CN1582154A - 使用环氧甾族醛固酮拮抗剂治疗或预防受试者中醛固酮介导的致病作用的方法 - Google Patents

使用环氧甾族醛固酮拮抗剂治疗或预防受试者中醛固酮介导的致病作用的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1582154A
CN1582154A CNA018239463A CN01823946A CN1582154A CN 1582154 A CN1582154 A CN 1582154A CN A018239463 A CNA018239463 A CN A018239463A CN 01823946 A CN01823946 A CN 01823946A CN 1582154 A CN1582154 A CN 1582154A
Authority
CN
China
Prior art keywords
experimenter
puli
spiral shell
shell ketone
disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA018239463A
Other languages
English (en)
Inventor
G·H·威廉斯
J·W·芳德
S·M·加斯维特
B·罗尼科
K·N·菲德
R·罗查
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pharmacia LLC
Original Assignee
Pharmacia LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pharmacia LLC filed Critical Pharmacia LLC
Publication of CN1582154A publication Critical patent/CN1582154A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A61K31/4152—1,2-Diazoles having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. antipyrine, phenylbutazone, sulfinpyrazone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/437—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a five-membered ring having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. indolizine, beta-carboline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A61K31/5513—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/58—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/58—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin
    • A61K31/585—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin containing lactone rings, e.g. oxandrolone, bufalin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A61P5/42—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones for decreasing, blocking or antagonising the activity of mineralocorticosteroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本发明提供在患有或易患一种或多种醛固酮介导的致病作用的受试者中治疗或预防该致病作用的方法，其中该受试者具有一种或多种选自下列的情况：亚正常的内源性醛固酮水平、盐敏感性和饮食钠摄取增加。该方法包括对受试者施用治疗有效量的一种或多种环氧甾族化合物(是醛固酮拮抗剂)。

