摩尔％以下。
其中，作为中和氨时可以使用的酸类，有硫酸、盐酸、硝酸、醋酸、草酸、磷酸等，特别优选使用硫酸、磷酸。通过硫酸和氨产生硫酸铵，该物质可以通过离子交换树脂或电透析除去。添加酸时，可将浓度调节为2.5-25质量％，更优选为5-20质量％，可以在测定培养基中含有的氨量的同时，滴加入中和量的酸。也可以在培养过程中，通过用pH传感器或pH控制器进行添加，自动地将pH维持在适当的值。
此外，产生副产物草酸的场合，作为中和该副产物所用的碱，有碳酸钙、氢氧化钠、氨水、氨气，特别优选使用氨水、氢氧化钠。另外，为了达到此目的，也可以在培养基灭菌之前加入碳酸钙，或者在培养过程中，用pH传感器或pH控制器添加氢氧化钠水溶液或者氨水或氨气等，自动地将pH维持在适当的值。根据丝状菌的种类，在同时产生副产物草酸和氨的场合，由于该氨可中和草酸，所以通过添加不足量的氨中和草酸即可。
另外，本发明中的“中和”，是指通过在氨中加入酸类，或者在草酸中加入碱，而消除其碱性或酸性的操作，不一定意味着pH达到7。通过上述中和操怍，将培养基的pH控制在4-8，更优选5-7。这样，可以在适合所使用的丝状菌同化L-丙氨酸的同时，将副产物与D-丙氨酸分离。
本发明中，从培养液分离菌体，可以用过滤、离心分离、压滤等以前公知的菌体分离方法进行。其中，对于分离浮游于培养液中的菌丝和菌体来说，过滤很简便，因此优选。
如上所述，本发明中，通过使丝状菌作用于DL-丙氨酸，使L-丙氨酸分解为氨、二氧化碳、草酸、水等，而实质上不产生副产物丙酮酸。因此，从培养液中除去了菌体后的分离液中，以D-丙氨酸为主成分，还含有在制备培养基时使用且其分解后残留的微量氨基酸等，所以之后的D-丙氨酸的精制分离非常容易。另外，该分离精制的容易性不单是指与丙酮酸分离的容易性。如上所述，丙酮酸是对热等非常不稳定的化合物，容易产生二氧化碳而分解，在L-丙氨酸同化的同时产生副产物丙酮酸的场合，必须设定丙酮酸和丙酮酸盐的分离条件，并进一步选择这些物质不分解的温和条件，或者进行这些物质的分解物的分离操作。例如，如果副产物仅仅是氨，可以加热分离液，将氨作为气体除去，但含有丙酮酸的场合，就不能进行这样的加热处理。而且，在不加热的场合，即使用离子交换树脂分离，丙酮酸也会在树脂内分解，使pH发生变化，导致与D-丙氨酸的分离能力劣化。但是，由于本发明中不含有丙酮酸，所以这种离子交换树脂的分离能力降低也少。即，由于本发明中不产生副产物丙酮酸，菌体分离后的分离液以D-丙氨酸作为主要成分，从该分离液中分离收集D-丙氨酸也变得非常简便，能够高收率地制造D-丙氨酸。
本发明中，从除去了菌体的分离液中分离收集D-丙氨酸，可以采用电透析法、离子交换树脂法、离子交换法·草酸钙·硫酸钙沉淀法等进行，特别是用电透析或离子交换树脂法能够有效地分离收集D-丙氨酸。在本发明中，由于分离液中含有的氨基酸以D-丙氨酸为主要成分，通过电透析，透析膜内仅残留D-丙氨酸，所以能够进行分离。
此外，使用离子交换树脂从分离液中分离D-丙氨酸的场合，特别优选使用氨型离子交换树脂，使D-丙氨酸吸附在该离子交换树脂上后，用氨洗脱。这是因为在分离D-丙氨酸的同时，能够使离子交换树脂恢复至氨型，便于再使用。优选的离子交换树脂有三菱化学公司生产的“Diaion SK1B”、Organo公司生产的“Amberlite IR-120B”、Dow化学公司生产的“DOWEX HGR”和“DOWEX HGR”等。
具体地说，以与电透析处理所用的发酵液相同的发酵液作为对象，在该发酵液中加入浓硫酸，将pH调至1。另一方面，使氨水通过充填在玻璃制柱内的离子交换树脂，使其成为NH4+型，然后用去离子水洗净。树脂量调整至交换基团/丙氨酸的摩尔比为1-6，更优选为2-5。使发酵液通过离子交换树脂，此时的通液速度优选空间速度为0.2-5，更优选为0.4-4。使发酵液通过后，使水流过，使硫酸洗出。随后，流过1摩尔的氨水，使吸附在树脂上的丙氨酸洗脱出来，使过量的氨流过，能够使树脂再成为NH4+型。另外，洗脱液中含有的氨可以通过加热除去。
此外，除去菌体后的分离液中所含的草酸盐对水的溶解度低。因此，可以通过利用其与D-丙氨酸的溶解度差的分离方法进行分离。具体而言，通过使草酸盐沉淀，可以分离。另外，D-丙氨酸、L-丙氨酸的定量通过HPLC进行。
实施例
以下，用实施例对本发明进行说明，但本发明不受这些实施例的限制。另外，“％”表示“质量％”。此外，D，L-丙氨酸的HPLC分析条件为：柱：住化分析中心生产的“OA-6100”；柱径×柱长：4.6mmφ×150mm；移动相：1mM硫酸铜水溶液；流速：1ml/min；检测器：UV检测器；波长：254nm。
(实施例1-5)
将表1所示组成的预培养培养基分装入规定容量的三角烧瓶中，121℃下高压灭菌15分钟后，用作预培养培养基。将表2所示规定量的菌以一铂金环或孢子悬浮液接种入该预培养基中，在表2所示的条件下，于旋转摇床上培养。预培养后，将预培养液按表4所示的规定量接种入表3所示的灭菌的主培养培养基(坂口氏烧瓶)中，用烧瓶进行培养。使用的丝状菌如表5所示。培养结束后，将培养液在3600rpm下离心分离10分钟，除去菌体，将上清液稀释至规定浓度，用HPLC进行分析，分别求得D型和L型的残留量。
