CN1236763C - 醛固酮拮抗剂在治疗或预防醛固酮介导的致病作用中的用途 - Google Patents

醛固酮拮抗剂在治疗或预防醛固酮介导的致病作用中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了治疗或预防人类受试者中的一种或多种醛固酮介导的致病作用的方法，该受试者患有或易患该一种或多种致病作用，其中该受试者具有选自低于正常的内源性醛固酮水平、盐敏感性和饮食钠摄取增加的一种或多种状况。该方法包括给予受试者治疗有效量的一种或多种醛固酮拮抗剂。

Description

醛固酮拮抗剂在治疗或 预防醛固酮介导的致病作用中的用途
相关申请的交叉参考
本发明是2000年11月8日提交的美国专利申请＿＿的继续部分，要求1999年11月9日提交的美国临时专利申请60/164,390的优先权。本申请也要求以下申请的优先权：2000年6月13日提交的美国临时专利申请60/211,064；2000年6月13日提交的美国临时专利申请60/211,250；2000年6月13日提交的美国临时专利申请60/211,253；2000年6月13日提交的美国临时专利申请60/211,264；2000年6月13日提交的美国临时专利申请60/211,311；2000年6月13日提交的美国临时专利申请60/211,340；2000年6月13日提交的美国临时专利申请60/211,451；2000年6月13日提交的美国临时专利申请60/211,459；2000年7月27日提交的美国临时专利申请60/221,358；2000年7月27日提交的美国临时专利申请60/221,364；以及2000年9月14日提交的美国临时专利申请60/233,056。
发明背景
发明领域
本发明涉及在受试者中治疗和/或预防一种或多种由内源性醛固酮作用所导致，特别是钠水平升高时醛固酮所导致的致病作用的方法。更具体地，本发明涉及醛固酮拮抗剂在具有低于正常的醛固酮水平的人类受试者中治疗和/或预防高血压、心脏病和/或肾功能障碍的用途。
相关技术的描述
原发性高血压是全球范围内的一种主要心血管病，它代表了一个重要的公共健康问题。与高血压相关的血压升高与冠心病和卒中的发病率有关。例如，Blumenfeld JD和Laragh JH.Congestive heartfailure：pathophysiology，diagnosis and management，1sted.Caddo(OK)：ProfessionalCommunications，Inc.；1994，报道了高血压使发生心衰的危险性增加3倍。同样，MacMahon S等：Lancet1990；335：765-71，报道了长期使舒张压降低仅仅5mm Hg，可以使发生冠心病的危险性降低至少20％，使发生卒中的危险性降低至少33％。
高血压也与晚期肾脏病相关。由高血压导致的晚期肾脏病和/或糖尿病肾病是一种巨大的公共健康负担，在美国等许多国家中发病率和患病率的增加引起了人们的警惕(United States Renal DataSystem.Excerpts from United States Renal Data System 1999Annual Data Report.Am J Kidney Dis 1999；34 Suppl 1：S1-S176)。尽管由于血压认知程度和血压控制的改进，高血压的其它合并症，如卒中和冠心病大大减少，高血压诱导的晚期肾脏病却大大增加(The sixth report of the JointNational Committee onprevention，detection，evaluation，and treatment of highblood pressure.Arch Intern Med 1997；157：2413-46)。
肾素-血管紧张素-醛固酮***(″RAAS″)在高血压的发生和进展中起主要作用。RAAS在几乎所有对细胞外液体积不足和低血压的生理反应中起关键作用。血液体积或动脉血压的降低导致肾素的释放，它作用于血管紧张素原，使其形成血管紧张素I。然后血管紧张素转化酶将血管紧张素I转化为血管紧张素II，它导致一些外周和中枢介导的反应，从而恢复血液体积和血压。在外周，血管紧张素II作用于平滑肌细胞，导致血管收缩，以便增加血压。在中枢，血管紧张素II的作用使交感神经兴奋和加压素释放。尽管从血管紧张素I到血管紧张素II的转化主要发生在肺，然后血管紧张素II在外周和中枢循环至靶组织，该转化也可以发生在脑的一些区域。
血管紧张素II也刺激肾上腺皮质的球状带，使盐皮质激素醛固酮的合成和分泌增加。醛固酮作用于远端肾小管和收集管，导致钠潴留以及钾和氢的***。这种钠潴留导致血液体积增加。醛固酮在心衰的病理生理中起作用，并且与高血压、心肌肥厚、心脏和血管纤维化、以及室性心律失常相关(Dzau VJ等：Circulation 1981；63：645651)。在具有心衰的患者中，高醛固酮水平似乎对应于这些患者的死亡率增加。(Gerbe JG，等：Antihypertensive agents and the drugtherapy of hypertension.In：Goodman LS，Gilman AG，editors.Goodman and Gilman′s the pharmacological basis oftherapeutics，8th edition.New York：McGraw-Hill；1993.p.784-813)。
Weber KT等(Cir 1987；75(Supp.I)：I-40-I-47)报道了循环中醛固酮水平的长期升高导致心脏和血管中纤维组织的形成，这导致所选择动物中的进展性心衰。心肌胶原产生的增加和随后的左心室肥厚导致心肌***，心室和血管的顺应性减少，舒张功能受损、舒张和收缩障碍、局部缺血，最终导致心衰。根据Struthers AD.J CardiacFailure 1996；2：47-54，心肌纤维化也可以导致心律失常和猝死。醛固酮阻断心肌去甲肾上腺素的摄取，增加了血浆去甲肾上腺素，并促进心室的异常活动。Rocha R等：Am J Hypertension 1999；12：76A报道了醛固酮影响大鼠压力感受器的功能并导致脑和肾血管损伤，以及内皮功能障碍。也报道了醛固酮增加血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂的水平，因此可以妨碍纤维蛋白溶解。
许多临床医生假定由血管紧张素转化酶抑制剂(″ACE抑制剂″)导致的RAAS的抑制将防止醛固酮形成。然而，在大多数接受ACE抑制剂长期治疗的患者中检测到了显著的血浆醛固酮水平。越来越多的证据表明ACE抑制剂仅仅暂时抑制醛固酮水平(Struthers AD.J CardiacFailure 1996；2：47-54.)。血浆醛固酮水平最初随ACE抑制剂的治疗降低，但在ACE抑制剂治疗的3-6个月后，返回至治疗前的水平，尽管患者对连续用药的依从性很好(Staessen J等：JEndocr 1981；91：457-465)。这种“醛固酮逃避”现象的出现是因为醛固酮释放有其它重要的决定因子，如血钾(Pitt B.Cardiovascular Drugs andTherapy 1995；9：145-149)。Marayev V等在1995年阿姆斯特丹举行的国际心衰大会上的报告中提出了这种逃避现象可能导致心衰患者的高死亡率。
Greene E等：J Clin Invest 1996；98：1063-8指出，尽管积累了许多证据表明血管紧张素II介导肾脏病，醛固酮也可能通过血液动力学作用和直接细胞作用与进展性肾脏病相关。在残余肾模型中观察到了高醛固酮症和肾上腺增生，血浆醛固酮水平增加了大约10倍。另外，临床研究报道了醛固酮水平增加与肾功能恶化之间的关系(Hene RJ等：Kidney Int 1982；21：98-101)。例如Berl T，等：Kidney Int 1978；14：228-35注意到，8名血钾正常的肾功能衰竭患者中的5名患者血浆醛固酮水平升高，在肌酐清除率＜15mL/min的6名患者中的5名患者血浆醛固酮水平升高。在一项后续研究中，HeneRJ等，Kidney Int 1982；21：98-101注意到，在28名肌酐清除率比正常值小50％的患者中，血浆醛固酮水平增加，尽管其血钾水平和血浆肾素活性正常。Ibrahim HN等：Semin Nephrol 1997；17：43140提示，钾和血管紧张素II(在肾衰患者中两者的水平都增加)协同促进伴随肾功能不全和进展性肾脏病所伴随的醛固酮过多。Quan ZY等：Kidney Int 1992；41：326-33报道了高血压、蛋白尿和结构性肾损伤在进行了次全肾切除术和肾上腺切除术的大鼠中不如在进行部分肾切除术和保留肾上腺的大鼠中普遍。尽管用大剂量糖皮质激素替代(没有替代醛固酮)，该结果仍然出现于肾上腺切除大鼠中。
在一种乙酸去氧皮质酮(″DOCA″)-盐高血压大鼠模型中，给予DOCA处理的动物外源性盐皮质激素诱导了恶性肾硬化和卒中病变(Gavras H等：Circ Res 1975；36：300-9)。Horiuchi等报道了一种倾向于卒中的自发性高血压(″SHRSP″)大鼠亚株肾脏中醛固酮受体浓度增加，它们在没有盐负荷的情况下发生了恶性肾硬化(HoriuchiM，et al.：Am JPhysiol 1993；264：286-91)。而且，Ullian等报道了Wistar-Furth大鼠(对醛固酮的作用无反应)不会发生反应于次全肾切除的肾病(Ullian ME等：Am J Physiol 1997；272：1454-61).