Description

使用环氧甾族醛固酮拮抗剂治疗 或预防受试者中醛固酮介导的致病作用的方法
相关申请的交叉引用
本申请是2000年11月8日提交的美国专利申请系列号09/709,253的部分继续申请，要求对1999年11月9日提交的美国临时专利申请系列号60/164,390的优先权。本申请也是2000年11月14日提交的美国专利申请系列号09/713,348的部分继续申请，要求对以下专利的优先权：2000年6月13日提交的美国临时专利申请系列号60/211,064；2000年6月13日提交的美国临时专利申请系列号60/211,250；2000年6月13日提交的美国临时专利申请系列号60/211,253；2000年6月13日提交的美国临时专利申请系列号60/211,264；2000年6月13日提交的美国临时专利申请系列号60/211,311；2000年6月13日提交的美国临时专利申请系列号60/211,340；2000年6月13日提交的美国临时专利申请系列号60/211,451；2000年6月13日提交的美国临时专利申请系列号60/211,459；2000年7月27日提交的美国临时专利申请系列号60/221,358；2000年7月27日提交的美国临时专利申请系列号60/221,364；2000年9月14日提交的美国临时专利申请系列号60/233,056。
发明背景
发明领域
本发明涉及治疗和/或预防受试者中，特别是在水平升高的钠的存在下，由于内源性醛固酮作用引起的一种或多种致病作用的方法。更具体而言，本发明涉及作为醛固酮拮抗剂的环氧甾族化合物，如艾普利螺酮(eplerenone)，在治疗和/或预防具有亚正常醛固酮水平、盐敏感性和/或饮食钠摄取增加的人类受试者的高血压、心血管疾病和/或肾功能障碍中的用途
相关技术描述
原发性高血压是全世界的一种主要血管疾病，是一个重要的公共卫生问题。与高血压有关的血压升高与冠心病和中风的发病率有关。例如，Blumenfeld JD和Laragh JH.《充血性心力衰竭：病理生理学、诊断和处置》(Congestive heart failure：pathophysiology，diagnosis andmanagement)，第一版.Caddo(OK)：Professional Communications，Inc.；1994报告，高血压使发生心力衰竭的危险增至3倍。类似地，MacMahon S等人：Lancet 1990；335：765-71报告，舒张期血压长期降低仅5mmHg即导致发生冠心病的危险至少降低20％，而发生中风的危险至少降低33％。
高血压也与肾终末期疾病有关。高血压和/或糖尿病肾病引起的肾终末期疾病是一个沉重的公共卫生负担，其发病率和普及率在包括美国在内的许多国家令人担忧地增长。(美国肾脏数据***(United StatesRenal Data System).摘自美国肾脏数据***1999年度数据报告.Am JKidney Dis 1999；34 Suppl 1：S1-S176)。高血压诱发的肾终末期疾病的发病率增长，尽管由于血压意识和控制的改善，其它高血压并发症(如中风和冠心病)实际上降低。(国家联合委员会(Joint NationalCommittee)关于高血压预防、检测、评价和治疗的第6次报告.ArchIntern Med 1997；157：2413-46)。
肾素-血管紧张素-醛固酮***(″RAAS″)在高血压的发生和进展中起主要作用。RAAS在响应细胞外液体积不足和高血压的几乎所有生理反应中起关键作用。血容量或动脉血压降低导致肾素释放，肾素作用于血管紧张素原，形成血管紧张素I。血管紧张素转化酶然后将血管紧张素I转化为血管紧张素II，引起几个外周和中枢介导的恢复血容量和血压的反应。在外周方面，血管紧张素II作用于平滑肌细胞，导致血管收缩以增加血压。在中枢方面，血管紧张素II可提高交感神经流出和加压素释放。尽管血管紧张素I向血管紧张素II的转化主要在肺中发生，然后血管紧张素II在外周和中枢循环以靶向组织，但是这种转化也能在脑区发生。
血管紧张素II也刺激肾上腺皮质的小球带，导致盐皮质激素醛固酮的合成和分泌。醛固酮作用于远端小管和集合小管，引起钠潴留及钾和氢的外排。这种钠潴留导致血容量增加。醛固酮在心力衰竭的病理生理学中起作用，与高血压、心脏肥大、心脏及血管纤维化和室性心律失常有关(Dzau VJ等人：Circulation 1981；63：645-651)。在心力衰竭患者中，高醛固酮水平似乎与这些患者死亡率的升高相对应(GerbeJG等人：“抗高血压剂和高血压的药物治疗”，Goodman LS，GilmanAG编著的《Goodman和Gilman治疗药理学基础》，第八版.New York：McGraw-Hill；1993.p.784-813)。
Weber KT等人(Cir 1987；75(Supp.1)：1-40 through 1-47)报告，循环醛固酮水平的慢性升高导致心脏和血管的纤维组织形成，这促进了所选动物的进行性心力衰竭。心肌胶原产生的增加以及随后的心室肥大导致心肌强直、心室和血管顺应性降低、舒张充盈损伤、舒张和收缩功能障碍、缺血，最终导致心力衰竭。根据Struthers AD.J CardiacFailure 1996；2：47-54所述，这种心肌纤维化也能导致心律失常和猝死。醛固酮阻断心肌摄取去甲肾上腺素，增加血浆去甲肾上腺素，促使心室异位(ectopic)活性。Rocha R等人：Am J Hypertension1999；12：76A报告，在大鼠中，醛固酮影响压力感受器功能，导致脑-血管和肾-血管损伤，以及内皮功能障碍。据报道，醛固酮也提高纤溶酶原激活剂抑制物的水平，从而可阻止纤维蛋白溶解。
许多临床医生假定血管紧张素转换酶抑制剂(″ACE抑制剂″)对RAAS的抑制将阻止醛固酮的形成。但是，在接受ACE抑制剂慢性治疗的大多数患者中检测到显著的血浆醛固酮水平。越来越多的证据表明，ACE抑制剂只是短暂地抑制醛固酮水平。(Struthers AD.J CardiacFailure 1996；2：47-54)。ACE抑制剂治疗开始时血浆醛固酮水平降低，但是在ACE抑制剂治疗3-6个月后恢复到治疗前的水平，尽管继续给药有良好的顺应性。(Staessen J等人：J Endocr 1981；91：457-465)。这种“醛固酮逃逸”现象的发生是因为醛固酮释放有其它重要的决定因素，如血清钾。(Pitt B.Cardiovascular Drugs and Therapy1995；9：145-149)。Marayev V等人在1995于荷兰阿姆斯特丹召开的国际心力衰竭会议上的陈述提出，这种逃逸现象可能导致心力衰竭患者的高死亡率。
Greene E等人：J Clin Invest 1996；98：1063-8提出，尽管已经积累了许多证据表明血管紧张素II与介导肾病有关，但是醛固酮也可能通过血液动力效应和直接细胞作用与进行性肾病有关。在残肾模型中观察到醛固酮过多症和肾上腺肥大，血浆醛固酮水平大约提高10倍。另外，临床研究报告了提高的醛固酮水平与肾退化之间的关系。(Hene RJ等人：Kidney Int 1982；21：98-101)。例如，Berl T等人：Kidney Int1978；14：228-35指出，评价了8名血钾正常的肾衰竭患者中的5名和6名肌酸酐清除率＜15mL/min的患者中的5名血浆醛固酮水平升高。在随后的一项研究中，Hene RJ等人：Kidney Int 1982；21：98-101指出，肌酸酐清除率＜正常水平的50％的28名患者的血浆醛固酮水平升高，但是血清钾水平和血浆肾素活性正常。Ibrahim HN等人：SeminNephrol 1997：17：431-40提示，钾和血管紧张素II(在肾衰竭患者中水平均升高)共同作用，促使醛固酮过量，伴肾功能不全和进行性肾病。Quan ZY等人：Kidney Int 1992；41：326-33报告，与施行肾脏部分切除术但肾上腺完整的大鼠相比，在施行肾脏次全切除术及肾上腺切除术的大鼠中，高血压、蛋白尿和结构性肾损伤则普遍性较低。尽管在肾上腺切除的大鼠中进行大剂量糖皮质激素替代(醛固酮不替代)，但是仍发生这一结果。
在乙酸脱氧皮质酮(“DOCA”)-盐高血压大鼠模型中，对DOCA处理的动物外源施用盐皮质激素诱发恶性肾硬化损伤和中风。(Gavras H等人：Circ Res 1975；36：300-9)。Horiuchi等人报告，在易患中风的自发性高血压大鼠(“SHRSP”)一个亚种的肾脏中，醛固酮受体浓度升高，其中在没有盐负荷的情况下出现恶性肾硬化症的发展。(Horiuchi M等人：Am J Physiol 1993；264：286-91)。此外，Ullian等人报告，Wistar-Furth大鼠(对醛固酮的作用无反应)可抵抗肾次全切除术所致的肾病进展。(Ullian ME等人：Am J Physiol 1997；272：1454-61)。
Greene等人评价了4个处理组(假手术的大鼠，未处理的肾脏部分切除[“残肾”]的大鼠，用洛沙坦和依那普利处理的残肾大鼠，用洛沙坦和依那普利处理随后输注醛固酮的残肾大鼠)，来辨别醛固酮在肾损伤进展中的重要性。(Greene E等人：J Clin Invest 1996；98：1063-8)。报告的结果表明，与假手术的大鼠相比，残肾大鼠的醛固酮水平升高10倍。相反，用洛沙坦和依那普利处理的残肾大鼠表现为醛固酮水平受到抑制，与未施用这些药物的残肾大鼠相比，蛋白尿、高血压和肾小球硬化症减少。在最后一组中，接受洛沙坦和依那普利处理随后输注醛固酮的残肾大鼠，其蛋白尿、高血压和肾小球硬化症程度类似于未处理的残肾大鼠。
用抗高血压药物处理控制血压有助于显著降低高血压引起的发病率和死亡率。例如，年龄调节的中风死亡率在美国已经下降了接近60％，冠心病死亡率下降了53％。(Hansson L等人：Lancet1988；351：1755-62)。根据一篇报告所述，舒张期血压从105mmHg降为83mmHg，则每年每1000名治疗的患者中能够预防4个主要的心血管事件，如果估计有6.91亿高血压患者接受最佳抗高血压治疗，可导致2,764,000个预防事件。(Hansson L等人：Lancet 1988；351：1755-62)。然而，甚至在医学发达国家，如美国，估计仅有29％的接受抗高血压治疗的患者被控制在140/90mmHg以下。(国家联合委员会(Joint National Committee).国家联合委员会关于高血压预防、检测、评价和治疗的第6次报告.NIH Publication No.98-4080 1997年11月)。
选自大量药物类别的多种药物能够用来治疗高血压、心力衰竭和肾功能障碍。(国家联合委员会.国家联合委员会关于高血压预防、检测、评价和治疗的第6次报告.NIH Publication No.98-4080 1997年11月)。这些药物包括：利尿剂(如氯噻酮、氢***、美托拉宗等)，血管扩张剂(如肼苯哒嗪、米诺地尔、硝普钠、dizaoxide等)，β-肾上腺素能受体拮抗剂(如***、美托洛尔、拉贝洛尔、醋丁洛尔等)，钙通道阻断剂(如维拉帕米、硫氮卓酮、硝苯地平等)和血管紧张素-II受体拮抗剂(如洛沙坦等)，以及ACE抑制剂(如卡托普利、依那普利、赖诺普利、喹那普利等)。对个体高血压患者选择最初的药物治疗一般根据共存的因素，如年龄、种族和同时发生的疾病(Kaplan NM.JHypertension 1995；13Suppl 2：S113-S117)。
ACE抑制剂通常用作标准治疗，显示对心力衰竭患者的存活率和住院有有益的影响。在CONSENSUS(北斯堪的那维亚人依那普利存活协作研究)试验中，与用安慰剂加基本没有醛固酮拮抗活性的利尿剂相比，用依那普利(一种ACE抑制剂)加基本没有醛固酮拮抗活性的利尿剂处理，使严重心力衰竭患者(纽约心脏学会(NYHA)功能类别IV)的一年死亡率下降31％。在CONSENSUS中，高基线血浆醛固酮水平的患者比低基线水平的患者死亡率更高。在依那普利治疗组中，只在基线醛固酮血浆水平高于中值的组中死亡率降低。在基线醛固酮血浆水平低于中值的组中，在死亡率上未观察到与安慰剂的区别。(Swedberg K等人：Circulation 1990；82：1730-1736)。经历急性心肌梗死的患者常常发展为心力衰竭，随后死亡。ACE抑制剂对RAAS的阻断显示减少了这些患者中的所有死亡率。Lancet 1993；342：821-828。
抗高血压药螺内酯比ACE抑制剂更少用于治疗。研制了一种醛固酮受体拮抗剂，治疗可能与高血压同时发生的醛固酮增多症，与充血性心力衰竭有关的水肿，和肝硬化。(Swedberg K等人Circulation1990；82：1730-6)。Pitt B.等人：The New England J.of Med.1999；341(10)：709-717最近报告，向ACE抑制剂加基本没有醛固酮拮抗活性的袢利尿剂(Loop diuretic)的标准治疗中加入螺内酯使严重心力衰竭患者的发病率和死亡率下降。然而，螺内酯的长期使用只限于某些患者，因为它具有临床副作用，特别是具有促孕和抗雄激素性质，导致男子乳腺发育、***和阳萎。(RALES研究人员.Am J Cardiol 1996；78：902-12)。
然而，对于相当数量的患者，治疗高血压、心力衰竭和肾终末期疾病的常规药物治疗不总是有效，或者效能下降。例如，尿蛋白***增加能够独立地预测高血压患者的心血管发病率和死亡率(KannelWB，Stampfer MJ，Castelli WP，Verter J.Am Heart J1984；108：1347-52)。已经发现是ACE抑制剂或血管紧张素II受体拮抗剂的抗高血压药总是减少蛋白尿，无论是否患有肾病或其总体抗高血压活性(Maki DD等人：Arch Intern Med 1995；155：1073-82)。蛋白尿的这种减少在高钠摄取的个体中减少或没有，无论施用的药物的总体抗高血压活性如何(Heeg JE等人：Kidney Int 1989；36：272-80)。而且，饮食中钠的减少提高了ACE抑制剂抗高血压和抗蛋白尿的作用(MacGregor GA等人：Exp Hypertens 1983；5：1367-80)。加入氢***能够部分改正患者中ACE抑制剂对高钠饮食的效能的降低(ButerH等人：Nephrol Dial Transplant 1998；13：1682-5)。然而，这种联合治疗具有存在组合药物的加成乃至协同副作用的缺点。
在另一个例子中，选择的个体具有低血浆肾素水平或低血浆肾素活性，仍表现为高血压。这种高血压形式能够在例如黑人、日本人和老年人中发现。这种高血压通常被称为“低肾素高血压”(或“钠和容积依赖的低肾素高血压”，因为钠下调肾素***)。在这些个体中，钠摄取增加之后血压升高，尽管事实是肾素血浆浓度正常或较低。治疗原发性高血压有效的药物，如ACE抑制剂或血管紧张素II受体拮抗剂，在治疗低肾素高血压方面相对无效(Weir J：Hypertension1997；11：17-21)。因此，低肾素高血压被描述为一种盐敏感高血压的形式。
对于对用来治疗高血压、心力衰竭、肾终末期疾病和其它病原性疾病的常规药物治疗没有满意反应的患者而言，改进的药物治疗是希望的。此外，这些病原性疾病越来越普及提示需要用更新的治疗性干预和策略代替或补充现有的方法。本发明满足了这一需要，提供了一种新的药物疗法，包括施用一种或多种环氧甾族化合物(它们是醛固酮拮抗剂)，在一群特征在于盐敏感和/或饮食钠摄取增加的患者中，用来治疗高血压、心力衰竭、肾终末期疾病和其它病原性疾病。
发明概述
本发明的不同方面包括在患有或易患一种或多种醛固酮介导的致病作用的受试者中治疗或预防该致病作用的方法，其中该受试者具有一种或多种情况，选自亚正常的内源性醛固酮水平、盐敏感性和饮食钠摄取增加。该方法包括对受试者施用治疗有效量的一种或多种环氧甾族化合物，它们是醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括在患有或易患一种或多种醛固酮介导的致病作用的受试者中预防该致病作用的方法，其中(a)该致病作用选自：高血压、心血管疾病、肾功能障碍、肝病、脑血管疾病、血管疾病、视网膜病、神经病、胰岛素病、水肿、内皮功能障碍、压力感受器功能障碍、偏头痛、热潮红和月经前紧张，(b)该受试者具有一种或多种情况，选自亚正常的内源性醛固酮水平、盐敏感性和饮食钠摄取增加。该方法包括对受试者施用治疗有效量的一种或多种环氧甾族化合物，它们是醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括在患有或易患高血压的受试者中治疗或预防高血压的方法，其中受试者具有盐敏感性或饮食钠摄取增加或者兼而有之。该方法包括对受试者施用治疗有效量的一种或多种环氧甾族化合物，它们是醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括在患有或易患心血管疾病的受试者中治疗或预防心血管疾病的方法，其中受试者具有盐敏感性或饮食钠摄取增加或者兼而有之。该方法包括对受试者施用治疗有效量的一种或多种环氧甾族化合物，它们是醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括在患有或易患心血管疾病的受试者中治疗或预防心力衰竭的方法，其中受试者具有盐敏感性或饮食钠摄取增加或者兼而有之。该方法包括对受试者施用治疗有效量的一种ACE抑制剂、一种基本没有醛固酮拮抗活性的袢利尿剂和一种或多种环氧甾族化合物，它们是醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括在需要的受试者中治疗或预防盐敏感性的方法。该方法包括对受试者施用治疗有效量的一种或多种环氧甾族化合物，它们是醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括使需要的受试者降低钠食欲的方法。该方法包括对受试者施用可抑制食欲的量的一种或多种环氧甾族化合物，它们是醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括减少或逆转具有或易有盐敏感性的受试者中盐敏感性进展的方法。该方法包括对受试者施用治疗有效量的一种或多种环氧甾族化合物，它们是醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括受试者的治疗或预防方法，以减少或预防全部或部分由脑中异常的醛固酮水平引起的一种或多种致病作用。该方法包括对受试者施用治疗有效量的一种或多种环氧甾族化合物，它们是醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括受试者的治疗或预防方法，以减少或预防全部或部分由肾中异常的钠潴留引起的一种或多种致病作用。该方法包括对受试者施用治疗有效量的一种或多种环氧甾族化合物，它们是醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括在易患一种或多种醛固酮介导的致病作用的受试者中预防该致病作用的方法，其中该受试者具有一种或多种情况，选自亚正常的内源性醛固酮水平、盐敏感性和/或饮食钠摄取增加。该方法包括对受试者施用预防有效量的一种或多种环氧甾族化合物，它们是醛固酮拮抗剂。
本发明的其它方面将是显然的，部分在下文中指出。
附图简述
图1-A显示H型(Form H)艾普利螺酮的X-射线粉末衍射图样。
图1-B显示L型(Form L)艾普利螺酮的X-射线粉末衍射图样。
图1-C显示艾普利螺酮的丁酮溶剂合物的X-射线粉末衍射图样。
图2-A显示由丁酮直接结晶的未磨碎的L型的差示扫描量热法(DSC)温谱图(thermogram)。
图2-B显示未磨碎的L型的差示扫描量热法(DSC)温谱图，它是通过溶剂合物的去溶剂化制备的，该溶剂合物通过高纯度艾普利螺酮从丁酮中结晶获得。
图2-C显示L型的差示扫描量热法(DSC)温谱图，其制备方法是：从高纯度艾普利螺酮的丁酮溶液中结晶一种溶剂合物，去溶剂化该溶剂合物产生L型，研磨获得的L型。
图2-D显示未磨碎的H型的差示扫描量热法(DSC)温谱图，它是通过一种溶剂合物的去溶剂化制备的，该溶剂合物通过从适当溶剂中消化低纯度的艾普利螺酮获得。
图3-A显示H型艾普利螺酮的红外光谱(漫反射率，DRIFTS)。
图3-B显示L型艾普利螺酮的红外光谱(漫反射率，DRIFTS)。
图3-C显示艾普利螺酮的丁酮溶剂合物的红外光谱(漫反射率，DRIFTS)。
图3-D显示艾普利螺酮的氯仿溶液的红外光谱(漫反射率，DRIFTS)。
图4显示艾普利螺酮的H型的13C NMR谱。
图5显示艾普利螺酮的L型的13C NMR谱。
图6显示丁酮溶剂合物的热重分析谱。
图7显示从丁酮中分离的7-甲基氢4α，5α：9α，11α-二环氧-17-羟基-3-氧-17α-孕烷-7α，21-二羧酸γ-内酯的结晶形式的X-射线粉末衍射图样。
图8显示从异丙醇中分离的7-甲基氢11α，12α-环氧-17-羟基-3-氧-17α-孕-4-烯-7α，21-二羧酸γ-内酯的结晶形式的X-射线粉末衍射图样。
图9显示从正丁醇中分离的7-甲基氢17-羟基-3-氧-17α-孕-4，9(11)-二烯-7α，21-二羧酸γ-内酯的结晶形式的X-射线粉末衍射图样。
图10显示对于人类受试者，对艾普利螺酮剂量作图的收缩期血压的改变。
图11显示对于人类受试者，对艾普利螺酮剂量作图的舒张期血压的改变。
图12显示对于一个人类受试者，对艾普利螺酮剂量作图的血浆肾素活性和血清醛固酮的改变。
图A-1显示在第1、5、9、13天，在开始L-NAME处理之前和之后的收缩期血压。
图A-2显示处死后测定的血浆肾素活性(A)和血浆醛固酮水平(B)。
图A-3显示(A)L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理诱发的心肌坏死性损伤的心脏组织病理学；(B)在盐皮质激素受体拮抗剂艾普利螺酮存在下接受L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理的动物的心肌(不显示坏死性损伤)的心脏组织病理学；(C)用胶原特异性染料对图A的心脏的染色；(D)用胶原特异性染料对图27B的心脏的染色。
图A-4显示心肌坏死的组织病理学评分。
图A-5显示在处死当天(第14天)采集的样品的尿蛋白***。
图A-6显示(A)中冠肾切片的PAS染色的肾组织病理学，该切片来自接受L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理的动物，(B)接受L-NAME/血管紧张素II/NaCl加艾普利螺酮的大鼠的肾皮质。
图A-7显示肾血管损伤的组织病理学评分。
图A-8显示醛固酮/盐单肾切除的大鼠的冠状动脉的炎症损伤。
图A-9显示艾普利螺酮处理的醛固酮/盐单肾切除的大鼠的冠状动脉的炎症损伤。
图A-10显示醛固酮/盐单肾切除的大鼠的心肌损伤。
图A-11显示饮用盐水的易患中风SHR大鼠的存活率。
图A-12显示饮用盐水的易患中风SHR大鼠的SBP。
图A-13显示饮用盐水的易患中风SHR大鼠的脑损伤。
图A-14显示饮用盐水的易患中风SHR大鼠的脑损伤。
图A-15显示从8.4-13.1周龄接受艾普利螺酮(100mg/kg/天)或载体长期治疗的易患中风自发性高血压大鼠在死亡前的(A)收缩期动脉血压(SBP)和(B)尿蛋白***(UPE)。
图A-16显示苏木精和曙红染色的中冠肾切片的代表性显微照片(最初放大倍数×130)，这些切片来自从8周龄开始用艾普利螺酮或载体处理5周后，饮用盐水的易患中风的自发性高血压大鼠。
图A-17显示饮用盐水的易患中风的自发性高血压大鼠在卡托普利加载体(CAP)、卡托普利加血管紧张素II(CAP+血管紧张素II)或卡托普利加血管紧张素II加艾普利螺酮(CAP+血管紧张素II+EPL)处理过程中的(A)收缩期动脉血压和(B)尿蛋白***。
图A-18显示易患中风的自发性高血压大鼠的血浆醛固酮水平，在8.3周龄时开始的卡托普利处理(50mg/kg/d)和1％NaCl/易患中风的啮齿动物饮食。
图A-19显示苏木精和曙红染色的肾皮质的代表性显微照片，这些皮质来自(A)用卡托普利加载体处理的饮用盐水的易患中风的自发性高血压大鼠和(B)卡托普利处理的动物。
图A-20显示对艾普利螺酮的PK谱(Cmax)的群体效应。
图A-21显示对艾普利螺酮的PK谱(AUCIqc)的群体效应。
图A-22显示对艾普利螺酮的PK谱(AUCinf)的群体效应。
图A-23显示对艾普利螺酮的PK谱(CL/F)的群体效应。
图A-24显示对艾普利螺酮的PK谱(Vol/F)的群体效应。
图A-25显示对艾普利螺酮的开环内酯形式的PK谱(Cmax)的群体效应。
图A-26显示对艾普利螺酮的开环内酯形式的PK谱(AUCIqc)的群体效应。
图A-27显示对艾普利螺酮的开环内酯形式的PK谱(AUCinf)的群体效应。
图A-28显示对艾普利螺酮的开环内酯形式的PK谱(CL/F)的群体效应。
图A-29显示对艾普利螺酮的开环内酯形式的PK谱(Vol/F)的群体效应。
图A-30显示多剂量施用后的平均艾普利螺酮血浆浓度。
图C-1显示由掺杂(a)0％、(b)1％、(c)3％和(d)5％二环氧化物的丁酮结晶获得的湿饼(丁酮溶剂合物)的X-射线粉末衍射图样。
图C-2显示由掺杂(a)0％、(b)1％、(c)3％和(d)5％二环氧化物的丁酮结晶获得的干燥固体的X-射线粉末衍射图样。
图C-3显示从掺杂3％二环氧化物的丁酮结晶获得的干燥固体的X-射线粉末衍射图样，(a)在干燥之前溶剂合物未磨碎，(b)在干燥之前溶剂合物磨碎。
图C-4显示从掺杂(a)0％、(b)1％、(c)5％和(d)10％的11，12-环氧化物的丁酮结晶获得的湿饼(丁酮溶剂合物)的X-射线粉末衍射图样。
图C-5显示从掺杂(a)0％、(b)1％、(c)5％和(d)10％的11，12-环氧化物的丁酮结晶获得的干燥固体的X-射线粉末衍射图样。
图C-6显示产物纯度、原材料纯度、冷却速度和终点温度的柱状图，根据表7A报告的数据。
图C-7显示用图15的柱状图制作的半标准图，用来确定对终材料纯度具有统计学显著影响的那些变量。
图C-8是一张以表7A报告的结果为基础的相互作用图，显示原材料纯度与冷却速度之间对终材料纯度的相互作用。
图C-9显示以表7A报告的数据为基础的H型重量分数、原材料纯度、冷却速度和终点温度的柱状图。
图C-10显示利用图18的柱状图制作的半标准图，用来确定对终材料的纯度有统计学显著的影响的那些变量。
图C-11是一张以表7A报告的结果为基础的相互作用图，显示原材料纯度与终点温度之间对终材料纯度的相互作用。
图C-12显示非晶态艾普利螺酮的X-射线衍射图样。
图C-13显示非晶态艾普利螺酮的DSC温谱图。
图D-1显示DBP距基线的均值改变。
图D-2显示SBP距基线的均值改变。
图D-3显示剂量范围析因设计研究的设计。
图D-4显示剂量范围的析因设计；最后一次检测的DBP的均值改变。
图D-5显示剂量范围的析因设计；最后一次就诊的SBP的均值改变。
图D-6显示滴定的艾普利螺酮对依那普利的剂量；研究设计。
图D-7显示滴定的艾普利螺酮对依那普利的剂量；BP距基线的均值改变(第24周)。
图D-8显示滴定的艾普利螺酮对依那普利的剂量；BP距基线的均值改变(第12月)。
图D-9显示滴定的艾普利螺酮对依那普利的剂量；特别重要的不利事件。
图D-10显示艾普利螺酮对依那普利对与(LVH)的组合；研究设计。
图D-11显示艾普利螺酮对依那普利对与(LVH)的组合；距基线lvm的均值改变。
图D-12显示艾普利螺酮对依那普利对与(LVH)的组合；LVM距基线的均值改变；最后一次就诊。
图D-13显示艾普利螺酮对依那普利对与(LVH)的组合；LVM距基线的均值改变。
图D-14显示艾普利螺酮对依那普利对与(LVH)的组合；BP距基线的均值改变；LVH患者最后一次就诊。
图D-15显示艾普利螺酮对依那普利对与(LVH)的组合；特别重要的事件。
图D-16显示低肾素型高血压；BP距基线的均值改变；第8周(单一治疗的终点)。
图D-17显示低肾素型高血压；BP距基线的均值改变；第16周(最后一次就诊)。
图D-18显示低肾素型高血压；接受另外添加的hctz的患者的百分数。
图D-19显示低肾素型高血压；响应率(responder rate)。
图D-20显示低肾素型高血压；特别重要的不利事件。
图D-21显示黑人与白人群体的比较；研究设计。
图D-22显示黑人与白人群体的比较；距基线的均值改变；白人；最后一次就诊。
图D-23显示黑人与白人群体的比较；距基线的均值改变；黑人；最后一次就诊。
图D-24显示黑人与白人群体的比较；距基线的均值改变；所有患者最后一次就诊。
图D-25显示黑人与白人群体的比较；特别重要的不利事件。
图D-26显示研究设计。
图D-27显示距基线的均值改变；uacr，第24周。
图D-28显示第8周和第24周时的uacr的几何平均值(μg/g)。
图D-29显示第8周和第24周时SBP距基线的均值改变。
图D-30显示第8周和第24周时DBP距基线的均值改变。
图D-31显示特别重要的不利事件。
图D-32显示SBP升高时的艾普利螺酮对氨氯地平；研究设计。
图D-33显示SBP升高时的艾普利螺酮对氨氯地平；BP距基线的均值改变(第24周)。
图D-34显示SBP升高时的艾普利螺酮对氨氯地平；24小时平均BP ABPM量值距基线的均值改变。
图D-35显示SBP升高时的艾普利螺酮对氨氯地平；24小时平均BP ABPM量值距基线的均值改变；脉压。
图D-36显示SBP升高时的艾普利螺酮对氨氯地平；距基线的均值改变；颈动脉-股骨PWV。
图D-37显示SBP升高时的艾普利螺酮对氨氯地平；距基线的均值改变；颈动脉-桡骨PWV。
图D-38显示SBP升高时的艾普利螺酮对氨氯地平。
图D-39特别重要的不利事件。
图D-40显示与ACE-I或ARB的共同施用；研究设计。
图D-41显示未用ACE-I控制的患者中BP的均值改变(每次就诊)。
图D-42显示与ACE-I或ARB的共同施用；BP距基线的均值改变；第8周(最后一次就诊)。
图D-43显示第8周BP距基线的均值改变(最后一次就诊)。
图D-44显示未用ARB控制的患者中BP的均值改变(每次就诊)。
图D-45显示距基线的均值改变；实验室值。
图D-46显示未用ACE-I控制的患者的血清钾值。
图D-47显示未用ARB控制的患者的血清钾值。
图D-48显示重要的不利事件。
图D-49显示严重的不利事件。
图D-50显示心率的均值改变。
图D-51显示平均活性肾素和醛固酮水平。
图D-52显示平均活性肾素和醛固酮水平。
图D-53显示退出(withdrawal)的原因。
图D-54显示对DBP治疗起反应的患者的百分数。
图D-55显示与ACE-I和ARB的共同施用。
图D-56显示与CCB或β-阻断剂的共同施用。
图D-57显示与CCB或β-阻断剂的共同施用。
图D-58显示与CCB或β-阻断剂的共同施用。
图D-59显示长期的开放标记安全性研究设计。
图D-60显示DBP的均值改变。
图D-61显示SBP的均值改变。
图D-62显示特别重要的不利事件。
图D-63显示ABPM研究设计中的艾普利螺酮对氨氯地平。
图D-64显示ABPM DBP中的艾普利螺酮对氨氯地平；距基线的均值改变(ABPM)。
图D-65显示ABPM SBP中的艾普利螺酮对氨氯地平；距基线的均值改变(ABPM)。
图D-66显示ABPM SBP中的艾普利螺酮对氨氯地平；距基线的均值改变(24小时ABPM)。
图D-67显示ABPM DBP中的艾普利螺酮对氨氯地平；距基线的均值改变(24小时ABPM)。
图D-68显示ABPM SBP中的艾普利螺酮对氨氯地平；每小时基线平均值(24小时ABPM)。
图D-69显示ABPM DBP中的艾普利螺酮对氨氯地平；每小时基线平均值(24小时ABPM)。
图D-70显示ABPM SBP中的艾普利螺酮对氨氯地平；每小时终点平均值(24小时ABPM)。
图D-71显示ABPM SBP中的艾普利螺酮对氨氯地平；每小时终点平均值(24小时ABPM)。
图D-72显示ABPM中的艾普利螺酮对氨氯地平；特别重要的不利事件。
图D-73显示研究示意图。
图D-74显示距基线的均值改变；第12周的cuff BP(最后一次就诊)。
图D-75显示距基线的均值改变(ABPM)。
图D-76显示调整的cuff seDBP距基线的均值改变。
图D-77显示调整的cuff seSBP距基线的均值改变。
图D-78显示特别重要的不利事件。
优选实施方案详述
发明总述
通常认为醛固酮介导的疾病只限于原发性和继发性醛固酮过多症。在醛固酮过多症中，一般认为过量水平的醛固酮是导致高血压的原因，其机制包括高水平的盐皮质激素受体被醛固酮占据，导致上皮钠通道(“EnaC”)激活和钠潴留增加。患醛固酮过多症的个体患肾脏及心脏疾病的危险也增加。这些疾病以前被认为是高血压的结果。
然而已经发现，任何水平(无论升高、正常还是亚正常)的内源性醛固酮在人类受试者中都是致病的。还发现，当受试者的钠水平升高时，人类受试者中由内源性醛固酮介导的致病作用的发展、发生及发展的快速性和/或严重程度进一步提高，无论醛固酮是以升高的、正常的还是亚正常的水平存在。在盐敏感的和/或饮食钠摄取增加的人类受试者中，内源性醛固酮的致病性特别明显。
另外，已经发现了在人类受试者中能够减少或消除这些醛固酮介导的致病性的新型方法。通常对需要的人类受试者施用治疗有效量的一种或多种环氧甾族化合物(是醛固酮拮抗剂)，以治疗或预防由于内源性醛固酮的作用引起的致病作用，包括由亚正常水平的内源性醛固酮引起的致病作用。环氧甾族化合物优选地是艾普利螺酮。受试者优选地是盐敏感的和/或饮食钠摄取增加的个体。在钠水平升高的情况下，致病作用优选地由内源性醛固酮的作用引起。升高的钠水平优选地是升高的细胞内钠水平，特别是心脏、肾脏和脑之一种或多种中的细胞内钠。
一般定义
如此处所用的术语“受试者”包括哺乳动物，优选地人，它是处理、观察或实验的对象。
术语“处理”包括任何处理、作用、应用、治疗、程序等，其中哺乳动物，特别是人接受医学救助，目的在于直接或间接地改善该哺乳动物的情况。
术语“预防”和“防止”包括在个体中防止临床上明显的致病作用的发生，或者防止临床前明显的致病作用阶段的发生。这些术语包括对一个受试者的预防处理，该受试者可能由于遗传、环境、社会或其它因素而具有发生致病作用的危险，例如但不限于高血压和心力衰竭。
短语“治疗有效的”是指可达到改善疾病的目的而避免了一般与备选治疗有关的不利副作用的醛固酮拮抗剂的量。
如此处所用的术语“钠”或“盐”包括任何形式的钠，特别是氯化钠形式。
术语“醛固酮拮抗剂”和“醛固酮受体拮抗剂”包括抑制醛固酮与盐皮质激素受体结合，从而阻断醛固酮的生物作用的化合物。优选地，醛固酮拮抗剂是一种选择性醛固酮拮抗剂，如艾普利螺酮。选择性醛固酮拮抗剂是相对于其它类固醇激素受体选择性结合盐皮质激素受体的醛固酮拮抗剂。
假设的机制
不拘泥于具体理论，假设致病性在大多数情况下由微血管功能障碍介导。这些微血管功能障碍被认为是微血管缩窄和微缺血的结果。因此，这些微血管改变通过不适应的机制进展，导致不同的致病作用。
亚正常水平的内源性醛固酮的致病性
如上所述，任何水平(包括亚正常水平)的内源性醛固酮在人类受试者中都是致病性的，特别是在水平升高的钠的存在下。这种水平的内源性醛固酮能够是局部水平(例如在特定器官中的内源性醛固酮的细胞内水平)，或者能够更加普遍，乃至全身。因此，内源性醛固酮的致病作用可以是局部的(例如在脑、心脏或肾脏中)，部分而不是完全局部化的，乃至全身的。
受试者的内源性醛固酮水平能够用常规检测方法测定。例如，在受试者中，内源性醛固酮能够作为循环(血浆、血清或全血)醛固酮、尿醛固酮等测定。这种测定可以使用多种商品试剂盒和/或发表的标准试验。例如，血浆醛固酮水平能够通过放射免疫测定法测定。这种测定可使用商品试剂盒，如Dinabot Co.(Tokyo，日本)销售的放射免疫测定试剂盒，用于测定血浆醛固酮。例如，血清醛固酮水平能够用常规免疫测定法测定。例如，尿醛固酮水平同样能够通过DiagnosticProducts Corp的使用抗血清的放射免疫测定法测定。醛固酮-18-葡糖苷酸一般在pH1下水解过夜，产生游离醛固酮，然后用RIA测定。(Prat JH等人：Hypertension.1999；34；315-319)。尿醛固酮能够表示为24小时标本中的总***，或者可以对肌酸酐标准化。
醛固酮正常值取决于具体的测定和选择的组群，但是这些值一般在文献中发表，本领域技术人员容易获得。例如，Merck手册在1526-2528页(第17版，1999)报告，经免疫测定法测定，对于仰卧位受试者，血清醛固酮的实验室正常值一般低于约16ng/dL，对于直立位受试者，约4ng/dL-约31ng/dL(对于饮食钠摄取为约100mEq/天-约200mEq/天的受试者)。Merck手册描述这些值为健康人群的平均值±两倍标准差。类似地，《医学生理学》第6版，Lange MedicalPublications，Los Altos，California；William F Ganong的综述列出了正常醛固酮水平，一般为3-10ng/dL。
由于具体测定法和组群的不同，临床医生或临床中心有时可能需要或希望凭经验确定自己的标准数据。尽管本领域技术人员能够做到这一点，但是需要某些具体的考虑。例如，一个地理区域的人群中可能存在遗传和环境(例如饮食)差异。因此，这一地区的平均值也许不能反映世界范围的平均值。一个例子是，以黑人为主的地区的平均血浆醛固酮可能低于以高加索人为主的地区。类似地，由大部分盐敏感个体组成的国家(例如日本)的平均值可能低于由小部分盐敏感个体组成的国家(例如瑞典)。另外，地区群体在饮食钠消费上可能存在差异，这也导致醛固酮水平的差异。除非另外指出，在此当提到亚正常水平的蛋白质(例如醛固酮或肾素)时，是指低于平均值的任一数值，认为它代表世界群体或希望的目的亚群。
根据本发明能够处理或预防的醛固酮介导的致病作用包括但不限于：高血压，心血管疾病，肾功能障碍，肝病，脑血管疾病，血管疾病，视网膜病，神经病(如周围神经病)，胰岛素病，水肿，内皮功能障碍，压力感受器功能障碍，偏头痛，热潮红，月经前紧张等。心血管疾病包括但不限于：心力衰竭(如充血性心力衰竭)，心律失常，舒张期功能障碍(如左心室舒张期功能障碍、舒张期心力衰竭和损伤的舒张期灌注)，收缩期功能障碍，局部缺血，肥大性心肌病，心脏性猝死，心肌和血管纤维化，损伤的动脉顺应性，心肌坏死性损伤，血管损伤，心肌梗死，左心室肥大，射血分数降低，心脏损伤，血管壁肥大，内皮增厚，冠状动脉纤维蛋白样坏死，等等。肾功能障碍包括但不限于：肾小球硬化，肾终末期疾病，糖尿病肾病，肾血流量减少，肾小球滤过分数提高，蛋白尿，肾小球滤过率降低，肌酸酐清除率降低，微量蛋白尿，肾动脉病，局部缺血损伤，血栓损伤，整体纤维蛋白样坏死，肾小球毛细血管局灶性血栓形成，毛细血管内(内皮和肾小球系膜)和/或毛细血管外细胞肿胀和增生(新月体)，有或没有显著细胞过多的网状肾小球膜基质膨胀，恶性肾硬化(如缺血性回缩，毛细血管丛血栓坏死，微动脉纤维蛋白样坏死，和累及血管小球和微血管的血栓毛细血管病损伤)，等等。肝疾病包括但不限于：肝硬化，肝腹水，肝充血，等等。脑血管疾病包括但不限于中风。血管疾病包括但不限于：血栓血管疾病(如壁纤维蛋白样坏死、红细胞外渗和破碎，腔和/或壁血栓形成)，增生性动脉病(如周围是粘质细胞外基质的膨胀的肌内膜细胞，和结节增厚)，动脉粥样硬化，血管顺应性降低(如僵硬，心室顺应性降低，和血管顺应性降低)，内皮功能障碍，等等。水肿包括但不限于：周围组织水肿，肝充血，脾充血，肝腹水，呼吸***或肺充血，等等。胰岛素病包括但不限于：胰岛素抗性，I型糖尿病，II型糖尿病，葡萄糖敏感，糖尿病前状态，综合征X，等等。
致病作用优选地选自高血压、心血管疾病、肾功能障碍、水肿、脑血管疾病和胰岛素病；更优选地，致病作用选自高血压、心血管疾病、中风和II型糖尿病；再更优选地，致病作用选自高血压、心力衰竭(特别是心肌梗死后心力衰竭)、左心室肥大和中风。
因此，在本发明的一个实施方案中，该方法包括施用治疗有效量的一种或多种环氧甾族化合物(醛固酮拮抗剂)，以在患有或易患一种或多种醛固酮介导的致病作用的人类受试者中治疗或预防该致病作用，其中该受试者含有亚正常水平的内源性醛固酮。致病作用优选地选自高血压、心血管疾病、脑血管疾病和II型糖尿病；更优选地，致病作用选自高血压、心力衰竭(特别是心肌梗死后心力衰竭)、左心室肥大和中风。该环氧甾族化合物优选地是艾普利螺酮。治疗或预防对象优选地是盐敏感的和/或饮食钠摄取增加的个体。
钠对醛固酮介导的病理学的影响
如上所述，已经发现在水平升高的钠的存在下，人类受试者中内源性醛固酮介导的致病作用的发展、发生和发展的快速性和/或严重程度进一步提高，无论醛固酮是以升高的、正常的还是亚正常的水平存在。在盐敏感的和/或饮食钠摄取增加的人类受试者中，内源性醛固酮的致病性特别明显。以前报告，升高的饮食钠摄取水平使高血压加重，特别是在盐敏感个体中，但是钠在可能的内源性醛固酮致病性中的作用以前并不了解。
因此，在本发明的另一个实施方案中，该方法包括施用治疗有效量的一种或多种环氧甾族化合物(是醛固酮拮抗剂)，以在患有或易患一种或多种醛固酮介导的致病作用的人类受试者中，治疗或预防该致病作用，其中该受试者是盐敏感的和/或饮食钠摄取增加的个体。致病作用优选地如上所述；更优选地，选自高血压、心血管疾病、脑血管疾病和II型糖尿病；再更优选地，选自高血压、心力衰竭(特别是心肌梗死后心力衰竭)、左心室肥大和中风。该环氧甾族化合物优选地是艾普利螺酮。当受试者的饮食钠摄取增加时，受试者的每日平均钠摄取至少约为50毫当量，优选地至少约100毫当量，更优选地至少约150毫当量，再更优选地至少约200毫当量。
根据大量高血压研究的结果，医学会通常推荐大多数个体减少他们的饮食钠摄取。例如，美国心脏协会营养委员会推荐成年人每日盐摄取的限度为3.0g(美国心脏协会营养委员会，“健康美国成年人饮食指南”Circulation 77：721-724，1988)。同样，DASH研究证实，将盐摄取降至1.5克能比2.4克的饮食降低血压。(NIH News Release，May17,2000“NHLBI研究表明减少饮食钠对血压有较大益处)。
尽管一般认为钠摄取的减少是有利的，但是许多个体和群体通常不减少或不能减少钠摄取。缺乏自律和阻止饮食改变的因素致使不顺从推荐指南。阻止饮食改变的因素可包括如下：(1)难以获得低氯化钠食品，地理或其它限制因素阻止或阻碍了获得低氯化钠食品；(2)冷藏的缺乏，需要使用高氯化钠水平来保存食物(例如腌制)；(3)文化环境，如在食物制造和含量方面需要尊重传统和宗教的要求，导致消费含有高水平氯化钠的食品；和(4)贫穷引起的成本限制，限制了购买含有较低氯化钠含量的较贵的食品(例如进口食品)。发现这些个体，特别是盐敏感的个体，对消费高氯化钠食品没有选择，除非忍受威及生命的营养不良或饥饿，否则必须通过食用高氯化钠饮食屈服于这种病理状况。然而，本发明的方法能够用来在达不到或不能达到饮食钠摄取减少的这些个体中治疗或预防醛固酮介导的致病作用。
钠的作用在盐敏感个体中特别明显。这些个体可能有损害的压力-尿钠增多反应，或者血管对钠的反应增强，并且具有成为高血压的更高的危险。大量研究表明，盐敏感患者对于钠摄取增加有恶化的反应，包括肾血流量减少、肾小球滤过分数增加和蛋白尿。(Bakris，GL等人：Am J Hypertens 1996；9：200S-6S)。盐敏感性也是心血管疾病的一个危险因素。(Campese VM：Hypertension 1992；19；403-18)。本发明的方法同样能够用来治疗或预防这些个体中醛固酮介导的致病作用。
钠摄取增加也能不利地影响患者对药物治疗的反应。例如，温和高血压研究治疗(TOMHS)检查了用来治疗黑人患者高血压的5类药物(Neaton JD等人：JAMA 1993；270：713-24)。研究表明，患者对***、钙通道阻断剂或具有内在拟交感神经药活性的β-肾上腺素能受体拮抗剂的反应好于ACE抑制剂或α-肾上腺素能受体拮抗剂(Grim CE等人：JChronic Dis 1980；33：87-94)。黑人和白人患者显示钠摄取减少可增强药物治疗。钠摄取减少对于药物治疗还有其它影响。例如，这种减少导致退出抗高血压治疗的情况得以改善，特别是对于盐敏感患者(van Brummelen P，Schalekamp M，de Graeff J.Acta Med Scand1978；204：151-7)。甚至钠的适度减少即能导致有效剂量的减少(Weinberger MH等人：JAMA 1988；6：2561-5)。然而，本发明的方法能够用于单一治疗，或者与其它治疗联合使用，例如由于盐敏感性和/或饮食钠摄取增加而对治疗的患者无效的常规药物治疗。
例如，本发明的一个实施方案包括在盐敏感的人类受试者中治疗或预防高血压的一种方法。根据该方法，对患有或易患高血压的盐敏感个体施用有效量的环氧甾族化合物(是一种醛固酮拮抗剂)。盐敏感个体的高血压是不同于其它形式的高血压的一种病理情况，它由普通饮食成分氯化钠诱发。如果不予处理，患有该病的患者的心肌梗死、中风、心力衰竭、肾功能障碍、器官功能障碍和其它心血管疾病的发病率也会提高。
盐敏感性高血压能够容易地诊断，例如通过在低氯化钠摄取条件下(如约1-3克/日，数天)，随后在高氯化钠摄取条件下(如约12-15克/日)，测量患者的血压改变。随着氯化钠摄取增加，血压升高约10％或更多表明是盐敏感性高血压。此外，受试者的血压改变也能够使用一种移动血压测量装置在24小时内监测。盐敏感性高血压患者不显示在睡眠期间正常发生的血压昼夜节律性降低(或“dip”)。而是，在整个24小时期间内，盐敏感性高血压患者的血压仍然升高。盐敏感患者最大保持高血压的这段另外的时间增加了由这种情况引起的对血管和器官的病理性损伤。
尽管通过减少氯化钠摄取能够改善这种情况，但是由于如上所述的种种原因，减少钠摄取可能并不实际。在没有饮食疗法时，试图进行治疗性干预。根据盐敏感性高血压的生物化学谱，随着交感神经活性和儿茶酚胺水平的提高，通常推荐使用β-肾上腺素能阻断药物。然而，这种治疗很少成功，并且能够引起严重的副作用，很少或者不能使许多患者缓解。由于高氯化钠饮食也抑制肾素-血管紧张素-醛固酮***，在盐敏感性高血压患者和高盐摄取患者中通常发现醛固酮水平正常或降低。结果是，医生忽视或阻止使用醛固酮拮抗剂治疗盐敏感性高血压。
因此，在另一个实施方案中，本发明包括在饮食钠摄取增加的人类受试者中治疗或预防高血压的一种方法。根据该方法，对饮食钠摄取增加且患有或易患高血压的受试者施用治疗有效量的一种环氧甾族化合物(是一种醛固酮拮抗剂)。
在特别重要的另一个实施方案中，本发明包括在需要的人类受试者中治疗或预防心血管疾病(特别是心肌梗死后心力衰竭)的一种方法。根据该方法，对盐敏感的和/或饮食钠摄取增加的受试者施用治疗有效量的一种环氧甾族化合物(是一种醛固酮拮抗剂)，其中该受试者患有或易患心血管疾病。
在特别重要的另一个实施方案中，本发明包括在需要的人类受试者中治疗或预防肾功能障碍的一种方法。根据该方法，对盐敏感的和/或饮食钠摄取增加的受试者施用治疗有效量的一种环氧甾族化合物(是一种醛固酮拮抗剂)，其中该受试者患有或易患肾功能障碍。
盐敏感性
实验和临床试验显示了钠摄取与血压之间的关系，而普通人群在这种关系上显示材料异质性。公认有显示不同反应的两个普通群组。第一个普通组是盐不敏感个体(也被称为“耐盐个体”)。在盐不敏感个体中，饮食钠摄取增加导致钠***增加，血压没有可测到的升高，或者只有最小的升高。类似地，盐不敏感个体的钠摄取的减少不会实质性降低血压或高血压的发病率。实际上，这些钠摄取限制因素可能对个体有害。
第二个普通组是盐敏感个体。在盐敏感个体中，随着钠消耗的增加和减少，血压通常分别升高或降低。盐敏感的正常血压个体在消费典型的北美洲饮食后甚至更可能发展为高血压。(Sullivan JM，1991；Hypertension 17(Suppl.1)：161-68)。当钠摄取增加时，肾血流量可能不增加或者可能减少，以致血管抵抗力和滤过分数提高，肾小球滤过率保持不变或提高。(Weir MR等人：Hypertension 1990；16：235-44)。
盐敏感个体的鉴定
本领域技术人员公知适于测定盐敏感性的试验，例如但不限于盐攻击试验。参见，例如，Brenner，K.“一种区别盐敏感与非盐敏感形式的人体和实验高血压的方法”，Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.1993May；2(3)：341-349。这种鉴定能够通过例如临床试验(如盐攻击试验)完成，或者通过检查家庭史和/或种族起源实现。临床试验能够用单向或双向分析进行。
盐攻击试验
测定盐敏感性的一种说明性非限制性方法是盐攻击试验。单向盐攻击试验能够使个体食用低盐饮食(例如40mmol/天，一周；“低盐方案”)完成。因为可自由获得钠的个体通常被证实顺应性较差，这一试验阶段最好在住院环境下进行。住院环境是，试验个体不能自由获得钠来源，饮食由营养师或本领域技术人员决定，确定钠含量。另外，摄入的钠的所有饮食来源都经过仔细测定。在低盐方案完成后，在静止条件下测量三次收缩期和舒张期血压。低盐方案完成后，个体立即再实施控制的饮食方案，其中摄取的总钠是220mmol/天(“高盐方案”)。在一周高盐方案结束时，如低盐方案一样测量收缩期和舒张期血压。证实收缩期血压或舒张期血压或两者均升高5mmHg以上的受试者被认为是盐敏感的。
双向盐攻击试验能够如下完成：对个体施行如以上单向试验所述的低盐方案和高盐方案，然后立即使个体食用类似于低盐方案的控制的低盐饮食，然后如单向试验所述测量收缩期和舒张期血压。证实在高盐方案结束时收缩期或舒张期血压或两者均升高5mmHg或以上，并且在随后的控制低盐饮食结束时收缩期或舒张期血压或两者均降低5mmHg或以上的个体被认为是盐敏感的。
鉴定盐敏感个体的另一种方法是进行一种反向单向分析，其中个体首先实施高钠方案，然后实施低钠方案。证实在低钠方案结束时收缩期或舒张期血压或两者均降低10％的个体被认为是盐敏感的。
上述单向、双向和反向单向盐攻击试验在希望时能够进一步修改。例如，代替住院设置，能够允许受试者在其它的正常环境中进行正常活动(即吃、睡眠、工作等)。对饮食方案的依从性通过分析24小时采集的尿确定。此外，也能通过主观调查和受试个体记录来监测依从性。上述试验方法的其它修改包括将每个试验方案的一周间隔缩短为3、4、5或6天。上述试验的其它修改还包括调节高钠盐摄取方案，例如每天8-16克钠。另外，也能够使用较低的收缩期或舒张期血压改变阈值(如5、6、7、8或9％)，希望时，如果个体在两个独立的单向试验测定中达到这个降低的阈值，也能够被评分为盐敏感性阳性的。
快速容量扩大和收缩试验
测定盐敏感性的另一种说明性非限制性方法是使用快速容量扩大和收缩试验，例如Grim等人；Hypertension 1979；1：476-85所述的方案；由Strazzullo等人：J Nephrol 2000；13：46-53修改。通常，受试者入院4天，每天接受50mmol钠。第1天，受试者也另外接受Slow-Na片形式的钠，达到150mmol钠的总摄取量。第2天，钠摄取再次固定为150mmol，受试者以恒定速度静脉内输注2L 0.9％氯化钠，共4小时。在氯化钠输注开始和结束时使用自动血压记录仪进行血压测量(以3分钟间隔测量5次的平均值)。在盐水输注3个小时前及期间测定尿钠***。在输液之前和之后测量体重、血细胞比容、血浆肾素活性和醛固酮。第3天，饮食钠限制(50mmol/天)加上午10:00、下午02:00和下午06:00三剂37.5mg呋塞米，导致钠和容量不足。要求受试者饮用不超过每千克体重25mL的自来水。第4天上午8:00测量血压。根据输液结束时测量的平均血压减氯化钠耗尽后的血压，计算对试验的反应。如果反应超过5mmHg则认为受试者是盐敏感的。
家族史或种族起源
家族史和种族起源也能够有助于确定具有盐敏感危险的受试者。这些危险因素包括但不限于：包括一个或以个以上高血压亲戚的家族史，或可追溯到显示盐敏感性普及性高于世界上一般人群的种族的系谱图。仅仅举一个例子，这种系谱图包括黑人、美洲黑人、美洲印第安人和日本人。(Powers DR等人：Arch Intern Med1998 158：793-800)。
分子鉴定
通过适当遗传检测方法对盐敏感性表型的分子鉴定也能用来检测个体的盐敏感性。例如，Rutledge等人已经描述了非洲美洲人中该表型与心钠素中的Hpa11突变之间的相关性。(J Hypertens.1995；13：953-5)。Svetkey等人报告了非洲美洲人中钠负荷/容量不足引起的舒张期血压反应与β2-肾上腺素能受体基因座之间的一致性。(Hypertension.1997；29：918-22)。意大利的一项同胞对研究报告了α-内收蛋白突变(I460 Trp)与盐敏感性之间的一致性(Cusi D等人；Lancet.1997；349：1353-7)。据报告，在瑞士人口中，2型11β-羟基类固醇脱氢酶(11βHSD2)基因的外显子3的AluI多态性与盐敏感性有关(Lovati E等人：J ClinEndocrinol Metab.1999；84：3745-9)。而且，据报告，在未经选择的原发性高血压患者中，同一基因中的CA-重复等位基因微卫星多态性与盐敏感性相关。(Ferrari P等人：Kidney Int.2000；57：1374-81)。另外，尿皮质醇与考的松代谢物的平均比升高显示，盐敏感受试者的11βHSD2活性比耐盐受试者降低。西班牙的一项高血压个体研究报告，ACE基因中存在的一个或两个拷贝的287碱基对***与盐敏感性之间有相关性。(Giner等人：Hypertension.2000；35：512-517)。
血浆免疫反应性内皮素水平
内皮细胞在调节血管紧张度和内环境稳定中起重要作用。这种功能部分通过血管作用物质的分泌介导。内皮素(由内皮细胞产生)是强血管收缩剂，是由三种不同基因编码的肽(Yanagiawa M等人：Nature1988 332：411-5)。内皮素-1(“ET-1”)是内皮产生的主要成员，以自分泌和旁分泌方式起作用。平滑肌细胞上的ET-1受体(即EtA和ETB)介导ET-1的诱发收缩、增生和肥大作用(De Nucci G等人：Proc Natl AcadSci USA 1988，85：9797-800)。
在耐盐高血压个体中，内皮素血浆水平一般正常。(Schiffrin EL等人：Am J Hypertens1991 4：303-8)。然而在严重高血压个体和黑人中，血浆免疫反应性ET-1通常增加。盐敏感个体通过血浆ET-1水平升高响应盐负荷增加。(Elijovich F等人：Hypertension 1999；33：1075)。因此，确定盐敏感个体的另一种方法是检测血浆免疫反应性内皮素水平。盐敏感个体中通常存在升高的血浆免疫反应性内皮素水平，特别是升高的血浆免疫反应性内皮素ET-1水平。
需要处理的受试者
亚正常水平的内源性醛固酮在人类受试者中的致病性以前并不知道。类似地，人体中钠水平升高引起的内源性醛固酮介导的致病作用的发展、发生和发展的快速性和/或严重程度以前并不知道。一般认为，钠负荷一般导致内源性醛固酮水平降低到不致病的水平。因此，能够从根据本发明的治疗或预防中受益的受试者通常是如下人类受试者：(i)具有亚正常的内源性醛固酮水平，(ii)具有盐敏感性，无论内源性醛固酮水平如何，和/或(iii)饮食钠摄取增加，无论内源性醛固酮水平如何。在每组受试者内，进行进一步的作图(profiling)和/或表型分型来鉴定将从本发明的治疗中受益的受试者亚组可能是有利的。
因此，能够从根据本发明的方法的治疗或预防中受益的受试者是通常显示一个或多个下列特征的人类受试者：
(a)受试者的每日平均氯化钠摄取量至少约为4克，特别是在指定的一年期间内以至少一个月或几个月的间隔在任一月内都满足这一条件时。受试者的每日平均钠摄取量优选地是至少约6克，更优选地至少约8克，再更优选地至少约12克。
(b)当受试者的每日氯化钠摄取量从不到约3克/天增加到至少约10克/天时，受试者显示收缩期血压和/或舒张期血压升高至少约5％，优选地至少约7％，更优选地至少约10％。
(c)受试者中血浆醛固酮(ng/dL)与血浆肾素(ng/ml/hr)的活性比大于约30，优选地大于约40，更优选地大于约50；再更优选地大于约60。
(d)受试者具有低血浆肾素水平；例如，受试者早晨的血浆肾素活性不到约1.0ng/dL/hr，以及/或者受试者的活性肾素值不到约15pg/mL。
(e)受试者具有或易患有收缩期和/或舒张期血压升高。通常，受试者的收缩期血压(例如用坐位的袖带水银血压计测量)至少约130mmHg，优选地至少约140mmHg，更优选地至少约150mmHg，受试者的舒张期血压(例如用坐位的袖带水银血压计测量)至少约85mmHg，优选地至少约90mmHg，更优选地至少约100mmHg。
(f)受试者的尿钠与钾之比(mmol/mmol)不到约6，优选地不到约5.5，更优选地不到约5，再更优选地不到约4.5。
(g)受试者的尿钠水平至少为每天60mmol，特别是在指定的一年期间内以至少一个月或几个月的间隔在任一月内都满足这一条件时。受试者的尿钠水平优选地至少约每天100mmol，更优选地至少约每天150mmol，再更优选地每天200mmol。
(h)受试者中一种或多种内皮素，特别是血浆免疫反应性ET-1的血浆浓度升高。ET-1的血浆浓度优选地高于约2.0pmol/L，更优选地高于约4.0pmol/L，再更优选地高于约8.0pmol/L。
(i)受试者的血压用ACE抑制剂治疗基本难以控制；特别是这样一种受试者：与不接受抗高血压治疗的受试者的血压相比，每天10mg依那普利使其血压下降不到约8mmHg，优选地不到5mmHg，更优选地不到3mmHg。
(j)受试者患有血容量增加的高血压或血容量增加的临界高血压，即，钠潴留增加导致的血容量增加影响血压的高血压。
(k)受试者是未适应的个体，即，证实该个体在肾血流速和/或醛固酮的肾上腺产生方面对钠摄取增加或血管紧张素II施用有不敏感的(blunted)阳性反应，特别是在该反应低于从总地理人群中采样的个体(例如从受试者的来源国或受试者是其居民的国家采样的个体)的反应时，优选地在该反应低于人群平均值的40％，更优选地低于30％，更优选地低于20％时。
(I)受试者患有或易患肾功能障碍，特别是选自肾小球滤过率减少、微量蛋白尿和蛋白尿的肾功能障碍。
(m)受试者患有或易患心血管疾病，特别是选自心力衰竭、左心室舒张期功能障碍、肥大性心肌病和舒张期心力衰竭的心血管疾病。
(n)受试者患有或易患肝脏疾病，特别是肝硬化。
(o)受试者患有或易患水肿，特别是选自周围组织水肿、肝或脾充血、肝腹水和呼吸***或肺充血的水肿。
(p)受试者患有或易患胰岛素抗性，特别是I型或II型糖尿病，和/或葡萄糖敏感。
(q)受试者至少55岁，优选地至少约60岁，更优选地至少约65岁。
(r)受试者整体上或部分地是选自亚洲(特别是日本人)种族、美洲印第安人种族和黑人种族的至少一个种族的成员。
(s)受试者携带与盐敏感性有关的一种或多种遗传标记。
(t)受试者肥胖，优选地身体脂肪超过25％，更优选地身体脂肪超过30％，再更优选地身体脂肪超过35％。
(u)受试者有一个或多个盐敏感的一代、二代或三代亲戚，其中一代亲戚是指父母或共为一个或多个相同父母的亲戚，二代亲戚是指祖父母和共为一个或多个相同祖父母的亲戚，三代亲戚是指曾祖父母或共为一个或多个相同曾祖父母的亲戚。优选地，这些个体有4个或更多的盐敏感的一代、二代或三代亲戚；更优选地，有8个或更多这样的亲戚；再更优选地，有16个或更多这样的亲戚；再更优选地，有32个或更多这样的亲戚。
除非另外指出不同，以上所列的数值优选地代表根据至少两次测定的平均值，更优选地代表每日平均值。
优选地，需要处理的受试者至少满足两个或更多的上述特征，更优选地，至少三个或更多的上述特征，再更优选地，至少四个或更多的上述特征。
因此，在本发明的一个实施方案中，需要处理的受试者是盐敏感的，并且满足两个或更多的下列条件：(i)受试者的每日平均氯化钠摄取量至少约为4克，特别是在指定的一年时间内以至少一个月或几个月的间隔在任一月内都满足这一条件时；和/或(ii)受试者的血浆醛固酮(ng/dL)与血浆肾素(ng/ml/hr)的活性比大于约30；(iii)受试者的早晨血浆肾素活性小于约1.0ng/dL/hr，和/或受试者的活性肾素值小于约15pg/mL；和/或(iv)受试者的收缩期血压至少约为130mmHg，且受试者的舒张期血压至少约为85mmHg；和/或(v)受试者患有或易患心血管疾病，特别是选自心力衰竭、左心室舒张期功能障碍、肥大性心肌病和舒张期心力衰竭的心血管疾病。
在本发明的另一个实施方案中，需要处理的受试者是盐敏感的，且满足下列条件：(i)受试者的血浆醛固酮(ng/dL)与血浆肾素(ng/ml/hr)的活性比大于约30；(ii)受试者的早晨血浆肾素活性小于约1.0ng/dL/hr，和/或受试者的活性肾素值小于约15pg/mL。
在本发明的另一个实施方案中，需要处理的受试者是盐敏感的，且满足至少两个下列条件：(i)受试者的每日平均氯化钠摄取量至少约为4克，特别是在指定的一年时间内以至少一个月或几个月的间隔在任一月内都满足这一条件时；和/或(ii)受试者的收缩期血压至少约为130mmHg，且受试者的舒张期血压至少约为85mmHg；和/或(iii)受试者患有或易患心血管疾病，特别是选自心力衰竭、左心室舒张期功能障碍、肥大性心肌病、缺血性心脏病和舒张期心力衰竭的心血管疾病。
说明性表型
在上述每个实施方案中，受试者优选地整体上或部分地是日本种族或黑人种族的成员。在日本，高血压是一个严重的问题。最近的一项估计表明，约有三千万日本成年人患有高血压。(Saruta T.J ClinTher Med 1997；13：4024-9)。尽管日本的血压控制情况最近已经改善，但是仍然认为高血压处理不够。(Shimamoto；K.Japanese Cases.Nihon Rinsyo(Clinical Medicine in Japan)，2000；58(Suppl)：593-6)。“日本的血压和尿钠、钾***趋势：Intersalt研究8年后的重新调查”(Trends in blood pressure and urinary sodium and potassiumexcretion in Japan：reinvestigation in the 8th year after the IntersaltStudy).Nakagawa H等人：Hum Hypertens 1999 Nov；13(11)：735-41建议日本人群增加饮食钾并减少饮食钠。
然而日本的钠限制方案被较差的依从性打乱。Kobayashi等人的一项对日本人的研究列出了限于5-8克/天的饮食，但是也没有获得良好的依从性。(Kobayashi，Y等人：Jpn Circ J 1983；47：268-75)。日本卫生与福利省建议将钠限制在不到10克/天(“老年人高血压治疗指南”，1995，老龄化与健康综合研究计划的一项暂时性计划，“老年人高血压治疗指南”研究小组成员，老龄化与健康综合研究计划，日本卫生与福利省)。Ogihara T等人：Nippon Ronen Igakkai Zasshi.1996；33(12)：945-75)。尽管10年来一直积极教育公众，但是根据日本正常个体与高血压个体中的尿钠水平判断，不依从性仍然较高(估计约50％以上)。(Kobayashi Y等人：Jpn Circ J；47(2)：268-75)。
此外，日本人显示有两个大组：盐敏感的和盐不敏感的(流行病学的预防营养因素：钠与钙的相互作用。Mizushima S，Clin ExpPharmacol Physiol 1999；26：573)。许多日本人的高血压被认为是盐敏感的。因此，显示盐敏感性、高钠摄取和不能主动限制钠消费相结合的日本种族成员尤其能受益于本发明的治疗。
因此在本发明的另一个实施方案中，需要处理的受试者是盐敏感的个体，其整体上或部分地是日本种族的成员，尤其患有或易患高血压和/或心血管疾病，特别是选自心力衰竭、左心室舒张期功能障碍、肥大性心肌病和舒张期心力衰竭的心血管疾病。
在本发明的另一个实施方案中，需要处理的受试者是盐敏感的个体，其整体上或部分地是日本种族的成员，尤其该受试者的每日平均氯化钠摄取量至少约为4克，特别是在指定的一年时间内以至少一个月或几个月的间隔在任一月内都满足这一条件时。
类似地，黑人中的高血压也是一个严重问题。许多高血压和血压正常的黑人是盐敏感的(Svetkey，LP等人：Hypertension.1996；28：854-8)。积累的流行病学数据表明，在年龄和性别匹配的所有组中，黑人的高血压普及率均超过白人。高血压黑人患左心室功能障碍、中风和肾损伤的发病率通常高于高血压白人(但是缺血性心脏疾病的发病率较低)。(Eisner，GM.Am J Kidney Dis 1990；16(4 Suppl 1)：35-40)。美洲黑人中高血压普及的原因主要是环境因素：高钠和乙醇摄取、肥胖、缺乏运动和心理紧张都被确定为其原因。(Flack，JM等人：J Assoc Acad Minor Phys 1991；2：143-50)。
黑人和白人群体中这一问题的原因还不清楚，但是似乎钠处理的不同可能导致黑人高血压的特殊的血液动力学和激素分布。提示限制促尿钠***能力的内在的或高血压诱导的肾异常、Na+，K(+)-ATPase泵活性降低、其它膜离子转运紊乱、不同地暴露于心理应激、胰岛素抗性提高和饮食因素(钙和钾摄取减少)可能起作用。(Flack，JM等人：Hypertension；1991；17(1 Suppl)：1115-21)。一项研究表明，遗传学差异也可能是黑人盐敏感性的原因。(Svetkey，LP等人：Hypertension1996；28：854-8)。
黑人中的高血压通常从限制饮食钠摄取开始治疗。如果饮食控制不够，则推荐施用一种抗高血压药，它具有24小时效能，可降低血管周围抵抗力，促进钠***，能改善肾血流动力学。(Eisner，GM.Am JKidney Dis 1990；16(4 Suppl 1)：35-40)。然而，黑人与白人相比，对抗高血压药的反应通常不同。β-肾上腺素能受体拮抗剂或ACE抑制剂单一治疗在黑人中通常不如在白人中有效。黑人男性对ACE抑制剂的反应性比黑人女性更低(Eisner，GM.Am J Kidney Dis 1990；16(4Suppl 1)：35-40)。因此，显示盐敏感性、高钠摄取和不能主动限制钠消费相结合的黑人种族成员尤其能够受益于本发明的治疗。
因此，在本发明的另一个实施方案中，需要处理的受试者是盐敏感的个体，整体上或部分地是黑人种族的成员，尤其患有或易患高血压和/或心血管疾病，特别是选自心力衰竭、左心室舒张期功能障碍、肥大性心肌病和舒张期心力衰竭的心血管疾病。
在本发明的另一个实施方案中，需要处理的受试者是盐敏感的个体，整体上或部分地是黑人种族的成员，尤其受试者的每日平均氯化钠摄取量至少约为4克，特别是在指定的一年时间内以至少一个月或几个月的间隔在任一月内都满足这一条件时。
在本发明的另一个实施方案中，需要处理的受试者是盐敏感的个体，整体上或部分地是黑人种族的成员，尤其显示标准抗高血压治疗导致血压下降逐渐减少，特别是在这种治疗包括施用ACE抑制剂时。
未适应的个体
如上所述，证实未适应的个体对于高钠摄取或血管紧张素II施用在肾血流速和肾上腺产生醛固酮方面有不敏感的阳性反应。这些未适应的个体还可显示空腹胰岛素水平升高和葡萄糖刺激的胰岛素水平加速升高。(Ferri等人：Diabetes 1999；48：1623-30)。胰岛素抗性也与心肌梗死危险增加有关。
因此，在本发明的另一个实施方案中，需要处理的受试者是盐敏感的未适应的个体，尤其(i)患有或易患胰岛素抗性，特别是I型或II型糖尿病，和/或葡萄糖敏感，和/或(ii)患有或易患心血管疾病。
老年个体
在盐敏感个体中，随着年龄的增加，饮食钠摄取增加引起的血压升高反应也增强。类似地，盐敏感性在高龄个体中更常发现。而且，随着年龄增加，胰岛素抗性显示类似的增多。
因此，在本发明的一个实施方案中，需要处理的受试者是年龄至少55岁、优选地至少约60岁、更优选地至少约65岁的盐敏感个体，尤其患有或易患胰岛素抗性，特别是I型或II型糖尿病，和/或葡萄糖敏感。
解毒和恢复的酒精中毒者
解毒和恢复的酒精中毒者通常也是盐敏感的(Genaro C等人：Hypertension 2000：869-874)。因此，在本发明的另一个实施方案中，需要处理的个体是盐敏感的个体，尤其是解毒和恢复的酒精中毒者。
肥胖
肥胖个体通常是盐敏感的。Bonner(MMW Fortschr Med 1999；14：34-6)的一项研究估计，所有高血压患者中有44％过重，而且与盐敏感性、细胞内钙增加、钠潴留和心输出量增加有关。另外，Dimsdale等人(AmJ Hypertens 1990；3：429-35)报告，肥胖患者更可能提高由盐负荷引起的收缩压。另外，盐敏感儿童患肥胖症和心血管疾病的可能性也增加。(Falkner B等人：Am J Clin Nutr 1997；65：618S-621S)。甚至在血压正常的个体中，钠敏感的受试者比钠抗性受试者有体重增加的倾向。(Rocchini AP等人：Am J MedSci 1994；307 Suppl 1：S75-80)。因此，在本发明的另一个实施方案中，需要处理的受试者是盐敏感的个体，尤其是肥胖者。
盐敏感性的治疗
本发明也涉及使用一种环氧甾族化合物(是一种醛固酮拮抗剂)减少和/或逆转盐敏感性的进展。盐敏感性是因心血管疾病(包括中风)死亡的一个独立危险因素，无论盐敏感者是高血压、吸烟还是含有高胆固醇。(Myron H.Weinberger，美国心脏协会高血压研究会第54届年会(54″Annual Conference of the American Heart Association′sCouncil for High Blood Pressure Research)，Washington，D.C.，2000)。
因此，在本发明的一个实施方案中，需要处理的受试者是盐敏感的个体，或多或少具有正常的临床表现。如此处所用的正常临床表现是指一个个体，明显没有高血压，没有患肾脏、心脏、心血管、脑血管或胰岛素疾病的任何明显证据。在这个个体中使用根据本发明的艾普利螺酮可预防醛固酮/盐介导的病理学的发展。
与年龄有关的盐敏感性进展一般在大多数人中发生。人们认为，这种进展部分是由于几种醛固酮介导的现象。首先，在高盐饮食未适应者中，有异常的血管紧张素介导的醛固酮释放控制，和导致高血压的肾血供应。其次，当受试者年龄增长时，醛固酮介导的血管僵硬损害血管顺应性，导致血管吸收部分血压的能力丧失。第三，与年龄有关的胰岛素产量提高加重了醛固酮介导的ENaC活性提高。