各预培养培养基的组成如表1所示；其预培养条件如表2所示；主培养的培养基组成如表3所示；主培养条件如表4所示。此外，分离液的分析结果如表5所示。另外，表5中，左栏的数值表示实施例1-5；L型、D型的数值表示培养基中各自残存的质量(g/L)；培养一栏表示培养时间(hr)。
表1预培养培养基
培养基组成(g/L)   实施例1   实施例2   实施例3   实施例4   实施例5
淀粉     10     -     -     -     50
聚蛋白胨     -     5     10     10     5
葡萄糖     10     -     2     2     10
牛肉膏     -     10     30     30     -
(NH4)2SO4     1.35     -     -     -     -
KH2PO4     0.3     1     1     1     1
MgSO4·7H2O     0.25     0.5     0.5     0.5     0.5
ZnSO4·7H2O     0.04     -     -     -     -
DL-丙氨酸     -     2     -     -     -
pH     不调节     不调节     不调节     不调节     不调节
表2预培养条件
    实施例1     实施例2     实施例3     实施例4   实施例5
接种量(孢子数/ml培养基)     2×106个     2×106个     一铂金环     一铂金环     106个
培养温度(℃)     30     30     30     30     30
转速(rpm)     220     220     210     220     220
培养时间(h)     21     21     21     21     21
装料量(ml)     30     30     50     50     50
培养器容量     200ml     200ml     300ml     300ml     300ml
表3主培养培养基
培养基组成(g/L)   实施例1   实施例2   实施例3   实施例4   实施例5
DL-丙氨酸     20     20     20     20     20
酵母提取物     0.5     0.5     0.5     0.5     0.5
KH2PO4     1     1     1     1     1
MgSO4·7H2O     0.5     0.5     0.5     0.5     0.5
pH     5     5     5     5     5
表4主培养条件
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
接种量(v/v％) 5  5  10  10  10
培养温度(℃) 30  30  30  30  30
转速(rpm) 107  107  108  108  110
装料量(ml) 200  200  50  50  50
培养器容量 500ml  500ml  500ml  500ml  500ml
表5
丝状菌   L型     D型     培养
  1 米根霉MK 9601   4.3     9.6     30
  2 米根霉MK 9601   2.2     9.5     30
3 米曲霉IFO 4254   5.6     9.8     30
米曲霉var.oryzae IFO 6215   5.1     9.9     30
寄生曲霉IFO 42 39   1.8     9.0     30
白色曲霉IFO 4310   5.2     9.8     30
黄曲霉IFO 7599   3.9     9.8     30
黄曲霉OI-164   0.0     7.0     30
黑曲霉van Tieghem IAM 2561   0.0     9.5     30
土曲霉IFO 6365   5.7     9.9     30
卷枝毛霉IFO 4574   1.7     8.0     30
不明毛霉IFO 8092   0.1     7.6     30
两型孢毛霉IFO 4555   3.5     9.6     30
两型孢毛霉IFO 4556   6.0     10.0     30
4 黑曲霉IFO 4066   8.4     9.7     30
黑曲霉IFO 4067   0.8     9.6     30
黑曲霉IFO 4068   3.6     9.8     30