Greene等评估了四个处理组(假手术大鼠、未处理的部分肾切除[“残余”]大鼠，用洛沙坦和依那普利处理的残余大鼠、以及用洛沙坦和依那普利处理然后输注醛固酮的残余大鼠)区分肾损伤进展中醛固酮的相对重要性(Greene等：J Clin Invest 1996；98：1063-8)。报道的结果表明，残余大鼠的醛固酮水平比假手术大鼠升高10倍。相反，用洛沙坦和依那普利处理的残余大鼠与没有给予这些药剂的残余大鼠相比，表现出醛固酮水平的抑制，并且蛋白尿、高血压和肾小球硬化减少。在最后一组中，残余大鼠接受洛沙坦和依那普利处理然后输注醛固酮，其蛋白尿、高血压和肾小球硬化程度与未处理残余大鼠相似。
抗高血压药物治疗对血压的控制使高血压引起的患病率和死亡率明显减少。例如，在美国，经过年龄校正计算的由卒中引起的死亡率减少了近60％，由冠心病引起的死亡率减少了近53％(Hansson L等：Lancet 1988；351：1755-62)。根据一项报道，在每年治疗的每1000名患者中，舒张压由105减少到83mmHg可以预防4个主要的心血管事件，这样如果估计的69.1亿高血压患者接受最佳的抗高血压治疗，那么将预防2,764,000个事件(Hasson L等：Lancet 1988；351：1755-62)。即使在医学发达国家，如美国，估计接受抗高血压治疗的患者中只有29％的血压控制在低于140/90mmHg(Joint National Committee.The sixth report of Joint National Committee on prevention，detection，evaluation，and treatment of high blood pressure.NIH Publication No，98-4080 November 1997)。
许多选自不同种类的药物可以用于治疗高血压、心衰和肾功能障碍(Joint National Committee.The sixth report of the JointNational Committee on prevention，detection，evaluation，andtreatment of high blood pressure.NIH Publication No.98-4080November 1997)。这些药物包括利尿剂(如氯噻酮，双氢克尿噻，美托拉宗等)、血管扩张剂(如hydrolazine，米诺地尔，硝普钠，dizaoxide等)、β肾上腺受体拮抗剂(如***，美托洛尔，拉贝洛尔，醋丁洛尔等)、钙离子通道阻滞剂(如维拉帕米，地尔硫卓，尼非地平等)、以及血管紧张素II受体抑制剂(如洛沙坦等)，以及ACE抑制剂(如卡托普利，依那普利，赖诺普利，喹那普利等)。对单个高血压病人的初始药物治疗的选择一般是基于共存因子如年龄、种族和并发疾病(Kaplan NM.J Hypertension 1995；13 Supp 12：S113-S117)。
ACE抑制剂通常作为标准治疗，并证明对心衰患者的生存和住院治疗具有有益作用。在CONSENSUS(合作性北斯堪的纳维亚依那普利生存研究)试验中，用依那普利(一种ACE抑制剂)加基本没有醛固酮拮抗活性的利尿剂治疗具有严重心衰的患者(纽约心脏协会(NYHA)心功能分级IV级)，其在一年中的死亡率与基本没有醛固酮拮抗活性的安慰剂加基本没有醛固酮拮抗活性的利尿剂治疗的患者相比减少了31％。在CONSENSUS中，血浆醛固酮基线水平高的患者比基线水平低的患者死亡率高，死亡率仅仅在基线血浆醛固酮水平高于中值的组中降低。在基线血浆醛固酮水平低于中值的组中，没有观察到与安慰剂组不同的死亡率(Swedberg等：Circulation 1990；82：1730-1736)。经历急性心肌梗塞的患者经常发生心衰及随后的死亡。已经证明由ACE抑制剂导致的RAAS的阻断在这些患者中减少了所有由其引起的死亡率。Lancet 1993；342：821-828。
抗高血压药螺内酯在治疗中不如ACB抑制剂常周。它是一种醛固酮受体拮抗剂，被开发用于高血压与充血性心衰和肝硬化相关的水肿状况中出现的高醛固酮症的治疗(Swedberg K，et al Circulation1990；82：1730-6)。Pitt B等：，The New England J.of Med.1999；341(10)：709-717最近报道了向ACE抑制剂和基本没有醛固酮拮抗活性的袢利尿剂的标准疗法中加入螺内酯，降低了具有严重心衰的患者中的患病率和死亡率。然而，由于其临床副作用，特别是导致乳腺增生、***和阳痿的孕激素和抗雄激素性质，螺内酯的长期使用在许多患者中受限(The RALES Investigators.Am J Cardiol 1996；78：902-12)。
治疗高血压、心衰和晚期肾脏病的常规药物治疗并不经常有效，或者对于很多患者效力减小。例如，尿蛋白分泌的增加是高血压患者中心血管发病率和死亡率的一个独立的预兆(Kannel WB，Stampfer MJ，Castelli WP，VerterJ.Am Heart J 1984；108：1347-52)。已经观察到抗高血压剂中的ACE抑制剂或血管紧张素II受体拮抗剂持续减少蛋白尿，这与肾脏病的存在或它们的总体抗高血压活性无关(Maki DD等：Arch Intern Med 1995；155：1073-82)。这种蛋白尿的减少在钠摄取量高的个体中减少或不存在，不论给予药物的总体抗高血压活性如何(Heeg JE等：Kidney Int 1989；36：272-80)。而且，饮食钠的减少增加了ACE抑制剂的抗高血压和抗蛋白尿作用(MacGregor GA等：Exp Hypertens 1983，5：1367-80)。在高盐饮食的患者中ACE抑制剂的效力减小，这可以通过加入双氢克尿噻而部分纠正(Buter H等：Nephrol Dial Transplant 1998；13：1682-5)。然而，这种联合治疗的不利方面在于联合使用的药物的附加或协同副作用。
在另一个例子中，所选的个体血浆肾素水平或血浆肾素活性低，但仍然表现出高血压。这种形式的高血压可以见于例如，黑人、日本人和老年人。这种高血压通常被称作“低肾素性高血压”(或“钠和体积依赖性低肾素高血压”，因为钠下调肾素***)。在这些个体中，钠摄取增加后，血压升高，尽管肾素的血浆水平正常或低。在治疗原发性高血压中有活性的试剂如ACE抑制剂或血管紧张素II受体拮抗剂对治疗低肾素性高血压相对无效(Weir J：Hypertension 1997；11：17-21)。因此，低肾素性高血压被描述为盐敏感性高血压的一种形式。
需要的应该是对不能满意地反应于用于治疗高血压、心衰、晚期肾脏病和其它致病状况的常规药物治疗的患者的改进药物疗法。进一步，这种致病状况的流行增加表明，需要更新的治疗干涉和策略用于替代或补充目前的方法。本发明强调了这种需要，并提供了新的药物疗法，包括给予一种或多种醛固酮拮抗剂，用于在以盐敏感性和/或饮食钠摄取增加的受试者群中治疗高血压、心衰、晚期肾脏病和其它致病状况。
发明概述