施用根据本发明的一种环氧甾族化合物可减少和/或逆转盐敏感性和相关疾病的进展，例如但不限于钠摄取增加引起的血压升高，肾脏、心血管和脑病。施用环氧甾族醛固酮拮抗剂可减少和/或逆转与年龄有关的效应的进展。而且，这种施用也将减少和/或逆转这些个体中盐敏感性对肾脏、心血管和脑病的遗传和饮食影响。
钠食欲的抑制
本发明也涉及使用一种环氧甾族化合物抑制需要它的个体的钠食欲。限制饮食钠摄取能够减少大量医学病症的大量病理结果，这种限制的依从性通常较差。当达到这种依从性时，甚至只在部分达到时，经受这种限制的个体通常体验到对盐的渴望，生活质量下降。因此本发明作为这种医学病情的其它治疗的附加方法有益于这些个体，并且进一步提高生活质量。
中枢醛固酮介导的疾病的治疗和/或预防
可以假定，盐敏感个体部分由于醛固酮的中枢作用而使血压升高。RAAS的激活在脑室内区(“ICV”)中引起血管加压或交感神经反应。醛固酮在脑中是致血管紧张的(hypertensigenic)，特别是在脑中的细胞内钠水平升高的个体中。这种醛固酮水平升高尤其可能在盐敏感个体中发生。醛固酮在个体的脑中(“中枢醛固酮”)的致血管紧张作用被认为部分介导神经性血管舒缩紧张度增加和动脉压力感受器反射(baroflexes)损伤。另外，人们认为，中枢醛固酮是紧张/焦虑诱导的下丘脑-垂体-肾上腺(“HPA”)轴激活的关键。对这些个体的标准抗高血压治疗被饮食钠摄取的增加打乱，而本发明提供了一种处理方法，它在钠摄取增加时仍然有效，并将改善高血压的管理。
因此，本发明包括环氧甾族醛固酮拮抗剂在功能上灭活个体(特别是脑中细胞内钠水平已经升高或易于升高的个体)脑中的醛固酮的用途。这种水平升高在饮食钠摄取增加的盐敏感个体中特别可能发生。“功能灭活”是指部分或完全阻断醛固酮介导的一种或多种作用。
本发明具体包括环氧甾族醛固酮拮抗剂治疗或预防由于下列一项或多项导致高血压的个体的用途：HPA轴激活，神经性血管舒缩紧张增加，或动脉压力感受器反射损伤。
本发明还包括环氧甾族醛固酮拮抗剂治疗或预防盐敏感的高血压个体的用途，用来减少或防止脑中异常醛固酮水平的不利作用。
肾-醛固酮-介导的疾病的治疗和/或预防
本发明也涉及环氧甾族化合物治疗细胞内钠水平升高的高血压受试者的用途，从而防止异常的肾钠潴留。因此，本发明包括环氧甾族化合物在功能上灭活人类受试者(特别是盐敏感的和/或饮食钠摄取增加的受试者)肾中的醛固酮的用途。“功能灭活”是指部分或完全阻断醛固酮介导的一种或多种作用。
钠摄取增加在盐敏感个体中能够导致钠水平升高和高血压期延长。在这些个体中，RAAS通常未受刺激，肾素和醛固酮水平相对较低，这部分是因为钠潴留不是必需的。因此，醛固酮上游的RAAS抑制剂(例如ACE抑制剂和血管紧张素II受体拮抗剂)具有有限的效能。尽管作为低肾素/盐敏感性高血压基础的基本生化缺陷还不清楚，但是在这些个体中异常的肾钠潴留导致高血压。适当治疗性控制的尝试通常包括联合治疗，能够导致比单一治疗更多的负面副作用。醛固酮在肾脏中是致血管紧张的，特别是在细胞内钠水平升高的个体中。这些个体尤其包括盐敏感个体。然而，本发明的新方法有效阻断未刺激的以及刺激的醛固酮的高血压作用。根据本方法施用环氧甾族化合物能够更正肾脏中缺陷的促尿钠***调节，恢复血压，尽管高钠摄取打乱了标准抗高血压治疗。
因此，在本发明的另一个实施方案中，在水平升高的钠的存在下，致病作用全部或部分由醛固酮的作用引起。优选地，在水平升高的细胞内钠存在下，致病作用全部或部分地由醛固酮的作用引起。
在本发明的另一个实施方案中，致病作用全部或部分地由脑中存在的醛固酮介导。优选地，在水平升高的细胞内钠存在下，致病作用全部或部分地由醛固酮的作用引起。更优选地，致病作用选自高血压和中风。
在本发明的另一个实施方案中，致病作用全部或部分地由肾脏中存在的醛固酮介导。优选地，在水平升高的细胞内钠存在下，致病作用全部或部分地由醛固酮的作用介导。更优选地，致病作用选自肾性高血压和肾硬化症。
在本发明的另一个实施方案中，致病作用全部或部分地由受试者中的醛固酮和饮食钠摄取增加的组合作用引起。
其它实施方案
在一个实施方案中，对需要的受试者施用治疗有效量的一种环氧甾族化合物(特别是艾普利螺酮)，用来治疗或预防全部或部分由醛固酮介导的器官损伤(如心脏、肾脏、脑、肝和肺)。优选地，该受试者显示以前描述的能够从治疗或预防中受益的受试者的一个或多个特征。这种治疗有效的特别重要的受试者包括：
(a)患有或易患胰岛素抗性(特别是I型或II型糖尿病)和/或葡萄糖敏感的受试者。
(b)显示选自微量蛋白尿、轻度到中度高血压和低血浆肾素水平的一种或多种病症的受试者(特别是在受试者也显示低肾素高血压时)。
(c)优选地显示轻度到中度高血压的黑人受试者。
(d)用血管紧张素II受体阻断剂(如洛沙坦)治疗后，显示血压降低不超过至少约4％、优选地至少约5％、更优选地至少约6％的受试者。更优选地，对这些受试者施用环氧甾族化合物联合血管紧张素II受体阻断剂。
(e)显示选自下列的一种或多种条件的受试者：年龄至少约60岁，收缩期高血压，宽脉压和微量蛋白尿。在这些受试者中，环氧甾族化合物能够以一定的剂量施用，例如，该剂量可以有效地减少选自下列的一种或多种临床特征的程度：脉压、颈动脉-股动脉脉搏波速、微量蛋白尿、周围性水肿或临床上有意义的痛苦症状。
为治疗或预防终器官损伤而施用的环氧甾族化合物以一定的量施用，该施用量可有效地使受试者的尿白蛋白/肌酸酐比(“UACR”)在开始治疗的12周内比开始治疗前的基线UACR降低至少约10％，优选地至少约15％，更优选地至少约20％，再更优选地至少约30％，再更优选地至少约40％，再更优选地至少约50％，再更优选地至少约60％。
在另一个实施方案中，对需要的受试者施用治疗有效量的一种环氧甾族化合物(特别是艾普利螺酮)，用来治疗或预防选自肾小球滤过率减少、微量蛋白尿和蛋白尿(特别是微量蛋白尿)的肾功能障碍。优选地，该受试者显示以前描述的能够从治疗或预防中受益的受试者的一个或多个特征。这种治疗有效的一组特别重要的受试者是患有或易患胰岛素抗性(特别是I型和II型糖尿病)和/或葡萄糖敏感的受试者。优选地，该环氧甾族化合物以一定的量施用，该施用量可有效地使UACR在开始治疗的12周内比开始治疗前的基线UACR降低至少约10％，优选地至少约15％，更优选地至少约20％，再更优选地至少约30％，再更优选地至少约40％，再更优选地至少约50％，再更优选地至少约60％。
在另一个实施方案中，对需要的受试者施用治疗有效量的一种环氧甾族化合物(特别是艾普利螺酮)，用来治疗或预防肾终末期疾病。优选地，该受试者显示以前描述的能够从治疗或预防中受益的受试者的一个或多个特征。这种治疗有效的一组特别重要的受试者是患有或易患胰岛素抗性(特别是I型和II型糖尿病)和/或葡萄糖敏感的受试者。优选地，该环氧甾族化合物以一定的量施用，该施用量可有效地使UACR在开始治疗的12周内比开始治疗前的基线UACR降低至少约10％，优选地至少约15％，更优选地至少约20％，再更优选地至少约30％，再更优选地至少约40％，再更优选地至少约50％，再更优选地至少约60％。
在另一个实施方案中，对需要的受试者施用治疗有效量的一种环氧甾族化合物(特别是艾普利螺酮)，用来治疗或预防左心室肥大。优选地该受试者显示以前描述的能够从治疗或预防中受益的受试者的一个或多个特征。这种治疗有效的一组特别重要的受试者是患有或易患胰岛素抗性(特别是I型和II型糖尿病)和/或葡萄糖敏感的受试者。优选地，该环氧甾族化合物能够与一种ACE抑制剂(如依那普利)联合施用。通常以足以实现下列一个或两个条件的量对这些受试者施用该环氧甾族化合物：(a)与开始治疗前的基线胶原更新率相比，胶原更新率在开始治疗后的12周内至少降低约5％，优选地至少约7％，更优选地至少约10％，(b)与开始治疗前的基线UACR相比，UACR在开始治疗后的12周内至少降低约10％，优选地至少约20％，更优选地至少约30％。
在另一个实施方案中，为了提高受试者的血管顺应性，施用治疗有效量的一种环氧甾族化合物(特别是艾普利螺酮)。优选地，该受试者显示以前描述的能够从治疗或预防中受益的受试者的一个或多个特征。这种治疗有效的一组特别重要的受试者是患有或易患胰岛素抗性(特别是I型和II型糖尿病)和/或葡萄糖敏感的受试者。
在另一个实施方案中，为了降低受试者的收缩期血压，施用治疗有效量的一种环氧甾族化合物(特别是艾普利螺酮)。优选地，该受试者显示以前描述的能够从治疗或预防中受益的受试者的一个或多个特征。这种治疗有效的一组特别重要的受试者是患有或易患胰岛素抗性(特别是I型和II型糖尿病)和/或葡萄糖敏感的受试者。优选地，环氧甾族化合物以一定的量施用，该施用量可有效地使收缩期血压在开始治疗的12周内比开始治疗前的收缩期血压降低至少约1％，优选地至少约3％，更优选地至少约5％，再更优选地至少约7％，再更优选地至少约8％，再更优选地至少约9％，再更优选地至少约10％。
在另一个实施方案中，为了治疗或预防受试者的醛固酮***作用，对需要的受试者施用治疗有效量的一种环氧甾族化合物(特别是艾普利螺酮)。这种***作用包括对醛固酮的全身病理反应，累及选自心脏、肾脏、脑、肝、肺和血管***的两种或更多器官。优选地，该受试者显示以前描述的能够从治疗或预防中受益的受试者的一个或多个特征。一组特别重要的受试者显示微量蛋白尿，特别是在该受试者还显示选自下列的一种或多种病症时：血压升高、心血管功能障碍、左心室肥大、心肌梗死、中风、外周血管病、视网膜病和肾终末期疾病。
在另一个实施方案中，对需要的受试者施用治疗有效量的一种环氧甾族化合物(特别是艾普利螺酮)，以治疗或预防选自下列的心血管疾病：先天性疾病、心脏瓣膜疾病、冠状动脉疾病、医院疾病、手术诱发的疾病、心肌病、病毒诱发的疾病、细茵诱发的疾病、解剖学疾病、血管病、移植诱发的疾病、局部缺血疾病、心脏心律失常、传导性疾病、血栓病、主动脉疾病、血凝固障碍、***失调、神经肌肉障碍、血液病、低压病、内分泌失调、肺病、非恶性肿瘤、恶性肿瘤和妊娠诱发的疾病。一组重要的心血管疾病包括选自下列的心血管疾病：冠状动脉疾病、心肌病、主动脉疾病和***失调。另一组重要的心血管疾病包括选自下列的心血管疾病：先天性疾病、心脏瓣膜疾病、医院疾病、手术诱发的疾病、病毒诱发的疾病、细茵诱发的疾病、解剖学疾病、移植诱发的疾病、传导性疾病、血凝固障碍、神经肌肉障碍、血液病、低压病、内分泌失调、肺病、非恶性肿瘤、恶性肿瘤和妊娠诱发的疾病。
在上述每一个实施方案中，这种治疗有效的另一组特别重要的受试者是用心或肾相关疾病的标准治疗处理(例如治疗高血压或心力衰竭的单一治疗或联合治疗，包括施用一种或多种具有利尿剂、钙通道阻断剂、β-肾上腺素能受体阻断剂、α-阻断剂活性或具有RAAS拮抗剂活性的化合物(如ACE抑制剂或血管紧张素受体拮抗剂))基本难以治愈的受试者。当这些难以治愈的受试者证实难以控制或对环氧甾族化合物单一治疗的反应满意性不足时，该环氧甾族化合物能够与标准治疗(特别是施用一种ACE抑制剂，使用或不使用噻嗪化物)联合使用，以获得有益的结果。满意性不足的反应包括，例如，用血管紧张素II受体阻断剂(如洛沙坦)治疗，致使受试者的血压降低不到至少约4％，优选地至少约5％，更优选地至少约6％，和/或UACR进展。
环氧甾族化合物
本发明的方法使用的环氧甾族醛固酮拮抗剂化合物通常含有一个用环氧型部分取代的甾族核。术语“环氧型”部分包括特征在于含有一个氧原子作为两个碳原子之间的桥的任何部分，其实例包括下列部分：
Figure A0182394600461
环氧乙基                      1，3-环氧丙基                    1，2-环氧丙基
如在短语“环氧甾族”中使用的术语“甾族”是指由环戊烯菲部分提供的一个核，含有常规的“A“、“B”、“C”、“D”环。环氧型部分可以在任何可附着或可取代位置与环戊烯菲附着，即与甾体核的环之一融合，或者该部分可以在环***的环组件上被取代。短语“环氧甾族”包括含有与之附着的一个或多个环氧型部分的甾体核。
适于本发明使用的环氧甾族醛固酮拮抗剂包括含有与甾体核的“C”环融合的环氧部分的化合物家族。特别优选的是20-螺烷(spiroxane)化合物，其特征在于存在9α，11α-取代的环氧部分。以下表1中1-11列出的化合物是本方法中可以使用的说明性9α，11α-环氧甾族化合物。这些环氧类固醇可以用Grob等人，美国专利号4,559,332所述的方法制备。Ng等人的WO97121720和Ng等人的WO98/25948公开了制备9，11-环氧甾族化合物及其盐的其它方法。
表1：醛固酮受体拮抗剂
化合物                 结构                   名称
1     
Figure A0182394600471
-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-环氧-17-羟基-3-氧-，γ内酯，甲酯，(7α，11α，17β)-
2
Figure A0182394600472
孕-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-环氧-17-羟基-3-氧-，二甲酯，(7α，11α，17β)-
3
Figure A0182394600473
3’H-环丙烷[6，7]孕-4，6-二烯-21-羧酸，9，11-环氧-6，7-二氢-17-羟基-3-氧-，γ内酯，(6β，7β，11α，17β)-
化合物                  结构                   名称
4
Figure A0182394600481
孕-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-环氧-17-羟基-3-氧-，7-(1-甲基乙基)酯，一钾盐，(7α，11α，17β)-
5
Figure A0182394600482
孕-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-环氧-17-羟基-3-氧-，7-甲基乙基酯，一钾盐，(7α，11α，17β)-
6
Figure A0182394600483
3’H-环丙烷[6，7]孕-1，4，6-三烯-21-羧酸，9，11-环氧-6，7-二氢-17-羟基-3-氧-，γ内酯，(6β，7β，11α)-
化合物                   结构                        名称
7 3’H-环丙烷[6，7]孕-4，6-二烯-21-羧酸，9，11-环氧-6，7-二氢-17-羟基-3-氧-，甲酯，(6β，7β，11α，17β)-
8
Figure A0182394600492
3’H-环丙烷[6，7]孕-4，6-二烯-21-羧酸，9，11-环氧-6，7-二氢-17-羟基-3-氧-，一钾盐，(6β，7β，11α，17β)-
   9
Figure A0182394600493
3’H-环丙烷[6，7]孕-1，4，6-三烯-21-羧酸，9，11-环氧-6，7-二氢-17-羟基-3-氧-，γ内酯，(6β，7β，11α，17β)-
化合物               结构                名称
10 孕-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-环氧-17-羟基-3-氧-，γ内酯，乙酯，(7α，11α，17β)-
11 孕-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-环氧-17-羟基-3-氧-，γ内酯，1-甲基乙基酯，(7α，11α，17β)-
特别重要的是含有USAN命名的艾普利螺酮的化合物(也被称为epoxymexrenone)，它是如上所述的化合物1。艾普利螺酮是一种醛固酮受体拮抗剂，例如比螺内酯有更强的醛固酮受体特异性。在本发明中选择艾普利螺酮作为醛固酮拮抗剂将有助于减少某些副作用，如使用特异性较低的醛固酮拮抗剂引起的男子乳腺发育。
环氧甾族醛固酮受体拮抗剂的固态形式
选择的环氧甾族化合物能够以任何固态形式施用，可以是其自身的一种或多种固态形式，或者是含有一种或多种固态形式的艾普利螺酮的药物组合物形式。这些新型固态形式包括但不限于溶剂化的结晶形式、非溶剂化的结晶形式和非晶态形式。
在一个实施方案中，根据本发明的方法施用的环氧甾族化合物是一种非溶剂化的结晶形式的艾普利螺酮，其X-射线粉末衍射图样如表1A所示(在此称为“较高熔点多晶型”或“H型”)。
在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的方法施用的环氧甾族化合物是一种未溶剂化的结晶形式的艾普利螺酮，其X-射线粉末衍射图样如表1B所示(在此称为“较低熔点多晶型”或“L型”)。
在较低的温度下(即低于后面所述的互变转变温度的温度)，未配制的H型显示比例如未配制的L型更快的溶解速度(约快30％)。当艾普利螺酮在胃肠道中的溶解是艾普利螺酮向靶细胞输送的限速步骤时，较快的溶解通常导致生物利用性提高。因此，相对于L型，H型能够提供改善的生物利用度谱。另外，选择具有较快溶解速度的一种固态形式的艾普利螺酮，相对于具有较低溶解速度的其它固态形式，在立即释放的药物组合物的赋形剂选择和配制方面同样具有较大的灵活性。
在较低的温度下(即低于后面所述的互变转变温度的温度)，L型具有比例如H型更高的物理稳定性。不需要特殊加工或贮存条件，并且不需要频繁盘点交换(inventory replacement)的固态形式的艾普利螺酮，如L型，是希望的。例如，选择一种在生产过程(如艾普利螺酮的研磨，以获得颗粒大小变小、表面积增加的材料)中物理稳定的固态形式的艾普利螺酮，可能不需要特殊的加工条件和与这些特殊加工条件有关的成本增加。类似地，选择一种在不同贮存条件下(特别是考虑艾普利螺酮产物的存在期中可能的不同贮存条件)物理稳定的固态形式的艾普利螺酮，可能有助于避免能够导致产物丢失或产物效能衰减的艾普利螺酮的多晶型或其它降解改变。因此，选择固态形式的艾普利螺酮，如具有较高物理稳定性的L型，能够获得比稳定性较差的艾普利螺酮形式更有意义的好处。
在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的方法施用的艾普利螺酮是一种溶剂化的结晶形式的艾普利螺酮。优选地，溶剂化的结晶形式基本排除不是药学可接受的溶剂的溶剂。因为在室温和大气压下H型和L型一般比晶体溶剂合物物理稳定性更强，这些组合物中使用的溶剂化的结晶形式通常含有药学可接受的高沸点和/或氢键溶剂，例如但不限于丁醇。人们认为，溶剂化的结晶形式总体能够提供与H型和L型不同的一定范围的溶解速率，以及在艾普利螺酮在胃肠道中的溶解是艾普利螺酮向靶细胞输送的限速步骤时，提供不同的生物利用性。
在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的方法施用的艾普利螺酮是非晶态艾普利螺酮。可以假定，非晶态艾普利螺酮具有与H型和L型不同的溶解速率，当艾普利螺酮在胃肠道中的溶解是艾普利螺酮向靶细胞输送的限速步骤时，具有不同的生物利用性。
在另一个实施方案中，根据本发明的方法施用的艾普利螺酮是一种组合，包含第一种固态形式的艾普利螺酮和第二种固态形式的艾普利螺酮。第一种和第二种固态形式的艾普利螺酮通常选自H型、L型、溶剂化的艾普利螺酮和非晶态艾普利螺酮。这些组合还可含有其它固态形式的艾普利螺酮，用于制备例如具有不同溶解谱的药物组合物，包括控释组合物。第一种固态形式与第二种固态形式的重量比优选地至少约为1∶9，更优选地至少约1∶1，再更优选地至少约2∶1，再更优选地至少约5∶1，再更优选地至少约9∶1。
在另一个实施方案中，艾普利螺酮以药物组合物形式施用，其中组合物中所含的艾普利螺酮的总体含量以相纯的(phase pure)H型表示。
在另一个实施方案中，艾普利螺酮以药物组合物形式施用，其中组合物中所含的艾普利螺酮的总体含量以相纯的L型表示。
在另一个实施方案中，艾普利螺酮以药物组合物形式施用，其中组合物中所含的艾普利螺酮的总体含量以相纯的溶剂化结晶艾普利螺酮表示。
在另一个实施方案中，艾普利螺酮以药物组合物形式施用，其中组合物中所含的艾普利螺酮的总体含量以非晶态艾普利螺酮表示。
在另一个实施方案中，艾普利螺酮以药物组合物形式施用，其中该组合物含有第一种固态形式的艾普利螺酮和第二种固态形式的艾普利螺酮，第一种和第二种固态形式的艾普利螺酮选自H型、L型、溶剂化艾普利螺酮和非晶态艾普利螺酮。一般而言，第一种固态形式与第二种固态形式的重量比优选地至少约为1∶9，优选地约1∶1，更优选地至少约2∶1，更优选地至少约5∶1，再更优选地至少约9∶1。
在另一个实施方案中，艾普利螺酮以药物组合物形式施用，其中该组合物含有H型和L型两者。该组合物中L型与H型的含量比通常为1∶20至约20∶1。在其它实施方案中，例如，该比值为约10∶1至约1∶10；约5∶1至约1∶5；约2∶1至约1∶2；或约1∶1。
尽管上述每个实施方案都可能包括施用一种固态形式的艾普利螺酮，此艾普利螺酮颗粒大小范围较宽，但是已经发现选择固态形式的艾普利螺酮与缩小艾普利螺酮颗粒大小联合起来能够提高未配制的艾普利螺酮和含有这种固态形式的艾普利螺酮的药物组合物的生物利用性。
在其它这样的实施方案中，未配制的艾普利螺酮或在药物组合物中用作原材料的艾普利螺酮的D90颗粒大小一般小于约400微米，优选地小于约200微米，更优选地小于约150微米，再更优选地小于约100微米，再更优选地小于约90微米。在另一个实施方案中，D90颗粒大小为约40微米到约100微米。在另一个实施方案中，D90颗粒大小为约30微米到约50微米。在另一个实施方案中，D90颗粒大小为约50微米到约150微米。在另一个实施方案中，D90颗粒大小为约75微米到约125微米。
在另一个这样的实施方案中，未配制的艾普利螺酮或用作药物组合物中的原材料的艾普利螺酮的D90颗粒大小通常小于约15微米，优选地小于约1微米，更优选地小于约800nm，再更优选地小于约600nm，再更优选地小于约400nm。在另一个实施方案中，D90颗粒大小为约10nm到约1微米。在另一个实施方案中，D90颗粒大小为约100nm到约800nm。在另一个实施方案中，D90颗粒大小为约200nm到约600nm。在另一个实施方案中，D90颗粒大小为约400nm到约800nm。
颗粒大小小于约15微米的固态形式的艾普利螺酮能够按照本领域公知的适当颗粒大小缩小技术制备。这些技术包括但不限于美国专利5,145,684、5,318,767、5,384,124和5,747,001所述。美国专利5,145,684、5,318,767、5,384,124和5,747,001在此如完全详述的引用作为参考。例如，根据美国专利5,145,684的方法，适当大小的颗粒的制备方法是：将艾普利螺酮分散到一种液体分散介质中，在研磨介质存在下湿磨该混合物，使颗粒减小到希望的大小。如必要或有利时，颗粒能够在表面调节剂存在下减小大小。
固态的定义
术语“非晶态”当用于艾普利螺酮时是指一种固态，其中艾普利螺酮分子以混乱的排列存在，不形成可以辨别的晶格或单晶。当进行X-射线粉末衍射时，非晶态艾普利螺酮不产生任何特有的结晶峰。
当在该申请中提到一种物质或溶液的“沸点”时，术语“沸点”是指在适用的加工条件下该物质或溶液的沸点。
术语“结晶形式”当用于艾普利螺酮时是指一种固态形式，其中艾普利螺酮分子排列形成一种可以辨别的晶格，其(i)含有可以辨别的单晶，和(ii)当进行X-射线照射时产生衍射峰。
如本申请中使用的术语“结晶”是指结晶和/或再结晶，取决于与艾普利螺酮原材料制备有关的适用环境。
术语“消化”是指一个过程，其中固态艾普利螺酮在溶剂或溶剂混合物中的浆液，在适用的加工条件下，在该溶剂或溶剂混合物的沸点下加热。
如此处所用的术语“直接结晶”是指直接由适当的溶剂结晶艾普利螺酮，而没有中间物溶剂化结晶固态形式的艾普利螺酮的形成和去溶剂化。
如此处所用的术语“颗粒大小”是指用本领域公知的常规颗粒大小测量技术测量的颗粒大小，如激光散射、沉淀场流动分级分离(sedimentation field flow fractionation)、光子相关光谱学或圆盘离心。
术语“D90颗粒大小”是指用这些常规颗粒大小测量技术测量的至少90％的颗粒的大小。
术语“纯度”是指用常规HPLC测定法测定的艾普利螺酮的化学纯度。如此处所用的“低纯度艾普利螺酮”一般是指含有有效量的H型生长促进剂和/或L型生长抑制剂的艾普利螺酮。如此处所用的“高纯度艾普利螺酮”一般是指不合或含有不到有效量的H型生长促进剂和/或L型生长抑制剂的艾普利螺酮。
术语“相纯度”是指对于一种具体的结晶或非晶态形式的艾普利螺酮，用此处所述的红外光谱分析法测量的艾普利螺酮的固态纯度。
术语“XPRD”是指X-射线粉末衍射。
术语“Tm”是指熔解温度。
固态形式的表征
1.分子构象
单晶X-射线分析表明，H型与L型的艾普利螺酮分子构象不同，特别是关于类固醇环位点7的酯基团的方向。酯基团的方向能够用C8-C7-C23-02扭转角定义。
在H型晶格中，艾普利螺酮分子采取如下构象，其中酯的甲氧基大致与位点7处的C-H键排列，羰基大致位于B-类固醇环的中心之上。该构象的C8-C7-C23-02扭转角大约为-73.0°。以这种方向，酯基团的羰基氧原子(01)与9，11-环氧化物环的氧原子(04)密切接触。01-04距离约为2.97_，恰好低于3.0_的范德华力接触距离(假定氧的范德华力半径为1.5_)。
在L型晶格中，艾普利螺酮分子采取如下构象，其中相对于H型，酯基大约旋转150°，并且C8-C7-C23-02扭转角大约为+76.9°。以这种方向，酯的甲氧基指向A-类固醇环的4，5-烯烃片段。以这种方向，酯基团的任一氧原子(01，02)与9，11-环氧化物环的氧原子的距离大于H型中测定的距离。02-04距离约为3.04_，恰好高于范德华力接触距离。01-04距离约为3.45_。
艾普利螺酮分子似乎采取一种构象，迄今通过单晶X-射线衍射分析，这种构象是溶剂化结晶形式的L型所特有的。
2.X-射线粉末衍射
艾普利螺酮的不同结晶形式用Siemens D5000粉末衍射仪或Inel多用途衍射仪分析。对于Siemens D500粉末衍射仪，测得的原始数据是，2q值为2-50，步级为0.020，步级时间为2秒。对于Inel多用途衍射仪，将样品置于铝样品容器中，在全部两个θ值时同时采集原始数据30分钟。
表1A、1B和1C显示了主峰的重要参数，分别包括H型(通过消化低纯度艾普利螺酮获得的乙醇溶剂合物的去溶剂化制备)、L型(通过高纯度艾普利螺酮再结晶获得的丁酮溶剂合物的去溶剂化制备)和丁酮溶剂合物(通过高纯度艾普利螺酮在丁酮中的室温浆液转化制备)结晶形式的艾普利螺酮的2q值和强度(X-射线辐射，波长为1.54056埃)。
由于H型和L型的生产途径(即溶剂合物的去溶剂化)问题，晶体衍射平面间距不完美，这导致H型和L型的衍射图样中可能存在峰定位的微小改变。另外，H型从通过消化粗艾普利螺酮制备的溶剂合物中分离。该方法产生总体化学纯度较低(约90％)的H型。最后，由于晶格中溶剂通道内溶剂分子的迁移率提高，溶剂化形式的艾普利螺酮预期显示衍射峰定位有一定的偏移。
表1A：H型数据
角2-θ d-间距(埃) 强度 强度(％)
6.994 12.628 1188 7.2
8.291 10.655 2137 13
10.012 8.827 577 3.5
11.264 7.849 1854 11.3
12.04 7.344 7707 46.8
14.115 6.269 3121 19
14.438 6.13 15935 96.8
15.524 5.703 637 3.9
16.169 5.477 1349 8.2
16.699 5.305 1663 10.1
16.94 5.23 1692 10.3
17.147 5.167 2139 13
17.66 5.018 6883 41.8
17.91 4.949 16455 100
18.379 4.823 3106 18.9
18.658 4.752 1216 7.4
19.799 4.48 1499 9.1
20.235 4.385 383 2.3
21.707 4.091 1267 7.7
21.8 4.073 1260 7.7
21.959 4.044 1279 7.8
22.461 3.955 4264 25.9
23.191 3.832 1026 6.2
23.879 3.723 1000 6.1
24.599 3.616 1688 10.3
25.837 3.445 931 5.7
26.034 3.42 686 4.2
26.868 3.316 912 5.5
27.093 3.288 1322 8
27.782 3.209 1236 7.5
28.34 3.147 1845 11.2
28.861 3.091 957 5.8
29.866 2.9892 745 4.5
30.627 2.9166 992 6
31.108 2.8726 1205 7.3
33.215 2.6951 1287 7.8
33.718 2.656 802 4.9
34.434 2.6024 914 5.6
表1B：L型数据
角2-θ d-间距(埃)m 强度(Cps) 强度(％)
7.992 11.054 11596 26.6
10.044 8.799 12048 27.6
11.206 7.889 4929 11.3
12.441 7.109 1747 4
12.752 6.936 4340 9.9
13.257 6.673 2444 5.6
14.705 6.019 43646 100
15.46 5.727 2670 6.1
15.727 5.63 7982 18.3
16.016 5.529 3519 8.1
17.671 5.015 8897 20.4
17.9 4.951 2873 6.6
18.352 4.83 612 1.4
18.703 4.74 689 1.6
19.524 4.543 1126 2.6
20.103 4.413 3753 8.6
20.63 4.302 1451 3.3
21.067 4.214 876 2
21.675 4.097 2760 6.3
22.232 3.995 1951 4.5
22.652 3.922 1657 3.8
23.624 3.763 827 1.9
24.279 3.663 1242 2.8
25.021 3.556 5144 11.8
25.485 3.492 1702 3.9
25.707 3.463 2493 5.7
26.251 3.392 1371 3.1
26.85 3.318 1970 4.5
27.319 3.262 1029 2.4
27.931 3.192 440 1
27.969 3.187 440 1
28.937 3.083 1128 2.6
29.703 3.005 1211 2.8
30.173 2.9594 1506 3.5
30.584 2.9206 1602 3.7
30.885 2.8928 1550 3.6
31.217 2.8628 1068 2.4
31.605 2.8285 1038 2.4
32.059 2.7895 1211 2.8
32.64 2.7412 684 1.6
32.747 2.7324 758 1.7
33.46 2.6759 506 1.2
34.194 2.6201 1085 2.5
34.545 2.5943 915 2.1
表1C：丁酮数据
角2-θ d-间距(埃) 强度(Cps) 强度(％)
7.584 11.648 5629 32.6
7.753 11.393 15929 92.3
10.151 8.707 2877 16.7
11.31 7.817 701 4.1
12.646 6.994 1027 5.9
13.193 6.705 15188 88
13.556 6.526 14225 82.4
14.074 6.287 1966 11.4
14.746 6.002 2759 16
15.165 5.837 801 4.6
15.548 5.694 1896 11
17.031 5.202 7980 46.2
17.28 5.127 17267 100
17.706 5.005 6873 39.8
18.555 4.778 545 3.2
18.871 4.699 1112 6.4
19.766 4.488 1704 9.9
20.158 4.401 1396 8.1
20.725 4.282 2644 15.3
21.787 4.076 1127 6.5
22.06 4.026 451 2.6
22.864 3.886 1542 8.9
23.412 3.796 14185 82.2
23.75 3.743 1154 6.7
24.288 3.662 3063 17.7
 25.253 3.524 1318 7.6
25.503 3.49 1736 10.1
25.761 3.455 1225 7.1
26.176 3.402 1346 7.8
26.548 3.355 1098 6.4
27.357 3.257 1944 11.3
27.605 3.229 2116 12.3
27.9 3.195 858 5
28.378 3.142 583 3.4
28.749 3.103 763 4.4
29.3 3.046 1182 6.8
29.679 3.008 2606 15.1
30.402 2.9377 2184 12.6
30.739 2.9063 648 3.8
H型、L型和丁酮溶剂合物结晶形式的艾普利螺酮的X-射线衍射图样的图形实例分别在图1-A、1-B、1-C中显示。H型在7.0±0.2、8.3±0.2和12.0±0.2°2θ处显示可以辨别的峰。L型在8.0±0.2、12.4±0.2、12.8±0.2和13.3±0.2°2θ处显示可以区别峰。丁酮溶剂化的结晶形式在7.6±0.2、7.8±0.2和13.6±0.2°2θ处显示区别峰。
3.熔解/分解温度
非溶剂化的艾普利螺酮结晶形式的熔解/分解温度用TA仪器2920差示扫描量热计测量。每个样品(1-2mg)均置于密封的或开启的铝盘中，以10℃/分钟加热。熔解/分解范围定义为从延伸开始到最大熔解/分解吸热。
非溶剂化的晶体形式(H型和L型)的熔解与化学分解和晶格捕获的溶剂的丧失有关。熔解/分解温度也受分析前固体操作的影响。例如，通过从适当溶剂直接结晶，或者先由高纯度艾普利螺酮在适当溶剂或溶剂混合物中结晶获得溶剂合物，再使其去溶剂化制备的未研磨的L型(D90颗粒大小约为180-450微米)，具有约237-242℃的熔解范围。磨碎的L型(D90颗粒大小约为80-100微米)(L型的制备方法是：从高纯度艾普利螺酮在适当溶剂或溶剂混合物中的溶液中结晶一种溶剂合物，去溶剂化该溶剂合物，产生L型，研磨产生的L型)通常有较低的和较宽的熔解/分解范围，约223-234℃。通过消化低纯度艾普利螺酮获得溶剂合物，使其去溶剂化制备的未研磨的H型(D90颗粒大小约为180-450微米)通常具有较高的熔解/分解范围，约为247-251℃。图2-A、2-B、2-C、2-D中分别给出了DSC温谱图的例子：(a)直接从丁酮中结晶的未研磨的L型，(b)高纯度艾普利螺酮从丁酮中结晶获得一种溶剂合物，使其去溶剂化制备的未研磨的L型，(c)高纯度艾普利螺酮从丁酮中结晶获得一种去溶剂化的溶剂合物，将其研磨制备的L型，和(d)从丁酮中消化低纯度艾普利螺酮获得一种溶剂合物，使其去溶剂化制备的未研磨的H型。
溶剂化形式的艾普利螺酮的DSC热谱图用PerkinElmer Pyris 1差示扫描量热计测定。每个样品(1-10mg)均置于开启的铝盘中，以10℃/分钟加热。低温下的一个或多个吸热事件与溶剂合物晶格中失去溶剂时发生的焓的改变有关。最高温度吸热与L型或H型艾普利螺酮的熔解/分解有关。
4.红外吸收光谱法
非溶剂化形式的艾普利螺酮(H型和L型)的红外吸收光谱用Nicolet DRIFT(扩散反射红外傅立叶变换)Magna System 550分光光度计获得。使用一个Spectra-Tech收集***和一个微量样品杯。样品(5％)在溴化钾中分析，以400-4000cm-1扫描。艾普利螺酮在稀释氯仿溶液(3％)或溶剂化晶体形式中的红外吸收光谱用Bio-rad FTS-45分光光度计获得。氯仿溶液样品用具有氯化钠盐板的0.2mm径长的溶液单元分析。溶剂合物FTIR光谱用IBM micro-MIR(多内部反射)附件收集。样品以400-4000cm-1扫描。图3-A、3-B、3-C、3-D中分别显示了红外吸收光谱的例子：(a)H型，(b)L型，(c)丁酮溶剂合物，和(d)艾普利螺酮氯仿溶液。
表2显示了H型、L型和丁酮溶剂化晶体形式的艾普利螺酮的说明性吸收带。为了进行比较，也显示了艾普利螺酮氯仿溶液的说明性吸收带。例如，在光谱的羰基区观察到H型与L型或丁酮溶剂合物之间的不同。H型有一个约1739cm-1的酯羰基延伸，而L型和丁酮溶剂合物分别有大约1724和1722cm-1的相应的延伸。在艾普利螺酮氯仿溶液中，酯羰基延伸在大约1727cm-1处发生。H型与L型之间酯羰基延伸频率的改变反映了两种晶体形式之间酯基团方向的改变。另外，A-类固醇环中共轭的酮的酯延伸从H型或丁酮溶剂合物中的大约1664-1667cm-1变换为L型中的大约1655cm-1。相应的羰基延伸在稀释溶液中在大约1665cm-1处发生。
在C-H弯曲区中看到H型与L型之间的另外一个不同。H型在大约1399cm-1处有吸收，在L型、丁酮溶剂合物或艾普利螺酮氯仿溶液中未观察到。1399cm-1延伸在与邻近羰基的C2和C21亚甲基成剪刀状的CH2区中发生。
表2
  吸光度区   H型(cm-1)   L型(cm-1)   丁酮溶剂合物(cm-1)   艾普利螺酮氯仿溶液(cm-1)
νC＝O(内酯) 1773  1775  1767  1768
νC＝O(酯) 1739  1724  1722  1727
νC＝O(3酮) 1664  1655  1667  1665
νC＝C(3，4-烯烃) 1619  1619  1622  1623
δasCH3，δCH2，δCH2(α-羰基) 1460，1444，1426  1467，1438，1422，1399  1467，1438，1422  1464，1438，1422
δsCH3 1380  1381  ～1380  1378
5.核磁共振
13C NMR谱在31.94MHz电场中获得。图4和图5分别显示H型和L型艾普利螺酮的13C NMR谱。为了获得图4反映的数据而分析的H型艾普利螺酮不是相纯的，包含少量的L型艾普利螺酮。根据大约64.8ppm、24.7ppm和19.2ppm处的碳共振能够最清楚地辨别H型。根据大约67.1ppm和16.0ppm处的碳共振能够最清楚地辨别L型。
6.热重分析法
溶剂合物的热重分析用TA Instruments TGA 2950热重分析仪进行。样品在氮清除(nitrogen purge)下置于开启的铝盘中。起始温度为25℃，温度以大约10℃/分钟的速度升高。图6-A显示丁酮溶剂合物的热重分析谱的一个例子。
7.单晶参数
下面的表3A、3B、3C总结了测定的H型、L型和几种溶剂化结晶形式的单晶参数。
表3A
参数  H型  L型 丁酮溶剂合物
晶体***  斜方晶  单斜晶  斜方晶
空间基团  P212121  P21  P212121
a  21.22_  8.78_  23.53_
b  15.40_  11.14_  8.16_
c  6.34_  11.06_  13.08_
α  90°  90°  90°
β  90°  93.52°  90°
γ  90°  90°  90°
Z  4  2  4
体积(_)  2071.3  1081.8  2511.4
ρ(计算值)  1.329g/cm3  1.275g/cm3  1.287g/cm3
R  0.0667  0.062  0.088
表3B
参数  丙酮溶剂合物  甲苯溶剂合物  乙酸丁酯溶剂合物1
晶体***  斜方晶  斜方晶  斜方晶
空间基团  P212121  P212121  P212121
a  23.31_  23.64_  23.07_
b  13.13_  13.46_  13.10_
c  8.28_  8.16_  8.24_
α  90°  90°  90°
β  90°  90°  90°
γ  90°  90°  90°
Z  4  4  4
体积(_)  2533.7  2596.6  2490.0
ρ(计算值)  1.239g/cm3  1.296g/cm3  1.334g/cm3
R  0.058  0.089  0.093
1由于通道中溶剂分子的混乱，溶剂合物分子未完全精炼。
表3C
参数  乙酸异丁酯溶剂合物1  异丙醇溶剂合物1  乙醇溶剂合物1
晶体***  斜方晶  斜方晶  斜方晶
空间基团  P212121  P212121  P212121
a  23.19_  23.15_  23.51_
b  12.95_  12.73_  13.11_
c  8.25_  8.25_  8.27_
α  90°  90°  90°
β  90°  90°  90°
γ  90°  90°  90°
Z  4  4  4
体积(_)  2476.4  2433.2  2548.6
ρ(计算值)  1.337g/cm3  1.296g/cm3  1.234g/cm3
R  0.098  0.152  0.067
1由于通道中溶剂分子的混乱，溶剂合物分子未完全精炼。
关于所选溶剂化结晶形式的艾普利螺酮的其它信息在下面的表4中报告。以上表3A报告的关于丁酮溶剂合物的单晶数据也代表许多其它艾普利螺酮结晶溶剂合物的单晶参数。检测的大多数艾普利螺酮结晶溶剂合物基本上彼此结构相同。由于掺入的溶剂分子的大小，X-射线粉末衍射峰可能从一种溶剂化的结晶形式向另一种微小位移，而检测的大多数溶剂合物的总体衍射图样基本相同，单晶参数和分子位置基本相同。
表4
    溶剂 化学计量(溶剂∶艾普利螺酮) 与丁酮溶剂合物结构相同？ 去溶剂化温度1(℃)
    丁酮     1∶1     N/A     89
    2-戊酮     ---     ---     ---
    乙酸     1∶2     是     203
    丙酮     1∶1     是     117
    乙酸丁酯     1∶2     是     108
    氯仿     ---     是     125
    乙醇     1∶1     是     166
    异丁醇     ---     ---     ---
    乙酸异丁酯     1∶2     是     112
    异丙醇     1∶1     是     121
    乙酸甲酯     1∶1     是     103
    丙酸乙酯     1∶1     是     122
    正丁醇     1∶1     是     103
    正辛醇     ---     是     116
    正丙醇     1∶1     是     129
    乙酸丙酯     1∶1     是     130
    丙二醇     ---     是     188
    叔丁醇     ---     ---     ---
    四氢呋喃     1∶1     是     136
    甲苯     1∶1     是     83
    乙酸叔丁酯     ---     是     109
1定义为由最后溶剂失重步骤推断的去溶剂化温度，在氮清除下以10℃/分钟的加热速度，通过热重分析测定。然而，溶剂合物的生产方法能够影响去溶剂化温度。不同方法能够产生不同数量的核化位点，这些位点能够在较低温度下启动溶剂合物中的去溶剂化。
溶剂合物的单晶由4个艾普利螺酮分子组成。单晶中艾普利螺酮分子和溶剂分子的化学计量也在以上关于大量溶剂合物的表4中报告。H型的单晶由4个艾普利螺酮分子组成。L型的单晶由2个艾普利螺酮分子组成。当艾普利螺酮分子变换及旋转以填充溶剂分子留下的空隔时，溶剂合物单晶在去溶剂化过程中转变为H型和/或L型单晶。表4也报告了大量不同溶剂合物的去溶剂化温度。
8.杂质分子的晶体性质
在溶剂合物的去溶剂化过程中，艾普利螺酮中选择的杂质能够诱发H型的形成。具体而言，评价了下列两种杂质分子的作用：7-甲基氢4α，5α：9α，11α-二环氧-17-羟基-3-氧-17α-孕烷-7α，21-二羧酸，γ-内酯3(“二环氧化物”)；7-甲基氢11α，12α-环氧-17-羟基-3-氧-17α-孕4-烯-7α，21-二羧酸，γ-内酯4(“11，12-环氧化物”)。
这些杂质分子对去溶剂化产生的艾普利螺酮结晶形式的影响在本申请的实施例中更详细地描述。
假设7-甲基氢17-羟基-3-氧-17α-孕-4，9(11)-二烯-7α，21-二羧酸，γ-内酯5(“9，11-烯烃”)与H型的单晶结构具有相似性，可以猜测，9，11-烯烃在溶剂合物去溶剂化过程中也能诱导H型的形成。
二环氧化物11，12-烯烃和9，11-烯烃能够分别如Ng等人的WO98/25948的实施例47C、47B和37H所述制备。
分离每种杂质化合物的单晶形式。图7、8、10分别显示分离的二环氧化物11，12-环氧化物和9，11-烯烃的晶体形式的典型X-射线粉末衍射图样。每种杂质分子的X-射线粉末衍射图样类似于H型的X-射线粉末衍射图样，提示H型和这三种杂质化合物具有类似的单晶结构。
也分离每种杂质化合物的单晶，进行X-射线结构检查，以证实这三种化合物采取与H型相似的单晶结构。二环氧化物的单晶从丁酮中分离。11，12-环氧化物的单晶从异丙醇中分离。9，11-烯烃的单晶从正丁醇中分离。表5显示测定的每种杂质化合物的结晶形式的晶体结构数据。获得的晶体***和单元参数与H型、二环氧化物、11，12-环氧化物和9，11-烯烃结晶形式基本相同。
表5
  参数   H型   二环氧化物   11，12-环氧化物   9，11-烯烃
  晶体***   斜方晶   斜方晶   斜方晶   斜方晶
  空间基团   P212121   P212121   P212121   P212121
  A   21.22_   21.328_   20.90_   20.90_
  B   15.40_   16.16_   15.55_   15.74_
  C   6.34_   6.15_   6.38_   6.29_
  α   90°   90°   90°   90°
  β   90°   90°   90°   90°
  γ   90°   90°   90°   90°
  Z   4   4   4   4
  体积(_)   2071.3   2119.0   2073.2   2069.3
  ρ(计算值)   1.329g/cm3   1.349g/cm3   1.328g/cm3   1.279g/cm3
  R   0.0667   0.0762   0.0865   0.0764
表5报告的4种化合物结晶成相同的空间群，具有类似的单元参数(即它们结构相同)。可以假设，二环氧化物、11，12-环氧化物和9，11-烯烃采取H型的构象。对于每种杂质化合物，H型包装的分离(直接从溶液中分离)相对容易，表明H型晶格是这一系列结构相似的化合物的一种稳定的包装模式。
艾普利螺酮的制备
用来制备本发明的新型结晶形式的艾普利螺酮原材料能够用Ng等人的WO97/21720和Ng等人的WO98/25948所述的方法制备，具体而言是WO97/21720和WO98/25948所述的方案1。
结晶形式的制备
1.溶剂化结晶形式的制备
艾普利螺酮的溶剂化结晶形式能够通过艾普利螺酮从适当的溶剂或适当的溶剂混合物中结晶制备。适当的溶剂或适当的溶剂混合物一般包括一种有机溶剂或有机溶剂混合物，它在温度升高时溶解艾普利螺酮以及所有杂质，但是在冷却后优先使该溶剂合物结晶。在室温下，艾普利螺酮在这些溶剂或溶剂混合物中的溶解度一般为约5mg/mL-约200mg/mL。该溶剂或溶剂混合物优选地选自以前在该方法中用来制备艾普利螺酮原材料的溶剂，如果包含于含有艾普利螺酮结晶形式的终药物组合物中，具体地是药学可接受的溶剂。例如，一种含二氯甲烷的溶剂***通常是不希望的，它产生含有二氯甲烷的溶剂合物。
使用的每种溶剂优选地是一种药学可接受的溶剂，具体的是如“杂质：残余溶剂指南”所述的2类或3类溶剂，国际人用药品注册技术要求协调会(International Conference On Harmonisation Of TechnicalRequirements For Registration Of Pharmaceuticals For HumanUse)(ICH指导委员会在1997年7月17日为ICH方法第4步推荐的)(Recommended for Adoption at Step 4 of the ICH Process on July17，1997 by the ICH Steering Committee)。再更优选地，该溶剂或溶剂混合物选自：丁酮、1-丙醇、2-戊酮、乙酸、丙酮、乙酸丁酯、氯仿、乙醇、异丁醇、乙酸异丁酯、乙酸甲酯、丙酸乙酯、正丁醇、正辛醇、异丙醇、乙酸丙酯、丙二醇、叔丁醇、四氢呋喃、甲苯、甲醇和乙酸叔丁酯。再更优选地，该溶剂选自丁酮和乙醇。
为了制备艾普利螺酮的溶剂化结晶形式，一定量的艾普利螺酮原材料溶解于一定体积的溶剂中，冷却，直到晶体形成。向溶剂中加入艾普利螺酮时的溶剂温度通常根据该溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线选择。对于此处所述的大多数溶剂，溶剂温度一般至少约25℃，优选地从约30℃到该溶剂的沸点，更优选地从该溶剂沸点以下约25℃到该溶剂的沸点。
此外，也可以将热溶剂加入到艾普利螺酮中，冷却混合物直到晶体形成。向艾普利螺酮中添加时的溶剂温度通常根据该溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线选择。对于此处所述的大多数溶剂，例如，溶剂温度一般至少约25℃，优选地从约50℃到该溶剂的沸点，更优选地从该溶剂沸点以下约15℃到该溶剂的沸点。
与一定体积的溶剂混合的艾普利螺酮原材料的量同样取决于该溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线。一般而言，添加到溶剂中的艾普利螺酮在室温下不完全溶解于该体积的溶剂中。对于此处所述的大多数溶剂，例如，与一定体积溶剂混合的艾普利螺酮原材料的量通常是室温下在该体积溶剂中溶解的艾普利螺酮量的至少约1.5-约4.0倍，优选地约2.0-约3.5倍，更优选地约2.5倍。
在艾普利螺酮原材料完全溶解于溶剂中后，溶液一般缓慢冷却，使艾普利螺酮的溶剂化结晶形式结晶。对于此处所述的大多数溶剂，例如，该溶液的冷却速度慢于约20℃/分钟，优选地约10℃/分钟或更慢，更优选地约5℃/分钟或更慢，再更优选地约1℃/分钟或更慢。
收获溶剂化结晶形式的终点温度取决于溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线。对于此处所述的大多数溶剂，例如，终点温度一般低于约25℃，优选地低于约5℃，更优选地低于约-5℃。降低终点温度通常有利于溶剂化结晶形式的形成。
此外，也可以利用其它技术制备溶剂合物。这些技术的例子包括但不限于：(i)在一种溶剂中溶解艾普利螺酮原材料，并添加一种辅助溶剂，帮助溶剂化结晶形式的结晶，(ii)溶剂合物的蒸汽扩散生长，(iii)通过蒸发分离溶剂合物，如旋转蒸发，和(iv)浆液转化。
利用任何合适的常规方法，如过滤或离心，能够将如上所述制备的溶剂化结晶形式的晶体与溶剂分离。在结晶过程中增加溶剂***的搅拌通常使晶体颗粒大小较小。
2.由溶剂合物制备L型
L型艾普利螺酮能够由溶剂化结晶形式通过去溶剂化直接制备。去溶剂化能够用任何合适的去溶剂化方法实现，例如但不限于加热溶剂合物，降低溶剂合物周围的压力，或这些方法的组合。如果为了除去溶剂加热溶剂合物，例如在烘箱中加热，则该过程中溶剂合物的温度一般不超过H型和L型的互变转变温度。该温度优选地不超过约150℃。
去溶剂化压力和去溶剂化时间不是非常关键。去溶剂化压力优选地约为1个大气压或更低。然而，当去溶剂化压力降低时，能够进行去溶剂化时的温度降低，并且/或者去溶剂化的时间同样缩短。特别是对于具有较高去溶剂化温度的溶剂合物，在真空下干燥将允许使用较低的干燥温度。去溶剂化时间仅仅需要足以完成去溶剂化，从而完成L型的形成。
为了确保基本含有所有L型的产物的制备，艾普利螺酮原材料一般是高纯度的艾普利螺酮，优选地是基本上纯的艾普利螺酮。用来制备L型艾普利螺酮的艾普利螺酮原材料的纯度通常至少为90％，优选地至少95％，更优选地至少99％。如本申请其它部分详述，艾普利螺酮原材料中的某些杂质能够不利地影响该方法获得的产物的产量和L型含量。
用该方法由高纯度艾普利螺酮原材料制备的结晶艾普利螺酮产物通常含有至少10％的L型，优选地至少50％的L型，更优选地至少75％的L型，再更优选地至少90％的L型，再更优选地至少约95％的L型，再更优选地基本上为相纯的L型。
3.由溶剂合物制备H型
一种含有H型的产物能够用与如上所述制备L型的方法相同的方法制备，包括：(i)使用低纯度艾普利螺酮原材料代替高纯度艾普利螺酮原材料，(ii)用相纯的H型晶体对该溶剂***引晶，或(iii)(i)和(ii)的组合。
A.杂质作为生长促进剂和抑制剂的用途
艾普利螺酮原材料中所选杂质的存在和含量，而不是艾普利螺酮原材料中所有杂质的总量，影响溶剂合物去溶剂化过程中H型晶体形成的可能。所选择的杂质通常是H型生长促进剂或L型生长抑制剂。它可包含于艾普利螺酮原材料中，在加入艾普利螺酮原材料之前包含于溶剂或溶剂混合物中，和/或在加入艾普利螺酮原材料之后加入溶剂或溶剂混合物中。Bonafede等人：J Amer Chem Soc 1995；117：30描述了生长促进剂和生长抑制剂在多晶型***中的用途，在此引用作为参考。对于本发明，杂质通常包括单晶结构与H型的单晶结构基本相同的一种化合物。该杂质优选地是X-射线粉末衍射图样与H型的X-射线粉末衍射图样基本相同的一种化合物，更优选地选自二环氧化物、11，12-环氧化物、9，11-烯烃及其组合。
制备H型晶体所需的杂质的量一般部分取决于溶剂或溶剂混合物和杂质相对于艾普利螺酮的溶解度。在H型从丁酮溶剂中结晶的过程中，例如，二环氧化物与低纯度艾普利螺酮原材料的重量比一般为至少约1∶100，优选地至少约3∶100，更优选地约3∶100-约1∶5，再更优选地约3∶100-约1∶10。11，12-环氧化物在丁酮中的溶解度高于二环氧化物，制备H型晶体通常需要大量的11，12-环氧化物。当杂质含有11，12-环氧化物时，二环氧化物与低纯度艾普利螺酮原材料的重量比至少约为1∶5，更优选地至少约3∶25，再更优选地约3∶25-约1∶5。当H型的制备中使用二环氧化物和11，12-环氧化物杂质时，每种杂质与艾普利螺酮原材料的重量比可低于在H型晶体制备中只使用该杂质时的相应比值。
当含有所选杂质的溶剂合物去溶剂化时，通常获得H型和L型的混合物。在溶剂合物最初去溶剂化产生的产物中，H型的重量分数一般低于约50％。如下所述，通过结晶或消化进一步处理该产物，通常可提高产物中L型的重量分数。
引晶
H型晶体也能如下制备：在艾普利螺酮结晶之前，用相纯的H型晶体(或如上所述的H型生长促进剂和/或L型生长抑制剂)对溶剂***引晶。艾普利螺酮原材料可以是低纯度艾普利螺酮或高纯度艾普利螺酮。当由任一种原材料制备的溶剂合物去溶剂化时，产物中H型的重量分数一般为至少约70％，可高达约100％。
加到溶剂***中的H型晶种与加到溶剂***中的艾普利螺酮原材料的重量比通常为至少约0.75∶100，优选地约0.75∶100-约1∶20，更优选地约1∶100-约1∶50。H型晶种能够用本申请中关于制备H型晶体所述的任何方法制备，特别是如下所述通过消化制备H型晶体。
H型晶种可以一次、多次或在一段时间内基本上连续地加入。然而，H型晶种的添加通常在艾普利螺酮开始从溶液中结晶之前完成，即引晶在达到浊点(亚稳区的下端)之前完成。一般在溶液温度为浊点以上约0.5℃到浊点以上约10℃，优选地在浊点以上约2℃-约3℃时进行引晶。当加入晶种时的浊点以上的温度升高时，H型晶体结晶所需的引晶量通常增加。
引晶优选地不仅在浊点以上发生，而且可在亚稳区内发生。浊点和亚稳区均取决于溶剂或溶剂混合物中艾普利螺酮的溶解度和浓度。例如，对于12倍体积稀释的丁酮，亚稳区的上端通常为约70℃-约73℃，亚稳区的下端(即浊点)为约57℃-63℃。对于8倍体积浓度的丁酮，亚稳区甚至更窄，因为溶液过饱和。在此浓度下，溶液的浊点在约75℃-约76℃时出现。因为在环境条件下丁酮的浊点约为80℃，该溶液的引晶一般在约76.5℃-沸点时发生。
以下实施例C-7描述了用H型引晶的一个说明性非限制性实施例。
用H型生长促进剂或L型生长抑制剂和/或H型引晶获得的结晶艾普利螺酮产物通常含有至少2％的H型，优选地至少5％的H型，更优选地至少7％的H型，再更优选地至少约10％的H型。其余的结晶艾普利螺酮产物一般是L型。
通过研磨艾普利螺酮制备的H型
在另一个备选方案中，已经发现通过适当研磨艾普利螺酮能够制备少量的H型。发现研磨的艾普利螺酮中的H型浓度高达约3％。
4.由低纯度艾普利螺酮制备的溶剂合物制备L型
如上所述，低纯度艾普利螺酮结晶形成一种溶剂合物，随后该溶剂合物去溶剂化，通常产生一种含有H型和L型的产物。含有更高L型含量的产物能够用与以上关于制备H型所述基本相同的方法用低纯度艾普利螺酮制备，包括用相纯的L型晶体对溶剂***进行引晶，或者使用L型生长促进剂和/或H型生长抑制剂。引晶方案和添加到溶剂***中的L型晶种含量与添加到溶剂***中的艾普利螺酮原材料含量的重量比通常类似于以上关于通过用相纯的H型晶体引晶制备H型艾普利螺酮所述的重量比。
用这种方法制备的结晶艾普利螺酮产物通常含有至少10％的L型，优选地至少50％的L型，更优选地至少75％的L型，更优选地至少90％的L型，再更优选地至少约95％的L型，再更优选地基本相纯的L型。
本节和以上关于H型艾普利螺酮制备的章节描述的引晶方案也可改善结晶艾普利螺酮颗粒大小的控制。
5.L型直接从溶液中结晶
也能够通过艾普利螺酮直接从适当溶剂或溶剂混合物中结晶制备L型艾普利螺酮，不需要形成中间溶剂合物，也不需要去溶剂化。一般而言，(i)溶剂的分子大小与溶剂合物晶格中的可用通道间隙不相容，(ii)在升高的温度下，艾普利螺酮和任何杂质在该溶剂中可溶，和(iii)在冷却后，导致非溶剂化L型艾普利螺酮结晶。在室温下，艾普利螺酮在溶剂或溶剂混合物中的溶解度通常为约5mg/mL-约200mg/mL。该溶剂或溶剂混合物优选地含有一种或多种溶剂，选自：甲醇、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙腈、硝基苯、水和乙基苯。
为了直接从溶液中结晶L型艾普利螺酮，一定量的艾普利螺酮原材料溶解于一定体积的溶剂中，冷却，直到晶体形成。向溶剂中加入艾普利螺酮时的溶剂温度通常根据该溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线选择。例如，对于此处所述的大多数溶剂，溶剂温度一般至少约25℃，优选地从约30℃到该溶剂的沸点，更优选地从该溶剂沸点以下约25℃到该溶剂的沸点。
此外，也可以向艾普利螺酮中加入热溶剂，冷却该混合物，直到晶体形成。向溶剂中加入艾普利螺酮时的溶剂温度通常根据该溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线选择。例如，对于此处所述的大多数溶剂，溶剂温度一般至少约25℃，优选地从约50℃到该溶剂的沸点，更优选地从该溶剂沸点以下约15℃到该溶剂的沸点。
与一定体积溶剂混合的艾普利螺酮原材料的量同样取决于该溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线。一般而言，添加到溶剂中的艾普利螺酮的量在室温下不完全溶解于该体积的溶剂中。例如，对于此处所述的大多数溶剂，与一定体积溶剂混合的艾普利螺酮原材料的量通常是室温下在该体积溶剂中溶解的艾普利螺酮的量的至少约1.5-约4.0倍，优选地约2.0-约3.5倍，更优选地约2.5倍。
为了确保制备含有基本相纯的L型的产物，艾普利螺酮原材料一般是高纯度的艾普利螺酮。艾普利螺酮原材料的纯度优选地至少为65％，更优选地至少90％，再更优选地至少98％，再更优选地至少99％。
在艾普利螺酮原材料完全溶解于溶剂后，该溶液一般缓慢冷却，使艾普利螺酮的溶剂化结晶形式结晶。例如，对于此处所述的大多数溶剂，该溶液的冷却速度慢于约1.0℃/分钟，优选地约0.2℃/分钟或更慢，更优选地约5℃/分钟-约0.1℃/分钟。
收获L型晶体时的终点温度取决于溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线。例如，对于此处所述的大多数溶剂，终点温度一般低于约25℃，优选地低于约5℃，更优选地低于约-5℃。
此外，也可以利用其它技术制备L型晶体。这些技术的例子包括但不限于：(i)在一种溶剂中溶解艾普利螺酮原材料，并添加一种辅助溶剂，帮助L型艾普利螺酮结晶，(ii)L型艾普利螺酮的蒸汽扩散生长，(iii)通过蒸发分离L型艾普利螺酮，如旋转蒸发，和(iv)浆液转化。
利用任何合适的常规方法，如过滤或离心，能够将如上所述制备的溶剂化结晶形式的晶体与溶剂分离。
另外，L型艾普利螺酮也能如下制备：消化(如下文所述)高纯度艾普利螺酮在丁酮中的浆液，在浆液的沸点下过滤消化的艾普利螺酮。
6.从溶液中直接制备H型
可以假定，如果在H型和L型的互变转变温度(Tt)以上进行结晶，特别是如果存在H型生长促进剂或L型生长抑制剂，或用相纯的H型晶体对溶剂引晶，H型应当直接从溶液中结晶，因为H型在这些更高的温度下更稳定。使用的溶剂***优选地含有高沸点溶剂，如硝基苯。合适的H型生长促进剂包括但不限于二环氧化物和11，12-烯烃。
7.用一种溶剂消化艾普利螺酮
艾普利螺酮的溶剂化结晶形式、H型和L型也能够通过在适当溶剂或溶剂混合物中消化艾普利螺酮原材料制备。在消化过程中，艾普利螺酮浆液在溶剂或溶剂混合物的沸点下加热。例如，一定量的艾普利螺酮原材料与一定体积的溶剂或溶剂混合物混合，加热至回流，除去馏出物，在除去馏出物的同时加入另外的量的溶剂。此外，馏出物也能够浓缩并再循环，在消化过程中不添加更多的溶剂。一般而言，一旦最初体积的溶剂被除去或浓缩并再循环，即冷却浆液，形成溶剂化晶体。通过任何合适的常规方法，如过滤或离心，溶剂化晶体能够与溶剂分离。根据溶剂化晶体中是否存在所选的杂质，如上所述的溶剂合物的去溶剂化产生H型或L型艾普利螺酮。一种合适的溶剂或溶剂混合物通常含有此处所述的一种或多种溶剂。例如，该溶剂可以选自丁酮和乙醇。
向消化过程中使用的溶剂中加入的艾普利螺酮原材料的量通常足以在溶剂或溶剂混合物的沸点下保持浆液(即溶剂或溶剂混合物中的艾普利螺酮不完全溶解)。说明性数值包括但不限于：每4mL丁酮约1克艾普利螺酮，每8mL乙醇约1克艾普利螺酮。
一旦溶剂更换完成，通常即缓慢冷却该溶液，以结晶艾普利螺酮的溶剂化结晶形式。例如对于检测的溶剂，溶液的冷却速度慢于约20℃/分钟，优选地约10℃/分钟或更慢，更优选地约5℃/分钟或更慢，再更优选地约1℃/分钟或更慢。
收获溶剂化结晶形式时的终点温度取决于溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线。例如，对于此处所述的大多数溶剂，终点温度一般低于约25℃，优选地低于约5℃，更优选地低于约-5℃。
如果主要含有或仅仅含有L型的产物是希望的，一般消化高纯度艾普利螺酮原材料。高纯度艾普利螺酮原材料的纯度优选地为至少98％纯，更优选地至少99％纯，再更优选地至少99.5％纯。用这种方法制备的消化的艾普利螺酮产物通常含有至少10％的L型，优选地至少50％的L型，更优选地至少75％的L型，更优选地至少90％的L型，再更优选地至少约95％的L型，再更优选地基本相纯的L型。
如果主要含有或仅仅含有H型的产物是希望的，一般消化低纯度艾普利螺酮原材料。当需要产生H型时，低纯度艾普利螺酮原材料通常仅含有H型生长促进剂和/或L型生长抑制剂。优选地，低纯度艾普利螺酮原材料的纯度为至少65％纯，更优选地至少75％纯，再更优选地至少80％纯。用这种方法制备的消化的艾普利螺酮产物通常含有至少10％的H型，优选地至少50％的H型，更优选地至少75％的H型，更优选地至少90％的H型，再更优选地至少约95％的H型，再更优选地基本相纯的H型。
8.非晶态艾普利螺酮的制备
通过适当粉碎固态，如压碎、研磨和/或微粉化，能够小量制备非晶态艾普利螺酮。相纯的非晶态艾普利螺酮例如能够通过冻干艾普利螺酮溶液，特别是艾普利螺酮水溶液制备。这些方法在下文实施例C-13和C-18中说明。
剂量和处理方案
施用的醛固酮拮抗剂的量和本发明的方法的剂量方案取决于多种因素，包括：年龄、体重、性别和受试者的医学状况、致病作用的严重程度、给药途径和频率和使用的具体醛固酮拮抗剂，因而可能广泛不同。对受试者施用的每日剂量，约0.001-30mg/kg体重，优选地约0.005-约20mg/kg体重，更优选地约0.01-约15mg/kg体重，再更优选地约0.05-约10mg/kg体重，最优选地约0.01-5mg/kg体重可能是合适的。对人类受试者施用的醛固酮拮抗剂的量一般是约0.1-2000mg，优选地约0.5-500mg，再更优选地约0.75-250mg，再更优选地约1-100mg。本发明具体包括在受试者中不产生严重利尿剂和/或抗高血压效应的醛固酮拮抗剂的每日剂量。每日剂量能够以每日1-4次施用。
醛固酮拮抗剂的剂量能够根据血压测量或适当的替代标记物(如钠尿肽、内皮素和如下文所述的其它替代标记物)确定及调节。施用醛固酮拮抗剂之后的血压和/或替代标记物水平能够与施用醛固酮拮抗剂之前的相应基线水平相比较，以确定本方法的效能，并在需要时滴定。在该方法中有用的主要替代标记物是肾脏和心血管疾病的替代标记物。
通常，细胞内钠水平升高的个体(特别是盐敏感的和/或高钠摄取的人类受试者)中醛固酮的致病性程度和根据本发明的环氧甾族化合物的最初适当剂量取决于致病性的存在。因此，首先评价个体的高血压、微血管功能障碍和与微血管功能障碍有关的疾病。这些疾病包括肾病和心脏病、神经病和视网膜病。
预防剂量
特别是当受试者在水平升高的钠的存在下易患一种或多种由醛固酮介导的致病作用时，在该致病作用诊断之前预防性地施用醛固酮拮抗剂是有利的，在受试者易患该致病作用期间连续施用醛固酮拮抗剂也是有利的。因此能对没有明显临床表现但是易患致病作用的个体施以预防剂量的环氧甾族化合物。醛固酮拮抗剂的这种预防剂量可能，但不是必须低于用来治疗具体目的致病作用的剂量。
高血压剂量
为了治疗盐敏感的和/或高钠摄取的人类受试者的高血压，首先根据血压测量(坐位袖带水银血压计)确定个体是血压正常的、临界高血压还是高血压。例如，当收缩期血压和舒张期血压分别低于125mmHg和低于80mmHg时，可以认为个体血压正常；当收缩期血压和舒张期血压分别为约125-140mmHg和80-90mmHg时，可以认为是临界高血压；当收缩期血压和舒张期血压分别高于140mmHg和90mmHg时，认为是高血压。随着高血压病情严重程度的增加，施用的环氧甾族化合物的剂量增加。根据给药后的血压测量，滴定施用的环氧甾族化合物的剂量。在最初评价个体对治疗的反应后，可以增加或减少剂量，以达到希望的血压降低作用。
例如，能够监测收缩期血压来确定合适的剂量。如图10所示，艾普利螺酮剂量增加将导致收缩期血压降低。因此，受试者能够用根据本发明的一种或多种环氧甾族化合物治疗，方法是逐步提高这种化合物的剂量，直到达到最低水平的收缩期血压降低，同时也使血清钾水平保持在正常范围内。
类似地，也能够通过监测舒张期血压确定合适的剂量。如图11所示，艾普利螺酮剂量增加导致舒张期血压降低。因此，受试者能够用根据本发明的一种或多种环氧甾族化合物治疗，方法是逐步提高这种化合物的剂量，直到达到最低水平的舒张期血压改变，同时也使血清钾水平保持在正常范围内。
心血管疾病剂量
治疗心血管功能疾病的剂量能够根据测量钠尿肽的血液浓度确定并调节。钠尿肽是一组结构相似的，但是遗传学不同的肽，它们在心血管、肾和内分泌内环境稳定中起多种作用。心钠素(“ANP”)和脑钠素(“BNP”)是心肌细胞来源的，C型钠尿肽(“CNP”)是内皮来源的。ANP和BNP与钠尿肽-A受体(“NPR-A”)结合，通过3 ′，5′-环鸟苷一磷酸(cGMP)介导尿钠增多、血管舒张、肾素抑制、抗有丝***和松驰性。血液中钠尿肽水平升高，特别是血液BNP水平升高，通常在血容量扩充的和血管损伤(如急性心肌梗死)后的受试者中观察到，并且在梗死后的一段延长的时间内持续升高。(Uusimaa等人：Int.J.Cardiol1999；69：5-14)。
与施用醛固酮拮抗剂之前测量的基线水平相比，钠尿肽水平的降低表明醛固酮的致病作用降低，因此与致病作用抑制相关。因此能够将希望的钠尿肽的血液水平与施用醛固酮拮抗剂之前的相应基线水平相比较，测定本发明在治疗致病作用中的效能。根据这些钠尿肽水平量值，能够调节醛固酮拮抗剂的剂量，以减少心血管致病作用。
类似地，根据循环和尿cGMP水平，也能够确定心脏病，并确定合适的剂量。血浆cGMP水平的升高与平均动脉压的下降相平行。尿cGMP***的增加与尿钠增多有关。
心脏病也能够根据射血分数降低或具有心肌梗死或心力衰竭或左心室肥大来确定。左心室肥大能够用超声心动图或核磁共振成像来确定，用来监测治疗的进展和剂量的适当性。
因此，在本发明的另一个实施方案中，本发明的方法能够用来降低钠尿肽的水平，特别是BNP水平，从而也治疗相关的心血管疾病。
肾病剂量
治疗肾功能疾病的剂量能够根据蛋白尿、微量蛋白尿、肾小球滤过率降低(GFR)或肌酸酐清除率降低来确定并调节。蛋白尿根据在24小时采集尿中含有0.3g以上的尿蛋白来确定。微量蛋白尿根据可免疫测定的尿白蛋白增加来确定。根据这些量值，能够调节醛固酮拮抗剂的剂量，降低肾致病作用。
神经病剂量
神经病，特别是周围神经病，能够根据感觉缺陷或感觉运动能力的神经学检查来确定并调节剂量。
视网膜病剂量
视网膜病能够根据opthamologic检查来确定并调节剂量。
根据血浆肾素或血清醛固酮水平给药
通常，根据本发明治疗的受试者在最初评价期间(即受试者以最初的每日剂量接受一种或多种环氧甾族化合物期间)，最初施用一定量的一种或多种环氧甾族化合物。最初的评价时间可以是持续约1-4周，优选地约1-2周。在最初的评价期之后，获得血样和尿样进行常规评价(即，一般称为血液和尿化学)。如果增加剂量没有禁忌症(例如高钾血症)，则在必要时提高一种或多种环氧甾族化合物的每日剂量。