黑曲霉IFO 4043   5.0     9.8     30
黑曲霉IFO 4281   6.3     9.7     30
产黄青霉IFO 4626   3.5     9.6     30
产黄青霉IFO 4640   3.6     8.3     30
产黄青霉IFO 6223   3.2     9.3     30
产黄青霉IFO 32030   8.3     9.6     30
黑曲霉IAM 2561   0.1     9.0     30
  5 黑曲霉IAM 2561   3.7     9.7     30
匍匐散囊菌IFO 4041   8.1     9.8     30
溜曲霉IFO 4099   5.2     9.6     30
球毛壳霉IFO 4451   9.2     9.7     30
家蝇卷霉IFO 4457   0.6     9.6     30
芽枝状枝孢IFO 4459   7.6     9.6     30
总状毛霉f.sp.Racemosus IFO 4581   5.9     9.5     30
白地霉IFO 4597   3.2     7.9     30
宛氏拟青霉IFO 4855   8.4     9.5     30
绿色木霉IFO 5720   5.5     9.2     30
蝇状青霉IFO 31132   8.8     9.5     30
Reesei木霉IFO 31326   3.9     9.3     30
Microstictum短柄霉IFO 32065   7.7     9.3     30
(实施例6-9)
按常规方法，将实施例1-5中使用的全部菌种进行单孢子分离操作，选择其中表现出优良活性的菌株，用此菌株在3L的发酵缶中进行培养实验。
将表6所示组成的预培养培养基分装入规定容量的三角烧瓶中，121℃下高压灭菌15分钟后，用作预培养培养基。将表7所示量的孢子接种入该预培养培养基中，在旋转摇床上进行表7所示的培养。预培养后，在装入表8所示的主培养培养基并灭菌的3L发酵缶中，接种入规定量的预培养液，在表9所示的条件下，通气搅拌培养。使用的丝状菌如表10所示。另外，在主培养期间，针对产生的氨，通过添加10％的硫酸水溶液；针对产生的副产物草酸，通过添加4重量％的氨水，调节pH，进行培养。培养结束后，将培养液在3600rpm下离心分离10分钟，除去菌体，将上清液稀释至规定浓度，用HPLC进行分析，分别求得D型和L型的残留量。
各预培养培养基的组成如表6所示；该预培养条件如表7所示；主培养培养基组成如表8所示；主培养条件如表9所示。另外，表10中，左栏的数值表示实施例6-9；L型、D型的数值表示培养基中各自残存的质量(g/L)；培养一栏表示培养时间(h)。
表6预培养培养基
培养基组成(g/L) 实施例6 实施例7 实施例8 实施例9
淀粉 - 50 50 50
聚蛋白胨 5 5 5 5
葡萄糖 - 10 10 10
牛肉膏 10 - - -
(NH4)2SO4 - - - -
KH2PO4 1 1 1 1
MgSO4·7H2O 0.5 0.5 0.5 0.5
ZnSO4·7H2O - - - -
CaCO3 10(只有黑曲霉添加) 10(只有黑曲霉添加) 10
DL-丙氨酸 2 - - -
pH 不调节 6 6 6
表7预培养条件
实施例6 实施例7 实施例8 实施例9
接种量(孢子数/ml培养基) 2×106个  106个  106个  106个
培养温度(℃) 30  30  30  30
转速(rpm) 220  220  220  220
培养时间(h) 21  18-21  21  21
装料量(ml) 30  110  110  110
培养器容量 200ml  500ml  500ml  500ml
表8主培养培养基
培养基组成(g/L) 实施例6 实施例7 实施例8 实施例9
DL-丙氨酸 50  50  100  100
酵母提取物 0.5  0.5  0.5  0.5
KH2PO4 1  1  1  1
MgSO4·7H2O 0.5  0.5  0.5  0.5
消泡剂(ml/2L培养基) 1  1  1  1
pH 5.5  5.5(黑曲霉为pH5) 5-5.5
表9主培养条件
实施例6 实施例7 实施例8 实施例9
接种量(v/v％) 5  5  5  5
培养温度(℃) 30  30  30  30
搅拌速度(rpm) 500  400-500  400-500  400-500
通气量(vvm) 1  1  1  1
装料量(ml) 2  2  2  2
培养器容量 3L缶  3L缶  3L缶  3L缶
表10
丝状菌   L型   D型   培养
6 米根霉MK9601   14.8   24.0   22
7 产黄青霉IFO 4626   0.0   23.3   40
溜曲霉IFO 4099   0.4   20.9   40
黑曲霉IAM 2561   0.0   23.2   40