本发明中各方面中包括治疗或预防人类受试者中的一种或多种醛固酮介导的致病作用的方法，该受试者患有或易患该一种或多种致病作用，其中该受试者具有选自低于正常的内源性醛固酮水平、盐敏感性和饮食钠摄取增加的一种或多种状况。该方法包括给予受试者治疗有效量的一种或多种醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括治疗或预防人类受试者中的一种或多种醛固酮介导的致病作用的方法，该受试者患有或易患该一种或多种致病作用，其中(a)所述一种或多种致病作用选自高血压、心血管病、肾功能障碍、肝脏疾病、脑血管病、血管病、视网膜病、神经病、胰岛素病、水肿、内皮功能障碍、压力感受器功能障碍、偏头痛、潮热、和经前期紧张，以及(b)该受试者具有一种或多种选自低于正常的内源性醛固酮水平、盐敏感性和饮食钠摄取增加的一种或多种状况。该方法包括给予受试者治疗有效量的一种或多种醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括治疗或预防患有或易患高血压的受试者中的高血压的方法，其中受试者具有盐敏感性或饮食钠摄取增加，或具有盐敏感性并且饮食钠摄取增加。该方法包括给予受试者治疗有效量的一种或多种醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括治疗或预防患有或易患心血管病的受试者中的心血管病的方法，其中受试者具有盐敏感性或饮食钠摄取增加，或具有盐敏感性并且饮食钠摄取增加。该方法包括给予受试者治疗有效量的一种或多种醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括治疗或预防患有或易患心血管病的受试者中的心衰的方法，其中受试者具有盐敏感性或饮食钠摄取增加，或具有盐敏感性并且饮食钠摄取增加。该方法包括给予受试者治疗有效量的ACE抑制剂、基本没有醛固酮拮抗活性的袢利尿剂、以及一种或多种醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括治疗或预防有需要的受试者的盐敏感性的方法。该方法包括给予受试者治疗有效量的一种或多种醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括减少有需要的受试者的钠食欲的方法。该方法包括给予受试者抑制食欲量的一种或多种醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括减少或逆转患有或易患盐敏感性的受试者中的盐敏感性进展的方法。该方法包括给予受试者治疗有效量的一种或多种醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括治疗或预防受试者，以减少或预防一种或多种全部或部分由脑内醛固酮水平异常所导致的致病作用的方法。该方法包括给予受试者治疗有效量的一种或多种醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括治疗或预防受试者，以减少或预防一种或多种全部或部分由肾内钠潴留异常所导致的致病作用的方法。该方法包括给予受试者治疗有效量的一种或多种醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明包括预防人类受试者中的一种或多种醛固酮介导的致病作用的方法，该受试者易患该一种或多种致病作用，其中该受试者具有选自低于正常的内源性醛固酮水平、盐敏感性和饮食钠摄取增加的一种或多种状况。该方法包括给予受试者预防有效量的一种或多种醛固酮拮抗剂。
本发明的其它方面将是明显的，此后将分部分指出。
附图简述
图1-A表示H型依普利农的X线粉末衍射图样。
图1-B表示L型依普利农的X线粉末衍射图样。
图1-C表示依普利农的甲基乙基酮溶剂合物的X线粉末衍射图样。
图2-A表示直接从甲基乙基酮结晶的未研磨的L型的示差扫描量热法(DSC)热像图。
图2-B表示通过从甲基乙基酮结晶高纯度依普利农获得的溶剂合物去溶剂化制备的未研磨L型的示差扫描量热法(DSC)热像图。
图2-C表示通过从高纯度依普利农在甲基乙基酮中的溶液结晶溶剂合物，并研磨得到的L型而制备的L型的示差扫描量热法(DSC)热像图。
图2-D表示通过对从合适的溶剂中消化低纯度依普利农得到的溶剂合物进行去溶剂化而制备的未研磨H型的示差扫描量热法(DSC)热像图。
图3-A表示H型依普利农的红外光谱(漫反射比，DRIFTS)。
图3-B表示L型依普利农的红外光谱(漫反射比，DRIFTS)。
图3-C表示依普利农的甲基乙基溶剂合物的红外光谱(漫反射比，DRIFTS)。
图3-D表示氯仿溶液中依普利农的红外光谱(漫反射比，DRIFTS)。
图4表示H型依普利农的13C NMR光谱。
图5表示L型依普利农的13C NMR光谱。
图6-A表示甲基乙基酮溶剂合物的热重分析图形。
图7表示从甲基乙基酮中分离的7-甲基氢4α，5α:9α-双环氧-17-羟基-3-氧-17α-孕烷-7α，21-二羧酸酯，γ-内酯晶形的X线粉末衍射图样。
3(“双环氧化合物”)；和“11，12-环氧化合物”
图8表示从异丙醇中分离的7-甲基氢11α，12α-环氧-17-羟基-3-氧-17α-孕-4-烯-7α，21-二羧酸酯，γ-内酯晶形的X线粉末衍射图样。
图9表示从正丁醇中分离的7-甲基氢17-羟基-3-氧-17α-孕-4，9(11)-二烯-7α，21-二羧酸酯，γ-内酯的X线粉末衍射图样。
图10表示作图为人类受试者依普利农剂量的函数的收缩压的改变。
图11表示作图为人类受试者依普利农剂量的函数的舒张压的改变。
图12表示作图为人类受试者依普利农剂量的函数的血浆肾素活性改变和血清醛固酮。
图A-1表示L-NAME治疗开始前和开始后1，5，9和13天的收缩压。
图A-2表示处死后测定的血浆肾素活性(A)和血浆醛固酮水平(B)。
图A-3表示以下心脏组织病理：(A)由L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理诱导的心肌坏死性病变；(B)在盐皮质激素受体拮抗剂依普利农存在下接受L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理的动物心肌没有表现出坏死性病变；(C)用胶原特异性染色对图A的心脏进行的染色；和(D)用胶原特异性染色对图27B的心脏进行的染色。
图A-4表示心肌坏死的组织病理学评分。
图A-5表示在处死的当天(第14天)收集的样品中的尿蛋白分泌。
图A-6表示(A)用PAS对接受L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理的动物的中央冠状肾切片进行的肾组织病理学染色和(B)接受L-NAME/血管紧张素II/NaCl加依普利农的大鼠的肾皮质。
图A-7表示肾血管损伤的组织病理学评分。
图A-8表示醛固酮/盐单侧肾切除大鼠冠状动脉的炎性病变。
图A-9表示依普利农处理的醛固酮/盐单侧肾切除大鼠冠状动脉的炎性病变。
图A-10表示醛固酮/盐单侧肾切除大鼠的心肌损伤。
图A-11表示饮用盐水的易于卒中的SHR大鼠的存活。
图A-12表示饮用盐水的易于卒中的SHR大鼠的SBP。
图A-13表示饮用盐水的易于卒中的SHR大鼠的脑损伤。
图A-14表示饮用盐水的易于卒中的SHR大鼠的脑损伤。
图A-15表示在8.4-13.1周龄时接受依普利农(100mg/kg/d)或赋形剂长期治疗的易于卒中的自发高血压大鼠死亡前的(A)动脉收缩压(SBP)和尿蛋白分泌(UPE)。
图A-16表示从8周龄开始服用5周依普利农或赋形剂的饮用盐水的易于卒中的自发高血压大鼠的中央冠状肾切片苏木精和伊红染色代表性显微照片。
图A-17表示用卡托普利加载体(CAP)、卡托普利加血管紧张素II(CAP+血管紧张素II)或卡托普利加血管紧张素II加依普利农(CAP+血管紧张素II+EPL)处理时饮用盐水的易于卒中的自发高血压大鼠的(A)动脉收缩压和(B)尿蛋白***。
图A-18表示开始用卡托普利治疗(50mg/kg/d)和在8.3周龄时开始1％NaCl/易于卒中的啮齿类饮食的易于卒中的自发高血压大鼠的血浆醛固酮水平。
图A-19表示用(A)卡托普利加赋形剂和治疗(B)卡托普利治疗的饮用盐水的易于卒中的自发高血压大鼠的肾皮质苏木精和伊红染色代表性显微照片。
图A-20表示对依普利农PK图形(Cmax)的群体作用。
图A-21表示对依普利农的PK图形(AUClqc)的群体作用。