合适的剂量也能够通过监测血浆肾素活性来确定。如图12所示，提高艾普利螺酮剂量导致血浆肾素活性水平升高。因此，受试者能够用根据本发明的一种或多种环氧甾族化合物治疗，方法是逐步提高这种化合物的剂量，直到达到希望的血浆肾素活性水平，同时也使血清钾水平保持在正常范围内。
合适的剂量也能够通过监测血清醛固酮水平来确定。如图12所示，提高艾普利螺酮剂量导致血清醛固酮水平升高。因此，受试者能够用根据本发明的一种或多种环氧甾族化合物治疗，方法是逐步提高这种化合物的剂量，直到达到希望的血清醛固酮水平，同时也使血清钾水平保持在正常范围内。
药物组合物
给药可以通过任何适当的途径实现，如：口服，或静脉内、肌肉内或皮下注射施用。
对于口服，药物组合物可以是例如片剂、胶囊、悬液或液体的形式。药物组合物优选地制成含有特定含量的活性成分的剂量单位的形式。这种剂量单位的例子有片剂或胶囊。适用于哺乳动物的每日剂量可能根据患者病情和其它因素广泛不同。
类似地，活性成分可以作为一种组合物通过注射施用，其中，例如，可以使用盐水、右旋糖或水作为适当的载体。该制剂可以是大丸剂的形式，或是水或非水等渗无菌注射溶液或悬液的形式。这些溶液和悬液可以用无菌粉末或颗粒制成，其中含有一种或多种药学可接受的载体或稀释剂，或粘合剂，如明胶或羟丙基-甲基纤维素，以及一种或多种润滑剂、防腐剂、表面活性剂或表面分散剂。
术语“药学可接受的”在此作为形容词使用，是指修饰的名词适用于一种药物产品。药学可接受的阳离子包括金属离子和有机离子。更优选的金属离子包括但不限于：适当的碱金属盐、碱土金属盐和其它生理学可接受的金属离子。代表性离子包括常见价的铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌。优选的有机离子包括质子化的叔胺和季铵阳离子，部分包括：三甲胺、二乙胺、N，N′-二苄乙烯二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲葡糖胺)和普鲁卡因。代表性药学可接受的酸包括但不限于：盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、甲磺酸、乙酸、甲酸、酒石酸、马来酸、苹果酸、柠檬酸、异柠檬酸、琥珀酸、乳酸、葡糖酸、葡糖醛酸、丙酮酸、草酰乙酸、延胡索酸、丙酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸等。
为了治疗目的，本发明的活性成分通常与适于所述给药途径的一种或多种佐剂组合。如果经口给药，这些成分可与下列成分混合：乳糖、蔗糖、淀粉粉末、链烷酸的纤维素脂、纤维素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸及硫酸的钠盐及钙盐、明胶、***胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙烯醇，然后制成片剂或装入胶囊以便施用。这些胶囊或片剂可含有一种控释制剂，如活性化合物在羟丙甲基纤维素中分散可能产生的。肠胃外施用的制剂可以是水或非水等渗无菌注射溶液或悬液的形式。这些溶液和悬液可以用无菌粉末或颗粒制备，含有所述用于口服制剂的一种或多种载体或稀释剂。这些成分可以溶解于水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苯甲醇、氯化钠和/或多种缓冲液。其它佐剂和施用方式在制药领域公知。
联合治疗
本发明的方法还可包括其它活性成分的施用或与施用环氧甾族醛固酮拮抗剂联合的治疗。
例如，本方法中使用的醛固酮拮抗剂能够与治疗高血压和心血管及肾脏疾病使用的其它活性药物联合对受试者施用。与醛固酮拮抗剂一起施用的活性药物可包括例如选自下列的药物：肾素抑制剂、血管紧张素II拮抗剂、ACE抑制剂、基本没有醛固酮拮抗剂作用的利尿剂和视黄酸。短语“联合治疗”(“共治疗”)，当用于药物组合时，包括在提供有利的药物组合效果的方案中以顺序方式施用每一种药物，也包括以基本同时的方式共同施用这些药物，例如在含有固定比例的这些活性药物的一个胶囊或注射中，或者每种药物在多个不同胶囊或注射中。
短语“血管紧张素II拮抗剂”包括，例如WO96/40257所述的血管紧张素II拮抗剂。
短语“血管紧张素转化酶抑制剂”(“ACE抑制剂”)包括一种试剂或化合物或两种或多种试剂或化合物的组合，它能够部分或完全阻断血管紧张素的十肽形式(“血管紧张素I”)酶促转化为血管紧张素的血管收缩八肽形式(“血管紧张素II”)。阻断血管紧张素II的形成通过消除血管紧张素II的主要作用能够影响体液和电解质、血压和血容量的调节。血管紧张素II的这些主要作用包括肾上腺皮质对醛固酮受体合成和分泌的刺激，以及通过微动脉平滑肌的直接缩窄升高血压。
能够在联合治疗中使用的ACE抑制剂的例子包括但不限于下列化合物：AB-103、ancovenin、贝那普利(benazeprilat)、BRL-36378、BW-A575C、CGS-13928C、CL-242817、CV-5975、Equaten、EU-4865、EU-4867、EU-5476、foroxymithine、FPL 66564、FR-900456、Hoe-065、I5B2、吲哚普利、酮甲基脲、KRI-1177、KRI-1230、L-681176、libenzapril、MCD、MDL-27088、MDL-27467A、莫维普利、MS-41、nicotianamine、喷托普利、非那西汀、匹伏普利、rentia pril、RG-5975、RG-6134、RG-6207、RGH-0399、ROO-911、RS-10085-197、RS-2039、RS 5139、RS 86127、RU-44403、S-8308、SA-291、螺普利拉、SQ-26900、SQ-28084、SQ-28370、SQ-28940、SQ-31440、Synecor、utibapril、WF-10129、Wy-44221、Wy-44655、Y-23785、Yissum P-0154、扎比普利、Asahi Brewery AB-47、alatriopril、BMS 182657、AsahiChemicalC-111、Asahi Chemical C-112、Dainippon DU-1777、mixanpril、Prentyl、佐芬普利(zofenoprilat)、1-(-(1-羧基-6-(4-哌啶基)己基)氨基)-1-氧丙基八氢-1H-吲哚-2-羧酸、Bioproject BP1.137、ChiesiCHF 1514、Fisons FPL-66564、idrapril、MarionMerrell DowMDL-100240、培哚普利拉和Servier S-5590、阿拉普利、贝那普利、卡托普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、fosinoprilat、咪达普利、赖诺普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、醋酸肌丙抗增压素、temocapril、群多普利、ceranapril、莫昔普利、quinaprilat和螺拉普利。
特别重要的一组ACE抑制剂包括：阿拉普利、贝那普利、卡托普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、fosinoprilat、咪达普利、赖诺普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、醋酸肌丙抗增压素、temocapril、群多普利、ceranapril、莫昔普利、quinaprilat和螺拉普利。
许多这样的ACE抑制剂可以商品获得。例如，极其优选的一种ACE抑制剂——卡托普利，由E.R.Squibb & Sons，Inc.，Princeton，N.J.(现在是Bristol-Myers-Squibb的一部分)销售，商标为“CAPOTEN”，片剂剂型，剂量为每片12.5mg、50mg和100mg。依那普利或马来酸依那普利和赖诺普利是两种更加优选的ACE抑制剂，由Merck & Co，West Point，Pa销售。所售依那普利的商标为“VASOTEC”，为片剂剂型，剂量为每片2.5mg、5mg、10mg和20mg。所售赖诺普利的商标为“PRINIVIL”，为片剂剂型，剂量为每片5mg、10mg、20mg和40mg。
利尿剂可以选自几个已知的类别，如噻嗪类和有关的胺磺酰类药物、保钾利尿剂、袢利尿剂和有机汞化合物利尿剂。噻嗪类(thiazides)的非限制性例子有苄氟噻嗪、苄噻嗪、***、环噻嗪、羟***、羟氟甲噻嗪、甲***、多噻嗪和三氯甲噻嗪。与噻嗪类有关的胺磺酰类药物的非限制性例子有氯噻酮、喹乙宗和美托拉宗。保钾利尿剂的非限制性例子有triameterene和阿米洛利。袢利尿剂，即作用于肾亨利袢上升支的利尿剂，其非限制性例子有呋塞米和乙炔丙烯酸(ethynacrylic acid)。有机汞化合物利尿剂的非限制性例子有巯汞林钠、汞乙氧茶碱、普鲁卡因和撒利汞及茶碱。
在一个实施方案中，联合治疗包括对盐敏感的和/或高钠摄取的人类受试者施用一种ACE抑制剂、一种环氧甾族化合物(它是一种醛固酮受体拮抗剂)和一种基本没有醛固酮拮抗活性的袢利尿剂，其中该ACE抑制剂、环氧甾族化合物和袢利尿剂以如下剂量联合施用，导致下列一种或多种情况：(1)与不使用环氧甾族化合物的这种联合治疗相比，死亡率统计学显著地降低；(2)与不使用环氧甾族化合物的这种联合治疗相比，非致死住院的数量率统计学显著地减少；(3)与不使用环氧甾族化合物的这种联合治疗相比，非致死住院的死亡率或数量率统计学显著地减少；(4)与不使用环氧甾族化合物的这种联合治疗相比，患有或易患心率变化性提高的受试者的猝死死亡率统计学显著地减少；(5)与不使用环氧甾族化合物的这种联合治疗相比，心力衰竭进展导致的死亡率统计学显著地减少；(6)与不使用环氧甾族化合物的这种联合治疗相比，左心室射血分数低于超过约26％的受试者中非致死住院的死亡率或数量统计学显著地减少；(7)与不使用环氧甾族化合物的这种联合治疗相比，左心室射血分数低于约26％的受试者中非致死住院的死亡率或数量统计学显著地减少；和/或(8)与不使用环氧甾族化合物的这种联合治疗相比，由于受试者的肺动脉纤维化增加或肺血压水平升高引起的临床上有意义的咳嗽得到抑制。
优选地，接受联合治疗的受试者：(1)易猝死；(2)在联合治疗前被归类为纽约心脏协会III级或IV级；(3)左心室射血分数超过约26％；和/或(4)由于肺动脉纤维化增加或肺血压水平升高，易患或已患临床上有意义的咳嗽。
这些联合治疗例如可用于减少非致死住院的死亡率或数量，或者防止或延缓盐敏感和/或高钠摄取的受试者发展为一般由原发性高血压或心肌梗死后心脏病引起的心力衰竭。一种基本没有醛固酮拮抗活性的利尿剂也可以与ACE抑制剂和环氧甾族化合物联合使用。
此外，联合治疗也可包括对盐敏感的和/或高钠摄取的人类受试者施用一种治疗有效量的ACE抑制剂、一种治疗有效量的环氧甾族化合物、一种治疗有效量的基本没有醛固酮拮抗活性的袢利尿剂和一种治疗有效量的地高辛。
下列实施例包含本发明的方法的详细描述。此详细描述属于本发明的范围，并且用来举例说明。这种详述只是为了说明目的，不是用来限制本发明的范围。在每一个实施例中使用的艾普利螺酮原材料主要包括L型多晶型，含有不到约10％的H型多晶型。对于大多数实施例而言，使用的艾普利螺酮材料不含可检测的量的H型多晶型(即不到约3％的H型多晶型)。
实施例
A.生物学实施例
实施例A-1.艾普利螺酮独立于血压阻断心肌梗死和肾动脉病的用途
为了证明艾普利螺酮能够预防醛固酮/盐介导的早期心血管损伤，使用一种大鼠实验模型，该模型结合了血压升高、适度高盐摄取、激活的RAAS和抑制的氧化氮产生等特点。该模型包括，在饮用1％NaCl并在第11-14天三天输注血管紧张素II的大鼠中，用Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(“L-NAME”)慢性抑制氧化氮合酶14天。在该实验中，通过在14天的心脏损伤L-NAME/血管紧张素II/NaCl模型中进行切除/醛固酮置换实验，测定盐皮质激素对心脏和肾脏的早期致病作用。具体而言，在该模型中检测：通过肾上腺切除术或艾普利螺酮(一种选择性醛固酮受体阻断剂)的药理拮抗作用减少盐皮质激素，是否可预防心脏和肾脏损伤，以及在肾上腺切除的大鼠中醛固酮置换是否能恢复损伤。另外，也确定L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理诱发何种类型的心脏损伤，并将这些变化与肾脏中发生的进行比较。
动物。研究中使用雄性Wistar大鼠(n＝44)，体重200-225克，获自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)。所有动物都在房间内饲养，每天12小时光照，室温为22±1℃。到达后给予动物一周的时间恢复，可自由获得Purina Lab Chow 5001(Ralston Purina Inc，St.Louis，MO)和自来水，直到开始实验。在方案开始后，所有组的动物都置于单独的代谢茏中，每天处理并称重。每天测量24小时液体摄取，食物摄取和排尿。在开始L-NAME处理前3天和第1、5、9、13天测量收缩期血压。在L-NAME处理的第14天对动物行断头术，躯干血液收集到含有乙二胺四乙酸的预冷试管中，取出心脏和肾脏，吸干，立即称重。心脏和肾脏保存在10％磷酸缓冲的***中，随后处理进行光学显微镜检查。
药物。艾普利螺酮由G.D.Searle Pharmaceuticals(St.Louis，MO)提供，溶解于0.5％甲基纤维素中，通过管饲法每天施用两次。***溶解于芝麻油中，每天单次皮下剂量施用(12μg/kg/天)。这一***剂量据报告在肾上腺切除的大鼠中能够保持正常体重增加、肾小球滤过率和空腹血浆葡萄糖和胰岛素水平。Stanton，B.，Giebisch G等人J.Clin.Invest 1985 75：1317-1326。该实验在L-NAME处理的第14天结束。血管紧张素II和醛固酮通过Alzet渗透微型泵施用(分别为2001型和2002型，Alza Co，Palo Alto，CA)，它们皮下植入到异荧烷(isofluorane)麻醉的动物的颈项处。填充该泵的血管紧张素II和醛固酮的浓度根据厂商提供的平均泵速、植入泵之前一天的动物体重和预计的剂量计算。血管紧张素II(人，99％肽纯度)购自American PeptideInc.(Sunny Vale，CA)，如以前报告的以225μg/kg/天的剂量施用。(HouJ等人J.Clin.Invest.1995 96：2469-2477)。醛固酮剂量(40μg/kg/天)比以前在醛固酮诱发的心血管损伤研究中使用的剂量大约低50％。这种较低的剂量在易中风的自发性高血压大鼠中诱发损伤。(Rocha R等人Hypertension 1999 33：232-237)。***、醛固酮和L-NAME购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。根据大鼠的每日液体摄取量和体重，每天调节饮用水中L-NAME的浓度，以提供40mg/kg/天的剂量。
手术操作。开始L-NAME处理前3天，第4组和第5组的大鼠用戊巴比妥钠(戊巴比妥，Abbott Laboratories，North Chicago，IL；60mg/kg，腹膜内)麻醉。用背腰法进行双侧肾上腺切除术，在每一侧切开不同的切口。在手术操作后，肾上腺切除的动物随意饮用1％NaCl。未发生手术后死亡。
测定和分析。使用Natsume KN-210测压计和流速计(PeninsulaLaboratories Inc，Belmont，CA)，通过尾-袖带体积描记法测量收缩期血压。在测量血压之前，大鼠在37℃下温暖10分钟，在有机玻璃箱中安静休息。利用磺基水杨酸浊度法测定实验最后一天采集的尿中的尿蛋白浓度。尿蛋白***计算为尿浓度与24小时尿排出量的积。血浆醛固酮浓度用来自Diagnostic Products Co.(Los Angeles，CA)的标准放射免疫测定试剂盒测定。血浆肾素活性(“PRA”)通过放射免疫测定法检测产生的血管紧张素I(DiaSorin Inc.，Stillwater，MN)测定。
组织学。如其他人报告的，为了测定纤维化，心脏用胶原蛋白特异的染料粘胶纤维红染色。(Young M等人Am.J.Physiol 1995 269：E657-E662)。间质胶原蛋白用自动成像分析仪测定。心脏也用苏木精和曙红染色进行光学显微镜检查。每个动物分析包括右心室和左心室的不同心脏切片的两个或三个切片。利用0-4的等级对心肌损伤水平进行评分，0代表没有损伤。得分1代表存在肌细胞，证明有早期坏死性病变，如核固缩或核溶解，未收缩的边缘摆动(marginal wavy)纤维和细胞质的嗜酸性染色，与散见的嗜中性浸润有关。当观察到一个明显的坏死区(嗜中性浸润严重的心肌细胞丢失)时，给予得分2。当发现两个或更多分开的坏死区(表明同一心脏中存在两种不同的心肌梗死)，但是这些区域局部化且损害不到50％的心室细胞时，心脏评分为3。证明大面积坏死区损害50％以上的左或右心室的心脏，给予得分4。
肾脏的冠状切片切成3-4mm，至少3-4个制备成石蜡包埋块。组织切片(2-3μm)用高碘酸-希夫试剂染色，由不了解不同实验方案的病理学家用光学显微镜在10×和40×下检查。如果存在肾小球损伤，其特征为存在节段或球样硬化，具有局部缺血或血栓改变。肾动脉和微动脉损伤根据血管壁纤维蛋白样坏死的存在分类。计数呈现损伤的肾动脉和微动脉分布，每个切片中损伤的血管数量除以同一切片中肾小球的数量，对检查的组织量标准化。肾血管损伤表示为每100个肾小球的损伤血管数量。
统计学分析。利用Kolmogorov-Smirnov检验检验数据的正态分布。收缩期血压用时间和处理组的重复方差测量-分析进行分析。具有一组变量的正态分布的数据使用一步方差分析。此后的分析用Newman Keuls多重比较检验进行。不是正态分布的数据用Kruskal-Wallis检验进行。随后，选择的逐对比较用精确Wilcoxon检验进行。对于正态分布的数据，数据报告为均值±SE，对于非正态分布的数据，表示为中值与上四分之一和下四分之一值。
给药方案。饮用1％NaCl的Wistar大鼠使用下列给药方案之一：1)对于用作对照的大鼠，单独1％NaCl(NaCl，n＝8)；(2)L-NAME/血管紧张素II/NaCl：在饮用溶液中L-NAME处理(40mg/kg/天)14天(n＝8)。在L-NAME处理的第11天，将含有血管紧张素II(0.225μg/kg/天)的渗透微型泵植入每个动物的皮下；(3)L-NAME/血管紧张素II/NaCl+艾普利螺酮：L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理的大鼠从0-14天另外接受艾普利螺酮(100mg/kg/天，口服；n＝8)。另外两组饮用NaCl的大鼠在开始L-NAME/血管紧张素II处理之前3天进行肾上腺切除。第4组(L-NAME/血管紧张素II/NaCl+ADX，n＝11)接受手术后立即开始接受***代替糖皮质激素。第5组(L-NAME/血管紧张肽II/NaCl+ADX/ALDO，n＝9)除了***外还接受醛固酮，与L-NAME处理同时在第0天开始。
结果
对血压的影响
基线收缩期血压在所有处理组中都相似。所有接受L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理的动物都显示收缩期血压，与饮用NaCl的对照相比，进行性地显著升高(P＜0.01)。在实验结束时观察到的高血压程度不受艾普利螺酮处理或肾上腺切除术的影响(图A-1)。
血浆肾素活性(PRA)和醛固酮水平
PRA和循环醛固酮水平的数据在图A-2中显示。与饮用盐水的对照相比，在完整的动物中，L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理显著降低PRA。施用醛固酮可防止在肾上腺切除的L-NAME/血管紧张素IIl/NaCl处理的大鼠中观察到较高水平的PRA(图A-2A)。尽管在用L-NAME/血管紧张素II/NaCl或L-NAME/血管紧张素II/NaCl加艾普利螺酮处理的肾上腺完整的动物中观察到PRA的显著抑制，但是血浆醛固酮类似于饮用盐水的对照(图A-2B)。如预期的，在肾上腺切除的大鼠中，血浆醛固酮水平降低到不可检测的水平，而肾上腺切除的输注醛固酮的大鼠醛固酮水平升高。
醛固酮在心脏损伤中的作用
下面的表A-1A总结了在实验结束时获得的数据。三组肾上腺完整的动物体重没有不同。然而，两组肾上腺切除的大鼠证明体重显著低于肾上腺完整组。用总心脏重量与总体重之比作为心脏肥大的指数。心脏肥大指数在所有接受L-NAME/血管紧张素II/NaCl的动物组中均高于饮用NaCl的对照。与L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理的大鼠相比，艾普利螺酮治疗和肾上腺切除术都显著减少心脏肥大。输注醛固酮可逆转肾上腺切除术对心脏肥大指数的影响，并使其恢复到与L-NAME/血管紧张素II/NaCl组没有不同的水平。
表A-1A
    基团                    n   BW        SBP       HW         HW/BWg        mmHg       mg          mg/g
NaCl                        8  331±4   139±4    924±2     2.79±.05L-NAME/Angll/NaCl           8  311±15  180±5    1150±4    3.87±.09L-NAME/Angll/NaCl/Epl       8  330±4   177±8    1144±4    3.46±.05L-NAME/Angll/NaCl/ADX       11 278±4   176±3    880±3     3.2±.13L-NAME/Angll/NaCl/ADX/ALDO  9  267±6   192±7    951±16    3.57±.06
心脏的组织学检查显示处理组之间有显著差别，P＜0.0001(图A-3和A-4)。L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理的大鼠发展为血管损伤和心肌坏死。图A-3A显示了这些损伤的一张典型显微照片。心肌坏死的特征在于肌纤维的横纹丢失、细胞质均化、细胞膜丢失、核固缩及最终核溶解、包括多形核细胞和单核细胞在内的炎症细胞的流入。纤维蛋白样坏死在小冠状动脉和微动脉中存在(未显示)。相反，L-NAME/血管紧张素ll/NaCl处理引起的心脏损伤在长期施用艾普利螺酮或进行肾上腺切除术的动物中明显减少(图A-3B，A-4)。证明这两组的心肌坏死水平类似于饮用NaCl的对照。增加醛固酮输液完全逆转了肾上腺切除术的保护作用。
在接受L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理的所有组中，用粘胶纤维红(一种胶原蛋白特异的染料)染色显示心脏的间质胶原容积分数不提高(数据未显示)。此外，胶原沉积在心肌坏死区中没有增加(图A-3A和A-3C，相邻切片分别用苏木精、曙红和粘胶纤维红染色)。
醛固酮在肾损伤中的作用
在NaCl组中，在两周治疗期结束时测定的尿蛋白***(24小时)正常(图A-5)。用L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理显著增加尿蛋白***。艾普利螺酮处理和肾上腺切除术防止了接受L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理的动物产生蛋白尿。相反，对肾上腺切除的大鼠施用醛固酮可完全恢复L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理对蛋白尿的影响。
肾脏的组织病理学评价也证明这些组之间的显著性差异，P＜0.001(图A-6和A-7)。在来自饮用NaCl的对照的肾脏中没有发现肾动脉病，接受L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理的动物证明有严重的肾血管损伤，累及小叶间动脉和微动脉(图A-6)。这些血管证明有血管壁的纤维蛋白样坏死，以及血管内侧增厚和周围***的增生。极少的分离的肾小球含有病灶血栓形成区。远端小管水平的蛋白质管型和近端小管中的重吸收蛋白质颗粒在L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理的大鼠中经常发现。肾动脉病在接受艾普利螺酮处理的动物中趋于减少。然而，根据组织病理学评分的分析，与L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理的大鼠相比，损伤减少60％没有达到统计学显著性(P＝0.1)。肾上腺切除术使L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理诱发的肾动脉病显著减少到与饮用NaCl的对照没有显著不同的水平(图A-7)。如在心脏中观察到的，当向肾上腺切除的L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理大鼠输注醛固酮时，肾脏的损伤显著增加。
已经发现，向高钠饮食的大鼠联合施用血管紧张素II和L-NAME——一种氧化氮合成抑制剂，导致高血压、心脏肥大、心肌坏死、蛋白尿和肾动脉病的发展。相反，没有一般与慢性心血管损伤有关的心肌纤维化的证据。肾上腺切除术可防止心肌坏死、蛋白尿和血管损伤，它消除了醛固酮的存在。当肾上腺切除的大鼠输注醛固酮时，肾上腺切除术的保护作用丧失。类似地，艾普利螺酮的醛固酮拮抗作用也减少心血管损伤。因此，在L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理的大鼠中，环氧甾族化合物防止或减少急性心血管损伤的发展。
该研究表明，L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理在心脏和肾脏水平上诱发高血压和终末器官损伤方面非常有效。艾普利螺酮在防止这种作用上是有效的。而且，由于艾普利螺酮不能明显地改变收缩期血压，因此治疗作用不依赖于它对钠潴留、容积扩大和高血压的影响。最后，这些数据提示，艾普利螺酮的作用不是防止小动脉和微动脉中的纤维化而是减少中间的纤维蛋白样坏死，以及随后的组织坏死。纤维化可能是一个修补过程。
实施例A-2.在大鼠和狗中对阻断醛固酮诱发的盐潴留的急性作用
方法：测定醛固酮处理的盐水负荷的肾上腺切除大鼠的抗盐皮质激素药理学活性。检测化合物在输注醛固酮之前30分钟通过管饲法施用。测定尿钠、钾和水***。结果表示为***的尿钠与钾之比(Na/K)±SEM(表A-2A)。
也在盐水水合的有意识的狗(n＝6)中测定抗盐皮质激素的药理学作用，这些狗通过静脉内输注用醛固酮处理，并且经口施用艾普利螺酮。测定***的尿钠和钾的浓度。结果表示为尿钠和钾和Na/K比的变化，并且与单独醛固酮处理相比较(表A-2B)。
结果：这些结果在两个种中证明了艾普利螺酮对醛固酮诱导的钠和水潴留和钾丢失的药理学逆转。在这些方法中，艾普利螺酮在单次口服后产生明显的尿钠增多。
表A-2A
    处理     尿Na/K±SEM
    无     5.15±0.15*
    醛固酮     1.68±0.04
    醛固酮与艾普利螺酮(1mg/kg)     2.53±0.23*
    醛固酮与艾普利螺酮(3mg/kg)     4.08±0.26*
    醛固酮与艾普利螺酮(10mg/kg)     4.11±0.27*
    醛固酮与螺内酯(1mg/kg)     2.26±0.25*
    醛固酮与螺内酯(3mg/kg)     2.90±0.25*
    醛固酮与螺内酯(10mg/kg)     4.38±0.26*
            *与醛固酮处理组显著不同(p＜0.05)
表A-2B
处理 尿***(mmol/2h) Na/K比
钠 钾
醛固酮 1.0 10.5  0.09
艾普利螺酮(10mg/kg) 24.4±3 11.9±1  2.1
螺内酯(10mg/kg) 12.6±2 7.4±0.7  1.7
实施例A-3：大鼠皮下与经口施用艾普利螺酮的比较
方法：测定醛固酮处理的盐水负荷的肾上腺切除大鼠中艾普利螺酮的抗盐皮质激素药理学活性。在注射醛固酮之前30分钟通过经口管饲法或皮下注射施用艾普利螺酮。测定尿钠、钾和水***。结果表示为***的尿钠与钾之比(Na/K)±SEM(表A-3A)。
结果：这些结果表明了艾普利螺酮拮抗醛固酮介导的肾效应的体内效能(表A-3A)。皮下注射比口服能提供更高的效能(表XVIII和XIX)。
表A-3A
组别     平均Na/K     SEM
盐水     9.57     1.81
醛固酮     1.68     0.68
醛固酮+螺内酯(3)     1.64     0.41
醛固酮+螺内酯(10)     1.56     0.32
醛固酮+螺内酯(30)     3.02     0.74
醛固酮+螺内酯(100)     4.02     1.50
醛固酮+螺内酯(3)     1.37     0.25
醛固酮+艾普利螺酮(10)     2.17     0.61
醛固酮+艾普利螺酮(30)     2.98     0.34
醛固酮+艾普利螺酮(100)     3.44     0.84
SEM＝标准误均值；括号中的数字表示施用的拮抗剂的剂量(mg/100g大鼠)；每组的动物数量为6-9只。
表A-3B
组别     平均Na/K     SEM
盐水     10.07     1.72
醛固酮     1.21     0.25
醛固酮+艾普利螺酮(3)     0.90     0.13
醛固酮+艾普利螺酮(10)     1.34     0.30
醛固酮+艾普利螺酮(30)     1.18     0.27
醛固酮+艾普利螺酮(100)     2.10     0.22
醛固酮+艾普利螺酮(300)     4.79     1.24
醛固酮+艾普利螺酮(1000)     5.70     1.04
 SEM＝标准误均值；括号中的数字表示施用的拮抗剂的剂量(mg/100g大鼠)；每组的动物数量为8-11只。
实施例A-4：高血压模型：容积扩充的高血压大鼠
方法：单肾切除的大鼠给予1％NaCl饮用水，通过2002型Alza渗透泵皮下输注醛固酮(0.5g/kg/hr)。检测化合物通过皮下注射施用，每天两次。利用与导管***腹主动脉的压力传感器相连的植入发送器连续测量血压和心率。
结果：当使用遥测术连续监测时，这个啮齿动物模型在检测的两个剂量时，艾普利螺酮降低血压(表A-4A，三周后24小时平均的数据)。艾普利螺酮不导致心率的显著变化。
表A-4A
处理     SAP     HR
醛固酮和载体     202±7     346±6
醛固酮和艾普利螺酮(100mg/kg)     155±7*     352±4
醛固酮和艾普利螺酮(200mg/kg)     174±5*     339±4
醛固酮和螺内酯(100mg/kg)     171+5±     338±4
醛固酮和螺内酯(200mg/kg)     170+9*     336±7
*与载体处理组显著不同(P＜0.05)。SAP：收缩期动脉压(mmHg±SEM)。HR：心率(搏动/min±SEM)
实施例A-5：艾普利螺酮在易患中风自发性高血压大鼠(SHR-SP)中的作用，这是高血压和中风的一种遗传模型
在易患中风的自发性高血压大鼠(SHR-SP)中，艾普利螺酮对血压的影响
方法：SHR-SP在纽约医学院动物设施中采血，给予正常的大鼠食物和非盐水饮用水(即自来水)。在13周龄时，对动物(n＝7-8)施用艾普利螺酮(100mg/kg/天，口服，每天两次)或载体。通过尾袖带体积描记法间接测量收缩期血压。
结果：结果在表A-5A中显示。两组动物在开始研究时有类似的和升高的收缩期血压。只用载体处理的动物，在连续三周实验期间收缩期血压持续升高。相反，用艾普利螺酮处理的动物的收缩期血压保持在处理前的水平。这些数据证明，在这种遗传高血压和中风模型中，艾普利螺酮是一种有效的抗高血压药。
表A-5A
第13周  第14周  第15周 第16周
载体 203.8±1.3  200.3±3.3  224.6±6.0 236.0±4.8
艾普利螺酮100mg/kg/天 201.4±1.6  202.8±1.8  208.0±4.2* 203.1±6.2*
n＝*与载体处理组显著不同(p＜0.05)，mmHg＝毫米汞柱
实施例A-6：醛固酮受体拮抗剂治疗心肌损伤
Sprague Dawley大鼠(250g)进行单肾切除，提供1％NaCl溶液作为唯一的水源。然后向大鼠中植入Alzet微型泵，皮下输送醛固酮(0.75μg/hr)或载体。这两个处理组进一步分成接受正常大鼠食物组或接受含艾普利螺酮(100mg/kg/天)食物组。用植入腹主动脉的无线电遥测单元测量血压。杀死大鼠检测心脏。
如图A-8所示，在这一高盐/单肾切除大鼠模型中，醛固酮导致可以用组织病理学证明的心脏损伤。在处理2-4后，心脏独特地显示血管周围性炎症、血管壁肥大、内皮增厚(新血管内膜)、冠状动脉纤维蛋白样坏死。心肌细胞改变最小，没有明显的纤维化。在处理6-8周后，有组织学明显的心肌细胞坏死、修复性纤维化(瘢痕)和反应性间质纤维化。相反，在大鼠食物中添加艾普利螺酮防止了在其它情况下观察到的组织病理学损伤(图A-9)。
如图A-10所示，单肾切除的大鼠的心肌损伤需要高盐摄取和醛固酮。单独的钠不能引起心肌损伤，施用艾普利螺酮阻断醛固酮可防止醛固酮加高钠的心肌损伤。
实施例A-7：艾普利螺酮预防中风和脑血管损伤的用途
该实验包括15只饮用盐水的雄性9周龄SHRSP。如图A-11所示，载体处理的SHRSP(n＝8)都形成了中风体征，并且在15.2±0.6周龄时死亡，而艾普利螺酮处理的SHRSP(100mg/kg/天，n＝7)直到18.5周龄杀死进行进一步评价时仍不显示中风体征(P＜0.005)。艾普利螺酮处理也防止明显的蛋白尿发展(38±18对136±19mg/天，P＜0.005)，但是没有防止严重高血压(237±3对242±4mmHg)(图A-12)。如图A-13所示，脑的组织病理学分析显示在所有载体处理的SHRSP中存在liquofactive坏死，与具有病灶出血的脑动脉和微动脉的纤维蛋白样坏死损伤有关。施用艾普利螺酮可显著减少这些损伤。使用用于脑损伤的0-4半定量评分***(图A-14)，在载体处理的大鼠中得到3.5±3的得分，在接受艾普利螺酮的动物中得分为0.5±2(P＜0.001)。因此，在饮用盐水的SHRSP的脑中，艾普利螺酮通过与动脉血压降低无关的机制，提供血管保护作用。结果表明，在中风发展中，饮用钠的大鼠有一种至今仍未被认识的对内源性盐皮质激素(例如醛固酮)的作用。而且，施用艾普利螺酮防止大鼠中随着饮食钠摄取增加醛固酮引起中风的发展。
实施例A-8：艾普利螺酮在易中风自发性高血压大鼠中的血管保护作用
在第一个方案中，饮用盐水的SHRSP(n＝9)经口服艾普利螺酮处理(100mg/kg/天)5-6周。与载体组(n＝9)相比，艾普利螺酮预防蛋白尿(16±2对85±11mg/天，P＜0.001)和肾损伤(1±1对40±5％，P＜0.0005)的发展，但是不防止严重的高血压(219±6对227±4mmHg)。在第二个方案中，在内源性血管紧张素II形成受到抑制且长期输注载体或外源性血管紧张素II的条件下，在卡托普利处理的SHRSP中检测盐皮质激素对血管损伤发展的作用。卡托普利处理的SHRSP接受三个治疗方案之一：(i)输注载体，所述载体用来溶解血管紧张素II，不含艾普利螺酮(n＝5)；(ii)输注血管紧张素II(25ng/min，皮下；n＝7)加通过管饲法施用2ml/kg/天0.5％甲基纤维素；(iii)输注血管紧张素II(25ng/min，皮下；n＝7)加艾普利螺酮(100mg/kg/天，通过管饲法)。2周后，所有三组SHRSP的收缩期血压相当，都严重升高。在接受卡托普利加载体的SHRSP中，血浆醛固酮水平降低，未发现肾病理学。增加血管紧张素II输注可提高血浆醛固酮水平，逆转卡托普利对蛋白尿(分别96±13对14±1mg/天)和肾损伤的保护。尽管连续输注血管紧张素II，但是与载体相比，艾普利螺酮处理可显著减轻蛋白尿(28±5对96±13mg/天，P＜0.001)和肾损伤(3±1对18±4％，P＜0.0001)。这些发现表明，在饮用盐水的SHRSP中，内源性盐皮质激素介导肾损伤的进展，这不依赖于血管紧张素II和它对血压的影响。
材料与方法
动物。按照制定的指导原则，使用来自我们本地群体的雄性SHRSP/A3N(F-75到F-78代)进行研究，n＝37。这些动物由NIH原种繁殖，来源于最早Okamoto和同事(Okamoto K等人Circ.Res.34和35(suppl 1)：1-143-1-153)描述的SHRSP/A3N亚种。所有动物都在纽约医学院动物实验设施室内饲养，保持12∶12小时光∶暗循环和22±1℃的室温。大鼠在4周龄时断奶，使其自由获得Purina Lab Chow5001(Ralston Purina，St.Louis，MO)和自来水，直到开始实验方案。
方案1：艾普利螺酮对肾病理变化的影响
18只SHRSP在8.1周龄时开始给予1％NaCl饮用，并喂以易患中风的啮齿动物饮食(#39-288，Zeigler Brothers，Inc.，Gardners，PA)。该饮食的钾(0.7％对1.2％重量)和蛋白质(17％对22％重量)低于标准饮食，在SHRSP中诱发较高的中风发病率(Stier CT等人Hypertension.13：115-121)。在8.4周龄时，动物等分为两组，开始用艾普利螺酮或载体进行长期治疗。艾普利螺酮(SC-66110)由G.D.Searle & Co.，(St.Louis，MO)提供。艾普利螺酮以50mg/ml悬浮于0.5％甲基纤维素(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)溶液中，通过管饲法施用，每日两次，达到100mg/kg的每日总剂量。由于艾普利螺酮与螺内酯不同，不产生活性代谢物，因此使用较高的剂量。载体对照同窝出生仔畜接受2ml/kg/天的0.5％甲基纤维素溶液。动物分开在代谢笼中饲养，以便能够进行24小时排尿量和蛋白质***的测量。动物每天检查一次中风的神经指征。清醒的大鼠每周测量一次收缩期动脉压和心率。处理5周后在动物13.1周龄时终止实验。在上午10:00与下午12:00之间对动物施以快速断头术，之后将躯干血采集到预冷的EDTA试管中。血液贮存于-20℃下，随后测定血浆醛固酮水平。快速取出肾脏，称重，然后保存在固定剂中，以后进行组织学检查。
方案2：在SHRSP中，艾普利螺酮对血管紧张素II诱发的肾损伤的影响
在第二系列的19只SHRSP中，评价内源性盐皮质激素对血管紧张素II诱发的肾损伤的影响。SHRSP从8.3周龄时开始随意给予易患中风的啮齿动物饮食(#39-288，Zeigler BrosInc.，Gardners，PA)和1％NaCl饮用溶液。为了在动物中提供一致的内源性血管紧张素II水平的背景抑制，向所有动物的饮用溶液中加入卡托普利(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)，以达到50mg/kg/天的剂量。以前显示，在不输注血管紧张素II的情况下，这一剂量的卡托普利防止饮用盐水的SHRSP发展肾及脑血管损伤(Rocha R等人Hypertension.33：232-237)，在9.3周龄时，将含有血管紧张素II(人型，American Peptide Inc.，Sunnyvale，CA)或其载体(无茵0.9％NaCl)的Alzet渗透微型泵2002型(Alza Co.，Palo Alto，CA)植入接受异荧烷(Ohmeda CaribeInc.，Guayama，PR)吸入麻醉的SHRSP的颈项皮下。大鼠分别饲养于代谢笼中，接受三种治疗方案之一：(i)输注一种载体，该载体用来溶液血管紧张素II，不含艾普利螺酮(n＝5)；(ii)血管紧张素II输注(25ng/min，皮下；n＝7)加2ml/kg/天0.5％甲基纤维素(通过管饲法)；(iii)血管紧张素II输注(25ng/min，皮下；n＝7)加艾普利螺酮(100mg/kg/天，通过管饲法)。预试验证明，剂量为25ng/min的血管紧张素II能够逆转依那普利的ACE抑制剂处理在饮用盐水的SHRSP中的血管保护作用。选择的艾普利螺酮剂量取决于方案1的实验结果，在饮用盐水的13周龄SHRSP中显示几乎完全的针对蛋白尿和肾损伤的保护，不依赖于收缩期血压的变化。动物每天处理并称重。采集尿样进行蛋白尿评价。收缩期血压和心率每周测量一次。处理2周后，对动物施行断头术，将躯干血收集到预冷的EDTA试管中，取出肾脏，吸干，立即称重。肾脏的冠状切片固定，然后处理进行光学显微镜检查。
测定和分析。苏醒的动物的收缩期血压和心率用Natsume KN-210测压计和流速计(Peninsula LaboratoriesInc.，Belmont，CA)通过尾袖带体积描记法测量。大鼠在37℃下温暖10分钟，使之在有机玻璃柜中安静休息，然后测量血压。尿体积的测量用比重法进行。尿蛋白浓度通过磺基水杨酸浊度法测定。使用125I-醛固酮作为示踪剂(Coat-aCount Aldosterone，Diagnostic Products Co.，Los Angeles，CA)，通过放射免疫测定法测定血浆醛固酮。
组织学。肾脏保存在10％磷酸盐缓冲的甲醛中。冠状切片(2-3μm)用苏木精和曙红染色，如前所述以盲测法用光学显微镜检查(Stier CT等人J Pharmacol Exp Ther(1992)260：1410-1415)。将肾小球损伤分类为局部缺血或血栓的。局部缺血损伤被定义为肾小球毛细血管丛的回缩，有或没有可见的肾小球膜溶解。肾小球血栓损伤被定义为下列的任一个：节段到整体的纤维蛋白样坏死，局灶性肾小球毛细血管的血栓形成，毛细血管内(内皮和肾小球系膜)和/或毛细血管外细胞(新月体)的膨胀和增殖，和网状肾小球膜基质的膨胀，有或没有显著的细胞过多。每个肾列举显示任一分类的损伤的肾小球数量，表示为每个中冠切片中存在的肾小球总数的百分数(对于方案1，均值±SEM＝218±7个肾小球每只动物，范围＝162-261个肾小球；对于方案2，为229±7个肾小球每只动物，范围＝196-290个肾小球)。通过计数同一中冠切片中显示血栓和/或增生动脉病的动脉和微动脉的总数，估计血管损伤。血管血栓损伤被定义为下列的任一个或组合：壁纤维蛋白样坏死，红细胞的外渗和破碎，腔和/或壁血栓形成。增生性动脉病的特征在于显著膨胀的肌内膜(myointimal)细胞的增殖，该细胞含有膨胀的圆形到卵圆形的小囊状核，其周围为粘质细胞外基质(“洋葱皮”)，通常导致结节增厚。血管损伤表示为每100个肾小球中损伤的动脉和微动脉的数量。半定量评价管型的存在和管状(局部缺血)回缩和简化。
统计学分析。通过双向方差分析测定在治疗和时间方面的显著作用。只有一个分组变量的数据通过Student′s非配对t检验统计学分析。当比较两个以上的组时，进行单向方差分析，随后进行以后的Newman-Keul′s多重对比检验。数据用GraphPad Prism统计软件包2.01版(GraphPad SoftwareInc.，San Diego，CA)分析。P＜0.05被认为是统计学显著的。数据报告为均值±SEM。
结果
方案1
图A-15显示用艾普利螺酮(100mg/kg/d)或载体长期处理的SHRSP在死亡前的收缩期血压和尿蛋白***。该条形图显示从8.4-13.1周龄开始接受艾普利螺酮(100mg/kg/d)或载体长期处理的易患中风自发性高血压大鼠在死亡前的(A)收缩期动脉血压(SBP)和(B)尿蛋白***(UPE)。从8.1周龄时开始，随意给予动物1％NaCl饮水和易患中风的啮齿动物饮食。***与载体处理的同窝出生仔畜相比，P＜0.001。数值是均值±SEM。
与同窝出生仔畜对照相比，艾普利螺酮可预防蛋白尿形成(85±1对16±2mg/天，P＜0.001)，但不能预防严重高血压(227±4对219±6mmHg)。在研究期间，艾普利螺酮处理的和载体处理的组之间收缩期血压和心率也没有不同。
表A-8A总结了肾损伤的组织学分析的结果。来自载体处理的、饮用盐水的SHRSP的肾脏有35±5％的肾小球显示局部缺血性或血栓性损伤，在小动脉和微动脉中显示广泛的血栓性和增生损伤，如图A-16A所示。该图显示苏木精和曙红染色的中冠肾切片的代表性显微照片(原始放大倍数×130)，该切片来自从8周龄时开始经过5周艾普利螺酮或载体处理后的饮用盐水的易患中风自发性高血压大鼠。来自载体处理的动物的肾皮质证明有恶性肾硬化，如局部缺血回缩(小箭头)、毛细血管丛血栓坏死(大箭头)和红细胞破碎并从血管中溢出的微动脉纤维蛋白样坏死，和向心性增生性动脉病(箭头)。几种较小的动脉和微动脉显示由于中度肥大引起显著壁增厚(双箭头)。存在局部缺血性回缩和小管的简化。其它的是蛋白管型扩大。相反，在艾普利螺酮处理5周后，年龄匹配的同窝出生仔畜只显示很少的局部缺血或血栓肾小球情况(图A-16B；来自艾普利螺酮(100mg/kg/天，通过管饲法)处理的动物的肾皮质不显示显著的病理学)。
蛋白管型在载体处理的SHRSP的10±5％小管中存在，在艾普利螺酮处理的SHRSP的0.11±0.04％的小管中存在(P＜0.001)。类似地，载体处理的SHRSP中48±7％的小管显示局部缺血性回缩和简化，与之相比，艾普利螺酮处理的SHRSP中仅有0.5±0.2％显示(P＜0.001)。血浆醛固酮浓度在这些组别之间没有显著不同，在载体处理的SHRSP中平均为305±68pg/ml，在艾普利螺酮处理的SHRSP中平均为315±35pg/ml。9只载体处理的SHRSP中有6只显示明确的中风指征，而艾普利螺酮处理的SHRSP均不显示中风的证据(P＜0.01，Fisher′s精确检验)。
在处理的前3周，体重不受艾普利螺酮影响(数据未显示)。之后，载体处理组的体重下降，但是艾普利螺酮处理的SHRSP持平或增加。关于尸体解剖的绝对肾重量，载体处理的SHRSP平均为2.42±0.11g，艾普利螺酮处理的SHRSP为2.58±0.06，且不受长期施用艾普利螺酮的影响。因为载体处理的SHRSP的终体重低于艾普利螺酮处理的SHRSP(220±7g对279±7g，P＜0.001)，该组的肾重量与体重之比显著较高。
方案2
图A-17A显示卡托普利处理的饮用盐水的SHRSP的收缩期血压，该动物接受载体(盐水)或血管紧张素II输注，同时进行或不进行艾普利螺酮的口服。图A-17包括一张线图，显示饮用盐水的易患中风自发性高血压大鼠在卡托普利加载体(CAP)、卡托普利加血管紧张素II(CAP+血管紧张素II)或卡托普利加血管紧张素II加艾普利螺酮(CAP+血管紧张素II+EPL)处理期间的(A)收缩期动脉血压和(B)尿蛋白***。卡托普利处理(50mg/kg/天)在8.3周龄时开始。在9.3周龄时皮下植入含有血管紧张素II(25ng/min)的Alzet渗透微型泵，开始用载体(n＝5)、单独用血管紧张素II或血管紧张素II加EPL(100mg/kg/天)(n＝7)同时处理。***与CAP或CAP+血管紧张素II+EPL相比，P＜0.001。数值为均值±SEM。所有SHRSP都形成严重高血压，在这些组中没有显著不同。死亡前收缩期血压在卡托普利加载体处理的组中平均为224±6mmHg，卡托普利加血管紧张素II加载体处理的组为224±4mmHg，卡托普利加血管紧张素II加艾普利螺酮处理的SHRSP为231±5mmHg。结果表明，向卡托普利中添加血管紧张素II不会比卡托普利加载体更加提高血压。另外，在接受血管紧张素II加艾普利螺酮的卡托普利处理的SHRSP中，血压测量相似。在9.5周龄时，在开始输注血管紧张素II之后2天，尿蛋白***在所有三组都保持低水平(图A-17B)。之后，用卡托普利加载体处理的SHRSP不发展为蛋白尿。但是接受卡托普利加血管紧张素II加载体的SHRSP发展明显的蛋白尿。相反，在接受卡托普利加血管紧张素II加艾普利螺酮的SHRSP中蛋白尿得到预防。研究结束时，尿蛋白***在卡托普利组中平均为14±1mg/天，在卡托普利加血管紧张素II组中为96±13mg/天，在卡托普利加血管紧张素II加艾普利螺酮处理组中为28±5mg/天(卡托普利或卡托普利+血管紧张素II+艾普利螺酮对于卡托普利+血管紧张素II，P＜0.001)。血浆醛固酮浓度在卡托普利+血管紧张素II处理的组中平均为404±160pg/ml，在接受卡托普利+血管紧张素II+艾普利螺酮的组中为231±37pg/ml(P＝NS；图A-18)。图A-18是一张条图，显示易患中风的自发性高血压大鼠的血浆醛固酮水平，该大鼠在8.3周龄时开始卡托普利处理(50mg/kg/天)和1％NaCl/易患中风的啮齿动物饮食。在9.3周龄时皮下植入含有载体或血管紧张素II(25ng/min)的Alzet渗透微型泵，开始含或不含艾普利螺酮的伴随治疗。动物在2周后杀死(*与单独卡托普利处理的动物相比，P＜0.05)。这些数值显著高于接受单独卡托普利的组(107±26pg/ml；P＜0.05)，类似于方案1所见。
与高水平蛋白尿相一致，卡托普利处理的饮用盐水的SHRSP的肾脏在2周结束时不显示任何损伤。对卡托普利处理的SHRSP施用血管紧张素II+载体诱发恶性肾硬化症的明显血栓微血管病损伤，影响肾小球和微血管(表A-8B)。相反，血管紧张素II输注引起的肾硬化损伤进展在同时接受艾普利螺酮的卡托普利处理的动物中显著减少。图A-19显示肾脏组织学变化的代表性显微照片，该肾脏来自饮用盐水的卡托普利处理的SHRSP(来自饮用盐水的易患中风的自发性高血压大鼠(SHRSP)的苏木精和曙红染色的肾皮质)(最初放大倍数为130倍)。卡托普利+载体处理可防止肾病的发展(图A-19A)。输注血管紧张素II+载体的卡托普利处理的SHRSP(图A-19B)显示的肾损伤类似于饮用盐水的载体处理的SHRSP(见图A-16A)。相反，肾血管和小球损伤的发病率在接受卡托普利+血管紧张素II+艾普利螺酮的动物中显著降低(图A-19C)。如方案1所述半定量评价小管缺血的存在。在接受卡托普利+载体的SHRSP中不存在这些变化。卡托普利+血管紧张素II+载体处理的SHRSP中有21±3％的小管显示缺血性回缩和简化，而在卡托普利+血管紧张素II+艾普利螺酮处理的SHRSP中只有2.5±0.9％的小管显示类似的改变(P＜0.0001)。
在研究过程中，显示这些组之间的体重没有差异，实验结束时，卡托普利+载体处理组为258±6g，卡托普利+血管紧张素II+载体处理组为223±7g，卡托普利血管紧张素II+艾普利螺酮处理组为234±5g。尸体解剖的绝对肾脏重量在卡托普利+载体处理组中为2.56±0.06g，卡托普利+血管紧张素II+载体处理组为2.12±0.06g，卡托普利+血管紧张素II+艾普利螺酮处理的SHRSP为2.00±0.03g。绝对肾脏重量或表示为体重的百分比的肾脏重量，不受艾普利螺酮处理的影响。
表A-8A
损伤 载体(n＝9) 艾普利螺酮(n＝9)
肾小球损伤(损伤/100个肾小球)局部缺血血栓总共 24±211±435±5 1.0±1.0***0.1±0.1***1.0±1.0***
肾血管病(损伤/100个肾小球)局部缺血血栓总共 25±49±134±4 1.0±1.0***0.1±0.1***1.0±1.0***
易患中风的自发性高血压大鼠(SHRSP)从8.4周龄时开始，用艾普利螺酮(100mg/kg/天，通过管饲法，分为两个剂量)或载体(0.5％甲基纤维素，2ml/kg/天，通过管饲法)长期处理。所有动物从8.1周龄时开始使用1％NaCl饮用溶液和易患中风的啮齿动物饮食，实验在大鼠达到13.1周龄5周后终止。***与载体相比，P＜0.001。数值为均值±SEM。
表A-8B
损伤 卡托普利(CAP)+载体(n＝5) CAP+血管紧张素II+载体(n＝7) CAP+血管紧张素II+艾普利螺酮(n＝7)
肾小球损伤(损伤/100个肾小球)局部缺血血栓总共 0±00±00±0 13±32±115±3 3.0±1.0**1.0±0.33.0±1.0**
肾血管病(损伤/100个肾小球)局部缺血血栓总共 0±00±00±0 15±1±116±2 4.0±1.0***0.1±0.14.0±1.0***
饮用盐水的易患中风的自发性高血压大鼠(SHRSP)在8.3周龄时开始用卡托普利(50mg/kg/天)处理。在9.3周龄时，所有动物皮下植入含有血管紧张素II(25ng/min)的渗透微型泵，开始用艾普利螺酮(100mg/kg/天)或载体处理。所有动物都使用1％NaCl饮用溶液和易患中风的啮齿动物饮食，在2周后杀死。**P＜0.01；***P＜0.001，与卡托普利+血管紧张素II+载体相比。数值是均值±SEM。
用艾普利螺酮处理的饮用盐水的SHRSP显示蛋白尿显著减少，显示几乎完全防止肾小球和肾血管损伤。艾普利螺酮处理也大大防止了在载体处理的动物中观察到的小管的局部的、可能缺血性的回缩(收缩)和简化。与艾普利螺酮在饮用盐水的SHRSP中保护肾损伤的能力相一致的是这些大鼠发展恶性肾硬化与盐皮质激素-盐高血压(严重高血压的一种低肾素模型)之间的密切平行。
艾普利螺酮的有利作用不依赖于血压降低。在盐皮质激素诱发高血压的大鼠中，还不清楚该病理学(血栓毛细血管病损伤)是否能归因于严重高血压引起的直接机械损伤，不依赖于高血压的盐皮质激素的直接作用，两者的组合，或其它因素。动脉压升高是醛固酮导致发展血栓毛细血管病损伤的必要条件。我们的结果表明，高血压本身不足以导致血管损伤，内源性盐皮质激素介导SHRSP中恶性肾硬化症的发展。严重肾血管损伤的发病在盐负荷SHRSP中极早期发生，表明这些动物中损伤发展的盐敏感性。同样，在盐皮质激素处理(乙酸脱氧皮质酮盐)的大鼠中，肾损伤需要高盐摄取。我们的发现表明，高盐摄取，如高血压，可能是醛固酮诱发的损伤形成的必要条件，但是可能不足以导致损伤发展。
尽管一般作为SHRSP中风的后果的死亡率不是该研究的终点，但是观察到艾普利螺酮对中风的神经指征发展有非常明确的保护作用。艾普利螺酮对血浆醛固酮水平没有影响(在艾普利螺酮处理的SHRSP中为315±35pg/ml，在载体处理的SHRSP中为305±68pg/ml)，这与醛固酮作用而不是醛固酮合成的抑制相一致。总之，本研究的结果表明，在饮用盐水的SHRSP中，SARA导致血管保护。
在这些条件下，这两组血管紧张素II的水平应当相似，因为内源性血管紧张素II的形成被抑制，外源性血管紧张素II的输注恒定。低剂量血管紧张素II的输注(25ng/min)可有效诱发蛋白尿，以及与肾小球局部缺血及血栓损伤有关的血栓和增生性动脉病的发展，尽管同时进行卡托普利处理。在初步研究中，低剂量的血管紧张素II(即25ng/min)不升高SHRSP的血压。与我们在未用卡托普利处理的饮用盐水的SHRSP中(方案1)发现的相似，在卡托普利处理的饮用盐水的SHRSP中观察到艾普利螺酮对血管紧张素II诱发的肾血管损伤发展的显著保护作用，这与血压降低无关。这些发现与如下概念一致：该ACE抑制剂的血管保护作用具体与内源RAAS干扰有关，并且确定了内源性盐皮质激素在血管紧张素II诱发的肾损伤进展中起关键作用。
血管紧张素II具有一种明确的作用，即作为高血压血管病的一个致病因素。血管紧张素II不仅作为强血管收缩剂，而且作为肾上腺素能反应的促进剂。ACE抑制剂的有利作用一般是由于血管紧张素II的血管作用降低；然而，这些试剂也能抑制血浆醛固酮水平。接受血管紧张素II、含或不含艾普利螺酮的SHRSP保持血浆醛固酮水平，与卡托普利处理的SHRSP相比显著升高，类似于方案1中在载体处理的SHRSP中所观察到的。另外，血管紧张素II输注与肾损伤的发展有关，这种效应能被艾普利螺酮的MR拮抗作用大大减弱。我们的研究在SHRSP中进行，当喂以高盐饮食时一般显示RAAS抑制减弱。这一现象可以说明我们的实验中观察到的差异。本研究显示在输注低剂量血管紧张素II诱发的SHRSP中内源性盐皮质激素对肾损伤进展的关键作用。这些发现提示，盐皮质激素是SHRSP中血管紧张素II的血管毒性作用的重要介质，与我们以前的如下发现一致：在不输注血管紧张素II的条件下，醛固酮输注逆转卡托普利对血管损伤的预防。综上所述，这些发现证明施用艾普利螺酮是预防SHRSP损伤形成(可能在RAAS激活后发生)的一种有效疗法。
总之，在饮用盐水的SHRSP中，长期施用艾普利螺酮可有效减少蛋白尿、恶性肾硬化症的肾损伤和中风指征。此外，长期外源施用低剂量的血管紧张素II(25ng/min)可逆转卡托普利处理降低血浆醛固酮水平的能力，防止饮用盐水的SHRSP发展肾血管损伤。然而，用艾普利螺酮选择性阻断醛固酮大大减弱了血管紧张素II诱导肾损伤的能力。这些作用不依赖于血压的主要变化。
实施例A-9：作用机制和特异性：体内的盐皮质激素受体结合
药代动力学和吸收
使用雄性和雌性大鼠，在静脉内及口服施用作为水溶液的剂量为15mg/kg的[14C]艾普利螺酮后，研究艾普利螺酮的药代动力学和代谢。分析血浆、尿和粪便标本的总放射性。通过LC/MS/MS法分析未酸化的合并血浆中艾普利螺酮和开内酯环形式的艾普利螺酮的浓度。另外，通过另外一种LC/MS/MS法分析酸化的合并血浆中“总艾普利螺酮”(内酯闭环形式加开环形式)的浓度。
在静脉内施用[14C]艾普利螺酮后，雄性和雌性大鼠中的总放射性的清除半衰期分别为1.9和1.6小时。口服施用作为水溶液的[14C]艾普利螺酮后，雄性和雌性中分别在施用后1.1和0.8小时达到总放射性的平均峰血浆浓度(Cmax)，表明放射性剂量的吸收率很快。雄性和雌性大鼠的总放射性的平均Cmax值分别为7.64和7.67μg当量/mL。雄性和雌性大鼠在口服施用[14C]艾普利螺酮后总放射性的全身利用率分别是59.6％和66.4％，表明艾普利螺酮良好的吸收。
雄性和雌性大鼠在静脉内施用后艾普利螺酮的清除半衰期分别为0.803和1.14小时。相应的总艾普利螺酮值分别为1.01和1.14小时。雄性和雌性大鼠的艾普利螺酮血浆清除率(CL)值分别为1.22和1.20L/kg/hr。相应的总艾普利螺酮值分别为0.983和0.694L/kg/hr。
在口服施用后，亲本药物的血浆浓度有明显的性别差异，雌性的值较高。在雄性大鼠中艾普利螺酮快速吸收，在0.5小时时达到1.71μg/mL的Cmax，在雌性大鼠中，在1小时时达到3.54μg/mL。在雄性和雌性大鼠中，艾普利螺酮的全身利用率分别为25.6％和66.1％。在雄性和雌性大鼠中，总艾普利螺酮的Cmax分别为3.20和6.35μg/mL。在雄性和雌性大鼠中，总艾普利螺酮的全身利用率分别为29.4％和74.2％。
分布
在对色素沉着的雄性大鼠(Long-Evans Hooded)口服施用剂量为20mg/kg的作为水溶液的[14C]艾普利螺酮后，进行大鼠组织分布研究。放射性剂量的组织摄取率快速，大多数组织在0.5小时时达到Cmax。血液和血浆中的平均Cmax分别为4.90和8.64μg当量/g。具有最高平均Cmax值的组织(不包括胃肠道组织)有肝脏、胰和肾脏，浓度分别为41.1、12.1和10.1μg当量/g。具有最低Cmax值的组织有眼(凹透镜)、脑和脊髓，浓度分别为0.045、0.516和0.630μg当量/g。到给药后96小时，除了盲肠、肾脏、大肠和肝脏以外，所有组织中的放射性浓度均低于检测低限，全都显示低于0.024μg当量/g的值。
实施例A-10：选择性醛固酮受体阻断改善饮食诱导的动脉粥样硬化中的内皮功能
检测艾普利螺酮在提高氧化氮生物利用率方面的效能，以确定艾普利螺酮是改善还是阻止伴随动脉粥样硬化发生的内皮功能障碍。
方法：新西兰白兔随机分为4个处理组。32只兔给以正常(NC)1％胆固醇食物(HC)，持续8周。在前2周之后，16只兔随机分配，通过管饲法接受盐水(S)或艾普利螺酮(E，50mg/kg，每日两次)，再继续6周。白兔在8周结束时施以安乐死，取出主动脉进行等长张力(isometric tension)研究，并通过光泽精(lucigenin)化学发光(250μM)估计血管节段中的过氧化物(O2 -)产生。血管用苯福林(3×10-7)预收缩至峰收缩的约50％，检测对乙酰胆碱(Ach)和***(NTG)的剂量反应。
结果：对Ach、NTG的峰松弛、ED50(M)值和O2 -计数(每mg干重)在表A-10中显示。
表A-10
  基团 ％Ach  ED50Ach ％NTG  ED50NTG  O2 -数
 NC-S  97±2  2.5×10-8 104±2  7.1×10-9  1478±352
 NC-E  97±3  3.2×10-8 107±2  5.7×10-9  1110±373
 HC-S  61±4#  1.2×10-7# 104±3  1.3×10-8  3445±863#
 HC-E  82±6*  6.8×10-8 112±4  1.0×10-8  1400±504*
                   *＝p≤0.01vs.HC-S，#＝p＜0.05vs.NC-S和NC-E
结论：在饮食诱导的动脉粥样硬化中，艾普利螺酮可增强内皮功能，减少O2 -产生。这些数据提供证据表明，艾普利螺酮将为内皮功能受到损害的疾病提供另外一种治疗策略。
用于说明药代动力学数据的缩写：
ANCOVA协方差分析
AUC血浆浓度-时间曲线下的面积
Cmax最大血浆浓度
Cmin最小血浆浓度
CI置信区间
CL/F表观血浆清除率
CRF病例报告形式
CV变异系数
Kel末期消除速率常数
Iqc最终可定量浓度
T1/2血浆消除半衰期
Tmax达到最大血浆/血液浓度的时间
XU采集的尿中的分析物总量
实施例A-11：药代动力学研究
为了获得艾普利螺酮的药代动力学数据，进行5项研究(包括对日本人(日本)和欧洲人(在日本之外)受试者进行的单次给药和多次给药耐受性和食物影响试验)。总共76名欧洲受试者和38名日本受试者参加了单次给药和多次给药耐受性和食物影响试验。其中3项研究是在日本之外的研究，包括10mg-1000mg的剂量。其它两项研究在日本进行，包括50mg-600mg的剂量。
日本之外的试验包括：(i)单次给药耐受性试验，和(ii)多次给药耐受性试验，和(iii)食物影响研究。日本之外的单次给药试验研究10、50、100、300或1000mg剂量的艾普利螺酮的施用。给予40名健康男性受试者单次口服艾普利螺酮。日本之外的多次给药耐受性试验研究以100、300和1000mg剂量施用11天的艾普利螺酮的多剂量效应。以剂量逐渐升高的方式对24名健康男性施用艾普利螺酮。日本之外的食物影响研究在12名健康男性中进行，他们以交叉方式在两个不同的时机(即在禁食过夜后或消费高脂肪(75g)食物之后立即)接受单次口服100mg剂量艾普利螺酮。
单次给药和多次给药耐受性试验都在日本进行，使用健康男性日本受试者。日本人单次给药耐受性试验在32名受试者中研究50、100、200、400和600mg单次口服艾普利螺酮剂量的施用。接受100mg剂量的6名受试者也参加单次给药耐受性试验的食物影响处理组。这6名受试者以交叉方式在两个不同的时机接受单次100mg口服艾普利螺酮；在禁食过夜后或消费脂肪食物之后立即。多次给药耐受性试验(JE3-99-06-401)在6名健康男性受试者中进行，他们每日一次接受7次艾普利螺酮400mg。
综合来自所有5项研究的单次给药空腹药代动力学数据，对剂量标准化的Cmax和AUC值进行以国家(日本、日本外)、限于国家内的(nested)研究和剂量为因素的方差分析，以评价国家(人群)的影响。对最低剂量进行剂量标准化(单次给药10mg，多次给药100mg)。在没有静脉内数据时，分布容积(V/F)和清除率(CL/F)参数以表观值表示，并依70kg体重标准化。对于分析的所有药代动力学参数，日本与日本之外的试验没有统计学显著的差异。不进行正式统计学分析和多次给药数据的比较，因为与日本外试验的3个剂量相比，日本试验中只有400mg艾普利螺酮的剂量。
图A-20到A-24和A-25到A-29分别显示由图形获得的艾普利螺酮和无活性开内酯环形式的艾普利螺酮的单剂量药代动力学参数与剂量。
表A-11A和A-11B显示日本外研究和日本研究中艾普利螺酮与其无活性开内酯环的单剂量药代动力学参数的最小均方。对于评价的所有衍生参数，日本与日本外人群之间没有统计学显著差异。
表A-11C包括日本和日本外食物影响试验中进食和禁食方案的几何最小均方，均方比和均方比的相应的95％置信区间(CI)。顺序、顺序内嵌套(nested)受试者、周期和方案的方差分析(ANOVA)模型用来分析Cmax和AUC参数，因此获得几何最小均方，均方比，和均方比的95％CI。
表A-11D和A-11E显示日本外100、300、1000mg艾普利螺酮剂量和日本400mg艾普利螺酮剂量试验的剂量标准化药代动力学参数的算术平均值。不进行正式统计学分析，实际衍生的数据只是为了比较。
日本与日本外单剂量药代动力学数据的比较显示衍生的药代动力学参数之间没有统计学显著性差异。如AUC参数所反映的，在关于总体暴露(total exposure)的日本数据中发现的食物影响类似于日本外试验。日本试验的平均多剂量药代动力学参数(400mg)与日本外试验获得的数据较好地排比。
表A-11A.单剂量艾普利螺酮药代动力学的最小均方
  日本   日本外   P值a
剂量标准化的Cmax(ng/ml)   120.0   131.0   0.412
剂量标准化的AUC(0-Iqc)hr·ng/ml   779.0   790.0   0.932
剂量标准化的AUC(0-inf)hr·ng/ml   826.0   792.0   0.782
CL/F(L/hr)   13.79   13.69   0.955
CL/F(L/hr/70kg)   13.52   14.44   0.639
Vss/F(L)   80.11   80.58   0.944
Vss/F(L/70kg)   81.42   83.83   0.796
a-F检验，P值，来自ANOVA模型的日本与日本外的比较
表A-11B.单剂量SC-70303药代动力学参数的最小均方
    日本     日本外     P值a
剂量标准化的Cmax(ng/ml)     9.71     8.93     0.518
剂量标准化的AUC(0-Iqc)hr·ng/ml     49.8     40.6     0.295
剂量标准化的AUC(0-inf)hr·ng/ml     52.4     48.5     0.669
a-F检验，P值，来自ANOVA模型的日本与日本外的比较
表A-11C.进食与禁食状态下艾普利螺酮药代动力学参数的最小均方
 日本外食物影响研究  进食  禁食  均值比(95％置信区间) P值a
 Cmax(ng/ml)  1318  1619  0.814(0.745-0.889) 0.0004
 AUC(0-Iqc)hr·ng/ml  9647  8938  1.079(0.915-1.273) 0.328
 AUC(0-inf)hr·ng/ml  9781  9062  1.079(0.916-1.272) 0.324
 日本食物影响研究  喂养  禁食  均值比(95％置信区间) P值a
 Cmax(ng/ml)  1517  1311  1.157(1.070-1.252) 0.0066
 AUC(0-Iqc)hr·ng/ml  10818  8880  1.218(0.958-1.550) 0.085
 AUC(0-inf)hr·ng/ml  10929  8971  1.218(0.956-1.553) 0.087
a-F检验，P值，来自ANOVA模型的进食与禁食方案的比较
表A-11D.多剂量艾普利螺酮药代动力学参数的算术平均值
日本外多次给药研究 100mg  300mg  1000mg
剂量标准化的Cmax(ng/ml) 1903.6  1194.1  739.4
剂量标准化的AUC(0-24)hr·ng/ml 11771.99  8838.0  6324.9
CL/F(L/hr/70kg) 9.38  15.8  17.0
日本多次给药研究 400mg
剂量标准化的Cmax(ng/ml) 1030.8
剂量标准化的AUC(0-24)hr·ng/ml 6380.0
CL/F(L/hr/70kg) 16.2
表A-11E.多剂量SC-70303药代动力学参数的算术平均值
日本外多次给药研究 100mg  300mg  1000mg
剂量标准化的Cmax(ng/ml) 128.5  121.4  83.03
剂量标准化的AUC(0-24)hr·ng/ml 663.4  733.4  631.0
日本多次给药研究 400mg
剂量标准化的Cmax(ng/ml) 84.68
剂量标准化的AUC(0-24)hr·ng/ml 467.5
该研究是一项单盲、随机化、安慰剂对照、口服剂量增加的顺序组研究，其中40名健康日本男性受试者使用5组艾普利螺酮剂量之一(50、100、200、400和600mg)。每组包括施用艾普利螺酮的6名受试者和施用安慰剂的2名受试者。6名受试者以交叉设计在同一研究中评价食物的影响，方法是在禁食和进食状态下单次施用100mg艾普利螺酮。在48小时内采集系列血液和尿液标本，评价艾普利螺酮的药代动力学。
测定的所有临床实验室参数未发现临床显著的异常，参加该研究的所有志愿者均未报告不良反应。
实施例A-12：日本人多次给药药代动力学研究
日本受试者的多次给药安全性和药代动力学研究在日本进行。这是一项单盲、随机化、安慰剂对照的研究。总共8名日本男性受试者参加该研究(6名接受每日一次400mg剂量的艾普利螺酮，2名接受安慰剂，连续7天)。在整个研究期间采集系列血液和尿液标本，在第一天单次给药后和给药7天后测定药代动力学、肾脏和激素参数。
一名接受艾普利螺酮的受试者在第2天感到轻微的疲劳，但是其它所有人均未报告其它不良反应。
实施例A-13：肝损伤
这是一项在16名健康受试者和16名中度肝损伤受试者中进行的开放标记、多次给药研究。根据Child-Pugh分类***，受试者的损伤程度为B级(有腹水)。这些肝损伤个体根据性别、年龄、体重和吸烟状态与正常健康志愿者进行匹配。