溜曲霉IFO 4099   0.0   20.9   40
家蝇卷霉IFO 4457   15.7   23.2   40
芽枝状枝孢IFO 4459   22.4   25.0   40
总状毛霉f.sp.Racemosus IFO4581   21.5   24.3   40
宛氏拟青霉IFO 4855   22.1   23.8   40
Reesei木霉IFO 31326   10.5   21.5   40
8 产黄青霉IFO 4626   1.0   45.1   90
溜曲霉IFO 4099   0.0   46.5   90
产黄青霉IFO 32030   30.9   47.7   100
蝇状青霉IFO 31132   42.6   45.2   100
黑曲霉IAM 2561   0.0   45.7   90
9 黑曲霉IFO 4067   10.2   44.2   100
黑曲霉IFO 4068   10.5   42.0   100
黑曲霉IFO 4281   0.3   45.0   90
(实施例10)
将含有50g/L淀粉，10g/L葡萄糖，5g/L聚蛋白胨，1g/L磷酸二氢钾，0.5g/L硫酸镁七水合物的培养基(pH6.0)110ml分装入500ml锥形瓶内，121℃下高压灭菌15分钟后用作预培养培养基。将产黄青霉IFO 4626按1×106个/mL培养基的孢子浓度接种于预培养培养基中，使用旋转振荡器，在30℃，220rpm下培养21小时。另一方面，将含有150g/L DL-丙氨酸，1g/L酵母提取物，1g/L聚蛋白胨，1g/L磷酸二氢钾，1g/L硫酸镁七水合物，0.5ml/l消泡剂的培养基2L装入3L的小型发酵缸内，121℃下高压灭菌15分钟后用作主培养培养基。在该主培养培养基中，将先前的预培养培养基按5％接种，在30℃、1.0vvm下通气搅拌培养。另外，在主培养过程中，在加入10％硫酸水溶液调节保持pH5.5的同时进行培养。在120小时内，使培养基中的L-丙氨酸完全同化，得到2.2L含有149g D-丙氨酸、81g硫酸铵的培养液。
由该培养液通过过滤(桐山制作所生产的滤纸No.5A，孔径7.0μm)除去菌体。在所得的液体中加入硫酸，调节至pH1，以SV＝1通过充填有离子交换树脂(三菱化学公司生产的Diaion SK-1B(NH4+型))的柱，使之吸附D-丙氨酸。用水将该柱充分洗涤后，用2％的氨水洗脱D-丙氨酸。该洗脱液用活性碳脱色，浓缩结晶后，得到147g精制的D-丙氨酸。所得的D-丙氨酸的光学纯度为99.9％ee以上，化学纯度为99.9％以上。
(实施例11)
在按实施例10的条件进行培养并除去菌体后的培养液中，添加28％的氨水，调节至丙氨酸的等电点pH6.0，然后进行电透析，电导率充分降低后，回收样品室中的液体，得到D-丙氨酸溶液。该溶液用活性碳脱色，浓缩结晶后，得到145g精制的D-丙氨酸。所得的D-丙氨酸的光学纯度为99.9％ee以上，化学纯度为99.9％以上。
工业实用性
本发明是用丝状菌同化DL-丙氨酸中所含的L-丙氨酸，制造D-丙氨酸的方法，由于丝状菌可简便地与培养液分离，而且培养液中不含丙酮酸，因此能够有效地制造D-丙氨酸。

Claims (7)

1.一种D-丙氨酸的制造方法，其特征在于，使丝状菌作用于含有DL-丙氨酸的溶液，同化L-丙氨酸，而实质上不产生副产物丙酮酸。
2.一种D-丙氨酸的制造方法，该方法包括以下步骤：使丝状菌作用于含有DL-丙氨酸的溶液，同化L-丙氨酸，而实质上不产生副产物丙酮酸，获得含有D-丙氨酸的溶液；分离该含有D-丙氨酸的溶液中所含的丝状菌，得到分离液；以及从该分离液中分离收集D-丙氨酸。
3.根据权利要求2所述的制造方法，其中，获得该含有D-丙氨酸的溶液的步骤是在用酸类中和同化产生的氨的同时进行的步骤，或者是在用碱中和同化产生的草酸的同时进行的步骤。
4.根据权利要求2或3所述的制造方法，其中，从该分离液中分离D-丙氨酸的步骤采用电透析或离子交换树脂。
5.根据权利要求4所述的制造方法，其中，离子交换树脂为氨型阳离子交换树脂。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制造方法，其中，丝状菌为曲霉属、青霉属、毛霉属、根霉属、卷霉属、枝孢属、木霉属、散囊菌属、毛壳霉属、短柄霉属、地霉属、拟青霉属中的任意1种以上。
7.根据权利要求1-6中任何一项所述的制造方法，其中，丝状菌为黑曲霉(Aspergillus niger)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、不明毛霉(Mucor ambiguus)、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、家蝇卷霉(Circinella muscae)中的任意1种以上。
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