图A-22表示对依普利农的PK图形(AUCinf)的群体作用。
图A-23表示对依普利农的PK图形(CL/F)的群体作用。
图A-24表示对依普利农的PK图形(Vol/F)的群体作用。
图A-25表示对开环内酯形式的依普利农PK图形(Cmax)的群体作用。
图A-26表示对开环内酯形式的依普利农PK图形(AUClqc)的群体作用。
图A-27表示对开环内酯形式的依普利农PK图形(AUCinf)的群体作用。
图A-28表示对开环内酯形式的依普利农PK图形(CL/F)的群体作用。
图A-29表示对开环内酯形式的依普利农PK图形(Vol/F)的群体作用。
图A-30表示多个剂量给药后的平均依普利农血浆浓度。
图C-1表示从掺杂(a)0％，(b)1％，(c)3％，和(d)5％的双环氧化合物的甲基乙基酮结晶获得的湿饼(甲基乙基酮溶剂合物)的X线粉末衍射图样。
图C-2表示从掺杂(a)0％，(b)1％，(c)3％，和(d)5％的双环氧化合物的甲基乙基酮结晶获得的干固体的X线粉末衍射图样。
图C-3表示从掺杂3％的双环氧化合物的甲基乙基酮结晶获得的干固体的X线粉末衍射图样，(a)在干燥前没有研磨溶剂合物，以及(b)在干燥前研磨溶剂合物。
图C-4表示从掺杂(a)0％，(b)1％，(c)5％，和(d)10％的11，12-环氧化合物的甲基乙基酮结晶获得的湿饼(甲基乙基酮溶剂合物)的X线粉末衍射图样。
图C-5表示从掺杂(a)0％，(b)1％，(c)5％，和(d)10％的11，12-环氧化合物的甲基乙基酮结晶获得的干固体的X线粉末衍射图样。
图C-6表示根据表7A报道数据所作的产品纯度、原料纯度、冷却速度和终点温度的立方图。
图C-7表示用图15的立方图制作的半标准图，用于确定对产物纯度具有统计学意义的变量。
图C-8是基于表7A报道的结果的相互关系图，表示原料纯度和冷却速度的相互作用对产物纯度的影响。
图C-9表示根据表7A报道的数据所作的H型重量分数、原料纯度、冷却速度和终点温度的立方图。
图C-10表示用图18的立方图制作的半标准图，用于确定对产物纯度具有统计学意义的变量。
图C-11是基于表7A报道的结果的相互作用图，表示原料纯度和终点温度的相互作用对产物纯度的影响。
图C-12表示无定形依普利农的X线衍射图样。
图C-13表示无定形依普利农的DSC热像图。
优选实施方案的详细描述
本发明的一般叙述
一般认为由醛固酮介导的疾病限于原发和继发高醛固酮症。在高醛固酮症中，一般认为过高水平的醛固酮是导致高血压的致病因子，它引起高血压的机制包括由醛固酮占据了高水平的盐皮质激素受体，从而导致内皮钠通道(“EnaC”)激活并增加了钠储留。受高醛固酮症影响的个体也增加了患肾脏和心脏疾病的危险性。这些疾病以前被认为是高血压的结果。
然而，已经发现任何水平(升高、正常或低于正常)的内源性醛固酮在人类受试者中都可以是致病性的。也已经发现在人类受试者中由内源性醛固酮介导的致病作用的发展、发生和发展速度、和/或严重性在人类受试者钠水平升高的时候得到进一步加强，而不论存在的醛固酮水平是升高、正常或低于正常。内源性醛固酮的致病性在具有盐敏感性和/或饮食钠摄取增加的人类受试者中特别引起了注意。
另外，已经发现了能够减少或去除人类受试者中的这种醛固酮介导的致病性的新方法。概言之，将治疗有效量的一种或多种醛固酮拮抗剂给予有需要的人类受试者，以治疗或预防一种或多种由内源性醛固酮的作用导致的致病作用，包括由低于正常水平的内源性醛固酮的作用导致的致病作用。在一种实施方案中，醛固酮拮抗剂是一种环氧-甾族化合物，如依普利农(eplerenone)。在另一种实施方案中，醛固酮拮抗剂是一种非环氧-甾族化合物，如螺内酯。受试者优选是具有盐敏感和/或饮食钠摄取增加的个体。致病作用优选由钠水平升高时的内源性醛固酮作用所导致。钠水平升高优选是细胞内钠水平的升高，特别是心脏、肾和脑中的细胞内钠。
一般定义
这里用到的名词“受试者”包括哺乳动物，优选人，它们是处理、观察或实验的对象。
名词“处理”包括任何处理、作用、应用、治疗、步骤等，其中哺乳动物，特别是人，接受医学帮助，其目的是直接或间接改进哺乳动物的状况。
名词“预防”包括预防所有的临床上显著的致病作用的发生，或预防个体中致病作用的临床前期的发生。该名词包括有发生例如但不限于高血压和心衰的致病作用的危险性的受试者的预防性处理，这种危险性可能是由于遗传、环境、社会或其它因素造成。
“治疗有效的”限定了将达到改进状况或疾病的目的，同时避免一般与其它疗法相关的副作用的醛固酮拮抗剂的量。
此处用到的名词“钠”或“盐”包括任何形式，特别是氯化钠形式的盐。
名词“醛固酮拮抗剂”和“醛固酮受体拮抗剂”包括抑制醛固酮与盐皮质激素受体结合，从而阻断醛固酮的生物学作用的化合物。
推测的机理
在不受任何特定理论限制的条件下，假定致病性在大多数情况下由微血管功能障碍介导。这种微血管功能障碍被认为是微血管收缩和微缺血的结果。因此，这些微血管改变通过通过不良适应的机制而进展，导致各种致病作用。
低于正常水平的内源性醛固酮的致病性
如前面所指出的，任何水平，包括低于正常水平的内源性醛固酮在人类受试者中，特别是在钠水平升高时都是致病性的。这种内源性醛固酮的水平可以是局部化的水平(例如，在特定器官中的内源性醛固酮细胞内水平)或可以更广泛或甚至是全身性的。因此，内源性醛固酮的致病作用可以是局部化的(例如在脑、心脏或肾)，部分但不完全局部化，或甚至是全身的。
可以用常规检测方法确定受试者的内源性醛固酮水平。例如，受试者中的内源性醛固酮水平可以测定为循环中的(血浆、血清或全血)醛固酮、尿醛固酮等。各种商业化试剂盒和/或公开的标准测定方法都可用于该检测。例如，血浆醛固酮水平可以通过放射免疫测定来测量。该检测可以使用商业化试剂盒，如由Dinabot(Tokyo，Japan)出售的用于测量血浆醛固酮水平的放射免疫试剂盒。例如，可以通过常规的免疫测定方法测量血清醛固酮水平。同样，可以通过采用例如Diagnostic Products公司的抗血清进行放射免疫测定，测量尿醛固酮水平。醛固酮-18-葡糖苷酸一般在pH为1时过夜水解，产生可以通过RIA测量的游离醛固酮。(Prat JH et al.：Hypertension.1999；34；315-319)。尿醛固酮可以表达为在24小时样品中的总***或可以标准化为肌酐。
正常醛固酮值将依赖于具体的测定方法和选择的人群，但这些值一般公开于文献中，并且容易由本领域技术人员获得。例如，Merck手册第1526-2528页(17版.1999)报道了通过免疫测定所测量的仰卧位受试者的血清醛固酮正常实验室值一般小于约16ng/dL，而直立位的受试者一般为约4-31ng/dL(对于饮食钠摄取为约100-200mEq/日的患者)。Merck手册将这些值描述为健康人群中的平均值±两个标准差。同样Review of Medical Physiology，6th Edition，Lange Medical Publications，Los Altos，California；William FGanong列出了一般为3-10ng/dL的正常醛固酮水平。
由于具体测定方法的和人群的变异，有时可能必须或需要医生或临床中心凭经验确定自己的标准数据。尽管本领域技术人员容易做到这一点，但还需要应用某些特殊的考虑。例如，遗传和环境(如饮食)差异可能存在于某一地理区域的人群中。因此，这样一个地区中的平均值可能不能反应全球的平均值。作为一个例子，在主要由黑人组成的地区中，平均血浆醛固酮可能低于主要由高加索人组成的地区。同样，大部分为盐敏感个体的国家(如日本)的平均值可能低于小部分为盐敏感个体的国家(如瑞典)。此外，各地区人群可能在饮食钠消耗上不同，这也将导致醛固酮水平的差异。除非特别指出，这里提到的低于正常水平的蛋白(如醛固酮或肾素)，是指低于所认为的代表全球人口或感兴趣的所需亚人群的平均值的任何值。