所有参加研究者都在第1天早晨接受一次400mg剂量的艾普利螺酮。他们在第2天不接受研究药物。受试者在第3-7天接受一次400mg剂量的艾普利螺酮。在给药前和给药后的第1天和第7天采集血液及尿液标本进行药代动力学分析。
对于肝损伤的受试者，允许对受试者的肝病或其并发症进行治疗。不允许能够影响研究结果的治疗。任何伴随药物的给药在整个研究中以一致的方案进行。
受试者从第一次给予研究药物前5天到给药期结束时给予控制盐的饮食(每日50mEq钠和80mEq钾)。在研究药物施用期间，测定基线及每个24小时时间内的肌酸酐清除率和钠***率。
比较中度肝损伤受试者和健康受试者中艾普利螺酮的生物利用度，主要是根据对数标准化的药代动力学反应变量的几何均值比和均值比的95％置信区间。几何均值比和均值比的95％置信区间根据下列步骤得出：应用SAS GLM方法的LSMEANS选项获得最小的差异和由ANCOVA获得的它们对应的标准差估计值，为平均差构建95％置信区间；反对数转化平均差和平均差的置信区间终点，获得几何均值比和均值比的95％置信区间。
分别总结两个肝脏组在第4-8天的艾普利螺酮的血浆浓度(Cmin)。重复测定分析第6-8天的艾普利螺酮的Cmin数据，评价通过每日一次艾普利螺酮400mg的多次给药，到第4天艾普利螺酮是否达到稳态。
线性动力学评价是根据多次给药AUC0-24和单次给药AUC0-∞的比较，这种比较使用多次给药AUC0-24与单次给药AUC0-∞之间的几何平均数之比，和均值比的95％置信区间，这是使用对数转换的AUC数据由配对t检验获得的。
由于正常受试者与肝损伤受试者匹配，所以肝损伤受试者与匹配的正常受试者之间在性别、体重和年龄上没有统计学显著的差异。在每一个肝功能和匹配的正常组中，受试者主要是高加索人(≥82％)。受试者年龄介于32-64岁之间，每组平均年龄约为46-51岁。每组中的大部分受试者为男性(≥65％)。
肝损伤的病因被确定为主要是酒精性肝硬化(56％)，随后是感染性肝硬化(17％)、慢性活动性肝炎(6％)，和其他(17％)。中度肝损伤的受试者已经诊断平均6.6年。报告28％(5/18)的中度损伤受试者和35％(6/17)的匹配正常受试者吸烟。
表A-13A单次及多次给药后艾普利螺酮的统计学概要
艾普利螺酮
单次给药 多次给药
参数      (a) 正常       中度 正常        中度
AUC(ng/mL*hr)(b)n均值％CV 16         1731015.37   51438.98(38.73)    (46.50) 17          1633784.48    48821.25(46.94)     (32.87)
Cmax(ng/mL)n均值％CV 17         183840.23    3787.53(28.30)    (35.69) 17          183883.18     4168.10(33.17)     (26.95)
Tmax(hr)n均值％CV 17         182.03       2.56(49.64)    (42.38) 17          182.12        2.81(49.05)     (50.83)
T1/2(hr)n均值％CV 16         176.31       6.78(37.20)    (25.49) 17          187.61        8.07(26.67)     (26.58)
CL/F(L/hr)(c)n均值％CV 16         1715.21      10.51(46.33)    (81.02) 17          1613.82       8.96(36.01)     (29.33)
XU0-48(μg)n均值％CV 16         148.78       10.27(64.97)    (75.25) 16          109.12        16.92(86.79)     (71.42)
对于艾普利螺酮药代动力学参数，几何最小均方、95％置信区间和相应的p值在表A-13B中列出。
表A-13B.生物利用度评价
     参数 最小均方 中度/正常均值比均值比的 95％置信区间 p值
 中度损伤  正常
    艾普利螺酮单次给药AUC(0-∞)(ng/mL*hr)AUC(0-lqc)(ng/mL*hr)CL/F(L/hr)Cmax(ng/mL)Tmax(hr)XU(0-48)(mg) 43578.342766.89.23406.82.77.9 29114.130276.513.73812.52.17.8 1.4971.4130.6680.894--1.016 (1.056，2.121)(1.004，1.988)(0.471，0.947)(0.723，1.105)--(0.540，1.915) 0.025*0.048*0.025*0.2880.0840.958
    艾普利螺酮多次给药AUC(0-24)(ng/mL*hr)CL/F(L/hr)Cmax(ng/mL)Tmax(hr)XU(0-48)(mg) 43765.99.13808.82.914.9 30066.413.33674.62.17.4 1.4560.6871.037--2.007 (1.163，1.821)(0.549，0.860)(0.863，1.245)--(1.007，3.999) 0.002**0.002**0.6930.0910.047*
    *p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001
表A-13C线性动力学评价
    参数               最小均方  AUC0-24/AUC0-∞的均值比   均值比的95％CI
 单次给药AUC0-∞ 多次给药AUC0-24
艾普利螺酮中度肝损伤正常 49815.4728713.97 47239.7829318.67 0.951.02 (0.84，1.07)(0.93，1.12)
对第6-8天血浆浓度的反复测定分析的结果表明，艾普利螺酮的稳态浓度在每日一次艾普利螺酮400mg给药的第4天达到(正常受试者每日效应的p值为0.0761，中度肝损伤受试者为0.1118)。
在单次给药3小时后和多次给药后的所有时间点，中度肝损伤受试者的艾普利螺酮血浆浓度均一直高于正常受试者(图A-30)。
这项研究表明，中度肝损伤不会不利地影响艾普利螺酮的代谢。在单次(400mg)和多次(400mg每日一次艾普利螺酮施用后，中度肝损受试者的血浆艾普利螺酮的暴露(由AUC代表)统计学显著地高于匹配的正常受试者(对于艾普利螺酮，高41-50％)。艾普利螺酮的稳态血浆浓度在每日一次400mg艾普利螺酮多次给药后的第4天达到。
在单次(AUC0-∞，43578.3对29114.1ng/mL hr)和多次(AUC0-24，43765.9对30066.4ng/mL hr)给药后，中度肝损伤受试者的AUC值统计学显著地高于匹配的正常受试者。在中度肝损伤受试者中，在单次给药后平均艾普利螺酮AUC值比匹配的正常受试者高41-50％，在多次给药后高46％。然而这两个受试组之间，平均峰艾普利螺酮血浆浓度(Cmax)和达到艾普利螺酮Cmax的时间(Tmax)没有统计学显著性差异。对于艾普利螺酮，建立了艾普利螺酮400mg每日一次多次给药后的线性动力学。对于两组受试者，平均AUC值之比(AUC0-24/AUC0-∞)的95％置信区间包括相等点1.0。对第6-8天血浆浓度的反复测定分析表明，在两个受试组中，艾普利螺酮的稳态浓度都在艾普利螺酮400mg每日一次给药后的第4天达到(每日效应的p值≥0.0761)。
虽然在中度肝损伤受试者的总体暴露高于正常受试者，但是该研究药物似乎在受试组中同样良好耐受。35％的正常肝功能受试者和44％的中度肝损伤受试者报告有不良反应。不良反应主要是轻度至中度，与研究药物有不确定的或可能的关系。尚未报告导致退出的不良反应或严重的不良反应。
艾普利螺酮施用后，中度肝损伤受试者的血浆艾普利螺酮暴露(由AUC代表)统计学显著地高于匹配的正常受试者(对于艾普利螺酮，高41-50％)。艾普利螺酮的稳态血浆浓度在每日一次艾普利螺酮400mg多次给药后的第4天达到。中度肝损伤受试者的艾普利螺酮暴露高于正常受试者，但该研究药物似乎在这两个受试组中同样良好耐受。
实施例A-14：艾普利螺酮在治疗高血压中的临床效能
在高血压患者中进行一项多中心、随机、双盲、平行组研究。该研究设计为比较一定剂量范围的艾普利螺酮(EPL)和安慰剂(PL)对血压(BP)、耐受性和安全性的影响。施用螺内酯(SPL)作为活性对照。该研究包括一个为期两周的预处理期，用来完成筛选程序和任何当前的抗高血压治疗的终止。筛选期后是一个为期4周的单盲安慰剂引入治疗期。随机分配之后是一个为期8周的双盲主动或安慰剂处理期。
主要效能量度是与安慰剂相比，测量的袖带舒张期血压距基线的变化。次要效能量度包括袖带测量的收缩期血压的变化和通过动态血压监测获得的24小时平均收缩期血压和舒张期血压的变化。安全性通过进行常规临床实验室检验、体检、ECG和不良反应的监测来评价。
总共417名患者随机分配，接受3种每日剂量之一：(1)艾普利螺酮(50、100或400mg，每日一次或分次施用)，(2)螺内酯(100mg/天，分次施用)，或者(3)安慰剂。最终一次访视距基线的校正血压均值变化(mmHg)在表A-14A中显示。
表A-14A：用艾普利螺酮、螺内酯和安慰剂双盲治疗期间的血压变化
 EPL  SPL  PL
方案(毫克/天) 50mg(25 BID) 50mg(50 QD) 100mg(50 BID) 100mg(100 QD) 400mg(200 BID) 400mg(400QD) 100mg(50 BID)
 Cuff  DBPSBP -4.4-8.1 -4.5-4.4 -7.8-11.7 -4.4-7.9 -8.9-14.8 -8.7-15.0 -9.5-16.7 -1.11.6
 ABPM  DBPSBP -4.1-7.5 -5.1-6.2 -6.6-11.6 -5.6-9.6 -9.0-16.1 -7.7-13.7 -8.7-15.8  0.40.0
 ABPM＝动态血压监测QD＝每日一次BID＝每日两次
这些反应与安慰剂显著不同(p±0.05)。24小时ABPM DBP和SBP在波谷时的下降(最后4小时)是相似的，无论EPL是每日一次还是每日二次施用。对于所有剂量，每日一次和每日二次方案的峰/谷比都是相似的(1.04-1.10)，表明每日一次施用艾普利螺酮在24小时内有持续的抗高血压效能。艾普利螺酮可很好的耐受，不良反应发生率与安慰剂相似，无男性***发育的报道。
主要和次要效能量度的亚组分析能够对基于如下因素的基线记录的亚组进行：种族(黑人、非黑人、日本人等)、性别、年龄、血浆肾素水平、醛固酮/肾素活性比、尿钠/钾比、患糖尿病、高血压史、心力衰竭史、肾功能障碍史等。基于连续量度如年龄的亚组可在中值处对分。
实施例A-15：艾普利螺酮与依那普利单用及联用在左心室肥大及原发性高血压患者中的效能和安全性的对比研究
进行一项临床研究，在治疗9个月后，在左心室肥大(LVH)和原发性高血压患者中评价单独和联合施用的艾普利螺酮和依那普利对血压(BP)变化和通过磁共振(MRI)测量的左室心肌重量(LVM)变化的影响。该研究是一项多中心、随机、双盲、安慰剂加入的平行组试验，包括最少150名LVH和原发性高血压患者，包括为期1-2周的预处理筛选期，随后是为期2周的单盲安慰剂加入期和为期9周的双盲治疗期。
进入单盲安慰剂加入期(run-in)的患者(1)事先的心电图显示LVH，这是根据(a)Sokolow Lyon电压标准(Sokolow M等人AmHeart J 1949；37：161)，或(b)Devereux标准(对于男性，LVMI＝134g/m2，对于女性，＝110g/m2；见Neaton JD等人JAMA1993；27：713-724)；(2)坐位(seated)血压如下：(a)如果目前用抗高血压药物治疗，seDBP＜110mmHg且seSBP＝180mmHg，或者(b)如果当前未用抗高血压药物治疗，seDBP＝85mmHg且＜114mmHg，seSBP＞140mmHg且＝200mmHg。
在单盲安慰剂加入期间，在第2次访视时，所有患者必定有根据Devereux标准能证实LVH的超声心动图。在完成2周的单盲安慰剂加入期后并接受MRI检查后，经中心实验室核准接受，患者被随机分到艾普利螺酮、依那普利或艾普利螺酮+依那普利10mg三组中的一组。在双盲治疗的前两周，患者接受(1)艾普利螺酮50mg+安慰剂，(2)依那普利10mg+安慰剂，或(3)艾普利螺酮50mg+依那普利10mg。第二周，对于所有患者，研究药物的剂量增加至(1)艾普利螺酮100mg+安慰剂，(2)依那普利20mg+安慰剂，或(3)艾普利螺酮100mg+依那普利10mg。第四周，对于所有患者，研究药物的剂量增加至(1)艾普利螺酮200mg+安慰剂，(2)依那普利40mg+安慰剂，或(3)艾普利螺酮200mg+依那普利10mg。表A-15A说明上述给药方案。
表A-15A.研究药物的剂量水平
剂量水平   随机化研究药物  片/胶囊数
艾普利螺酮 依那普利 艾普利螺酮+依那普利
安慰剂加入  安慰剂  安慰剂 安慰剂  1片/1粒胶囊
剂量1  50mg  10mg (50+10)mg  1片/1粒胶囊
剂量2  100mg  20mg (100+10)mg  1片/1粒胶囊
剂量3  200mg  40mg (200+10)mg  2片/2粒胶囊
氢***12.5mg
氨氯地平10mg
如果血压第8周未被控制(DBP＝90mmHg或SBP＞180mmHg)，将增加开放标记的氢***(HCTZ)12.5mg。如果血压第10周未被控制，(1)如果第8周开始施用HCTZ，HCTZ剂量加至25mg，或者(2)如果第8周时未施用，加用HCTZ 12.5mg。如果血压在第12周时未被控制，(1)如果以前在第8周或第10周时未施用HCTZ，加用开放标记的HCTZ 12.5mg，或者(2)如果在第10周HCTZ剂量不足25mg，HCTZ剂量加至25mg，或者(3)如果患者已接受HCTZ 25mg，加用氨氯地平10mg。如果在16周或在以后的任一次访视中，患者显示持续未控制的DBP(即seDBP＝90mmHg或seSBP＞180mmHg，在间隔3-10天的连续两次访视中一直如此)，患者将退出该研究。
如果患者只进行双盲治疗并在试验中的任何时间出现有症状的低血压，也将退出试验。施用开放标记药物的患者将按照与增加时相反的顺序将开放标记药物减量。如果在停用所有开放标记药物后仍然存在有症状的低血压，则患者退出试验。此研究期间的任何时间，如果在间隔1-3天的连续两次测量时，重复测量的血清钾水平升高＞5.5mEq/L(BUN和肌酸酐水平也下降，样品分开，送往当地和中心实验室，根据当地的值做出处理决定)，则患者退出该研究。注意：如果BUN和/或肌酸酐水平显著升高超过基线(肌酸酐＝2.0mg/dL或为基线值的1.5倍，或者BUN＝35mg/dL或为基线值的2倍)，患者应当进行下列医学处理，直至恢复。
患者将返回诊所，在第0、2、4、6、8、10、12、16周时及之后总共9个月每月一次进行评价。心率、血压、血清钾水平和不良反应将在每次访视时评价。BUN和肌酸酐水平在第2周和第6周测定。关于临床安全性的其它血液实验室评价将每月进行。常规尿液分析每3个月进行1次。神经激素分布(血浆肾素[总的和活性的]、血清醛固酮和血浆皮质醇)和特殊研究(PIIINP、PAI、微量蛋白尿和tPA)将在第0周和第12周及第6个月和第9个月进行。用于基因分型的血样在第0周采集。在筛选时和第9个月，进行12导联ECG和体检。在第0周和第9个月进行MRI，评估左室心肌重量的变化，血样的贮存，血样的甲状腺刺激激素(TSH)，和24小时采集的尿的白蛋白、钾、钠和肌酸酐。在第0、12周和第6、9月时进行24小时尿采集，分析尿醛固酮。如果提前终止，则对接受至少3个月双盲治疗的患者进行MRI和血样TSH检测。在第0、12周和第6、9月时，收集所有患者的药物经济学数据。
下列示意图说明研究方案：
Figure A0182394601281
(1)根据超声心电图或心电图为LVH。
(2)未控制血压的拯救标准如章节4.5所述。
(3)MRI。
(4)增量。在研究期间的任一时间，如果在间隔1-3天的连续两次访视时，重复测定的血清钾升高(K＞5.5mEq/L)，患者必须退出。
(5)如果DBP≥90mmHg或SBP＞180mmHg，开放标记的加用HCTZ 12.5mg。
(6)开放标记的加用HCTZ 12.5mg(如果第8周时未进行)；或者如果在第8周加入HCTZ 12.5mg，则将HCTZ剂量加到25mg，如果DBP≥90mmHg或SBP＞180mmHg。
(7)如果血压第12周时未被控制，将加用开放标记的HCTZ 12.5mg(如果在第8周或第10周时没有加用)；或者HCTZ剂量加到25mg(如果在第10周时未用)；或者加用氨氯地平10mg(如果患者接受HCTZ 25mg)。
(8)如果第16周时，或者在之后的任一次访视时，患者显示持续未控制的血压，即seDBP≥90mmHg或seSBP＞180mmHg，在间隔1-3天的连续两次访视时一直如此，则患者退出研究。
Pbo＝安慰剂
En＝依那普利
效能的主要量度是艾普利螺酮组相对于依那普利组中，根据MRI评价的LVM距基线的改变。另外，也通过tertile在患者的盐敏感性程度方面评价效能(其中根据盐攻击导致的血压反应凭经验确定tertile)。
效能的次要量度包括下列：(1)三个治疗组中LVM距基线的改变；(2)三个治疗组的每一个中，坐位波谷袖带DBP(seDBP)和SBP(seSBP)距基线的改变；(3)主动脉顺应性和心室灌注参数；和(4)特殊研究(PIIINP、微量蛋白尿、PAI和tPA)。另外，也比较三个治疗组的长期安全性和耐受性。
该研究的主要目的是比较依那普利相比艾普利螺酮对LVH患者及原发性高血压患者的左心室重量(LVM)变化的影响。该研究的次要目的包括：(1)比较三个治疗组中LVM距基线的改变；(2)通过测量坐位袖带波谷DBP和SBP，比较三个治疗组的抗高血压作用；(3)通过MRI分析，比较三个治疗组对主动脉顺应性和心室灌注参数的影响；(4)通过测定III型前胶原的氨基末端前肽[PIIINP]，比较三个治疗组对血浆纤维化标记物的影响，通过测定微量蛋白尿评价对肾小球功能的影响，以及通过测定纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)和组织纤溶酶原激活剂(tPA)评价对纤维蛋白溶解平衡的影响；和(5)比较三个治疗组的长期安全性和耐受性。
主要和次要效能量度的亚组分析能够对基于如下因素的基线记录的其它亚组进行：性别、年龄、血浆肾素水平、醛固酮/肾素活性比、尿钠/钾比、患糖尿病、高血压史、心力衰竭史、肾功能障碍史等。基于连续量度如年龄的亚组可在中值处对分。
实施例A-16：艾普利螺酮和洛沙坦在低肾素性高血压患者中的比较研究
进行一项临床研究，比较艾普利螺酮和洛沙坦在低肾素性高血压患者中的抗高血压作用。该研究是一项个多中心、双盲、随机、安慰剂加入的平行组试验，包括最少150名患者。每名患者通过盐攻击单向试验检测盐敏感性。该试验也包括为期1-3周的预处理筛选期，随后是为期2-3周的单盲安慰剂加入期和为期16周的双盲治疗期。在完成安慰剂加入期并且经过连续两次***访视满足进入血压(BP)标准(平均坐位舒张期血压[seDBP]＝90mmHg和＝115mmHg，平均坐位收缩期血压[seSBP]＜200mmHg)后，患者随机接受艾普利螺酮或洛沙坦。患者前4周接受艾普利螺酮100mg或洛沙坦50mg。如果第4周时血压未被控制(DBP＝90mmHg)，研究药物的剂量将增至艾普利螺酮200mg或洛沙坦100mg。如果第8周血压未被控制，加用氢***(HCTZ)12.5mg。如果第12周时血压未被控制，若第8周时未用HCTZ，可加用HCTZ 12.5mg；或者，若第8周时已开始施用HCTZ，HCTZ剂量可加至25mg。患者继续治疗直到第16周。表A-16A说明上述给药方案。
表A-16A.研究药物的剂量水平
剂量水平  随机化研究药物  每日艾普利螺酮片/洛沙坦胶囊数*
 艾普利螺酮  洛沙坦
安慰剂加入  安慰剂  安慰剂  1片/1粒胶囊
水平1  100mg  50mg  1片/1粒胶囊
水平2  200mg  100mg  2片/2粒胶囊
*“艾普利螺酮片剂”是指活性艾普利螺酮或与其匹配的安慰剂，“洛沙坦胶囊”是指活性洛沙坦或与其匹配的安慰剂
心率、BP、血清钾水平和不良反应将在每次访视时评价(第0、2、4、6、8、10、12、14和16周)。第0周，采集血样进行基因分型和贮存保持，以及24小时尿样，用来测定醛固酮、钾、钠、肌酸酐和肌酸酐清除率；保存采集的第0周24小时尿的一等份。血浆肾素在筛选时测定；血清醛固酮、血浆肾素和血浆皮质醇将在第0、8、16周测定。关于临床安全性的其它实验室评价(血液学、血液化学和尿液分析)将在第0、4、8、12、16周进行。12导联心电图检查将在第0周和第16周进行。体检在筛选时和第16周进行。
下列示意图说明研究方案：
(1)未被控制的血压的拯救标准如章节4.5所述。
(2)患者必须在连续两次访视时满足进入血压标准，适合双盲阶段。
(3)血样用于基因分型。
(4)如果血压未被控制(DBP≥90mmHg)，则提高剂量至艾普利螺酮200mg或洛沙坦100mg。
(5)如果血压未被控制(DBP≥90mmHg)，则加用HCTZ 12.5mg。
(6)如果血压未被控制(DBP≥90rnmHg)，如果第8周时未加用，则加用HCTZ 12.5mg，或者，如果第8周时已经加用12.5mg，则将HCTZ加倍至25mg。
效能的主要量度是在第8周和第16周时，艾普利螺酮与洛沙坦之间，波谷袖带seDBP距基线的均值变化。另外，也通过tertile在患者的盐敏感性程度方面评价效能(其中根据盐攻击导致的血压反应的增强凭经验确定tertile)。
效能的次要量度包括下列：(1)第8周和第16周时波谷袖带seSBP距基线的均值变化；(2)需加用HCTZ的患者的百分数；和(3)达到目标血压(DBP＜90mmHg)或DBP降低＝10mmHg的患者的百分数。其他次要量度可以用来评价艾普利螺酮和洛沙坦治疗患者中，seDBP距基线的改变与治疗前醛固酮/肾素比值和24小时尿检(尿醛固酮、钾、钠、肌酸酐、肌酸酐清除率)之间的关系，并通过报告的不良反应、临床实验室评价、体检和心电图评价艾普利螺酮和洛沙坦的安全性和耐受性。
对低肾素高血压患者的这项研究，比较艾普利螺酮的效能与选择性血管紧张素II受体拮抗剂洛沙坦的效能。在第8周和第12周，两个治疗组中高血压未被控制的患者均可加用氢***(HCTZ)。HCTZ可激活RAAS，因此说明激活在每种药物成功中的作用。本研究的主要目的是对比低肾素高血压患者中第8周和第16周时，艾普利螺酮和洛沙坦所致坐位波谷袖带血压(seDBP)距基线的均值变化。本研究的次要目的包括：(1)比较艾普利螺酮与洛沙坦治疗的患者中，第8周和第16周时坐位袖带收缩期血压(seSBP)距基线的的均值变化，需加用HCTZ的患者的百分比，达到目标血压(DBP＜90mmHg或DBP降低＝10mmHg)的患者的百分比；(2)评价艾普利螺酮和洛沙坦治疗的患者中，seDBP距基线的改变与预处理前醛固酮/肾素比值和预处理24小时尿检(尿醛固酮、钾、钠、肌酸酐、肌酸酐清除率)之间的关系；和(3)通过报告的不良反应、临床实验室评价、体检和心电图评价艾普利螺酮和洛沙坦的安全性和耐受性。
主要和次要效能量度的亚组分析能够对基于如下因素的基线记录的亚组进行：种族(黑人、非黑人、日本人等)、性别、年龄、尿钠/钾比、患糖尿病、高血压史、心力衰竭史、肾功能障碍史等。基于连续量度如年龄的亚组可在中值处对分。
实施例A-17：艾普利螺酮与安慰剂以及与洛沙坦在黑人和白人高血压患者中的抗高血压作用和安全性的比较研究
进行一项临床研究，在黑人高血压患者和白人高血压患者中比较艾普利螺酮与安慰剂以及与洛沙坦的抗高血压作用和安全性及耐受性。在该研究中，高血压被定义为坐位舒张期血压(DBP)＝95mmHg且＜110mmHg，坐位收缩期血压(SBP)＜180mmHg。该研究是一项多中心、随机、双盲、安慰剂和活性控制、安慰剂加入的平行组试验，包括最少500名随机分配的黑人和白人轻度至中度高血压患者。每名患者通过盐攻击单向试验测定盐敏感性。该实验还包括为期1-2周的治疗前筛选期，随后是为期2-4周的单盲安慰剂加入期，和为期16周的双盲治疗期。黑人患者和白人患者将以大约2∶1的比例进入该研究，在每个研究中心平衡并预先分类。在单盲安慰剂加入期结束后，符合的患者被随机分配，接受艾普利螺酮、安慰剂或洛沙坦。
在双盲治疗的前4周，患者将接受艾普利螺酮50mg、洛沙坦50mg或相匹配的安慰剂。如果在第4、8或12周血压(BP)未被控制(DBP＝90mmHg或SBP＝140mmHg)，研究药物的剂量将加至艾普利螺酮100mg、洛沙坦100mg或相匹配的安慰剂。对于血压充分控制的患者剂量不变。如果在第8周或第12周时血压未被控制(DBP＝90mmHg或SBP＝140mmHg)，且患者施用艾普利螺酮100mg、洛沙坦100mg或相匹配的安慰剂，则剂量增加到艾普利螺酮200mg、洛沙坦100mg或相匹配的安慰剂。在第2、6、10、14周时，研究药物的剂量不再增加，以使现有剂量充分发挥作用。表A-17A说明上述给药方案。
表17-17A.研究药物的剂量水平
  剂量水平                       随机化研究药物   片/胶囊数
艾普利螺酮   洛沙坦     安慰剂
  安慰剂加入 相匹配的安慰剂   相匹配的安慰剂 相匹配的安慰剂   1片/1粒胶囊
  剂量1 50mg   50mg 相匹配的安慰剂   1片/1粒胶囊
  剂量2 100mg   100mg 相匹配的安慰剂   2片/2粒胶囊
  剂量3 200mg   100mg 相匹配的安慰剂   2片/2粒胶囊
如果在第12周或之后血压未被控制(DBP＝95mmHg或SBP＝150mmHg)，且患者使用最高耐受剂量的研究药物，他/她应退出该研究。如果在研究期间的任何时间发生有症状的低血压(即与低血压有关的头昏目眩、眩晕或昏厥)，研究药物可以减至较低的剂量；然而，如果患者使用最小剂量的研究药物(艾普利螺酮50mg，洛沙坦50mg或相匹配的安慰剂)，或者如果在试验期间的任何时间在间隔1-3天的连续两次访视时，DBP＝110mmHg或SBP＝180mmHg，则患者退出。患者将接受总共16周的研究药物。
患者将返回诊所，在第0、2、4、6、8、10、12、14、16、17周时进行评价。心率、血压、体重、血清钾水平和不良反应将在每次访视时评价。关于安全性的血液学和生物化学评价和尿液分析将在第0、16、17周或最后一次访视时进行。另外，神经激素分布(血浆肾素[总的和活性的]、血清醛固酮和血浆皮质醇)将在第0周和第16周或最后一次访视时检测。用于测定微量蛋白尿的尿斑在第0周和第16周或最后一次访视时采集。12导联心电图和体检将在筛选时和第17周或最后一次访视时进行。
作为该试验的一部分，进行每组(arm)100名患者的子研究(总共300名患者)，测定人群的药代动力学。对血浆艾普利螺酮浓度的检测在第0天、访视3A和5A时进行。在第0天和访视3A和5A时采集2份7mL血样。在第0天时，第一份血样在0小时(给药前)采集，第二份血样在研究药物第一次给药1小时后采集；对于访视3A和5A，患者将按照他/她返回诊所前预定的时间，在早晨服用研究药物，两份血样间隔1小时采集。在访视3A和5A时，患者安排一个早晨或一个下午访视。
以下示意图说明研究方案：
(1)在研究期间的任何时间，如果在间隔1-3天的连续两次访视时，患者的DBP≥110mmHg或SBP≥180mmHg，患者退出该研究。
(2)如果血压未被控制(DBP≥90mmHg或SBP≥140mmHg)，则增加剂量至艾普利螺酮100mg或洛沙坦100mg或相匹配的安慰剂。
(3)如果血压未被控制(DBP≥90mmHg或SBP≥140mmHg)，如果以前的剂量是艾普利螺酮100mg或洛沙坦100mg或相匹配的安慰剂，则提高剂量至艾普利螺酮200mg或洛沙坦100mg加安慰剂或相匹配的安慰剂。
(4)如果在试验期间的任何时间发生有症状的低血压，且患者不是使用最小剂量的研究药物，剂量可以降低到研究药物的较低剂量；然而，如果患者使用最小剂量(艾普利螺酮50mg或洛沙坦50mg或相匹配的安慰剂)，他/她必须退出。
(5)采集群体PK样品。
(6)如果在间隔1-3天的连续两次访视时，钾水平升高(钾浓度＞5.5mEq/L)，如果使用最小剂量的研究药物，患者必须退出。如果不是最小剂量，研究药物可以降低一个水平。在研究药物减量后，如果间隔1-3天钾仍然＞5.5mEq/L，患者必须退出。如果在间隔1-3天的连续两次访视时，钾水平＞5.0mEqL但≤5.5mEq/L，研究药物不必加量。在这种情况下，如果在第12周之前DBP≥90mmHg或SBP≥140mmHg，或者在第12周时或之后DBP≥95mmHg或SBP≥150mmHg，患者必须退出。
(7)如果在第12周之前血压未被控制(DBP≥90mmHg或SBP≥140mmHg)，或者在第12周时或之后，DBP≥95mmHg或SBP≥150mmHg，且患者使用最大剂量的研究药物，他/她必须退出该研究。
效能的主要量度是在所有患者(黑人和白人)中，艾普利螺酮与安慰剂在第16周时所致坐位波谷袖带DBP距基线的均值变化。另外，也通过tertile在患者的盐敏感性程度方面评价效能(其中根据盐攻击导致的血压反应的增强凭经验确定tertile)。主要安全性终点是16周时间内严重的和不严重的不良反应、退出和实验室异常。
次要终点如下：(1)第16周时，在种族组之内和之间，艾普利螺酮与安慰剂所致坐位波谷袖带DBP距基线的均值变化；(2)第16周时，在所有患者中和种族组之内和之间，艾普利螺酮与洛沙坦所致坐位波谷袖带DBP距基线的均值变化；(3)第16周时，在所有患者中和种族组之内和之间，艾普利螺酮与安慰剂或洛沙坦所致坐位波谷袖带SBP距基线的均值变化；(4)第16周时，在所有患者中和种族组之内和之间，艾普利螺酮与安慰剂或洛沙坦所致微量蛋白尿距基线的均值变化，这根据尿白蛋白与肌酸酐之比确定；(6)第16周时，在所有患者中和种族组之内和之间，艾普利螺酮与安慰剂或洛沙坦所致血清钾、镁、钠、铝和肌酸酐距基线的均值变化；(7)第16周时，在所有患者中和种族组之内和之间，艾普利螺酮与安慰剂或洛沙坦所致神经激素分布(血浆肾素[总的和活性的]、血清醛固酮和血浆皮质醇)距基线的均值变化；(8)在所有患者中和种族组之内和之间，艾普利螺酮与安慰剂和洛沙坦相比，距基线的均值变化，关于神经激素、代谢、肾和抗高血压作用，选择的亚群例如女人、老年人(＝65岁)、肥胖(体重指数＝30kg/m2)、微量蛋白尿(尿白蛋白/肌酸酐比＞0.041mg白蛋白/mg肌酸酐)和特殊高血压患者(SBP＝160mmHg)；(9)相对于影响药物表观清除率的患者因素(变异系数)，艾普利螺酮的血浆浓度-时间分布。
本研究的主要目的是：(1)比较艾普利螺酮与安慰剂在所有轻度到中度高血压患者(黑人和白人)中的抗高血压作用，这根据第16周时的坐位舒张期血压(DBP)确定；(2)在16周治疗过程中比较艾普利螺酮与安慰剂在所有患者中的安全性和耐受性。
本研究的次要目的是：(1)在黑人和白人高血压患者之内和之间，比较艾普利螺酮与安慰剂的抗高血压作用，这根据DBP确定；(2)在所有患者和黑人与白人高血压患者之内和之间，比较艾普利螺酮与洛沙坦的抗高血压作用，这根据DBP确定；(3)在所有患者和黑人和白人高血压患者之内和之间，比较艾普利螺酮与洛沙坦的抗高血压作用，这根据坐位收缩期血压(SBP)确定；(4)在所有患者中和黑人和白人高血压患者之内和之间，比较艾普利螺酮与安慰剂或洛沙坦对肾功能的影响，这根据用于测定微量蛋白尿的斑尿确定；(5)在所有患者中和黑人和白人高血压患者之内和之间，比较艾普利螺酮与安慰剂或洛沙坦对肾的影响，这根据血清钾、镁、钠、铝和肌酸酐水平确定；(6)在所有患者中和黑人和白人高血压患者之内和之间，比较艾普利螺酮与安慰剂或洛沙坦对神经激素分布(血浆肾素[总的和活性的]、血清醛固酮和血浆皮质醇)的影响；(8)在所有患者中和黑人和白人高血压患者之内和之间，比较艾普利螺酮与安慰剂或洛沙坦对神经激素、代谢、肾和抗高血压作用的影响，选择的亚群例如：a)妇女；b)老年人(＝65岁)；c)肥胖(体重指数＝30kg/m2)；d)微量蛋白尿(微量蛋白尿＞0.041mg白蛋白/mg肌酸酐)；e)特定高血压患者(SBP＝160mmHg)；(9)模建艾普利螺酮的血浆浓度-时间分布，确定影响药物表观清除率的患者因素(变异系数)。
主要和次要效能量度的亚组分析能够对基于如下因素的基线记录的其它亚组进行：性别、年龄、血浆肾素水平、醛固酮/肾素活性比、尿钠/钾比、患糖尿病、高血压史、心力衰竭史、肾功能障碍史等。基于连续量度如年龄的亚组可在中值处对分。
实施例A-18：在2型糖尿病、白蛋白尿和高血压患者中，艾普利螺酮与依那普利抗高血压、肾和代谢作用的比较研究
进行一项临床研究，在2型糖尿病、白蛋白尿和高血压患者中比较艾普利螺酮与依那普利及其组合的抗高血压、肾和代谢作用。该研究是多中心、随机化、双盲、活性控制、安慰剂加入的平行组试验，包括最少200名随机分配的2型糖尿病、白蛋白尿和高血压患者。每名患者通过盐攻击单向试验检测盐敏感性。该试验还包括为期1-2周的预处理筛选期，随后是为期2-4周的单盲安慰剂加入期，和为期24周的双盲治疗期。在结束单盲安慰剂加入期后，符合的患者随机分配为三组之一：艾普利螺酮+安慰剂，依那普利+安慰剂，或艾普利螺酮+依那普利。在双盲治疗的前2周，患者接受艾普利螺酮50mg+安慰剂，依那普利10mg+安慰剂，或艾普利螺酮50mg+依那普利10mg。第2周，研究药物剂量增加到艾普利螺酮100mg+安慰剂，依那普利20mg+安慰剂，或艾普利螺酮100mg+依那普利10mg。第4周，剂量增加到艾普利螺酮200mg+安慰剂，依那普利40mg+安慰剂，或艾普利螺酮200mg+依那普利10mg。表A-18A说明上述给药方案。
表A-18A：研究药物的剂量水平
剂量水平  随机分配研究药物 片/胶囊数
 艾普利螺酮  依那普利 艾普利螺酮+依那普利
安慰剂加入  安慰剂  安慰剂 安慰剂  1片/1粒胶囊
剂量1  50mg  10mg (50+10)mg  1片/1粒胶囊
剂量2  100mg  20mg (100+10)mg  1片/1粒胶囊
剂量3  200mg  40mg (200+10)mg  2片/2粒胶囊
氢***12.5mg
氨氯地平10mg
如果第8周时血压(BP)未被控制(舒张期血压[DBP]＝90mmHg)，加用氨氯地平10mg作为第一种开放标记药物。如果第10周时DBP未被控制，若以前未使用，则加用氨氯地平10mg，或者若以前加用了氨氯地平10mg，则加用氢***(HCTZ)12.5mg作为第二种开放标记药物。如果第12周或之后血压未被控制，若以前未使用，则加用氨氯地平10mg，或者若以前加用了氨氯地平10mg，但以前没有加用HCTZ 12.5mg，则加用HCTZ 12.5mg，或者若以前加用了HCTZ12.5mg，则将HCTZ的剂量提高到25mg。如果在第15周或随后任一访视时，患者持续显示未控制的DBP＝95mmHg，在间隔3-10天的连续两次访视时一直如此，且患者接受如上所述的所有加用的开放标记药物，则患者须退出该研究。
如果发生有症状的低血压，且患者接受开放标记的加用药物，可以按照与加用时相反的顺序撤出加用的药物，直到低血压消失。如果患者不服用开放标记的药物，他/她必须退出该研究。
在研究期间的任何时间，如果在间隔3-10天的连续两次访视时一直DBP＝110或收缩期血压[SBP]＝180mmHg，或者如果经过重复测定(样品分开，送往地方和中心实验室)，血清钾水平升高(＞5.5mEq/L)，则患者必须退出。
患者将返回诊所，在第0、2、4、6、8、10、12、15、18、21、24、25周进行评价。心率、血压、体重、血清钾和不良反应将在每次访视时评价。关于安全性的血液学和生物化学评价和尿液分析将在第0、4、6、8、10、15、21、24、25周进行。胶原蛋白标记物(III型前胶原的氨基末端前肽[PIIINP]，IV型胶原蛋白的7S域[7SIVC]和I型胶原蛋白的端肽[ICTP])、纤维蛋白溶解平衡(纤溶酶原激活物抑制剂[PAI-1]、组织纤溶酶原激活物[t-PA])、胰岛素和糖基化血红蛋白将在第0、8、15、24周时测定。药物经济学数据将在第0、8、15、24周时采集。在第0、8、24周时通过收集24小时尿测定白蛋白尿。12导联心电图和体检将在筛选时和第25周时进行。基因型、腰围、血浆肾素水平(总的和活性的)和血清醛固酮将在第0周时测定。
以下示意图说明研究方案：
Figure A0182394601431
(1)如果在研究期间的任一时间发生DBP≥110mmHg或SBP≥180mmHg，并在间隔3-10天的连续两次访视时一直如此，则患者退出。
(2)加量。在研究期间的任一时间，如果经过重复测定，血清钾水平升高(K＞5.5mEq/L)，患者必须退出。
(3)如果DBP≥90mmHg，加用开放标记的氨氯地平10mg。
(4)如果DBP≥90mmHg，若以前未加用，则加用开放标记的氨氯地平10mg，或者若以前未加用氢***，则加用开放标记的HCTZ12.5mg。
(5)如果DBP≥90mmHg，若以前未加用，则加用开放标记的氨氯地平，或者若以前未加用HCTZ，则加用HCTZ 12.5mg，或者将HCTZ剂量提高到25mg。
(6)第15周时或之后，如果患者持续显示未控制的血压(DBP≥95mmHg，在间隔3-10天的连续两次访视时一直如此)，且患者接受上述所有加用的开放标记药物，则患者必须退出该研究。
(7)如果发生有症状的低血压，患者退出研究。
(8)如果发生有症状的低血压，且患者接受开放标记的加用药物，则按照与加用时相反的方式撤回加用的药物，直到低血压消失。
效能的主要量度是第24周时艾普利螺酮与依那普利或其组合之间尿白蛋白***与基线的改变。另外，也通过tertile在患者的盐敏感性程度方面评价效能(其中根据盐攻击导致的血压反应的增强凭经验确定tertile)。
效能的次要量度包括：(1)第8周和第24周时，艾普利螺酮与依那普利或其组合之间，坐位波谷袖带DBP(“seDBP”)和SBP(seSBP)距基线的均值变化；(2)第24周时，艾普利螺酮与依那普利或其组合之间，胶原蛋白标记物(PIIINP、7SIVC和ICTP)、纤维蛋白溶解平衡(PAI-1和t-PA)和代谢效应(胰岛素、糖基化血红蛋白、空腹血清葡萄糖和脂类[甘油三酯、总胆固醇和HDL胆固醇])距基线的均值变化；(3)由于基因型、基线躯干性肥胖、基线血浆肾素水平(总的和活性的)或基线血清醛固酮水平，艾普利螺酮与依那普利或其组合之间，抗高血压、代谢物或尿白蛋白***反应距基线的均值变化；和(4)根据不良反应、临床实验室值、体检、生命体征和心电图评价安全性和耐受性。
这项双盲活性控制研究用来测定艾普利螺酮与依那普利相比对患有NIDDM和白蛋白尿的高血压患者的胰岛素抗性、glycemic控制、肾功能和脂类分布的净影响。本研究的主要目的在于比较用艾普利螺酮治疗与用依那普利或其组合治疗的患者第24周时尿白蛋白***距基线的均值变化。本研究的次要目的在于：(1)第8周和第24周时，比较艾普利螺酮与依那普利或其组合对波谷袖带seDBP和seSBP距基线的均值变化的影响；(2)第24周时，比较艾普利螺酮与依那普利或其组合的影响，通过胶原蛋白标记物(III型前胶原的氨基末端前肽[PIIINP]，IV型胶原蛋白的7S域[7SIVC]和I型胶原蛋白的端肽[ICTP])；纤维蛋白溶解平衡(纤溶酶原激活物抑制剂[PAI-1]、组织纤溶酶原激活物[t-PA])和代谢效应(胰岛素、糖基化血红蛋白、空腹血清葡萄糖和脂类[甘油三酯、总胆固醇和HDL胆固醇])距基线的均值变化而确定；(3)测定由于基因型、基线躯干性肥胖(腰围)、基线血浆肾素水平(总的和活性的)或基线血清醛固酮水平，艾普利螺酮与依那普利和其组合的抗高血压、代谢或尿白蛋白***反应距基线的均值变化的任何差异；并比较艾普利螺酮与依那普利和其组合的安全性和耐受性，这根据报告的不良反应、临床实验室值、体检、生命体征和心电图评价。
主要和次要效能量度的亚组分析能够对基于如下因素的基线记录的其它亚组进行：种族(黑人、非黑人、日本人等)、性别、年龄、血浆肾素水平、醛固酮/肾素活性比、尿钠/钾比、心力衰竭史等。基于连续量度如年龄的亚组可在中值处对分。
实施例A-19：艾普利螺酮与氨氯地平在收缩期血压升高患者中的抗高血压作用的比较研究
进行一项临床研究，在收缩期血压升高的患者中比较艾普利螺酮与氨氯地平对收缩期血压的影响。这是一项多中心、随机化、双盲、活性控制、安慰剂加入的平行组试验，包括最少200名随机分配的收缩期高血压患者，被定义为：1)坐位收缩期血压(SBP)＝150mmHg且＜165mmHg，脉压(PP)＝70mmHg，或2)SBP＝165mmHg且＜200mmHg，坐位收缩期血压(DBP)＜95mmHg。每名患者通过盐攻击单向试验检测盐敏感性。该试验还包括为期1-2周的预处理筛选期，随后是为期2-4周的单盲安慰剂加入期，和为期24周的双盲治疗期。在结束单盲安慰剂加入期后，符合的患者被随机分配，接受艾普利螺酮或氨氯地平。在双盲治疗的前2周，患者接受艾普利螺酮50mg或氨氯地平2.5mg。第2周，如果SBP未被控制(SBP＝140mmHg)，研究药物的剂量增加一个剂量水平，即艾普利螺酮100mg或氨氯地平5mg；对于血压充分控制的患者，该剂量不变。第6周时或之后如果SBP未被控制(SBP＝140mmHg)，研究药物的剂量增加一个剂量水平，第2周时如果未增加，则增加至艾普利螺酮100mg或氨氯地平5mg，或者如果第2周已经增加，则增加到艾普利螺酮200mg或氨氯地平10mg。对于SBP充分控制的患者，该剂量不变。第10周时或之后，如果在间隔1-3天的连续两次访视时SBP＝170mmHg，且患者使用最大剂量的研究药物，他/她必须退出。患者将接受总共24周的双盲研究药物。表A-19A说明了上述给药方案。
表A-19A：研究药物的剂量水平
剂量水平 随机化研究药物 片/胶囊数
艾普利螺酮 氨氯地平
安慰剂加入 相匹配的安慰剂 相匹配的安慰剂  1片/1粒胶囊
剂量1  50mg  2.5mg  1片/1粒胶囊
剂量2  100mg  5mg  1片/1粒胶囊
剂量3  200mg  10mg  2片/2粒胶囊
如果在研究期间的任何时间发生有症状的低血压(SH)，即与低血压有关的头昏目眩、眩晕或昏厥，且患者不是使用最小剂量的研究药物，则患者可以减量。如果在最小剂量的研究药物时发生SH，则患者必须退出。
在研究期间的任一时间，如果在间隔1-3天的连续两次测量时SBP＝200mmHg或DBP＝110mmHg，患者必须退出。患者将接受总共24周的双盲研究药物。
患者将返回诊所，在第0、2、6、10、14、19、24、25周时进行评价。心率、血压、血清钾水平、伴随药物和不良反应将在每次访视时评价。关于安全性的血液学和生物化学评价和尿液分析将在筛选时、第0、24、25周进行。特殊研究：胶原蛋白标记物(III型前胶原的氨基末端前肽[PIIINP]，IV型胶原蛋白的7S域[7SIVC]和I型胶原蛋白的端肽[ICTP])、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)、组织纤溶酶原激活物(t-PA)、微量蛋白尿，在选择的部位，动态血压监测(ABPM)和动脉顺应性将在第0、14、24周时进行。生活质量调查将在访视2A时(单盲试验开始时)和第0、14、24周时或最后一次访视时进行。进行基线DNA基因分型。12导联心电图和体检将在筛选时和第25周或最后一次访视时进行。
以下示意图说明研究方案：
(1)在研究期间的任一时间，如果在间隔1-3天的连续两次访视时，SBP≥200mmHg或DBP≥110mmHg，患者必须退出。
(2)如果血压未被控制(SBP≥140mmHg)，则增加剂量。
(3)如果在间隔1-3天的连续两次访视时，血压未被控制(SBP≥170mmHg)，且患者使用最大剂量，他/她必须退出研究。
(4)如果发生有症状的低血压(SH)，艾普利螺酮或氨氯地平可以减至下一剂量。然而，如果在最低剂量的研究药物(50mg艾普利螺酮或2.5mg氨氯地平)时发生SH，患者必须退出。
(5)如果在间隔1-3天的连续两次访视时，钾水平升高(钾浓度＞5.5mEq/L)，研究药物可以降低一个水平。如果在间隔1-3天的连续两次访视时钾仍然＞5.5mEq/L，患者必须退出。如果在间隔1-3天的连续两次访视时，钾水平＞5.0mEqL但≤5.5mEq/L，研究药物不必增量。在这种情况下，如果第10周之前SBP≥140mmHg，或者第10周时或之后≥170mmHg，患者必须退出。
效能的主要量度是第24周时艾普利螺酮对氨氯地平的坐位波谷袖带SBP距基线的变化。次要目的如下：(1)第24周时，艾普利螺酮与氨氯地平之间，脉压(SBP-DBP)距基线的均值变化；(2)第24周时，艾普利螺酮与氨氯地平之间，坐位波谷袖带收缩期血压(DBP)距基线的均值变化；(3)第24周时，艾普利螺酮与氨氯地平之间，心率(HR)、PP、SBP和DBP距基线的均值变化，这通过ABPM记录来确定；(4)第24周时，艾普利螺酮与氨氯地平之间，动脉顺应性距基线的均值变化；(5)第24周时，艾普利螺酮与氨氯地平之间，PAI-1、t-PA和胶原蛋白标记物距基线的均值变化；(6)第24周时，艾普利螺酮与氨氯地平之间，微量蛋白尿距基线的均值变化，这根据尿白蛋白与肌酸酐之比确定；(7)相对于基因型，对艾普利螺酮和氨氯地平的反应；(8)艾普利螺酮与氨氯地平相比的安全性和耐受性；(9)第14周和第24周时，艾普利螺酮与氨氯地平之间，生活质量评价距基线的均值变化。
另外，也通过tertile在患者的盐敏感性程度方面评价效能(以上1-9条)(其中根据盐攻击导致的血压反应的增强凭经验确定tertile)。
这项对于收缩期高血压人群的试验用来分两组测定艾普利螺酮与氨氯地平治疗相比的抗高血压作用，比较艾普利螺酮治疗与氨氯地平相比的生活质量，比较艾普利螺酮与氨氯地平相比在老年人中的副作用，评价动脉顺应性、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)和胶原蛋白代谢标记物。本研究的主要目的在于比较艾普利螺酮与氨氯地平对SBP的影响，这根据第24周时坐位波谷袖带SBP距基线的均值变化来确定。本研究的次要目的是：(1)第24周时，比较艾普利螺酮与氨氯地平对脉压(SBP-DBP)距基线的均值变化的影响；(2)第24周时，比较艾普利螺酮与氨氯地平的抗高血压作用，这根据坐位波谷袖带SBP距基线的均值变化确定；(3)第24周时，根据ABPM记录比较艾普利螺酮与氨氯地平之间，HR、PP、SBP和DBP距基线的均值变化；(4)第24周时，比较艾普利螺酮与氨氯地平对动脉顺应性的影响，这根据距基线的均值变化确定；(5)第24周时，比较艾普利螺酮与氨氯地平对PAI-1、组织纤溶酶原激活物[t-PA]和胶原蛋白标记物(III型前胶原的氨基末端前肽[PIIINP]，IV型胶原蛋白的7S域[7SIVC]和I型胶原蛋白的端肽[ICTP])的影响，这根据距基线的均值变化确定；(6)第24周时，比较艾普利螺酮与氨氯地平对微量蛋白尿的影响，其表示为尿白蛋白与肌酸酐之比，根据距基线的均值变化确定；(7)相对于基因型，比较对艾普利螺酮与氨氯地平的反应；(8)比较艾普利螺酮与氨氯地平的安全性和耐受性，这根据为期24周的治疗期间报告的不良反应、临床实验室值、体检、生命体征和心电图确定；(9)第14周和第24周，比较艾普利螺酮与氨氯地平对患者健康相关的生活质量的影响，这根据距基线的均值变化确定。
主要和次要效能量度的亚组分析能够对基于如下因素的基线记录的其它亚组进行：种族(黑人、非黑人、日本人等)、性别、年龄、血浆肾素水平、醛固酮/肾素活性比、尿钠/钾比、患糖尿病、心力衰竭史、肾功能障碍史等。基于连续量度如年龄的亚组可在中值处对分。
实施例A-20：艾普利螺酮与安慰剂在有症状心力衰竭(HF)患者中的剂量范围研究
进行一项临床研究，评价艾普利螺酮剂量范围的安全性和耐受性，评价它们对神经激素功能的影响，检测它们改善同时用ACE抑制剂和袢利尿剂治疗的心力衰竭患者的体征和症状的能力。另外，也通过tertile在患者的盐敏感性程度方面评价效能(其中根据盐攻击导致的血压反应的增强凭经验确定tertile)。该研究是一项随机化、双盲、多中心、安慰剂对照的平行组试验，用来评价艾普利螺酮与安慰剂的三个不同的每日剂量。该研究包括至少100名患者。每名患者通过盐攻击单向试验检测盐敏感性。
研究的群体是患有有症状的心力衰竭的患者，其射血分数＝40％，属于纽约心脏协会(NYHA)功能类别II-IV。适合该试验的患者将接受下列治疗之一：艾普利螺酮25mg每日一次，50mg每日一次，100mg每日一次，或安慰剂，共12周。评价神经激素的方法是测定N末端心钠素(N-端ANP)、脑钠素(BNP和pro-BNP)、血浆肾素(总的和活性的)和血浆和尿醛固酮。患者体征和症状的评价可以用NYHA功能分级进行。通过评价高钾血症和有症状的低血压的发病率、其它不良反应和临床实验室异常，评价其安全性。该研究用来检测艾普利螺酮与安慰剂处理在神经激素水平和临床体征和症状主要变化方面的差异。
本研究的主要目的是：(1)评价一定剂量范围的艾普利螺酮在同时用ACE抑制剂和袢利尿剂治疗的HF患者中的安全性和耐受性；(2)通过测定神经激素功能[N-端心钠素(ANP)、脑钠素(BNP)及其前体(pro-BNP)、血清和尿醛固酮和血浆肾素(总的和活性的)]，评价一定剂量范围的艾普利螺酮在同时用ACE抑制剂和袢利尿剂治疗的HF患者中的效果；(3)评价在12周内施用的一定剂量范围的艾普利螺酮在改善体征和症状方面的效能，这根据NYHA功能分级距基线的变化评价。本研究的次要目的是：(1)评价与ACE抑制剂和袢利尿剂同时施用的一定剂量范围的艾普利螺酮对心率(HR)、BP和体重的影响；(2)当与艾普利螺酮同时施用时，评价艾普利螺酮对ACE抑制剂和袢利尿剂剂量变化的影响。
以下示意图说明研究方案：
注意：
同时治疗包括ACE-I+袢利尿剂
效能评价：NYHA功能分级，醛固酮，肾素，N端ANP，BNP，Pro-BNP。
如果患者不能耐受研究药物，则在调整研究药物的剂量之前应当考虑改变伴随药物的剂量(例如钾添加剂、ACE-I等)。如果在研究期间的任一时间，血清钾水平＝6.0mEq/L，则暂时停用研究药物。如果血清钾水平一直＝6.0mEq/L，则患者停用研究药物。如果发现升高的钾水平＜6.0mEq/L，应当终止钾添加剂(如果使用的话)，患者应当继续接受研究药物。如果研究药物停用，如果可能的话，应当根据良好的临床实践总结伴随药物，并调整剂量。
表A-20A总结了根据血清钾水平的必要的剂量变化。血清钾应当在开始治疗后的1周内和任何剂量改变的1周内测定。如果在研究期间的任一时间，血清钾＞5.5mEq/L，则将研究药物的剂量减为下一个剂量水平，即从1片每日一次减为1片隔日一次，或从1片隔日一次减为暂时停用。当血清钾水平＜5.5mEq/L时，以1片隔日一次重新开始施用研究药物，并根据表A-20B所示的方案加量。如果认为钾的增加是不真实的(即由于溶血或最近给予钾添加剂)，则可以重复测定钾水平。
表A-20A：根据血清钾水平的研究药物剂量调整
如果血清钾水平是：   且目前的剂量是：     剂量改变： 片数：
＜5.0mEq/L   停用     增加 1片，隔日一次
＜5.0mEq/L   1片，隔日一次     增加 1片，每日一次
＜5.0mEq/L   1片，每日一次     不变 1片，每日一次
＝5.0且＜5.5mEq/L   停用     增加 1片，隔日一次
＝5.0且＜5.5mEq/L   1片，隔日一次     不变 1片，隔日一次
＝5.0且＜5.5mEq/L   1片，每日一次     不变 1片，每日一次
＝5.5且＜6.0mEq/L   停用     不变 无
＝5.5且＜6.0mEq/L   1片，隔日一次     减少 无
＝5.5且＜6.0mEq/L   1片，每日一次     减少 1片，隔日一次
＝6.0mEq/L   任何剂量     * 无
*如果持续升高，则停用药物。如果一次升高，停止给药。
主要和次要效能量度的亚组分析能够对基于如下因素的基线记录的其它亚组进行：性别、年龄、血浆肾素水平、醛固酮/肾素活性比、尿钠/钾比、患糖尿病、高血压史、心力衰竭史、肾功能障碍史等。基于连续量度如年龄的亚组可在中值处对分。
实施例A-21：在轻度到中度高血压的治疗中，艾普利螺酮剂量范围的效能和安全性评价
进行一项多中心、随机化、双盲、安慰剂对照的平行组试验，评价三个不同的总每日剂量(50、100和200mg)的艾普利螺酮与安慰剂的安全性和效能。该研究包括为期2周的预处理期，用来清除目前的任何抗高血压药物，并完成筛选程序。在清除后通过盐攻击单向试验检测每名患者的盐敏感性。盐敏感性检测之后是为期4周的单盲、安慰剂加入处理，之后随机分配，是一个为期8周的双盲、主动与安慰剂处理期。表A-21A说明上述剂量方案。
表A-21A.剂量方案包装
片剂
剂量方案 50mg 100mg
安慰剂加入及处理期 (1)与50mg相匹配的安慰剂 (1)与100mg相匹配的安慰剂+(1)与100mg相匹配的安慰剂
艾普利螺酮50mg (1)50mg活性 (1)与100mg相匹配的安慰剂+(1)与100mg相匹配的安慰剂
艾普利螺酮100mg (1)与50mg相匹配的安慰剂 (1)100mg活性+(1)与100mg相匹配的安慰剂
艾普利螺酮200mg (1)与50mg相匹配的安慰剂 (1)100mg活性+(1)100mg活性
如果在研究期间的任何时间发生有症状的低血压(SH)，即与低血压(BP)有关的头昏目眩、眩晕或昏厥，则患者必须退出。在双盲治疗期间的任一时间，如果在间隔1-3天的连续两次测量时收缩期血压(SBP)＝180mmHg或舒张期血压(DBP)＝110mmHg，则患者必须退出。在研究期间的任一时间，如果在间隔1-3天的连续两次测量时，经重复测定(样品分开，送往当地和中心实验室，根据当地值做出处理决定)血清钾水平升高＞5.5mEq/L，则患者必须退出。
主要的效能量度是与安慰剂相比波谷测量的袖带DBP距基线的变化。次要的效能量度包括测量的波谷袖带SBP的变化，通过动态BP监测测量的24小时平均DBP和SBP变化(只在选择的研究部位进行)。给药8周后神经激素(血浆肾素、血清醛固酮)的变化也是次要的效能量度。也通过tertile在患者的盐敏感性程度方面评价效能(其中根据盐攻击导致的血压反应的增强凭经验确定tertile)。
该研究的主要目的是当对轻度到中度高血压患者施用8周时，根据波谷袖带DBP测量距基线的变化，评价每日一次剂量为50、100、200mg的艾普利螺酮相比安慰剂的抗高血压作用。在艾普利螺酮治疗8周后，与安慰剂相比，本研究的次要目的是：(1)评价波谷袖带SBP距基线的变化；(2)利用动态血压监测(ABPM)，测定艾普利螺酮相对于安慰剂的24小时抗高血压作用；(3)评价血浆肾素和血清醛固酮水平的变化；和(4)建立艾普利螺酮对抗高血压治疗的安全性和耐受性，根据报告的不良反应、临床实验室值、体检、生命体征和心电图评价。
以下示意图说明研究方案：
(1)血压未被控制的拯救标准，即DBP≥115mmHg或SBP≥190mmHg。
(2)血压未被控制的拯救标准，即DBP≥110mmHg或SBP≥180mmHg。
(3)如果在任一时间血清钾水平和重复值＞5.5mEq/L，患者必须退出。
(4)动态血压监测(ABPM)只在参与ABPM的研究部位进行。
主要和次要效能量度的亚组分析能够对基于如下因素的基线记录的其它亚组进行：性别、年龄、血浆肾素水平、醛固酮/肾素活性比、尿钠/钾比、患糖尿病、心力衰竭史、肾功能障碍史等。基于连续量度如年龄的亚组可在中值处对分。
实施例A-22：艾普利螺酮在急性心肌梗死后心力衰竭患者中的安全性和效能
进行一项临床研究，比较艾普利螺酮加标准治疗与安慰剂加标准治疗对急性心肌梗死(AMI)后心力衰竭(HF)患者的所有病因死亡率的影响。次要终点包括心血管疾病发病率和死亡率。该研究是一项多中心、随机化、双盲、安慰剂对照、两部分(arm)、平行组试验，持续到发生1012例死亡，估计这需要大约6200名随机患者，平均需要大约2.5年。
符合该研究的患者患有：(1)AMI(指标事件)，根据如下证实：(a)心脏酶异常(肌酸磷酸激酶[CPK]＞正常范围上限的2倍[ULN]，和/或CPK-MB＞总CPK的10％)，(b)开展MI的心电图(ECG)诊断(ST段和T波的进行性改变与AMI一致，有或没有病理性Q波)；(2)左心室(LV)功能障碍，根据AMI之后和随机分配之前测定的LV射血分数(LVEF)＝40％证实；和(3)HF的临床证据，根据至少下列一种情况证实：(a)肺水肿(在没有明显慢性肺病时，双侧咳嗽后湿罗音延伸至少1/3肺野；或(b)胸部X-光显示肺静脉淤血，伴间质或肺泡水肿；或(c)第三心音(S3)听诊证实持续心动过速(＞每分钟100次)。符合的患者可以在急诊室评价及假设诊断为AMI伴HF之后的任何时间加入研究。进入该研究的患者如果临床状态稳定，例如，没有血管加压剂、inotropes、主动脉内气球泵、低血压(收缩期血压[SBP]＜90mmHg)或可能需行急性冠状动脉造影的复发性胸痛，在AMI 3天(＞48小时)和10天之间随机分配。植入心脏除颤器的患者排除在外。
患者将接受可能包括ACE抑制剂、利尿剂、硝酸盐和β-阻断剂的标准治疗，可以接受抗凝剂和抗血小板剂，可以接受血栓溶解剂或急诊血管成形术。患者将随机分配，接受艾普利螺酮25mg每日一次，或安慰剂。第4周时，如果血清钾＜5.0mEq/L，将研究药物的剂量提高到50mg每日一次(两片)。如果在研究期间的任何时间，血清钾＞5.5mEq/L但＜6.0mEq/L，研究药物的剂量将减至下一剂量水平，即从50mg每日一次到25mg每日一次(一片)，从25mg每日一次到25mg隔日一次，或者从25mg隔日一次到暂时停用。如果在研究期间的任何时间，血清钾＝6.0mEq/L，则应当停用研究药物，当血清钾＜5.5mEq/L时可以以25mg隔日一次重新开始使用。如果在研究期间的任一时间血清钾一直＝6.0mEq/L，则应当永久停用研究药物。如果患者对研究药物耐受不良，则在调整研究药物的剂量之前应当考虑改变伴随药物的剂量。血清钾在开始治疗后的48小时、第1周和第5周、预定的其它所有研究访视时、任何剂量改变后的一周内测定。
研究访视在筛选、基线(随机化)、第1周和第4周、3个月和之后的每3个月进行，直到研究终止。医学史、心脏酶、Killip分级、重新灌注时间(如果适用)、AMI和HF的证明、LVEF的测定和可能分娩的妇女的血清妊娠检验将在筛选时进行。体检和12-导联ECG在筛选时和最后一次访视(停止研究药物)时进行。关于安全性的血液学和生物化学评价和尿液分析将在筛选时、第4周、第3个月和第6个月、之后每6个月进行，直到研究终止。用于DNA分析的其它血样在筛选过程中采集。生命体征(坐位心率和血压)，纽约心脏协会(NYHA)功能类别、不良反应和选择的伴随药物在每次访视时记录。生活质量评价将在筛选期间、第4周、第3、6、12个月和最后一次访视时进行。所有随机分配的患者将每3个月检测一次终点，直到研究终止。
以下示意图显示研究方案：
最小试验持续时间：发生1012例死亡
Figure A0182394601601
1同时治疗可包括：ACE，±利尿剂，±β-阻断剂，±阿司匹林，±其它常用的AMI后方案。
2如果当前剂量耐受且血清钾＜5.0mEq/L，则提高剂量。关于研究药物剂量调整的完整说明，见章节3.6和表1。
3血清钾必须在第48小时、第1周、第5周和任何研究药物剂量改变的1周内测定。剂量调整根据最近的钾水平进行。如果在研究期间的任何时间血清钾＞5.5mEq/L但＜6.0mEq/L，则将研究药物的剂量减至下一个剂量。如果在研究期间的任何时间血清钾≥6.0mEq/L，则暂时停用研究药物。如果研究药物暂时停用，可以在血清钾＜5.5mEq/L时以一片隔日一次重新开始使用，并如章节3.6表1所述滴定。如果研究期间的任何时间血清钾一直≥6.0mEq/L，则永久停用研究药物。
*血清钾测定在开始给药后48小时进行。
主要的终点是所有病因死亡率。该试验用来检测所有病因死亡率的18.5％降低，在终止研究前都需要1012例死亡。次要终点包括：(1)心血管疾病死亡率；(2)心脏性猝死；(3)进行性心力衰竭导致的死亡；(4)所有病因导致的入院；(5)心血管疾病入院；(6)心力衰竭入院；(7)所有病因的死亡率加所有病因的入院；(8)心血管疾病死亡率加心血管疾病入院；(9)心血管疾病死亡率加心力衰竭入院；(10)新诊断为房性纤颤；(11)因复发性非致死AMI和致死AMI入院；(12)中风入院；和(13)生活质量。
本研究的主要目的是比较艾普利螺酮加标准治疗与安慰剂加标准治疗对AMI后心力衰竭的患者中所有死亡率的影响。本研究的次要目的是比较两个治疗组的下列情况，包括：(1)心血管疾病死亡率；(2)心脏性猝死；(3)进行性心力衰竭导致的死亡；(4)所有病因导致的入院；(5)心血管疾病入院；(6)心力衰竭入院；(7)所有病因的死亡率加所有病因的入院；(8)心血管疾病死亡率加心血管疾病入院；(9)心血管疾病死亡率加心力衰竭入院；(10)新诊断为房性纤颤；(11)因复发性非致死AMI和致死AMI入院；(12)中风入院；和(13)生活质量。
患者在治疗的前4周将接受艾普利螺酮25mg每日一次，或安慰剂(一片)。第4周，如果血清钾＜5.0mEq/L，研究药物的剂量将增加到50mg每日一次(两片)。如果血清钾第4周＝5.0mEq/L但是第5周＜5.0mEq/L，则研究药物的剂量将增加到50mg每日一次(两片)。在此情况下，第6周检测血清钾。
表A-22A总结了根据血清水平要求的剂量改变。血清钾在开始治疗后的48小时、第1周和第5周、任何剂量改变后一周内测定。如果在研究期间的任何时间血清钾＞5.5mEq/L，则研究药物的剂量减至下一剂量水平，即从50mg每日一次到25mg每日一次，从25mg每日一次到25mg隔日一次，或从25mg隔日一次到暂时停用。当血清钾＜5.5mEq/L时，研究药物以25mg隔日一次重新开始使用，并根据表A-22A所述的方案加量。如果认为钾的增加是不真实的(即由于溶血或最近给予钾添加剂)，可以重复测定钾水平。
如果患者对研究药物耐受不良，则在调整研究药物的剂量之前应当考虑改变伴随药物(例如钾添加剂、ACE-I等)的剂量。如果在研究期间的任何时间血清钾水平＝6.0mEq/L，则暂时停用研究药物。如果血清钾水平一直＝6.0mEq/L，则患者停用研究药物。如果发现钾水平升高＜6.0mEq/L，应当停用钾添加剂(如果使用的话)，患者应当继续接受研究药物。如果研究药物停用，应当总结同时使用的药物，如果可能的话，按照良好的临床实践调整剂量。
表A-22A：根据血清钾水平的研究药物剂量调整
如果血清钾水平是：  且目前的剂量是： 剂量改变： 片数：
＜5.0mEq/L  停用 增加 1片，隔日一次
＜5.0mEq/L  1片，隔日一次 增加 1片，每日一次
＜5.0mEq/L  1片，每日一次 增加 2片，每日一次
＜5.0mEq/L  2片，每日一次 不变 2片，每日一次
＝5.0且＜5.5mEq/L  停用 增加 1片，隔日一次
＝5.0且＜5.5mEq/L  1片，隔日一次 不变 1片，隔日一次
＝5.0且＜5.5mEq/L  1片，每日一次 不变 1片，每日一次
＝5.0且＜5.5mEq/L  2片，每日一次 不变 2片，每日一次
＝5.5且＜6.0mEq/L  停用 不变 无
＝5.5且＜6.0mEq/L  1片，隔日一次 减少 无
＝5.5且＜6.0mEq/L  1片，隔日一次 减少 1片，隔日一次
＝5.5且＜6.0mEq/L  2片，每日一次 减少 1片，每日一次
＝6.0mEq/L  任何剂量 * 无
*如果持续升高，则停用药物。如果一次升高，停止给药。
将进行主要和次要终点的亚组分析。亚组将基于如下因素的基线记录：种族(黑人，非黑人)、性别、年龄、患糖尿病、射血分数、血清钾、血清肌酸酐、β-阻断剂的使用、地高辛的使用、钾添加剂的使用、第一次及随后的AMI、Killip分级、重新灌注状态、高血压史、HF史、吸烟史、心绞痛史、指标AMI到随机分配的时间以及地理区域。基于连续量度如年龄、射血分数、血清钾和血清肌酸酐的亚组能够在中值处对分。
实施例A-22：艾普利螺酮用来预防或治疗内皮功能障碍
在仰卧休息20分钟后，非主要的(nondominant)臂动脉在局部麻醉下插管。在盐水输注30分钟后，通过前臂静脉-阻塞体积描记法测量基线前臂血流。然后将药物用恒速输液器输入研究的臂中。在每个基线处和每次药物输注最后2分钟期间测量前臂血流。在研究过程中以固定间隔测量非输液臂(对照)的血压。
药物输注。首先，以25、50、100mmol/min输入乙酰胆碱(内皮依赖的血管扩张剂)，每次5分钟。随后以4.2、12.6、37.8nmol/min输入硝普钠(不依赖内皮的血管扩张剂)，每次5分钟，然后以1、2、4μmol/min输入N-单乙基-L-精氨酸(L-NMMA；竞争性NO合酶抑制剂)，每次5分钟。随后以64、256、1024pmol/min输入血管紧张素I(只在转化为血管紧张素II后才起作用的血管收缩剂)，每次7分钟。在不同药物之间，药物输注用盐水冲洗20-30分钟，以便有足够的时间使前臂血流回复到基线值。
结果。预期艾普利螺酮将显著提高对乙酰胆碱的前臂血流反应(前臂血流的百分变化)，由于L-NMMA，血管收缩相应增强。进一步预期，使用艾普利螺酮也显著减少血管紧张素I反应，而血管紧张素II反应不变。该研究进一步表明，醛固酮与内皮功能障碍有关，降低心力衰竭患者中的NO生物活性。而且，艾普利螺酮预期可预防这些功能障碍和所致的其它病理改变。
B.组合物实施例
下列实施例说明本发明的几个方面，但是不应视为其限制。用来产生所示数据的实验方法在下文中更详细地描述。这些实施例中所用的符号和惯例与目前药理学文献中使用的一致。除非另外说明，(i)这些实施例中所述的所有百分比都是根据总组合物重量的重量百分比，(ii)胶囊的总组合物重量是胶囊总填充重量，不包括实际使用的胶囊的重量，(iii)包衣片剂包裹常规包衣材料，如Opadry WhiteYS-1-18027A，包衣的重量百分比是包衣片剂总重量的大约3％。
实施例B-1
一种口服剂型可以如下制备：筛选下列成分，然后以所示的量混合在一起。然后可将成分装在硬明胶胶囊中。
成分                   含量
艾普利螺酮             12.5mg
硬脂酸镁               10mg
乳糖                   100mg
实施例B-2
一种口服剂型可以如下制备：混合在一起，用10％明胶溶液颗粒化。湿颗粒筛选、干燥，与淀粉、滑石粉和硬脂酸混合，筛选，压成片剂。
成分                         含量
艾普利螺酮                   12.5mg
二水合硫酸钙                 100mg
蔗糖                         15mg
淀粉                         8mg
滑石粉                       4mg
硬脂酸                       2mg
实施例B-3
一种口服剂型可以如下制备：筛选下列成分，然后以所示的量混合在一起。然后可将成分装在硬明胶胶囊中。
成分                        含量
艾普利螺酮                  12.5mg
硬脂酸镁                    10mg
乳糖                        100mg
实施例B-4
一种口服剂型可以如下制备：混合在一起，用10％明胶溶液颗粒化。湿颗粒筛选、干燥，与淀粉、滑石粉和硬脂酸混合，筛选，压成片剂。
成分                        含量
艾普利螺酮                  12.5mg
二水合硫酸钙                100mg
蔗糖                        15mg
淀粉                        8mg
滑石粉                      4mg
硬脂酸                      2mg
实施例B-5：25Mg剂量的直接释放片剂
制备一种25mg剂量的直接释放片剂(片剂直径为7/32”)，其含有下列成分：
成分                             片剂的重量％         含量(mg)
艾普利螺酮                       29.41                25.00
一水合乳糖(#310，NF)             42.00                35.70
微晶纤维素(NF，Avicel PH101)     18.09(7.50％颗粒     15.38
                                 内+10.59％颗粒外)
交联羟甲纤维素钠(NF，Ac-Di-Sol)  5.00                 4.25
羟丙基甲基纤维素(#2910，USP，    3.00                 2.55
Pharmacoat 603)
月桂硫酸钠(NF)                   1.00                 0.85
滑石粉(USP)                      1.00                 0.85
硬脂酸镁(NF)                     0.50                 0.42
总计                             100                  85
Opadry White YS-1-18027A         3.00                 2.55
实施例B-6：50Mg剂量的直接释放片剂
制备一种50mg剂量的直接释放片剂(片剂直径为9/32”)，其含有下列成分：
成分                           片剂的重量％          含量(mg)
艾普利螺酮                     29.41                  50.00
一水合乳糖(#310，NF)           42.00                  71.40
微晶纤维素(NF，Avicel PH101)   18.09(7.50％颗粒内     30.75
                               +10.59％颗粒外)
交联羟甲纤维素钠(NF，          5.00                   8.50
Ac-Di-Sol)
羟丙基甲基纤维素(#2910，USP，  3.00                   5.10
Pharmacoat 603)
月桂硫酸钠(NF)                 1.00                   1.70
滑石粉(USP)                     1.00        1.70
硬脂酸镁(NF)                    0.50        0.85
总计                            100         170
Opadry White YS-1-18027A        3.00        5.10
实施例B-7：100Mg剂量的直接释放片剂
制备一种100mg剂量的直接释放片剂(片剂直径为12/32”)，其含有下列成分：
成分                           片剂的重量％       含量(mg)
艾普利螺酮                     29.41              100.00
一水合乳糖(#310，NF)           42.00              142.80
微晶纤维素(NF，Avicel PH101)  18.09(7.50％颗粒内  61.50
                               +10.59％颗粒外)
交联羟甲纤维素钠(NF，          5.00               17.00
Ac-Di-Sol)
羟丙基甲基纤维素(#2910，USP，  3.00               10.20
Pharmacoat 603)
月桂硫酸钠(NF)                 1.00               3.40
滑石粉(USP)                    1.00               3.40
硬脂酸镁(NF)                   0.50               1.70
总计                           100                340
Opadry White YS-1-18027A       3.00               10.20
实施例B-8：10mg剂量的直接释放胶囊
制备一种10mg剂量的直接释放胶囊制剂，其含有下列成分：
成分                    含量(mg)       典型批量(kg)
艾普利螺酮                10.0           1.00
乳糖，水合NF              306.8          30.68
微晶纤维素，NF            60.0           6.00
滑石粉，USP             10.0               1.00
交联羟甲纤维素钠，NF    8.0                0.80
月桂硫酸钠，NF          2.0                0.20
胶体二氧化硅，NF        2.0                0.20
硬脂酸镁，NF            1.2                0.12
胶囊总填充重量          400.0              40.00
硬明胶胶囊，尺寸#0，    1个胶囊            100000个胶囊
白色不透明
实施例B-9：25mg剂量的直接释放胶囊
制备一种25mg剂量的直接释放胶囊制剂，其含有下列成分：
成分                      含量(mg)    典型批量(kg)
艾普利螺酮                 25.0           2.50
乳糖，水合NF               294.1          29.41
微晶纤维素，NF             57.7           5.77
滑石粉，USP                10.0           1.00
交联羟甲纤维素钠，NF       8.0            0.80
月桂硫酸钠，NF             2.0            0.20
胶体二氧化硅，NF           2.0            0.20
硬脂酸镁，NF               1.2            0.12
胶囊总填充重量             400.0          40.00
硬明胶胶囊，尺寸#0，       1个胶囊        100000个胶囊
白色不透明
实施例B-10：50mg剂量的直接释放胶囊
制备一种50mg剂量的直接释放胶囊制剂，其含有下列成分：
成分                     含量(mg)       典型批量(kg)
艾普利螺酮                50.0            5.00
乳糖，水合NF              273.2           27.32
微晶纤维素，NF             53.6           5.36
滑石粉，USP                10.0           1.00
交联羟甲纤维素钠，NF       8.0            0.80
月桂硫酸钠，NF             2.0            0.20
胶体二氧化硅，NF           2.0            0.20
硬脂酸镁，NF               1.2            0.12
胶囊总填充重量             400.0          40.00
硬明胶胶囊，尺寸#0，       1个胶囊        100000个胶囊
白色不透明
实施例B-11：100mg剂量的直接释放胶囊
制备一种100mg剂量的直接释放胶囊制剂，其含有下列成分：
成分                      含量(mg)          典型批量(kg)
艾普利螺酮                 100.0               10.00
乳糖，水合NF               231.4               23.14
微晶纤维素，NF             45.4                4.54
滑石粉，USP                10.0                1.00
交联羟甲纤维素钠，NF       8.0                 0.80
月桂硫酸钠，NF             2.0                 0.20
胶体二氧化硅，NF           2.0                 0.20
硬脂酸镁，NF               1.2                 0.12
胶囊总填充重量             400.0               40.00
硬明胶胶囊，尺寸#0，      1个胶囊              100000个胶囊
白色不透明
实施例B-12：200mg剂量的直接释放胶囊
制备一种200mg剂量的直接释放胶囊制剂，其含有下列成分：
成分                       含量(mg)           典型批量(kg)
艾普利螺酮                 200.0                 20.00
乳糖，水合NF                 147.8           14.78
微晶纤维素，NF               29.0            2.90
滑石粉，USP                  10.0            1.00
交联羟甲纤维素钠，NF         8.0             0.80
月桂硫酸钠，NF               2.0             0.20
胶体二氧化硅，NF             2.0             0.20
硬脂酸镁，NF                 1.2             0.12
胶囊总填充重量               400.0           40.00
硬明胶胶囊，尺寸#0，         1个胶囊         100000个胶囊
白色不透明
C.固态实施例
下列实施例包括本申请所述不同固态形式的艾普利螺酮的制备方法的详述。这些详细描述属于本发明的范围，并且用来说明本发明。这些详细描述只是用于说明目的，并非意在限制本发明的范围。除非另外说明，所有部分都基于重量，温度是摄氏度。下列每一个实施例中使用的艾普利螺酮原材料都按照Ng等人的WO98/25948的方案1制备。
实施例C-1：(a)由高纯度艾普利螺酮原材料制备丁酮溶剂合物，(b)由获得的溶剂合物制备L型结晶艾普利螺酮
A.丁酮溶剂合物的制备：
高纯度艾普利螺酮(437mg；纯度大于99％，含有不到0.2％的二环氧化物和11，12环氧化物)通过在热板上加热至沸腾，并以900转/分磁力搅拌，溶解于10mL丁酮中。获得的溶液在连续磁力搅拌下冷却至室温。一旦达到室温，即将溶液转移到1℃水浴中，保持搅拌1小时。一小时后，通过真空过滤收集固体丁酮溶剂合物。
B.L型结晶艾普利螺酮的制备：
步骤A制备的固体丁酮溶剂合物在环境压力下在100℃烤箱中干燥4小时。通过DSC和XPRD分析确定干燥的固体是纯L型。
实施例C-2：由高纯度艾普利螺酮原材料制备其它溶剂合物
其它溶剂合物结晶形式的制备方法是，用下列溶剂之一代替丁酮：正丙醇、2-戊酮、乙酸、丙酮、乙酸丁酯、氯仿、乙醇、异丁醇、乙酸异丁酯、异丙醇、乙酸甲酯、丙酸乙酯、正丁醇、正辛醇、乙酸丙酯、丙二醇、叔丁醇、四氢呋喃和甲苯，并且基本如实施例C-1步骤A所述进行结晶。基本如实施例C-1步骤B所述由每种溶剂合物形成L型艾普利螺酮。
实施例C-3：通过蒸汽扩散生长制备丁酮溶剂合物
艾普利螺酮(400mg；纯度大于99.9％)通过在热板上加温溶解于20mL丁酮中，形成贮存溶液。将8mL贮存溶液转移到第一个20mL闪烁瓶中，用丁酮稀释到10mL(80％)。将10mL贮存溶液转移到第二个20mL闪烁瓶中，用丁酮稀释到10mL(40％)。用丁酮将最后2mL贮存溶液稀释到10mL(20％)。将含有稀释液的4个小瓶转移到含有少量己烷作为抗溶剂的干燥器中。密封干燥器，使己烷蒸汽扩散到丁酮溶液中。到第二天，丁酮溶剂合物晶体在80％稀释样品中生长。
实施例C-4：通过旋转蒸发制备丁酮溶剂合物
称重约400mg艾普利螺酮(纯度大于99.9％)到250mL圆底瓶中。向瓶中加入溶剂(150mL)，必要时缓慢加热溶液直到固体溶解。将获得的澄清溶液置于Buchi旋转式蒸发器上，水浴温度为85℃，在真空下除去溶剂。当圆底瓶中还有大约10mL溶剂时停止溶剂的去除。用适于检查其形式的方法(XPRD，DSC，TGA，显微术等)分析获得的固体。
实施例C-5：浆液转化
向5mL乙酸乙酯中加入约150mg L型艾普利螺酮和150mg H型艾普利螺酮。获得的浆液以300转/分搅拌(磁力搅拌)过夜。次日过滤收集固体样品。通过XPRD分析样品，表明样品完全由L型艾普利螺酮组成。
实施例C-6：(a)由低纯度艾普利螺酮原材料制备丁酮溶剂合物，(b)由获得的溶剂合物制备H型结晶艾普利螺酮
含有不同含量的杂质7-甲基氢4α，5α：9α，11α-二环氧-17-羟基-3-氧-17α-孕烷-7α，21-二羧酸，γ-内酯(“二环氧化物”)或杂质7-甲基氢11α，12α-环氧-17-羟基-3-氧-17α-孕-4-烯-7α，21-二羧酸，γ-内酯(“11，12-环氧化物”)的样品如下制备：将希望的量的杂质与足以提供100mg总样品质量的艾普利螺酮加入7mL闪烁瓶中。每个样品中二环氧化物和11，12-环氧化物的重量百分比分别在表C-6A和C-6B中列出。向每个闪烁瓶中加入一个微小(micro-flea)磁力搅拌棒，以及1mL丁酮。小瓶较松地盖上帽，在磁力搅拌下，通过在热板上加热回流溶解固体。一旦固体溶解，溶液即在热板上冷却至室温。在冷却过程中继续磁力搅拌。在溶液达到室温后，通过真空过滤收集固体，立即用X-射线粉末衍射(XPRD)分析。然后将固体置于100℃烤箱中，在环境压力下干燥1小时。利用XPRD，通过监测12.1度2θ时H型衍射峰的面积，分析干燥的固体的H型含量。用Inel多用途衍射仪记录所有XPRD衍射图样。
表C-6A
二环氧化物的重量百分比 艾普利螺酮的重量(mg) 二环氧化物的重量(mg)
    0％     100.44     --
    1％     99.08     1.24
    2％     98.09     2.24
    3％     97.08     3.04
    5％     95.09     5.04
表C-6B
 11，12-环氧化物的重量百分比 艾普利螺酮的重量(mg)  11，12-环氧化物的重量(mg)
 0％ 101.38  0
 1％ 99.23  1.10
 5％ 94.97  5.36
 10％ 90.13  10.86
A.二环氧化物结果
图C-1显示由掺杂(a)0％、(b)1％、(c)3％和(d)5％二环氧化物的丁酮结晶获得的湿饼(丁酮溶剂化物)的X-射线粉末衍射图样。为了易于比较，峰强度已经标准化。衍射图样中没有H型或二环氧化物特有的峰。这些模式是艾普利螺酮的丁酮溶剂合物所特有的。
图C-2显示由掺杂(a)0％、(b)1％、(c)3％和(d)5％二环氧化物的丁酮结晶获得的干燥固体的X-射线粉末衍射图样。为了易于比较，峰强度已经标准化。对于以0％和1％掺杂水平进行的丁酮结晶的相应干燥样品，未检测到H型。以3％和5％掺杂水平进行的丁酮结晶的相应干燥样品，检测到H型。每种样品在大约12.1度2θ时的H型衍射峰面积和估计的H型含量在表C-6C中列出。
表C-6C
起始艾普利螺酮混合物中二环氧化物的重量百分比 产生的晶体中二环氧化物的重量百分比(HPLC)   H型峰面积12°2θ峰 估计的H型的重量百分比
    0％     ---     未检测     未检测
    1％     0.29％     未检测     未检测
    3％     0.58％     1168     10％
    5％     1.05％     4175     30％
表C-6C报告的结果证实，在去溶剂化过程中存在二环氧化物影响H型的形成。这些结果表明，当二环氧化物掺入和/或吸附到丁酮溶剂合物晶体上时，可有效诱导H型艾普利螺酮的形成。
重复3％二环氧化物掺杂实验，分析制备途径对去溶剂化过程中形成的H型的量的影响。在该实验中，由掺杂的结晶获得的丁酮溶剂合物被分成两部分。第一部分不处理，而第二部分用研钵和杵轻轻研磨，诱导较高水平的晶体瑕疵。这两部分都在环境压力和100℃下干燥1小时。干燥的固体用XPRD分析。由掺杂3％二环氧化物的丁酮结晶获得的干燥固体的XPRD图样在图C-3中显示，其中(a)在干燥之前不研磨溶剂合物，(b)在干燥之前研磨溶剂合物。这些XPRD图样表明研磨的样品中H型的含量高于未研磨的样品。这些结果提示，分离并处理丁酮溶剂合物的条件能够影响去溶剂化产生的晶体形式。
B.11，12-环氧化物结果
图C-4显示由掺杂(a)0％、(b)1％、(c)5％和(d)10％的11，12-环氧化物的丁酮结晶获得的湿饼(丁酮溶剂合物)的X-射线粉末衍射图样。为了易于比较，峰强度已经标准化。衍射图样中没有H型或11，12-环氧化物特有的峰。这些模式是艾普利螺酮的丁酮溶剂合物所特有的。
图C-5显示由掺杂(a)0％、(b)1％、(c)5％和(d)10％的11，12-环氧化物的丁酮结晶获得的干燥固体的X-射线粉末衍射图样。为了易于比较，峰强度已经标准化。对于以0％、1％、5％掺杂水平进行的丁酮结晶的相应干燥样品，未检测到H型。以10％掺杂水平进行的丁酮结晶的相应干燥样品，检测到H型。每个样品在大约12.1度2θ时的H型衍射峰面积和估计的H型含量在表C-6D中列出。
表C-6D
起始艾普利螺酮混合物中11，12-环氧化物的重量百分比 产生的晶体中11，12-环氧化物的重量百分比(HPLC) H型峰面积12°2θ峰 估计的H型的重量百分比
    0％     无法获得   未检测   未检测
    1％     无法获得   未检测   未检测
    5％     无法获得   未检测   未检测
    10％     无法获得   1541   10-15％
表C-6D报告的结果证实，在去溶剂化过程中存在11，12-环氧化物影响H型的形成。诱导H型艾普利螺酮形成所需的丁酮结晶中杂质的百分比，似乎11，12-环氧化物高于二环氧化物。
实施例C-7：结晶和干燥对终晶体形式的影响
进行下列4个实验，分析结晶和干燥对终晶体形式的影响：(i)艾普利螺酮的丁酮结晶(23+3实验统计学设计)，(ii)低质量的母液残留的结晶，(iii)用H型引晶的高纯度艾普利螺酮的结晶，(iv)用L型引晶的低纯度艾普利螺酮的结晶。实验设计中的变量包括冷却速度、原材料纯度水平和结晶的终点温度。对于该实施例，高纯度艾普利螺酮被定义为磨碎的超纯艾普利螺酮(HPLC分析显示该材料纯度为100.8％)，低纯度艾普利螺酮被定义为89％纯度的艾普利螺酮。为了制备低纯度艾普利螺酮，分析并混合从制备艾普利螺酮过程中取出的母液，产生一种是61.1％艾普利螺酮、12.8％二环氧化物和7.6％11，12-环氧化物的物质。该材料然后与足量的高纯度艾普利螺酮混合，产生89％艾普利螺酮。
丁酮结晶
在丁酮结晶实验中，所有步骤都用60g高纯度艾普利螺酮进行。高终点被定义为45℃，低终点被定义为5℃。高冷却速度被定义为3℃/分钟，低冷却速度被定义为0.1℃/分钟冷却。中点为1.5℃/分钟冷却，纯度为94.5％的艾普利螺酮，和25℃的终点。
在用FTIR读取背景后，将250mL丁酮加到1L Mettler RC-1，MP10反应器中，以100转/分搅拌。几次扫描后，将艾普利螺酮加到反应器中，随后加入另外470mL的丁酮。为了悬浮固体，搅拌增加到500转/分，批温度增加到80℃。为了确保艾普利螺酮的溶解，批温度保持在80℃。在产生的透明溶液中通常可见黑斑或白斑。然后以希望的速度斜线冷却批温度到希望的终点，保持1小时，然后倒入转移瓶中过滤。反应器为真空，然后用120mL丁酮洗涤转移瓶和饼。一旦洗液经过饼，即终止。各约10克湿饼在75℃的标称条件下在真空烤箱中干燥，轻轻放出氮气。对于以下所述的“高、高、高”和“低、低、低”实验，在高和低条件下进行流化床干燥。高流化床干燥被定义为100℃，鼓风机设置为“4”，低流化床干燥被定义为40℃，鼓风机设置为“1”。
低质量的母液残留的结晶
在低质量的母液残留实验中，将60g纯度为61.1％的材料和720mL丁酮直接加入1L Mettler RC-1，MP10反应器中。在加入反应器之前，纯度为61.1％的材料不与高纯度艾普利螺酮混合。获得的混合物加热到80℃，在该温度下是一种不透明的浆液。继续结晶，在快速冷却条件和45℃下过滤该混合物。
H型引晶
在H型引晶实验中，将60g纯(100.8％)艾普利螺酮和720mL丁酮加入1L Mettler RC-1，MP10反应器中。混合物加热到80℃，然后以1.5℃/分钟的速度冷却到25℃。当溶液冷却到62℃时，用3g相纯的H型晶体引晶，开始结晶。H型晶种通过以下实施例C-9所述的消化法制备。
L型引晶
在L型引晶实验中，将66.6g 89.3％艾普利螺酮(通过混合48.3g 100％艾普利螺酮与18.3g 61.1％艾普利螺酮制备)和720mL丁酮加入1L Mettler RC-1，MP10反应器中。混合物加热到80℃，然后以1.5℃/分钟的速度冷却到25℃。当溶液冷却到63℃时，用3g相纯的L型晶体引晶，开始结晶。L型晶种通过以上实施例C-1所述的结晶和去溶剂化方法制备。
实验结果在表C-7A中报告。在n+1结晶实验中，只在使用低纯度艾普利螺酮的实验中检测到H型，其产物含有二环氧化物。以较高的冷却速度在终产物中也能发现水平升高的二环氧化物。
低质量母液残留实验的结晶产生低质量的物质，经过X-射线粉末衍射分析，它似乎是二环氧化物和H型的混合物。
H型引晶实验(高纯度艾普利螺酮用H型引晶)产生一种产物，根据X-射线粉末衍射分析，它是77％H型，但根据DSC，完全是H型。然而，X-射线粉末衍射图样还没有检测超过约15％H型的线性。该实验只是该实施例的4个实验之一，在不使用二环氧化物的情况下产生H型。
L型引晶实验(低纯度艾普利螺酮用L型引晶)产生一种产物，它完全是L型。
艾普利螺酮的高流化床干燥获得的数据似乎与真空炉干燥获得的数据相对应。低流化床干燥产生不同于真空炉干燥的结果。
表C-7A
冷却速度1 冷却终点1 杂质水平3  核化温度(℃)  重量百分比11，12-环氧化物4  重量百分比二环氧化物4  去溶剂化晶体的测定  百分产量  总量百分比H型(XPRD)
+ + -  57.0  ND  ND  100.3  66.1  ND
+ - -  54.9  ND  ND  100.3  98.1  ND
- + -  60.9  ND  ND  100.3  ND
- - -  63.4  ND  ND  100.5  79.3  ND
+ + ++  N/A  4.8  36.6  43.3  27  1005
+ + +  52.2  0.49  0.88  98.3  62  29
+ - +  53.3  0.56  1.0  98.1  87  9
0 0 0  59.0  0.18  0.36  99.4  75  5
- + +  63.3  0.20  0.44  99.4  36  31
- - +  61.4  0.18  0.40  99.5  87  ND
0 0 0  60.6  0.18  0.36  99.5  79.2  ND
0 0 0  55.9  0.38  0.80  98.6  80.5  ＜3％
0 0 100.8％艾普利螺酮用H型引晶  0.03  ND  100.4  82.2  77/1006
0 0 89.3％艾普利螺酮用L型引晶  0.33   0.50  97.5   80.2  ND
1冷却速度：(+)＝3℃/min.；(0)＝1.5℃/min.；(-)＝0.1℃/min。
2冷却终点：(+)＝45℃；(0)＝25℃；(-)＝5℃。
3杂质水平：(+)＝89.3％纯度的艾普利螺酮原材料；(++)＝61.1％纯度的艾普利螺酮原材料；(0)＝100.8％纯度的艾普利螺酮原材料；(-)＝94.5％纯度的艾普利螺酮原材料。
4在75℃真空炉中干燥溶剂合物后的重量百分比。
5经XPRD分析，似乎是H型与二环氧化物的混合物。
6经XPRD分析，似乎是77％H型，经DSC分析，似乎是100％H型。
A.材料纯度
图C-6显示以表C-7A报告的数据为基础的产物纯度、原材料纯度、冷却速度和终点温度的立方图。该立方图提示，在结晶开始时使用较高纯度材料将产生较高纯度的产物。结晶的终点温度似乎不会大大影响产物纯度。然而，冷却速度似乎有影响，较快的冷却速度产生纯度略低的产物。实际上，使用较快冷却速度，二环氧化物水平通常较高。
图C-7显示用立方图的结果制作的半标准图，用来确定哪个变量(如果有的话)对产物纯度具有统计学显著影响。原材料纯度对产品纯度有统计学显著的最大影响，但是冷却速度和冷却速度与原材料纯度之间的相互作用也具有统计学显著的影响。
图C-8是基于这些结果的相互作用图，显示原材料纯度与冷却速度之间对产品纯度的相互作用。使用高纯度艾普利螺酮(100.8％艾普利螺酮原材料)，冷却速度对终纯度似乎没有或有极小的影响。然而，使用低纯度艾普利螺酮(89.3％艾普利螺酮原材料)，当冷却速度升高时，产物纯度下降。该结果提示以较高冷却速度进行的艾普利螺酮结晶中有更多的杂质结晶出来。
H型含量
图C-9显示以表C-7A报告的数据为基础的H型重量分数、原材料产物纯度、冷却速度和终点温度的立方图。该立方图提示，在结晶开始时使用较高纯度的艾普利螺酮将产生较低含量的H型。结晶的终点温度似乎也对终产物的形成有影响。冷却速度似乎不会大大影响H型的形成，但是在杂质存在时，在低终点温度下较快冷却可能产生一些H型。
图C-10显示使用立方图的结果制作的半标准图，用来确定哪个变量(如果有的话)对终物质中H型的含量有统计学显著的影响。原材料纯度、结晶的终点温度和两个变量之间的相互作用具有统计学显著的影响。
图C-11是以这些结果为基础的相互作用图，显示原材料纯度与终点温度之间对终H型含量的相互作用。使用高纯度艾普利螺酮(100.8％艾普利螺酮原材料)，终点温度对H型含量似乎有极小的影响。在使用纯艾普利螺酮的每种情况下都不产生H型。然而，使用低纯度艾普利螺酮(89.3％艾普利螺酮原材料)，两种情况下都存在H型，在较高终点温度下H型显著更多。
表C-7B报告在使用流化床(LAB-LINE/P.R.L.Hi-Speed FluidBed Dryer，Lab-Line Instruments，Inc.)或真空炉(Baxter ScientificProducts Vacuum Drying Oven，Model DP-32)干燥的材料中H型的重量分数。在高流化床或真空炉干燥的相当的材料中，可见类似的H型含量。然而，与真空炉相比，在低流化床中干燥的相当的材料观察到差异。
表C-7B
  冷却速度   终点   杂质水平   干燥类型 H型的重量百分比
    高     高     高   真空炉     29％
    高     高     高   高流化床     25％
    高     高     高   低流化床     4.7％
    低     低     低   真空炉     ND
    低     低     低   高流化床     ND
    低     低     低   低流化床     5.5％
实施例C-8：H型和L型混合物从丁酮中的结晶，以制备溶剂合物，和(b)溶剂合物的去溶剂化，以制备L型
H型艾普利螺酮(10g)与80mL丁酮合并。混合物加热至回流(79℃)，在此温度下搅拌30分钟。产生的浆液然后用逐步控温(holdpoint)方案冷却，方法是使浆液在65℃、50℃、35℃、25℃下每个温度保持约90分钟。浆液过滤并用约20mL丁酮漂洗。分离的固体最初在滤纸上干燥，然后在40-50℃真空炉中干燥。干燥在90-100℃的真空炉中完成。获得去溶剂化的固体，回收率为82％。XPRD、MIR和DSC证实，该固体具有L型晶状结构。
实施例C-9：低纯度艾普利螺酮原材料用一种溶剂消化，以制备H型
用乙醇溶剂消化：
低纯度艾普利螺酮(24.6g；经HPLC测定为64％重量)与126mL乙醇3A混合。浆液加热至回流，除去馏出物。在通过大气蒸馏除去126mL溶剂的同时加入另外126mL乙醇3A。在完成溶剂更换后，将混合物冷却到25℃，搅拌1小时。固体过滤并用乙醇3A漂洗。风干固体，产生乙醇溶剂合物。溶剂合物在90-100℃真空炉中进一步干燥6小时，获得14.9g H型艾普利螺酮。
用丁酮溶剂消化
在一个备选消化方法中，1克低纯度艾普利螺酮(纯度约为65％)在4mL丁酮中消化2小时。2小时后，混合物冷却至室温。一旦冷却，即通过真空过滤收集固体，经XPRD分析确定为丁酮溶剂合物。该固体在100℃下干燥30-60分钟。经XPRD确定干燥的固体是纯H型。
实施例C-10：高纯度艾普利螺酮原材料用一种溶剂消化，以制备L型
用乙醇溶剂消化：
高纯度艾普利螺酮(1克)在8mL乙醇中消化大约2小时。溶液然后冷却至室温，通过真空过滤收集固体。在过滤后立即通过XPRD分析固体，表明该固体是一种溶剂合物(推测是乙醇溶剂合物)。该固体随后在大气压和100℃下干燥30分钟。干燥的固体用XPRD分析，确定主要是L型(未检测到H型)。
用丁酮溶剂消化：
高纯度艾普利螺酮(1克)在4mL丁酮中消化2小时。2小时后，溶液冷却至室温，通过真空过滤收集固体。立即通过XPRD分析固体，确定它是艾普利螺酮的一种溶剂合物(推测是丁酮溶剂合物)。该溶剂合物随后在环境气压和100℃下干燥30-60分钟。干燥的固体用XPRD分析，确定主要是L型，不存在H型的衍射峰。
实施例C-11：L型直接从溶液中结晶
程序A：艾普利螺酮(2.5g)通过加热到75℃溶解于乙酸乙酯中。一旦艾普利螺酮溶解，溶液即在75℃下保持30分钟，确保完全溶解。然后溶液以1℃/分钟冷却至13℃。一旦达到13℃，浆液即用高架搅拌器以750转/分搅拌2小时。通过真空过滤收集晶体，在40℃真空炉中干燥1小时。该固体的XPRD图样和DSC温谱图是L型艾普利螺酮所特有的。该固体的热重分析(TGA)表明该固体在高达200℃时没有重量损失。
程序B：在一个备选程序中，通过在热板上加热及磁力搅拌，2g艾普利螺酮溶解于350mL 15/85％的乙腈/水中。一旦艾普利螺酮溶解，溶液即在磁力搅拌下冷却至室温过夜。通过真空过滤收集产生的固体。晶体是双折射的，具有三角、平板样晶体型。该固体具有L型所特有的XPRD和DSC。TGA表明在高达200℃时没有重量损失。
程序C：在一个备选程序中，将640mg艾普利螺酮置于含有20mL乙基苯的50mL烧瓶中。产生的浆液加热到116℃，成为澄清的溶液。澄清的溶液在30分钟内冷却至25℃。冷却期间在84℃时开始晶核形成。从溶液中过滤产生的固体，风干，产生530mg固体(83％回收率)。高温显微术和XPRD证实该固体是L型晶体。
程序D：在一个备选程序中，将1.55g艾普利螺酮加入2.0mL硝基苯中，加热至200℃。产生的浆液在200℃下搅拌过夜。第二天，溶液冷却至室温(自然空气对流)，分离固体。通过XPRD和偏振光显微镜检查确定该固体是L型艾普利螺酮。
程序E：在一个备选程序中，将5.0g艾普利螺酮(纯度大于99％)加入82g甲醇(104mL)中。在搅拌(210转/分)下，溶液加热至60℃，在该温度下保持20分钟，以确保完全溶解。溶液然后在搅拌下以0.16℃/分钟冷却到-5℃。过滤收集晶体，在40℃真空炉中干燥20小时。干燥的固体通过DSC和XPRD分析确定为纯L型艾普利螺酮。
程序F：在一个备选程序中，将6.0g艾普利螺酮(含有9％乙醇且修正纯度为95.2％的乙醇溶剂合物)加入82g甲醇(104mL)中。在搅拌下(210转/分)，溶液加热到60℃，在该温度下保持20分钟，以确保完全溶解。溶液然后以0.14℃/分钟的速度冷却到50℃，在该温度下保持约2.5小时。溶液然后在搅拌下以0.13℃/分钟的速度冷却到-5℃。过滤收集晶体，在40℃真空炉中干燥20小时。干燥的固体通过DSC和XPRD分析确定为纯L型艾普利螺酮。
实施例C-12：H型直接从溶液中结晶
将150.5mg二环氧化物和2.85g艾普利螺酮加入1.5mL硝基苯中。该混合物在200℃下磁力搅拌几小时。然后通过自然空气对流，使浆液冷却至室温。干燥样品，通过偏振光显微镜检查和XPRD进行分析。XPRD表明样品是H型和L型的混合物。根据显微镜检查，该晶体是半透明的，表明未发生去溶剂化(及H型或L型的转化)。
实施例C-13：通过粉碎制备非晶态艾普利螺酮
Wig-L-Bug钢容器的大约一半填充约60g艾普利螺酮(纯度大于99.9％)。将钢球和钢帽放回样品容器上，用Wig-L-Bug装置搅拌30秒。从Wig-L-Bug容器表面刮下艾普利螺酮，容器再搅拌30秒。获得的固体通过XPRD和DSC分析，确定为非晶态艾普利螺酮和L型结晶艾普利螺酮的混合物。
实施例C-14：通过冻干制备非晶态
称重大约100mg粗艾普利螺酮至含有400mL水的烧杯中。溶液略微加热5分钟，然后超声处理并加热，再搅拌5分钟。将大约350mL艾普利螺酮溶液过滤到一个1000mL圆底瓶中，其中含有50mLHPLC水。该溶液在干冰/丙酮浴中在1-2分钟的时间内急冻。将烧瓶与Labconco Freezone 4.5冷冻干燥机相连，干燥过夜。将烧瓶中的固体转移到一个小棕色瓶中。在偏振光显微镜下观察一小等份，放大倍数为10×、1.25×optivar，cargille油(1.404)，经观察是至少95％的非晶态艾普利螺酮。图C-12和C-13显示获得的非晶态艾普利螺酮的XPRD图样和DSC温谱图。图C-12中在39度2θ观察到的峰可归因于铝样品容器。
实施例C-15：艾普利螺酮多晶型组合物
制备含有25mg、50mg、100mg和200mg剂量L型艾普利螺酮的片剂，其含有下列成分：
成分     片剂的重量％
L型艾普利螺酮     29.41
H型艾普利螺酮     未检测
一水合乳糖(#310，NF)     42.00
微晶纤维素(NF，Avicel PH101)     18.09
交联羟甲纤维素钠(NF，Ac-Di-Sol)     5.00
羟丙基甲基纤维素(#2910，USP，Pharmacoat 603)     3.00
月桂硫酸钠(NF)     1.00
滑石粉(USP)     1.00
硬脂酸镁(NF)     0.5
总计     100.00
实施例C-16：艾普利螺酮多晶型组合物
制备含有100mg剂量的艾普利螺酮的胶囊(硬明胶胶囊，#0)，其含有下列成分：
    成分     含量(mg)
    L型艾普利螺酮     90.00
    H型艾普利螺酮     10.00
    乳糖，水合，NF     231.4
    微晶纤维素，NF     45.4
    滑石粉，USP     10.0
    交联羟甲纤维素钠，NF     8.0
    月桂硫酸钠，NF     2.0
    胶体二氧化硅，NF     2.0
    硬脂酸镁，NF     1.2
    总胶囊填充重量     400.00
实施例C-17：艾普利螺酮多晶型组合物
制备含有200mg剂量的艾普利螺酮的胶囊(硬明胶胶囊，尺寸#0)，其含有下列成分：
    成分     含量(mg)
    L型艾普利螺酮     190.0
    H型艾普利螺酮     10.00
    乳糖，水合，NF     147.8
    微晶纤维素，NF     29.0
    滑石粉，USP     10.0
    交联羟甲纤维素钠，NF     8.0
    月桂硫酸钠，NF     2.0
    胶体二氧化硅，NF     2.0
    硬脂酸镁，NF     1.2
    总胶囊填充重量     400.00
实施例C-18：磨碎的艾普利螺酮的制备
首先使溶剂合物通过Fitzmill上的20目筛分散干燥的丁酮溶剂合物。分散的固体然后用Alpine Hosakawa stud disk pin磨研磨，在液氮冷却下操作，进料速度为大约250千克/小时。研磨产生D90大小约为65-100微米的磨碎的艾普利螺酮。
鉴于以上所述，本发明的几个目的已经达到。由于在不背离本发明的范围的情况下，本发明的上述方法、组合和组合物能够进行多种改变，因此上述描述中包括的所有物质都是说明性的，并非意在限制。本申请提到的所有文件均在此全文引用作为参考。
当介绍本发明的成分或优选实施方案时，冠词a”、“an”、”the”和”said”是指一种或多种成分。术语“包含”、“包括”和“具有”是包括端值在内的，表示除了列出的成分之外可能还有其它成分。
实施例D-1：一定剂量范围的艾普利螺酮在轻度到中度高血压治疗中的效能和安全性评价
当每日一次(QD)或分开剂量施用时，例如每日两次(BID)或每日三次(TID)，艾普利螺酮在宽剂量范围内(50-400mg)是安全且良好耐受的。如图D-1和图D-2所示，宽范围剂量的艾普利螺酮比安慰剂导致舒张期血压(DBP)和收缩期血压(SBP)显著下降，无论评价方法如何。艾普利螺酮在最后一次给药后24小时内增强肾素-醛固酮-血管紧张素***(RAAS)，证实每日一次给药的效能。血压(BP)和RAAS作用的程度取决于剂量，而不是给药频率。
实施例D-2：艾普利螺酮剂量范围析因设计
这是一个多中心、随机化、双盲、安慰剂和活性控制的平行组艾普利螺酮剂量范围研究，包括为期1-2周的预处理筛选期，随后是为期2-4周的单盲安慰剂加入期，之后随机分配，是一个为期8周的双盲随机处理期。见图D-3。患者在第0、2、4、8周评价。在方案指定的时间点的研究评价包括血压(BP)、心率、临床实验室分析、生命体征、体检、12-导联ECG及不良反应的监测。
总共614名患者被随机分配。男性或女性患者，18岁或更大，具有轻度到中度高血压史，或新诊断为高血压(坐位DBP≥90mmHg且＜110mmHg)。
艾普利螺酮单一治疗，每日剂量25mg、50mg或200mg，或氢***(HCTZ)单一治疗，每日剂量12.5mg或25mg，导致剂量依赖的DBP下降。艾普利螺酮单一治疗，每日剂量25mg、50mg或200mg，或HCTZ单一治疗，每日剂量12.5mg或25mg，导致剂量依赖的SBP下降。如图D-4和图D-5所示，艾普利螺酮与HCTZ联合治疗导致DBP和SBP剂量依赖的均值降低，从基线降到最后一次访视。对于艾普利螺酮200/HCTZ 12.5和艾普利螺酮与25mg HCTZ的所有组合，其降低显著大于安慰剂。
与相应的单一治疗相比，艾普利螺酮与HCTZ的所有组合都导致DBP和SBP更大的降低。
根据不良反应、安全性实验室结果和生命体征评价，作为单一治疗或与HCTZ联合施用8周的艾普利螺酮是安全的且良好耐受。未观察到男性乳腺发育，阳萎和***的发生率与安慰剂相当。
实施例D-3：艾普利螺酮与依那普利在原发性高血压患者中的抗高血压和肾保护作用
这项为期12个月的双盲滴定-作用(titration-to-effect)研究比较了艾普利螺酮(EPL)——一种选择性醛固酮阻断剂，和依那普利(ENAL)——一种ACE抑制剂，在高血压治疗中的效能和安全性。
研究设计在图D-6中说明。轻度到中度高血压患者(舒张期血压[DBP]≥95mmHg且＜110mmHg)被随机分配，最初接受EPL 50mg每日一次(n＝253)或ENAL 10mg每日一次(n＝246)。如果在第4、8、12、16或20周时DBP≥90mmHg，研究药物治疗剂量逐渐增加，至EPL 100mg和200mg每日一次，或ENAL 20mg和40mg每日一次。为了检查治疗是否导致高血压疾病状态长期改变，第24周血压[BP]得到控制的所有患者都降低一个剂量水平，另外6个月每月一次(如果减量导致BP控制丧失，则研究药物治疗剂量重新增加至第24周的水平)。第24周和第12个月，评价BP、RAAS激素谱、尿白蛋白***(尿白蛋白/肌酸酐比[UACR])、实验室检测、安全性和不良反应(AE)的变化。
如图D-7和图D-8所示，两种药物使SBP/DBP在第24周时(EPL-14.5/-11.2mmHg，ENAL-12.7/-11.3mmHg)和12个月时(EPL-16.5/-13.3mmHg，ENAL-14.8/-14.1mmHg)降低。EPL和ENAL组患者在第12个月时用减少的剂量继续控制BP。
在基线微量蛋白尿升高的患者中(UACR≥30mg/g)，第24周时，使用EPL比ENAL观察到更大的显著性UACR降低(-61.5％对-25.7％，P＝0.01)。明显有更多的ENAL患者患咳嗽(6.5％对2.4％，P＝0.029)、高血糖症(2.8％对0.0％，P＝0.007)和尿道感染(UTI)(2.8％对0.4％，P＝0.035)。
用艾普利螺酮阻断醛固酮可有效控制BP。艾普利螺酮治疗的患者显示更大的UACR降低，它可预后预测末期器官的损伤，并且有更少的不良反应。在轻度到中度高血压患者中，艾普利螺酮和依那普利的抗高血压作用(DBP和SBP)在治疗24周后相似。
艾普利螺酮和依那普利的抗高血压作用(DBP和SBP)的保持在减量后的6个月时间内相似。
血清化学，包括钾、钠、镁、碳酸氢盐和尿酸，没有临床显著的变化。艾普利螺酮和依那普利是安全的，且良好耐受(图D-9)。
实施例D-4：艾普利螺酮、依那普利和艾普利螺酮/依那普利联合治疗在左心室肥大患者中的效能和耐受性
这项为期9个月的双盲增量研究比较艾普利螺酮(EPL)——一种选择性醛固酮阻断剂与依那普利(ENAL)——一种ACE抑制剂和EPL+ENAL联合治疗的心脏保护活性和耐受性。
研究设计在图D-10中说明。根据超声心动图诊断的轻度到中度高血压和左心室肥大(LVH)患者随机分配为接受EPL 50mg每日一次(n＝64)、ENAL 10mg每日一次(n＝71)或EPL 50mg/ENAL 10mg(n＝67)。药物在第2周增量至EPL 100mg、ENAL 20mg和EPL 100mg/ENAL 10mg，第4周为EPL 200mg、ENAL 40mg和EPL200mg/ENAL 10mg。如果第8周时血压仍然未被控制(DBP≥90mmHg或SBP＞180mmHg)，则加用HCTZ 12.5mg，必要时第10周增加到HCTZ 25mg。左室重量(LVM)(通过MRI测量)、血压、胶原蛋白更新和耐受性在9个月终点时评价。
LVM的降低在表D-4和图D-11到D-13中显示，血压的降低在图D-14中显示。
表D-4
                                 EPL           ENAL           EPL+ENAL
                               50-200mg       10-40mg
LVM
    校正的均数变化[g(SE)]     -14.5(3.36)     -19.7(3.20)    -27.2(3.39)
    P值，对ENAL               0.258
    P值，对EPL/ENAL           0.007           0.107
SBP/DBP
    校正的均数变化[mmHg(SE)]  -21.0/-10.8     -22.5/-13.0    -27.1/-13.5
                              (1.81/1.02)     (1.69/0.95)    (1.79/1.01)
    P值，对ENAL               0.539/0.113
    P值，对EPL/ENAL           0.016/0.062     0.061/0.749
所有处理在胶原蛋白更新(EPL-7.3％，ENAL-7.3％，和EPL/ENAL-10.2％)和UACR(EPL-28.7％，ENAL-39.1％，和EPL/ENAL-50.7％)方面均观察到距基线的显著降低。如图D-15所示，患咳嗽的ENAL患者显著多于EPL患者(14.1％对3.1％，P＝0.033)。
在消退LVH和降低胶原蛋白更新方面，艾普利螺酮单一治疗与依那普利单一治疗一样有效。作为附加治疗，艾普利螺酮可增强依那普利的效能。
实施例D-5：艾普利螺酮与洛沙坦在低肾素高血压患者中的比较
为了检验低血浆肾素高血压患者可能是盐/容量敏感的，因此对艾普利螺酮的反应可能强于ACE抑制剂或血管紧张素II受体阻断剂这一假说，对低肾素高血压进行的这项为期16周的随机双盲研究比较了艾普利螺酮(EPL)——一种选择性醛固酮阻断剂与洛沙坦(LOS)——一种血管紧张素II受体阻断剂的效能和安全性。
研究设计在图D-16中说明。低肾素高血压患者(早晨血浆肾素活性≤1.0ng/mL/h或活性肾素值≤25pg/mL)被随机分配，最初接受EPL100mg每日一次(n＝6)或洛沙坦(LOS)50mg每日一次(n＝82)。第4周，如果血压未被控制(DBP≥90mmHg)，则研究药物增量至EPL 200mg每日一次或LOS 100mg每日一次。第8周，如果血压仍然未被控制，则加用HCTZ 12.5mg，必要时第12周增量至25mg。在第8周和第16周评价BP、RAAS激素谱和安全性。
在EPL和LOS组中，基线平均活性肾素水平分别是11.7mU/L和12.7mU/L。如图D-17所示，在该试验的单一治疗部分结束时(第8周)，至于SBP/DBP距基线的均值变化，EPL组显著高于LOS组(EPL-15.8/-9.3mmHg，LOS-10.1/-6.7mmHg，P＝0.017/0.001)。
如图D-18所示，第16周时，在加用HCTZ后，SBP/DBP距基线的均值变化在EPL组中(-18.3/-10.8mmHg)好于LOS组(-15.0/-9.8mmHg)。另外，需要HCTZ附加治疗的患者的累积百分数在EPL组中(32.5％)低于LOS组(55.6％)(图D-19)。两组的活性肾素水平升高在第8周(EPL+50.1％，LOS+63.8％，P＝0.416)和第16周时(EPL+73.0％，LOS+83.3％，P＝0.635)相似。至于血清醛固酮水平升高，EPL组在第8周(EPL+74.7％，LOS-18.7％；P＜0.001)和第16周(EPL+89.8％，LOS-5.5％，P＜0.001)时较大。至于治疗意外不良反应的总体发病率或任何具体治疗意外不良反应的发病率，EPL和LOS组之间未观察到显著性差异。
在治疗低肾素高血压方面，艾普利螺酮比洛沙坦更有效，并且显示类似的耐受性。因此艾普利螺酮是对高血压患者的这一重要亚群的一种可行治疗选项。
在低肾素高血压患者中，在治疗的第8周，艾普利螺酮单一治疗的抗高血压作用(DBP和SBP)大于洛沙坦单一治疗。在第8周之后进行HCTZ时，第16周评价的艾普利螺酮和洛沙坦的抗高血压作用相当。
与洛沙坦治疗患者相比，较少的艾普利螺酮治疗患者需要加用HCTZ来控制血压。第8周时，艾普利螺酮单一治疗比洛沙坦单一治疗使更多的患者的血压得到控制；当8周后进行HCTZ时，如图D-20所示，血压控制在两个治疗组中有一些相似。
证实醛固酮/肾素水平与DBP变化之间没有相关性。如图D-21所示，艾普利螺酮是安全的且良好耐受。
实施例D-6：艾普利螺酮与洛沙坦在黑人和白人高血压患者中的效能和耐受性
黑人高血压患者更可能具有低肾素水平，因此，可能对血管紧张素II受体阻断剂单一治疗反应性较差。艾普利螺酮(EPL)最近显示能比血管紧张素II受体阻断剂洛沙坦(LOS)更好地降低低肾素高血压患者的血压，引出EPL在黑人高血压患者中也可能较好的假说。为了检验这一假说，一项为期16周的双盲随机研究比较了EPL、LOS和安慰剂(PBO)在黑人和白人轻度到中度高血压患者中的效能和安全性。
研究设计在图D-22中说明。黑人(n＝348)和白人(n＝203)轻度到中度高血压患者被随机分配，最初接受EPL 50mg每日一次、LOS 50mg每日一次或PBO。如果第4、8或12周时血压未被控制(DBP≥90mmHg)，则研究药物的剂量提高一个剂量水平，至EPL 100mg或200mg每日一次、LOS 100mg每日一次或PBO。第16周时，评价血压、血液化学、通过UACR测定的微量蛋白尿和安全性。
SBP/DBP和活性肾素的基线至第16周的变化在表D-6和图D-23至D-25中显示：
                 表D-6：SBP/DBP和活性肾素的基线至第16周的变化
                                                                           p值
                         EPL           LOS         PBO         EPL vs PBO        EPL vs LOS
所有患者
    ΔSBP/DBP(mmHg)  -12.8/-10.3   -6.3/-6.9   -3.4/-5.3    ＜0.001/＜0.001    ＜0.001/＜0.001
  活性肾素(％变化)     +45.6       +67.1       +14.8        ≤0.023            ≤0.037
黑人患者
    ΔSBP/DBP(mmHg)  -13.5/-10.2   -5.3/-6.0   -3.7/-4.8    ＜0.001/＜0.001    ＜0.001/＜0.001
  活性肾素(％变化)     +39.3       +40.0       +11.7        ≤0.023
白人患者
    ΔSBP/DBP(mmHg)  -12.3/-11.1   8.5/-8.4   -3.2/-6.4     ＜0.001/＜0.001    0.126/0.068
  活性肾素(％变化)     +57.1       +113.7      +22.9        ≤0.023            ≤0.037
黑人患者中的基线活性肾素水平(EPL 10.9mU/L，LOS 9.6mU/L，PBO 10.4mU/L)低于白人患者(EPL 12.0mU/L，LOS 14.4mU/L，PBO 15.4mU/L)。UACR距基线的校正均值百分变化为，EPL-21.6％，LOS-18.2％，PBO 5.2％(EPL对PBO，P＝0.003)。
如图D-26所示，至于治疗意外不良反应的总体发病率或任何具体治疗意外不良反应的发病率，EPL、LOS和PBO之间未观察到显著性差异。
在黑人高血压患者中，在轻度到中度高血压的治疗上，艾普利螺酮优于洛沙坦，在白人患者中也有较好效能的趋势。这两种药物都减少微量蛋白尿，这可预后预测末期器官损伤和心血管疾病，这两种药物都是安全的且良好耐受。
艾普利螺酮治疗在所有患者(黑人和白人)中都导致优于安慰剂的抗高血压作用，如根据DBP和SBP测量的。艾普利螺酮治疗在黑人患者和白人患者中程度相当地有效降低DBP和SBP。
艾普利螺酮治疗在所有患者和黑人患者中导致强于洛沙坦的抗高血压作用，如根据DBP和SBP测量的，在白人患者中与洛沙坦相当。与安慰剂相比，用艾普利螺酮和洛沙坦治疗在所有患者、黑人患者和白人患者中都导致微量蛋白尿减少。
艾普利螺酮治疗对RAAS激素(神经激素)的影响与醛固酮受体拮抗作用相一致，与利用血管紧张素II受体拮抗作用的洛沙坦治疗相一致。使用安慰剂未见RAAS激素的变化。
实施例D-7：抗蛋白尿：艾普利螺酮、依那普利和艾普利螺酮/依那普利联合治疗在患有微量蛋白尿的糖尿病高血压患者中的效能
这项为期24周的双盲研究比较艾普利螺酮(EPL)——一种选择性醛固酮阻断剂、依那普利(ENAL)——一种ACE抑制剂和EPL+ENAL联合治疗在患有糖尿病和蛋白尿的高血压患者中的肾和抗高血压作用和耐受性。
最初的研究设计在图D-27中说明。患有轻度到中度高血压(DBP＞95mmHg且＜110mmHg；SBP＜180mmHg)和微量蛋白尿(UACR≥250mg/g)的2型糖尿病患者随机分配接受EPL 200mg每日一次、ENAL 40mg每日一次或EPL 200mg/ENAL 10mg(通过在4周内增量达到剂量)。在第8周或之后，如果血压仍未被控制(DBP≥90mmHg)，则加用HCTZ 12.5mg，必要时进一步增量至25mg。
该研究的主要目的是比较用艾普利螺酮及用依那普利治疗或联合治疗的患者第24周时尿蛋白***距基线的均值变化，根据尿白蛋白/肌酸酐比(UACR)测定。本研究的次要目的是：
1.在第8周和第24周时，比较艾普利螺酮与依那普利或联合治疗对波谷袖带坐位DBP(seDBP)和坐位SBP(seSBP)距基线的均值变化的影响。
2.第24周时，比较艾普利螺酮与依那普利或联合治疗的影响，根据下列指标距基线的均值变化确定：胶原蛋白标记物(III型前胶原的氨基末端前肽[PIIINP]，IV型胶原蛋白的7S域[7SIVC]和I型胶原蛋白的端肽[ICTP])；纤维蛋白溶解平衡(纤溶酶原激活物抑制剂[PAI-1]、组织纤溶酶原激活物[t-PA])和代谢效应(胰岛素、糖基化血红蛋白、空腹血清葡萄糖和脂类[甘油三酯、总胆固醇和HDL胆固醇])。
3.测定艾普利螺酮与依那普利和联合治疗的抗高血压、代谢或尿白蛋白***反应距基线的均值变化，与基线躯干性肥胖(腰围)、基线血浆肾素水平(总的和活性的)或基线血清醛固酮水平相关。
4.比较艾普利螺酮与依那普利或联合治疗的安全性和耐受性，根据报告的不良反应、临床实验室值、体检、生命体征和心电图评价。
在方案确定的时间点进行的研究评价包括血压、心率、体重、胶原蛋白标记物(PIIINP、7SIVC和ICTP)、纤维蛋白溶解平衡(PAI-1和t-PA)、胰岛素和糖基化血红蛋白、药物经济学数据和UACR。在整个研究过程中，通过常规临床实验室分析评价安全性，包括血清钾、生命体征、体检、体重、12导联ECG和不良反应的监测。
尽管最初计划有165名患者(图D-27)，但是实际上使266名患者随机分配：93名艾普利螺酮，84名依那普利，89名艾普利螺酮/依那普利。SBP/DBP的校正的均值变化在表D-7和图D-30和D-31中显示。
表D-7：SBP/DBP的校正的均值变化
  EPL   ENAL   EPL+ENA
 BP
 N   89   83   85
 ΔSBP/DBP(第8周-基线)   -13.5/-10.2   -15.4/-11.6   -16.5/-12.8
 ΔSBP/DBP(第24周-基线)   -19.5/-13.2*   -20.4/-15.0   -21.8/-16.2
*P＝0.015，相比EPL+ENAL
36/84 EPL患者、43/81 ENAL患者和25/79 EPL+ENAL患者需要加用氢***(HCTZ)。在8名EPL、2名ENAL和8名EPL+ENAL受试者中观察到K+升高(≥6.0mEq/L)。因高钾血症退出的患者，EPL+ENAL组(14)多于EPL组(6)和ENAL组(2)。治疗组之间的其它不良反应相似。
艾普利螺酮比依那普利导致更大的微量蛋白尿减少，艾普利螺酮与依那普利组合比单独的药物更大程度地导致微量蛋白尿减少。根据UACR估计，微量蛋白尿的减少不依赖于血压减少的水平，表明用艾普利螺酮选择性阻断醛固酮在患有2型糖尿病的高血压患者中有肾保护作用。
用艾普利螺酮、依那普利治疗和联合治疗在第8周导致类似的DBP和SBP降低(无加用药物)。第24周(需要时在加用HCTZ/氨氯地平后)，艾普利螺酮与依那普利组合比艾普利螺酮治疗导致更大程度的DBP降低。
基线躯干性肥胖、血浆肾素水平或血清醛固酮与艾普利螺酮、依那普利或组合治疗引起的抗高血压代谢或尿白蛋白***变化之间没有相关性。
如图D-32所示，在患有糖尿病的高血压患者中，与依那普利治疗的患者相比，用艾普利螺酮治疗与血清钾水平升高和与高钾血症有关的不良反应有关。
在同一人群中，治疗引起的高钾血症的发病率高于未患微量蛋白尿的人群。这些结果表明肾排钾能力受损。然而，许多高钾血症患者能够继续用艾普利螺酮或艾普利螺酮/依那普利治疗，而不会使高钾血症恶化。这一发现进一步表明，在这些高钾血症糖尿病患者中，用艾普利螺酮继续治疗不仅不仅减少了微量蛋白尿，而且提高了排钾的能力。
用艾普利螺酮、依那普利和联合治疗良好耐受。
实施例D-8：在收缩期高血压老年人中，艾普利螺酮与钙对血压、血管顺应性和微量蛋白尿的拮抗作用的比较
在老年患者中，收缩期血压升高和宽脉压比舒张期血压更好地预测心血管危险。老年人中，血管顺应性变差和小球内高血压一般伴随着分离的收缩期高血压。在收缩期高血压和/或脉压变宽(SBP≥150mmHg且＜165mmHg，PP≥70mmHg；或SBP≥165mmHg且＜200mmHg，DBP＜95mmHg)的老年患者(平均年龄67.7岁)中进行一项为期24周的双盲、滴定-作用研究，检查艾普利螺酮与标准二氢吡啶钙拮抗剂氨氯地平对血压、血管顺应性和微量蛋白尿的影响。
研究设计在图D-33中显示。患者随机分配，接受艾普利螺酮50mg每日一次(N＝134)或氨氯地平2.5mg每日一次(N＝135)，有两个可能的滴定步骤(第2周和第6周，分别为艾普利螺酮100和200mg每日一次，氨氯地平5和10mg每日一次)，以使SBP下降为≤140mmHg。在基线和治疗24周后，评价根据脉搏波速测定的动脉顺应性、微量蛋白尿和不良反应的变化(AE)。
如表D-8和图D-34到D-38所示，EPL和AML导致类似的SBP降低(-20.5mmHg对-20.1mmHg)，脉压降低(-15.9mmHg对-13.4mmHg)、颈动脉-股动脉脉搏波速下降(-2.1msec对-2.4msec)。在基线微量蛋白尿患者(＞30mg/g)中，EPL减少UACR强于AML(-27.1％对-3.3％，P＝0.002)。
在AML组中，患者的生活质量(QoL)评价在21种症状上显示距基线有显著且临床有意义的痛苦恶化，而在EPL组中未观察到这种痛苦恶化。在这21种症状中，EPL在下列5种症状中有显著阳性作用：足及踝肿胀，体重增加，夜尿，排尿增多，呼吸急促。外周水肿的频发程度，EPL远低于AML(3.7％对25.2％，P＜0.05)(图D-39)。
表D-8：临床观察
参数 艾普利螺酮 氨氯地平  P值
收缩期血压(mmHg) -20.5±1.14 -20.1±1.13  0.826
脉压(mmHg) -15.9±0.96 -13.4±0.95  0.066
颈动脉-股动脉脉搏波速(msec) -2.1±0.25 -2.4±0.25  0.449
Δ微量蛋白尿(％)* -52.3 -10.4  0.002
水肿率(％) 3.7 25.2  ＜0.001
*只是对于基线微量蛋白尿患者(＞30mg/g)
这些发现证明，艾普利螺酮与氨氯地平类似地降低收缩期血压、脉压和血管顺应性。相反，艾普利螺酮比氨氯地平程度更大地减少微量蛋白尿，这是CV发病率和末期器官损伤的一个明确的危险因素，并且与显著低于氨氯地平的外周水肿有关。
艾普利螺酮是安全的，在降低SBP方面与氨氯地平相当。艾普利螺酮和氨氯地平在降低脉压方面相当。氨氯地平降低DBP的作用强于艾普利螺酮。艾普利螺酮减少微量蛋白尿强于氨氯地平。在测量血管顺应性的患者亚组中，艾普利螺酮和氨氯地平与它的改善有关。在动态血压监测(ABPM)的患者亚组中，艾普利螺酮和氨氯地平与HR、SBP、DBP和脉压的下降有关。
艾普利螺酮和氨氯地平是安全的和良好耐受的；氨氯地平与较高的外周水肿发病率有关。
实施例D-9：在轻度-中度高血压患者中，艾普利螺酮与血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素II拮抗剂的同时施用
ACE抑制剂(ACE-I)和血管紧张素受体阻断剂(ARBs)是高血压药物治疗中常用的药物。这些药物的单一治疗通常不足以达到足够的血压控制。ACE-I和ARB(和联合)都不足以长期抑制醛固酮水平。醛固酮具有独立的不利的心血管作用，包括血压升高。因此，醛固酮阻断可以是对ACE-I或ARB控制不利的高血压患者的合理附加治疗。
本研究的目的是测定：1)当与一种ACE-I或ARB同时向轻度-中度高血压患者施用时，新型选择性醛固酮受体拮抗剂(SARA)艾普利螺酮的安全性，和2)背景ACE-I或ARB治疗控制不利的患者加用的艾普利螺酮对血压的影响。
研究设计在图D-40中显示。该研究中检测的患者目前用一种ACE-I和/或ARB治疗，其DBP≥95mmHg且＜110mmHg，SBP＜180mmHg。除了固定剂量的单次ACE-I或ARB外，退出以前的抗高血压治疗。
在用ACE-I或ARB单一治疗不能控制血压的高血压患者中，增加艾普利螺酮导致：
(1)目前用ACE-I治疗的患者的SBP显著下降(图D-41到D-43)；
(2)目前用ARB治疗的患者的SBP和DBP显著下降(图D-42到D-44)；
(3)有关的实验室异常(图D-45)，特别是K+(图D-46和D-47)，没有显著增加，或者不良反应增加(图D-48和D-49)；
(4)任一组的心率都没有变化(图D-50)；
(5)活性肾素和血清醛固酮水平的变化与醛固酮受体拮抗作用一致(图D-51和D-52)；
(6)较低的研究退出(图D-53)；和
(7)较高的对治疗有反应(DBP)的患者的百分比(图D-54)。
当与ACE-I或ARB同时对单一治疗不能控制血压的轻度-中度高血压患者施用时，艾普利螺酮是有效的且安全的。
根据此处的结果，艾普利螺酮在阻止不利心血管作用中的重要性，和ACE-I和ARB都不能充分抑制该激素，证明了艾普利螺酮是用于ACE-I或ARB不足以控制的高血压患者的一种有用的附加治疗。
实施例D-10：艾普利螺酮与CCB或β-阻断剂的同时施用
此艾普利螺酮研究设计在图D-55中显示。这是一项多中心、双盲、随机化、安慰剂对照、安慰剂加入的平行组研究。该研究包括为期1-2周的预处理筛选期，随后是为期2-4周的单盲安慰剂加入，之后随机分配，为期8周的双盲治疗期。患者根据钙通道阻断剂(CCB)或β肾上腺素能受体阻断剂(BB)治疗分类，然后以相等的比例分配，接受艾普利螺酮50mg或安慰剂。如果第2周时血压未被控制(DBP≥90mmHg)，则将研究药物的剂量增加到艾普利螺酮100mg每日一次或安慰剂。如果第4周或第6周时血压未被控制，且研究药物的剂量未增加，则将剂量增加到艾普利螺酮100mg每日一次或安慰剂。剂量只在研究期间增加一次。在研究期间的任何时间，如果发生有症状的低血压(即与低血压有关的头昏目眩、眩晕或昏厥)，则患者退出。
在方案指定的时间点的研究评价包括血压、心率、临床实验室分析、ECG和伴随药物。在整个研究过程中，通过常规临床实验室分析、生命体征、体检、12-导联ECG和不良反应的监测评价安全性。在研究期间的任一时间，如果患者的钾水平和重复值＞5.5mEq/L，则患者退出该研究。
设计该研究，每组和每部分(cohort)包括60名随机患者。实际有272名患者被随机分配：在CCB部分(cohort)中有137名(67名安慰剂，70名艾普利螺酮)，在BB部分(cohort)中有135名(66名安慰剂，69名艾普利螺酮)。
在用BB或CCB单一治疗未能控制血压的患者中，向BB中增加艾普利螺酮能有效降低DBP和SBP；向CCB中增加艾普利螺酮能有效降低SBP(图D-56和D-57)。
根据对不良反应、体检、心率和ECG的评价，艾普利螺酮作为一种附加抗高血压剂是安全且良好耐受的。选择的实验室值(即钠、镁、BUN、肌酸酐、SGOT、SGPT、GGT、尿酸、葡萄糖、脂类[总胆固醇、LDL胆固醇、HDL胆固醇和甘油三酯])没有临床上显著的变化(图D-58)。
如表D-10所示，在CCB部分(cohort)内，在每一时间点，对治疗有反应的接受艾普利螺酮的患者(seDBP＜90mmHg或比基线下降≥10mmHg)多于接受安慰剂的患者。在BB部分(cohort)内，在每一时间点，与接受安慰剂的患者相比，接受艾普利螺酮的患者中有显著更高的比例对治疗有反应(p＜0.011)。
表D-10：舒张期血压反应速度
对研究药物有反应的患者百分比
CCB Cohort  BB Cohort
  时间点 安慰剂(N＝66)   艾普利螺酮(N＝67)   p-值   安慰剂(N＝66)   艾普利螺酮(N＝69)   p-值
  第2周 30(45.5％)   40(60.6％)   0.069   31(47.0％)   48(69.6％)   0.009
  第4周 36(54.5％)   51(76.1％)   0.003   35(53.0％)   53(76.8％)   0.003
  第6周 46(69.7％)   55(82.1％)   0.063   41(62.1％)   56(81.2％)   0.011
  第8周 41(62.1％)   48(71.6％)   0.204   33(50.0％)   52(75.4％)   0.002
实施例D-11：对于轻度到中度高血压的长期治疗而言，艾普利螺酮是安全、有效的
研究设计在图D-59中显示。这项为期6-16个月的开放标记单组滴定-作用研究评价EPL在轻度到中度高血压患者中的安全性、耐受性和效能。
DBP≥90mmHg且＜110mmHg，或SBP≥140mmHg且＜180mmHg的患者(n＝586)接受EPL 50mg每日一次。如果第2周或第4周时血压未被控制(DBP≥90mmHg或SBP≥140mmHg)，则EPL加量至100mg，每日一次，必要时200mg，每日一次。如果在从第6周到第3个月结束时的任一时间点血压仍然未被控制，则加用研究者选择的第二种抗高血压药物。在方案指定的时间评价安全性、耐受性和血压。
如图D-60和D-61所示，在所有剂量组中观察到DBP和SBP的下降。总共433名患者(582名中的74.3％)在治疗结束时被归类为反应者(即seDBP＜90mmHg或比基线下降≥10mmHg)。在这些治疗者中，有44.8％(261/582)的患者对艾普利螺酮单一治疗起反应。表D-12中列出了有反应的患者的seDBP和seSBP的均值和从基线到治疗结束时的均值变化。
表D-11：坐位收缩期和舒张期血压的均值和治疗结束时与基线相比的均值变化(mmHg)-有效者。准备治疗的人群
 亚组 N  基线均值SBP/DBP 均值变化SBP/DBP  SE改变SBP/DBP
 Epl 50mg每日一次 68  143.0/92.3 -15.9/-10.6  1.47/0.78
 Epl 50、100mg每日一次 89  147.1/94.2 -18.1/-12.2  1.34/0.73
 Epl 50、100、200mg每日一次 104  150.4/95.1 -19.1/-12.5  1.34/0.73
 Epl 50、100、200mg每日一次+Ahyp  172  154.2/98.3 -24.9/-14.6  0.95/0.54
报告治疗意外不良反应(AE)与研究药物“不确定”或“可能”相关的患者比例分别为21.5％和8.4％。如图D-62所示，对于50、100、200mg的剂量，分别在3.0％、0.7％和2.5％的患者中观察到阳萎、男性乳腺发育和***，但是大多数事件被认为是不确定的或与研究的药物没有相关性。
在2.4％的患者中注意到K+水平升高，主要是接受EPL 200mg的患者。终剂量水平是EPL 50mg的患者(N＝68)中，SBP/DBP距基线的均值变化是-15.9/-10.6；对于EPL 100mg(N＝89)是-18.1/-12.2；对于EPL 200mg(N＝104)是-19.1/-12.5；对于EPL 200mg加附加治疗(N＝172)是-24.9/-14.6。
当作为单一治疗或与其它抗高血压药物联用时，艾普利螺酮对轻度到中度高血压的长期治疗是安全、有效的。
在可达14个月内，以单独每日剂量50-200mg或与另一种抗高血压药联用时以200mg/天施用艾普利螺酮是安全的且良好耐受。
实施例D-12：在动态血压监测(ABPM)中的艾普利螺酮与氨氯地平
本研究方案在图D-63中显示。这是一项多中心、随机化、双盲、活性控制、安慰剂加入的平行组研究。该研究包括为期1-2周的预处理筛选期，随后是为期2-4周的单盲安慰剂加入期，之后随机分配，为期16周的双盲随机化治疗期。患者随机分配，接受艾普利螺酮50mg或氨氯地平2.5mg。
如果第2周时DBP未被控制(DBP≥90mmHg)，研究药物的剂量增加一个剂量水平，至艾普利螺酮100mg或氨氯地平5mg。如果第4、6、8或12周时血压未被控制，研究药物的剂量增加一个剂量水平(至艾普利螺酮100mg或200mg，或氨氯地平5mg或10mg)。如果在这些访视时，患者接受艾普利螺酮200mg或氨氯地平10mg至少14天，而血压未被控制，则患者退出该研究。如果在第4、6、8或12周时发生有症状的低血压(即与低血压有关的头昏目眩、眩晕或昏厥)，且患者为剂量水平2或3，则将剂量降低一个剂量水平(至剂量水平1或2)。如果在第2周或第4、6、8或12周时发生有症状的低血压，且患者使用最低剂量水平(剂量水平1)，则患者不退出。
在方案指定的时间点的研究评价包括血压、心率、ABPM、Holter记录、临床实验室分析，包括血清钾水平、伴随药物。在整个研究过程中，通过常规临床实验室分析、生命体征、体检、12-导联ECG和不良反应的监测评价安全性。在研究期间的任一时间，如果患者的钾水平和重复值＞5.5mEq/L，则患者退出该研究。
根据24小时平均舒张期ABPM估计，氨氯地平的抗高血压作用大于艾普利螺酮(图D-64)。根据24小时平均舒张期ABPM估计，艾普利螺酮和氨氯地平的抗高血压作用相当(图D-65)。
根据ABPM估计，白天，氨氯地平的降血压作用大于艾普利螺酮，夜间相当(图D-65到D-67)。
在施用氨氯地平或艾普利螺酮后，每小时基线平均SBP(图D-68)和DBP(图D-69)和每小时终点平均SBP(图D-70)和DBP(图D-71)相当。氨氯地平和艾普利螺酮对速度-压力-产物(HR×SBP)的影响相当。
活性肾素和血清醛固酮水平的变化证明了盐皮质激素受体的阻断和RAAS的代偿性反馈激活。
除了氨氯地平与较高的外周水肿发病率有关之外，艾普利螺酮和氨氯地平是安全的且良好耐受(图D-72)。
实施例D-13：在400名***性高血压患者中利用动态和临床血压对新型选择性醛固酮阻断剂艾普利螺酮的评价
本研究方案在图D-73中显示。为了估计艾普利螺酮在***性高血压中的用途，在治疗I-III期高血压的剂量范围内，进行一项为期12周的双盲、安慰剂对照、平行分组、固定剂量的研究。在单盲安慰剂治疗3-4周并获得基线临床和动态BP量值(ABPM)后，400名患者随机分配，接受安慰剂或4个剂量的艾普利螺酮之一(25、50、100和200mg，每日一次)。在12周治疗结束时利用临床及动态血压重新评价患者。
表D-13和图D-73和D-75显示了使用艾普利螺酮后临床和动态血压距基线的变化。也显示了袖带seDBP(图D-76)和袖带seSBP(图D-77)距基线的校正均值变化。
表D-13：使用艾普利螺酮后临床和动态血压与基线的变化
    剂量(N)   Δ临床血压(mmHg)   Δ动态血压(mmHg)
    安慰剂(90)     -0.0/-1.7     -1.3/-0.8
    25mg(45)     -5.7/-3.7     -6.4/-4.4
    50mg(87)     -6.7/-4.6     -6.8/-4.1
    100mg(90)     -10.4/-6.3     -9.1/-5.5
    200mg(88)     -8.8/-5.4     -10.3/-5.7
如图D-78所示，在使用艾普利螺酮的患者中未报告男性乳腺发育、***或***痛。艾普利螺酮引起的不良反应和退出率与安慰剂相似。因此，这些数据证明，对于ABPM，艾普利螺酮在低至每日25mg的剂量时是有效的。而且，根据临床和动态血压，I-III期高血压中的最高有效剂量是每日100mg。