可以根据本发明治疗或预防的由醛固酮介导的致病作用包括，但不限于高血压、心血管病、肾功能障碍、肝脏疾病、脑血管病、血管病、视网膜病、神经病(如周围神经病)、胰岛素病、水肿、内皮功能障碍、压力感受器功能障碍、偏头痛、潮热、经前期紧张等。心血管病包括，但不限于，心衰(如充血性心衰)、心律失常、舒张功能障碍(如左心室舒张功能障碍、舒张性心衰和舒张充盈受损)、收缩功能障碍、局部缺血、肥厚性心肌病、心脏猝死、心肌和血管纤维化、动脉顺应性受损、心肌坏死性病变、血管损伤、心肌梗塞、左心室肥厚、射血分数减少、心脏病变、血管壁肥厚、内皮增厚、冠状动脉纤维蛋白样坏死等。肾功能障碍包括，但不限于肾小球硬化、晚期肾脏疾病、糖尿病肾病、肾血流减少、肾小球滤过分数增加、蛋白尿、肾小球滤过率减少、肌酐清除率减少、微白蛋白尿、肾血管病变、缺血性病变、血栓形成性病变、肾小球纤维蛋白样坏死、肾小球毛细血管局灶性血栓形成、毛细血管内(内皮和系膜)和/或毛细血管外细胞肿胀和增生(新月形)、有或无显著细胞增生的网状系膜基质扩张、恶性肾硬化(如缺血性收缩、毛细血管从血栓形成性坏死、小动脉纤维蛋白样坏死、和影响肾小球和微血管的血栓形成性微血管病变)等。肝脏疾病包括，但不限于，肝硬化、肝腹水、肝脏充血等。脑血管病包括，但不限于卒中。血管病包括，但不限于血栓形成性血管病(如血管壁纤维蛋白样坏死、红细胞溢出和破裂、血管腔和/或壁血栓形成)、增殖性血管病(如细胞外粘蛋白基质和结节样增厚所围绕的肿胀肌内膜细胞)、动脉硬化、血管顺应性减少(如僵硬、心室顺应性减少、和血管顺应性减少)、内皮功能障碍等。水肿包括，但不限于，外周组织水肿、肝充血、脾充血、肝腹水、呼吸道或肺充血等。胰岛素病包括，但不限于，胰岛素抵抗、I型糖尿病、II型糖尿病、葡萄糖抵抗、糖尿病前状态、X综合征等。
致病作用优选选自高血压、心血管病、肾功能障碍、水肿、脑血管病、和胰岛素病；更优选地，致病作用选自高血压、心血管病、卒中、II型糖尿病；更优选地，致病作用选自高血压、心衰(特别是心肌梗塞后心衰)、左心室肥厚和卒中。
因此，在本发明的一个实施方案中，该方法包括给予治疗有效量的一种或多种醛固酮拮抗剂，用于治疗或预防人类受试者中的醛固酮介导的致病作用，该受试者患有或易患该一种或多种致病作用，其中该受试者的内源性醛固酮水平低于正常值。致病作用优选选自高血压、心血管病、脑血管病和II型糖尿病；更优选地，致病作用选自高血压、心衰(特别是心肌梗塞后心衰)、左心室肥厚和卒中。醛固酮拮抗剂优选为依普利农。治疗或预防的受试者优选是盐敏感和/或饮食钠摄取增加的个体。
钠对醛固酮介导病理的作用
如前所述，已经发现在人类受试者中由内源性醛固酮介导的致病作用的发生、迅速发病和发展和/或严重程度在高水平钠的存在下进一步增强，不论醛固酮水平升高、正常或低于正常。这种内源性醛固酮的致病性在盐敏感和/或饮食钠摄取增加的人类受试者中特别显著。尽管以前曾经报道过饮食钠摄取水平升高加重高血压，特别是在盐敏感个体中更是如此，以前并不理解钠在加强内源性醛固酮致病性中的作用。
因此，在本发明的另一实施方案中，该方法包括给予治疗有效量的一种或多种醛固酮拮抗剂，用于治疗或预防人类受试者中的醛固酮介导的致病作用，该受试者患有或易患该一种或多种致病作用，其中该受试者具有盐敏感性和/或饮食钠摄取增加。该致病作用优选是前面所阐述的；更优选选自高血压、心血管病、脑血管病和II型糖尿病；更优选地，它们选自高血压、心衰(特别是心肌梗塞后心衰)、左心室肥厚和卒中。醛固酮拮抗剂优选为依普利农。当受试者的饮食钠摄取增加时，受试者的平均每日钠摄取至少为50毫当量，优选至少100毫当量，更优选至少150毫当量，更优选至少200毫当量。
根据许多高血压研究的结果，医学团体一般推荐大多数个体减少它们的饮食钠摄取。例如，美国心脏学会的营养委员会建议将成人的每日盐摄取限制在3.0g内(American Heart Association NutritionCommittee，″Dietary Guidelines for Healthy American Adults.″Circulation 77：721-724，1988)。同样，DASH研究证明，将钠摄取减少到1.5g，相对于2.4g降低了血压(NIH News Release，May17，2000″NHLBI Study Shows Large Blood Pressure Benefit FromReduced Dietary Sodium)。
尽管一般认为减少钠摄取是有益的，许多个体和人群一般不会或不能减少钠摄取。缺乏自我约束和阻碍饮食改变的因素导致了这种对推荐指导原则的不依从性。阻碍饮食改变的因素可以包括，例如以下因素：(1)不能得到低氯化钠食物，地理或其它限制防止或阻碍得到低氯化钠食物；(2)缺乏冷冻条件，因此需要使用高氯化钠水平用于保存食物(如泡菜)；(3)培养环境，例如需要在食物制备和含量上遵循传统和宗教要求，导致食用含高水平氯化钠的食物；和(4)由于贫困导致的消费限制，不能购买氯化钠含量较低的较贵食物(如进口食物)。这些个体，特别是那些盐敏感的个体，发现他们除了威胁生命的营养不良或饥饿外，没有替代消耗高氯化钠食物的选择，因此只能食用高氯化钠饮食，从而易患这种病理学状况。然而，本发明的方法可以在不能达到减少饮食钠摄取的个体中用于治疗或预防醛固酮介导的致病作用。
钠的作用在盐敏感个体中特别显著。这些个体的血压-尿钠***反应容易受损，或对钠的血管反应容易增加，并且更容易发生高血压。许多研究表明，盐敏感患者对钠摄取的增加具有加剧的反应，他们的肾血流减少、肾小球滤过分数增加、以及发生蛋白尿。(Bakris，GL，etal.：Am JHypertens 1996；9：200S-6S)。盐敏感也是心血管病的一个危险因子。(Campese VM：Hypertension 1992；19；403-18)。本发明的方法同样可以用于治疗或预防这些个体中的醛固酮介导的致病作用。
钠摄取的增加也可以对受试者的药物治疗反应产生不良影响。例如，轻度高血压治疗研究(TOMHS)观察了用于治疗高血压的黑人患者的5种药物(Neaton JD，et al.：Z4M4 1993；270：713-24)。该研究表明，患者对***、钙离子通道阻滞剂、或具有内在拟交感活性的β肾上腺素受体拮抗剂的反应优于对ACE抑制剂或α肾上腺素受体拮抗剂的反应(Grim CE，et al.：J Chronic Dis 1980；33：87-94)。黑人和白人患者表现出当钠摄取减少时药物治疗的增强。例如，这种减少导致从抗高血压治疗退出的改进，特别是在盐敏感患者中(vanBrummelen P，Schalekamp M，de Graeff J.Acta llIed Scand 1978；204：151-7)。钠的适度减少甚至可以导致有效剂量的减少(Weinberger MH，et al.：JAMA 1988；6：2561-5)。然而，本发明的方法可以用于单独治疗或联合治疗，例如用于对由于盐敏感和/或饮食钠摄取增加等原因而无效的患者的常规药物治疗。
例如，在本发明的一个实施方案中包括了一种治疗或预防具有盐敏感性的人类受试者的高血压的方法。根据该方法，将治疗有效量的醛固酮拮抗剂给予患有或易患高血压的盐敏感个体。盐敏感个体的高血压是区别于其它形式的高血压的病理学状况，它由普通饮食成分氯化钠所诱导。如果未经治疗，患有这种状况的患者也将会产生心肌梗塞的发病率增加、卒中、心衰、肾功能障碍、器官功能障碍和其它心血管病变。
盐敏感性高血压可以很容易诊断，例如，通过测量低氯化钠摄取(如在几天内约1-3g/日)然后进行高氯化钠摄取(如约12-15g/日)的患者的血压改变而诊断。氯化钠摄取增加时血压增加约10％或更多是盐敏感性高血压的一种指标。此外，受试者血压的改变可以在24小时的时间段内采用流动血液测量设备进行测量。具有盐敏感性高血压的患者在睡眠期没有表现出血压的昼夜节律性降低(或“骤降”)。相反，盐敏感性高血压患者的血压在整个24小时的周期中保持升高。在这个额外阶段中盐敏感患者保持最大程度的高血压，这给血管和器官带来了由这种状况导致的病理学损害。