Claims (26)

1.一种在患有或易患器官损伤的人类受试者中治疗或预防器官损伤的方法，该方法包括对受试者施用治疗有效量的环氧甾族化合物，其中该受试者满足下列一个或多个条件：
(a)该受试者患有或易患胰岛素抗性或葡萄糖敏感；
(b)该受试者显示选自微量蛋白尿、轻度到中度高血压和低血浆肾素水平的一种或多种病症；
(c)该受试者是黑人；
(d)用血管紧张素II受体阻断剂治疗后，该受试者显示血压下降不到至少约4％；或
(e)该受试者显示一种或多种选自下列的条件：年龄至少约60岁、收缩期高血压、脉压增宽和微量蛋白尿。
2.权利要求1的方法，其中所述环氧甾族化合物是艾普利螺酮。
3.权利要求1的方法，其中所述器官选自心脏、肾脏、脑、肝和肺。
4.权利要求1的方法，其中所述环氧甾族化合物以一定的量施用，与开始治疗前的基线尿白蛋白/肌酸酐比，该施用量使得受试者的尿白蛋白/肌酸酐比在开始治疗后的12周内有效减少至少约10％。
5.权利要求1的方法，其中所述受试者用心脏或肾脏相关疾病的标准疗法基本难以治愈。
6.一种在患有或易患肾功能障碍的人类受试者中治疗或预防肾功能障碍的方法，该方法包括对受试者施用治疗有效量的一种环氧甾族化合物，其中肾功能障碍选自肾小球滤过率降低、微量蛋白尿和蛋白尿。
7.权利要求6的方法，其中所述环氧甾族化合物是艾普利螺酮。
8.权利要求6的方法，其中所述受试者患有或易患胰岛素抗性或葡萄糖敏感。
9.权利要求6的方法，其中所述环氧甾族化合物以一定的量施用，相对于开始治疗前的基线尿白蛋白/肌酸酐比，该施用量使得受试者的尿白蛋白/肌酸酐比在开始治疗后的12周内有效减少至少约10％。
10.权利要求6的方法，其中所述受试者用心脏或肾脏相关疾病的标准疗法基本难以治愈。
11.一种在患有或易患肾终末期疾病的人类受试者中治疗或预防肾终末期疾病的方法，该方法包括对受试者施用治疗有效量的一种环氧甾族化合物，其中该环氧甾族化合物以一定的量施用，相对于开始治疗前的基线尿白蛋白/肌酸酐比，该施用量使得受试者的尿白蛋白/肌酸酐比在开始治疗后的12周内有效减少至少约10％。
12.权利要求11的方法，其中所述环氧甾族化合物是艾普利螺酮。
13.权利要求11的方法，其中所述受试者患有或易患胰岛素抗性或葡萄糖敏感。
14.权利要求11的方法，其中所述受试者用心脏或肾脏相关疾病的标准疗法基本难以治愈。
15.一种在患有或易患左心室肥大的人类受试者中治疗或预防左心室肥大的方法，该方法包括对受试者施用治疗有效量的一种环氧甾族化合物，其中该环氧甾族化合物以至少有效达到下列条件之一的量施用：
(a)相对于开始治疗前的基线胶原更新率，胶原更新率的量值在开始治疗后的12周内减少至少约5％，或
(b)相对于开始治疗前的基线尿白蛋白/肌酸酐比，尿白蛋白/肌酸酐比在开始治疗后的12周内减少至少约10％。
16.权利要求15的方法，其中所述环氧甾族化合物是艾普利螺酮。
17.权利要求15的方法，其中所述受试者患有或易患胰岛素抗性或葡萄糖敏感。
18.权利要求15的方法，其中所述受试者用心脏或肾脏相关疾病的标准疗法基本难以治愈。
19.一种降低人类受试者的收缩期血压的方法，该方法包括对受试者施用治疗有效量的一种环氧甾族化合物，其中该环氧甾族化合物以一定的量施用，相对于开始治疗前的基线收缩期血压，该施用量使得收缩期血压在开始治疗后的12周内有效降低至少约1％。
20.权利要求19的方法，其中所述环氧甾族化合物是艾普利螺酮。
21.权利要求19的方法，其中所述受试者患有或易患胰岛素抗性或葡萄糖敏感。
22.权利要求19的方法，其中所述受试者用心脏或肾脏相关疾病的标准疗法基本难以治愈。
23.一种在患有或易患心血管疾病的人类受试者中治疗或预防心血管疾病的方法，该方法包括对受试者施用治疗有效量的环氧甾族化合物，其中该心血管疾病选自：先天性疾病、心脏瓣膜疾病、冠状动脉疾病、医院性疾病、手术诱发的疾病、心肌病、病毒诱发的疾病、细菌诱发的疾病、解剖学疾病、血管病、移植诱发的疾病、局部缺血疾病、心脏心律失常、传导性疾病、血栓病、主动脉疾病、血凝固障碍、***失调、神经肌肉障碍、血液病、低压病、内分泌失调、肺病、非恶性肿瘤、恶性肿瘤和妊娠诱发的疾病。
24.权利要求23的方法，其中所述环氧甾族化合物是艾普利螺酮。
25.权利要求23的方法，其中所述受试者患有或易患胰岛素抗性或葡萄糖敏感。
26.权利要求23的方法，其中所述受试者用心脏或肾脏相关疾病的标准疗法基本难以治愈。
CNA018239463A 2000-07-27 2001-12-13 使用环氧甾族醛固酮拮抗剂治疗或预防受试者中醛固酮介导的致病作用的方法 Pending CN1582154A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22136400P 2000-07-27 2000-07-27
US26149701P 2001-01-12 2001-01-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1582154A true CN1582154A (zh) 2005-02-16