尽管这种状况可以通过氯化钠摄取的减少而改善，但由于前面所述的各种原因，钠摄取减少可能是不实际的。当没有饮食疗法时，尝试了治疗性发明。基于盐敏感性高血压的生化特征和增加的交感神经活性和儿茶酚胺水平，通常推荐β肾上腺素阻滞药物。然而，这种治疗几乎没有获得成功并可以导致严重副作用，并且对于许多患者只几乎不提供或没有提供缓解。由于高氯化钠饮食也抑制肾素-血管紧张素-醛固酮***，在盐敏感高血压患者和具有高盐摄取的患者中醛固酮水平通常正常或减少。因此，用醛固酮拮抗剂治疗盐敏感性高血压为医学从业者所忽视或不提倡。
因此，在另一种实施方案中，本发明包括一种治疗或预防饮食钠摄取增加的人类受试者中的高血压的方法。根据本方法，给予饮食钠摄取增加并且患有或易患高血压的受试者治疗有效量的醛固酮拮抗剂。
在另一种特别感兴趣的实施方案中，本发明包括治疗或预防有需要的人类受试者的心血管病，特别是心肌梗塞后心衰的方法。根据本发明，将治疗有效量的醛固酮拮抗剂给予具有盐敏感性和/或饮食钠摄取增加的受试者，其中该受试者患有或易患心血管病。
在另一种特别感兴趣的实施方案中，本发明包括治疗或预防有需要的人类受试者的肾功能障碍。根据本发明，将治疗有效量的醛固酮拮抗剂给予具有盐敏感性和/或饮食钠摄取增加的受试者，其中该受试者患有或易患肾功能障碍。
盐敏感性
尽管实验室和临床试验表现出钠摄取和血压之间的关系，关于此关系，普通人群表现出了物质异质性。识别了表现出不同反应的两个普通人群。第一个普通人群为盐不敏感个体(也称作“盐抵抗个体”)。在盐不敏感个体中，饮食钠摄取增加导致了钠***的增加，但测量不到，或仅仅导致血压的微小增加。同样，盐不敏感个体钠摄取的减少并不从物质上降低血压或高血压的发病率。实际上，这种盐摄取的限制对个体可能是有害的。
第二个普通人群是盐敏感个体。在盐敏感个体中，血压一般随钠消耗的增加和减少升高和降低。当进食典型的北美饮食时，盐敏感的血压正常个体甚至可能更容易随时间发生高血压(Sullivan JM，1991；Hypertension 17(Suppl.I)：I61-68)。当钠摄取增加时，肾血流可能不增加或可能减少，使得血管阻力和滤过分数增加，肾小球滤过率不变或增加(Weir MR et al.：Hypertension 1990；16：235-44)。
鉴定盐敏感个体
测定盐敏感性的适当试验，例如，但不限于盐刺激(challenge)试验，是本领域的普通技术人员所公知的。见，例如，Brenner，K.″Amethod for distinguishing salt-sensitive from non-saltsensitive forms of human and experimental hypertension″，Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.1993 May；2(3)：341-349。这种鉴定可以通过，例如，临床试验(例如盐刺激试验)或通过检验家族史和/或种族起源而完成。可以采用单向和双向分析进行临床试验。
盐刺激试验
测定盐敏感性的一种说明性的非限制性方式是盐刺激试验。单向盐刺激试验可以通过将个体置于低钠饮食(如40mmol/日，共一周；“低盐方案”)而完成。由于自由得到钠的个体通常表现出很差的依从性，该试验是在住院条件下进行的。住院条件下进行试验的个体不能自由得到钠来源，其饮食由营养学家或本领域技术人员确定钠含量。此外，仔细测量了摄取的饮食来源的钠。在完成低盐方案之后，在静息状态下测量收缩压和舒张压各3次。完成低盐方案之后，立即将个体再次置于受控制的饮食方案中，其中总的钠摄取为220mmol/日(“高盐方案”)。在高盐饮食一周结束时，同低盐方案时一样，测量收缩压和舒张压。收缩压或舒张压或两者增加5mm Hg以上者被认为是盐敏感的。
双向盐刺激试验的进行可以通过如前面所述将个体置于低盐方案中和高盐方案中，然后立即将个体置于与低盐方案相似的对照的、低钠饮食，然后同单向试验一样测量收缩压和舒张压。在高盐方案结束时收缩压或舒张压或两者增加5mm Hg以上，或在随后的对照的、低盐饮食结束时收缩压或舒张压或两者降低5mm Hg以上的个体被认为是盐敏感的。
鉴定盐敏感个体的另一种方法是进行逆单向分析，其中首先将个体置于高钠方案，然后进行低钠方案。在低钠方案结束时收缩压或舒张压或两者降低10％的个体被认为是盐敏感的。
当需要时可以对前面描述的单向、双向和逆单向盐刺激试验可以进一步改进。例如，可以允许受试者在正常环境中进行正常活动(即吃饭、睡觉、工作等)，而不是住院。对饮食方案的顺应性可以通过分析24小时的尿收集物而判断。另外，可以通过由试验个体的主观问卷和记录而监测顺应性。上述试验方法的其它改进包括将每个方案的一周时间减少至3、4、5或6天。上述试验的其它改进包括调整钠的高盐方案摄取量，例如调整为每日8-16g钠。此外，可以使用更低的舒张压和收缩压改变域值(如5，6，7，8，或9％)，如果需要，当在两个独立的单向试验判断中满足这一降低的域值时可以将个体评分为盐敏感性阳性。
迅速体积扩张和收缩试验
测定盐敏感性的另一种说明性的非限制方式是通过迅速体积扩张和收缩试验，例如，由Grim et al；.Hypertension 1979；1：476-85描述的方法；由Strazzullo et al.：J Nephrol 2000；13：46-53进行了改进。总的说来，让受试者住院4天，并接受50mmol/日的钠。第一天，受试者接受Slow-Na片剂形式的额外的钠，以达到150mmol钠的总摄取。第二天，仍将钠摄取固定在150mmol，给予受试者恒定的静脉内输注速度，即4小时内输注2L 0.9％的氯化钠。在氯化钠输注开始和结束时用自动血压记录仪测量血压(以三分钟的间隔测量5次的平均值)。在盐水输注前3小时和输注时测量尿钠***。在输注前和输注后测量体重、红细胞比积、血浆肾素活性和醛固酮。第3天，通过饮食限钠(50mmol/日)加上在10:00a.m.，02:00p.m.和06:00p.m.三次给予37.5mg速尿而实现钠和体积减少。在第4天8:00a.m.测量血压。通过计算在输注末测量的平均血压减去氯化钠减少之后的血压而计算对试验的反应。如果该反应高于5mm Hg，受试者被认为是盐敏感的。
家族史或种族起源
家族史和/或种族起源也可以帮助判断受试者盐敏感性的风险。这些危险因子包括，但不限于，由一个或多个患高血压的亲属组成的家族史，可追踪至比普通的全球人群的盐敏感性更普遍的种群的家系。这种家系的例子包括黑人、美国黑人、美国印第安人和日本人(PowersDR et al.：Arch Intern Med 1998 158：793-800)。
分子鉴定
通过适当的遗传试验方法对盐敏感性表型进行的分子鉴定也可以用于测定个体的盐敏感性。例如，Rutledge等描述了非洲裔美国人中这种表型和心房钠肽Hpall突变之间的关联。(J Hypertens.1995；13：953-5)。Svetkey等报道了非洲裔美国人中对钠负荷/体积减少的舒张压反应与β2肾上腺素受***点之间的一致性。(Hypertension.1997；29：918-22)。在意大利进行的一项同胞配对研究报道了α内收蛋白突变(1460Trp)和盐敏感性之间的一致性(Cusi D et al；.Lancet.1997；349：1353-7)。据报道，2型11β羟基类固醇脱氢酶(11βHSD2)基因外显子3的AluI多态性与瑞士人群中的盐敏感性相关。(Lovati Eet al.：J Clin Endocrinol Metab.1999；84：3745-9)。此外，据报道，在具有原发性高血压的未选择患者中的同一基因中的CA重复等位基因微卫星多态性与盐敏感性相关。(Ferrari P et al.：KidneyInt.2000；57：1374-81)。此外，11βHSD2活性在盐敏感受试者中与盐抵抗受试者相比有所减少，这是由尿皮质醇与皮质酮代谢物平均比值的升高所显示的。在西班牙进行的一项关于高血压个体的研究报道了ACE基因中的一个或两个拷贝的287个碱基对的***片段与盐敏感性的关联。(Giner et al.：Hypertension.2000；35：512-517)。
血浆免疫反应性内皮素水平
内皮细胞在血管张力和体液平衡的调节中起重要作用。该功能部分是通过血管活性物质的分泌介导的。内皮素(由内皮细胞产生)是强效的血管收缩因子，并且是由三个不同的基因编码的肽(YanagiawaM et al.：Nature 1988 332：411-5)。内皮素-1(″ET-1″)是由内皮产生的主要成分，它以自分泌和旁分泌方式起作用。平滑肌细胞上的ET-1受体(即EtA和ETB)介导ET-1的收缩、增殖和肥大诱导的作用(De Nucci G et al.：Proc Natl Acad Sci USA 1988，85：9797-800)。
在盐抵抗高血压个体中，内皮素血浆水平通常是正常的。(Schiffrin EL et al.：Am JHypertens 1991 4：303-8)。然而，在严重高血压个体和黑人中，血浆反应性ET-1通常升高。盐敏感个体通过表现出血浆ET-1水平升高而反应于盐负荷的增加(Elijovich Fet al.：Hypertension 1999；33：1075)。因此，另一种鉴定盐敏感个体的方法是通过检验血浆反应性内皮素水平。盐敏感个体中通常存在血浆免疫反应性内皮素水平的升高，特别是免疫反应性内皮素ET-1水平的升高。
需要治疗的受试者
以前并不理解人体中低于正常水平的内源性醛固酮的致病性。同样，以前也不理解在人体中由钠水平升高导致的由内源性醛固酮介导的致病作用的发生增加、迅速起病和发展、和/或严重性。一般认为钠负荷导致内源性醛固酮水平减少至非致病水平。因此，可以根据本发明的治疗或预防而获益的个体一般是具有以下特征的人类受试者(i)内源性醛固酮水平低于正常值，(ii)不论内源性醛固酮水平如何都具有盐敏感性，和/或(iii)不论内源性醛固酮水平如何，饮食钠摄取增加。在这些受试者的每一组中，进一步对其进行分型和/或表型分析以鉴定将从本发明的治疗中获益的受试者亚组是有益的。
因此，可以根据本发明的方法进行治疗或预防而从中获益的受试者一般是表现出以下一种或多种特征的人类受试者：
(a)该受试者的平均每日氯化钠摄取至少为约4g，特别是该状况在给定的一年时间段中的至少一个或多个月期间的任意一个月满足了这个条件时。受试者平均每日的钠摄取优选为至少约6g，更优选至少约8g，更优选至少约12g。
(b)当受试者的每日氯化钠摄取从小于约3g/日增加至至少约10g/日时，受试者的收缩压和/或舒张压增加至少约5％，优选至少约7％，更优选至少约10％。
(c)受试者中的血浆醛固酮(ng/dL)与血浆肾素(ng/ml/hr)的活性比大于约30，优选大于约40，更优选大于约50，更优选大于约60。
(d)受试者具有低血浆肾素水平；例如，受试者的清晨血浆肾素活性小于约1.0ng/dL/hr，和/或受试者的活性肾素值小于约15pg/mL。
(e)受试者患有或易患收缩压和/或舒张压升高。总的说来，受试者的收缩压(例如，通过袖带式水银血压计测量)至少为约130mm Hg，优选至少约140mm Hg，优选至少约150mm Hg，受试者的舒张压(例如，通过袖带式水银血压计测量)至少为约85mm Hg，优选至少约90mmHg，更优选至少约100mm Hg。
(f)受试者的尿钠与钾的比(mmol/mmol)小于约6，优选小于约5.5，更优选小于约5，更优选小于约4.5。
(g)受试者的尿钠水平为每日至少约60mmol，特别是该状况在给定的一年时间段中的至少一个或多个月期间的任意一个月满足了这个条件时。受试者的尿钠水平优选为至少约100mmol/日，更优选至少约150mmol/日，更优选至少约200mmol/日。
(h)受试者中一种或多种内皮素，特别是血浆免疫反应性ET-1的血浆浓度升高。ET-1的血浆浓度优选至少高于约2.0pmol/L，更优选高于约4.0pmol/L，更优选高于约8.0pmol/L。
(i)其血压用ACE抑制剂基本难以治疗的受试者；特别是与没有抗高血压治疗的受试者的血压相比，用10mg/日的依那普利治疗后血压降低少于约8mm Hg，优选少于约5mm Hg，更优选少于约3mm Hg。
(j)受试者具有血体积扩张性高血压或血体积扩张性临界高血压，即，由钠潴留增加导致的影响血压的血体积增加引起的高血压。
(k)受试者为非调节个体，即，该个体在肾血流速度和/或肾上腺产生醛固酮方面对钠摄取的增加或血管紧张素II给药的阳性反应迟钝，特别是反应小于从一般的地理人群取样的个体(例如，从受试者的来源国或受试者为居民的国家取样的个体)，优选当该反应小于人群平均值的40％，更优选小于30％，更优选小于20％。
(l)受试者具有或易患肾功能障碍，特别是选自以下一种或多种的肾功能障碍：肾小球滤过率减少、微白蛋白尿和蛋白尿。
(m)受试者具有或易患心血管病，特别是选自以下一种或多种的心血管病：心衰、左心室舒张功能不全、肥厚性心肌病和舒张性心袁。
(n)受试者具有或易患肝脏疾病，特别是肝硬化。
(o)受试者具有或易患水肿、特别是选自以下一种或多种的水肿：外周组织水肿、肝或脾充血、肝腹水、以及呼吸道或肺充血。
(p)受试者具有或易患胰岛素抵抗，特别是I型或II型糖尿病，和/或葡萄糖抵抗。
(q)受试者至少55岁，优选至少约60岁，更优选至少约65岁。
(r)受试者完全或部分属于选自以下至少一种的种族：日本人种族、美国印第安人种族、以及黑人种族。
(s)受试者具有一种或多种与盐敏感性相关的遗传标记。
(t)受试者肥胖，优选身体中的脂肪优选超过25％，更优选超过30％，甚至更优选超过35％。
(u)受试者具有一或多个1级、2级或3级(degree)亲属为盐敏感的，其中1级亲属表示父母或有一个或多个相同父母的亲属，2级亲属表示祖父母和有一个或多个相同祖父母的亲属，3级亲属表示曾祖父母和有一个或多个相同的曾祖父母的亲属。优选地，这些个体具有4个和更多的盐敏感性1级、2级或3级亲属；更优选具有8个或更多这种亲属；甚至更优选具有16个或更多这种亲属；甚至更优选具有32个或更多这种亲属。
除非特别指明，前面列出的值优选表示基于至少两次测量的平均值，更优选基于至少两次测量的表示每日平均值。
优选地，需要治疗的受试者满足至少两个或多个上述特征，更优选满足至少3个或更多上述特征，更优选满足至少4个或更多上述特征。
因此，在本发明的一个实施方案中，需要治疗的受试者是盐敏感性的，并且满足以下两个或更多条件：(i)受试者平均每日摄取的氯化钠为至少约4g，特别是在给定的一年的时间段中的至少一个或多个月期间的任意一个月期间满足这个条件；和/或(ii)受试者中血浆醛固酮(ng/dL)与血浆肾素(ng/ml/hr)的活性比大于约30；(iii)受试者中清晨的血浆肾素活性小于约1.0ng/dL/hr，和/或受试者中的活性肾素值小于约15pg/mL；和/或(iv)受试者的收缩压至少为约130mm Hg，舒张压至少为约85mm Hg；和/或(v)受试者具有或易患心血管病，特别是选自以下一种或多种的心血管病：心衰、左心室舒张功能障碍、肥厚性心肌病、以及舒张性心衰。
在本发明的另一种实施方案中，需要治疗的患者是盐敏感的，并且满足以下条件：(i)受试者中血浆醛固酮(ng/dL)与血浆肾素(ng/ml/hr)的活性比大于约30；和(ii)受试者中清晨的血浆肾素活性小于约1.0ng/dL/hr，和/或(iii)受试者中的活性肾素值小于约15pg/mL。