Family

ID=26915714

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA018239463A Pending CN1582154A (zh) 2000-07-27 2001-12-13 使用环氧甾族醛固酮拮抗剂治疗或预防受试者中醛固酮介导的致病作用的方法

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP1303308B1 (zh)
JP (1) JP2004505060A (zh)
CN (1) CN1582154A (zh)
AT (1) ATE338566T1 (zh)
AU (1) AU2001282990A1 (zh)
CA (1) CA2415078A1 (zh)
DE (1) DE60122898T2 (zh)
ES (1) ES2269442T3 (zh)
WO (1) WO2002009759A2 (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030105144A1 (en) 2001-04-17 2003-06-05 Ping Gao Stabilized oral pharmaceutical composition
KR20040078683A (ko) * 2002-01-30 2004-09-10 파마시아 코포레이션 심혈관 질환의 예방 또는 치료를 위한 알도스테론 길항제및 비스테로이드 소염제의 조합 치료법
TW200400816A (en) 2002-06-26 2004-01-16 Lilly Co Eli Tricyclic steroid hormone nuclear receptor modulators
US7786101B2 (en) 2002-11-05 2010-08-31 Bayer Schering Pharma Ag Cardiovascular protection using anti-aldosteronic progestins
ES2214130B1 (es) * 2003-02-13 2005-12-01 Almirall Prodesfarma, S.A. 2-3'-bipiridinas.
ES2213485B1 (es) 2003-02-13 2005-12-16 Almirall Prodesfarma, S.A. Derivados de la 2-fenilpiran-4-ona.
US20040220155A1 (en) * 2003-03-28 2004-11-04 Pharmacia Corporation Method of providing a steroid-sparing benefit with a cyclooxygenase-2 inhibitor and compositions therewith
MA54133B1 (fr) 2018-03-08 2022-01-31 Incyte Corp Composés d'aminopyrazine diol utilisés comme inhibiteurs de pi3k-y
WO2020010003A1 (en) 2018-07-02 2020-01-09 Incyte Corporation AMINOPYRAZINE DERIVATIVES AS PI3K-γ INHIBITORS

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1522701A (zh) * 1995-06-07 2004-08-25 G.D.ɪ����˾ 环氧-甾族化合物醛甾酮拮抗剂和血管紧张肽ⅱ拮抗剂联合治疗用于治疗充血性心衰
AU6039296A (en) * 1995-06-07 1996-12-30 G.D. Searle & Co. Method to treat cardiofibrosis with a combination therapy of an angiotensin ii antagonist and an epoxy-steroidal aldoste rone antagonist
PL348198A1 (en) * 1998-11-06 2002-05-06 Searle & Co Combination therapy of angiotensin converting enzyme inhibitor and aldosterone antagonist for reducing morbidity and mortality from cardiovascular disease

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002009759A3 (en) 2002-11-28
EP1303308A2 (en) 2003-04-23
ATE338566T1 (de) 2006-09-15
WO2002009759A2 (en) 2002-02-07
JP2004505060A (ja) 2004-02-19
CA2415078A1 (en) 2002-02-07
EP1303308B1 (en) 2006-09-06
ES2269442T3 (es) 2007-04-01
DE60122898D1 (de) 2006-10-19
AU2001282990A1 (en) 2002-02-13
DE60122898T2 (de) 2007-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11730739B2 (en) Treatment of congenital adrenal hyperplasia
CN1330556A (zh) 血管紧张肽－转化酶抑制剂和醛固酮拮抗剂用于降低心血管疾病的发病率和死亡率的联合疗法
CN1236763C (zh) 醛固酮拮抗剂在治疗或预防醛固酮介导的致病作用中的用途
Huang et al. Role of central nervous system aldosterone synthase and mineralocorticoid receptors in salt-induced hypertension in Dahl salt-sensitive rats
US20060058274A1 (en) Use of an aldosterone receptor antagonist to improve cognitive function
CN1582154A (zh) 使用环氧甾族醛固酮拮抗剂治疗或预防受试者中醛固酮介导的致病作用的方法
CN1229141C (zh) 用于治疗心血管病的血管紧张素转化酶抑制剂和环氧－甾族醛固酮拮抗剂的组合物
JP2004518611A (ja) 炎症関連障害を予防するか又は治療するためのアルドステロン遮断薬療法
AU2001216040A1 (en) Use of an aldosterone antagonist for the treatment or prohpylaxis of aldosterone-mediated pathogenic effects
CN1642557A (zh) 醛固酮受体拮抗剂与烟酸或烟酸衍生物的组合
US20070191324A1 (en) Methods for treatment or prophylaxis of aldosterone-mediated pathogenic effects in a subject using an epoxy-steroidal aldosterone antagonist
US20040102424A1 (en) Methods for the treatment or prophylaxis of aldosterone-mediated pathogenic effects in a subject using an epoxy-steroidal aldosterone antagonist
CN1638777A (zh) 用于预防或治疗炎症相关病症的醛固酮阻滞剂治疗
EP1453522A1 (en) Methods for treatment or prophylaxis of aldosterone-mediated pathogenic effectgs in a subject using an epoxy-steroidal aldosterone antagonist
CN1642556A (zh) 醛固酮受体拮抗剂与胆汁酸多价螯合剂的联合
US20030191100A1 (en) Methods for the treatment or prophylaxis of aldosterone-mediated pathogenic effects in a subject
CN1625412A (zh) 预防或治疗心血管疾病的醛甾酮拮抗剂和非－甾族抗炎剂的组合疗法
CN1878548A (zh) AT1拮抗物、阿米洛利或triameterine与一种利尿剂的组合
ZA200404632B (en) Methods for treatment or prophylaxis of aldosterone-mediated pathogenic effects in a subject using an epoxysteroidal aldosterone antagonist.
CN1642573A (zh) 醛固酮受体拮抗剂和贝酸衍生物的联合用药
ZA200209111B (en) Use of an aldosterone antagonist for the treatment of prophylaxis of adosterone-mediated pathogenic effects.
CN101048153A (zh) 用于治疗ⅰ型糖尿病、肥胖和相关疾病的包含cb1***素受体拮抗剂和钾通道开放剂的药物组合物
Zhou et al. Gastrodia Uncaria Granules: Modulating Hypertension via the FXR-FGF15-CYP7A1 Pathway in Ascendant Hyperactivity of Liver Yang
CN1180313A (zh) 血管紧张素转化酶抑制剂、降低副作用量的醛固酮拮抗剂和利尿剂的组合物
CN1552319A (zh) 银杏酮酯滴丸

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1069972

Country of ref document: HK

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1069972

Country of ref document: HK