在本发明的另一种实施方案中，需要治疗的患者是盐敏感的，并且满足以下条件中的至少两个：(i)受试者平均每日摄取的氯化钠为至少约4g，特别是在给定的一年的时间段中的至少一个或多个月期间的任意一个月期间满足这个条件；和/或(ii)受试者的收缩压至少为约130mm Hg，舒张压至少为约85mm Hg；和/或(iii)受试者具有或易患心血管病，特别是选自以下一种或多种的心血管病：心衰、左心室舒张功能障碍、肥厚性心肌病、缺血性心肌病以及舒张性心衰。
示例性表型
在上述实施方案中的每一个，受试者的全部或部分优选为日本人种族或黑人种族中的一个成员。日本的高血压是一个严重的问题。一项最近的研究提示，大约3千万的日本成人患有高血压。(Saruta T.JClin Ther Med 1997；13：4024-9)。尽管血压控制状况最近在日本得到了改进，高血压管理仍被认为是不够的。(Shimamoto；K.Japanese Cases.Nihon Rinsyo(Clinical Medicine in Japan)，2000；58(Suppl)：593-6)。Trends in blood pressure and urinarysodium and potassium excretion in Japan：reinvestigation inthe 8th year after the Intersalt Study.Nakagawa H，et al.：Hum Hypertens 1999 Nov；13(11)：735-41推荐日本人增加饮食钾并减少饮食钠。
然而，限钠方案在日本由于依从性差而受到了阻碍。由Kobayashi等进行的一项日本人的研究制定了将饮食限制在5-8g/日的方案，但仍然难以达到良好的依从性。(Kobayashi，Y et al.：Jpn Circ J 1983；47：268-75)。日本健康和福利部门推荐了将钠限制在低于10g/日(Guidelines on treatment of hypertension in the elderly，1995--a tentative plan for comprehensive research projects onaging and health--Members of the Research Group for″Guidelines on Treatment of Hypertension in the Elderly″，Comprehensive Research Projects on Aging and Health，theMinistry of Health and Welfare of Japan).Ogihara T，et al.：Nippon Ronen Igakkai Zasshi.1996；33(12)：945-75)。尽管主动对公众进行了10年的教育，仍然存在很高的不依从率(估计高于约50％)，这是由日本的正常和高血压个体的尿钠水平而测量的(Kobayashi Y，et al.：Jpn Circ J；47(2)：268-75)。
此外，日本人有两个主要的群体：盐敏感和盐不敏感(Preventivenutritional factors in epidemiology：interaction betweensodium and calcium.Mizushima S，Clin Exp Pharmacol Physiol1999；26：573)。已经确认许多日本人的高血压是盐敏感的。因此，表现出盐敏感、高钠摄取和不能主动限制钠消耗的结合的日本人种族成员尤其可以从本发明的治疗获益。
因此，在本发明的另一种实施方案中，需要治疗的受试者是盐敏感个体，他们全部或部分为日本人种族的成员，并且具有或易患高血压和/或心血管病，特别是选自以下一种或多种的心血管病：心衰、左心室舒张功能障碍、肥厚性心肌病、以及舒张性心衰。
在本发明的另一种实施方案中，需要治疗的受试者是盐敏感个体，他们全部或部分为日本人种族的成员，并且受试者平均每日摄取的氯化钠为至少约4g，特别是在给定的一年时间段中的至少一个或多个月期间的任意一个月期间中满足这个条件。
黑人中的高血压同样是一个显著的问题。许多高血压和正常血压的黑人是盐敏感的(Svetkey，LP et al.：Hypertension.1996；28：854-8)。积累的流行病学数据表明，在几乎所有年龄和性别匹配组中，黑人中高血压的流行高于白人。高血压黑人一般比高血压白人具有更高的左心室功能障碍、卒中和肾脏损伤的发病率(但缺血性心脏病的发病率更低)(Eisner，GM.Am J Kidney Dis 1990；16(4 Suppl1)：35-40)。美国黑人中高血压的流行原因很大程度上是环境引起的：高钠和酒精摄取、肥胖、身体活动少、以及心理压力都被鉴定为原因。(Flack，JM，et al.：JAssoc Acad Minor Phys 1991；2：14350)。
黑人和白人中都具有的问题的原因是不明确的，但似乎钠处理上的差异可能会造成黑人高血压患者的特定血液动力学和体液特征。已经提出，限制尿钠***能力的内在或高血压诱导的肾功能异常、Na+，K(+)-ATP酶泵活性的减少、其它膜离子运输障碍、对心理压力的不同暴露、更大的胰岛素抵抗、以及饮食因素(钙和钾摄取减少)可能起了一定作用。(Flack，JM et al.：Hypertension；1991；17(1 Suppl)：I115-21)。一项研究表明，遗传差异可能也会成为黑人中盐敏感性的基础(Svetkey，LP，et al.：Hypertension 1996；28：854-8)。
黑人中的高血压起初一般是通过限制饮食中的钠摄取而控制的。如果饮食控制还不够，推荐给予一种具有24小时效力并降低血管外周阻力、促进钠***、并潜在改进肾脏血液动力学的抗高血压剂(Eisner，GM.Am JKidney Dis 1990；16(4 Suppl 1)：35-40)。然而，与白人相比，黑人一般对抗高血压剂的反应不同。总的说来，β肾上腺素受体拮抗剂或ACE抑制剂的单一治疗在黑人中不如白人中有效。黑人男性对ACE抑制剂的反应甚至容易低于黑人女性(Eisner，GM.AmJKidney Dis 1990；16(4 Suppl 1)：35-40)。因此，表现出盐敏感、高钠摄取和不能主动限制钠消耗的结合的黑人种族尤其可以从本发明的治疗获益。
因此，在本发明的另一种实施方案中，需要治疗的受试者是盐敏感个体，他们全部或部分为黑人种族的成员，并且具有或易患高血压和/或心血管病，特别是选自以下一种或多种的心血管病：心衰、左心室舒张功能障碍、肥厚性心肌病、以及舒张性心衰。
在本发明的另一种实施方案中，需要治疗的受试者是盐敏感个体，他们全部或部分为黑人种族的成员，并且受试者平均每日摄取的氯化钠为至少约4g，特别是在给定的一年时间段中的至少一个或多个月期间的任意一个月期间满足这个条件。
在本发明的另一种实施方案中，需要治疗的受试者是盐敏感个体，他们全部或部分为黑人种族的成员，并且反应于标准抗高血压治疗时的血压降低表现出的逐渐增加的降低有所减少，特别是当进行包括给予ACE抑制剂的治疗时。
非调节个体
如前面所述，非调节个体表现出在肾血流速度和肾上腺醛固酮产生方面对高钠摄取或血管紧张素II给药的阳性反应的钝化。这些非调节个体此外还可以表现出空腹胰岛素水平的增加和葡萄糖刺激胰岛素水平增加的增加(Ferri et al.：Diabetes 1999；48：1623-30)。胰岛素抵抗也与心肌梗塞风险的增加相关。
因此，在本发明的另一种实施方案中，需要治疗的受试者是盐敏感和非调节个体，他们(i)具有或易患胰岛素抵抗，特别是I型或II型糖尿病，和/或葡萄糖抵抗，和/或(ii)具有或易患心血管病。
老年个体
在盐敏感个体中，反应于饮食钠摄取的给定增加的血压升高随年龄增加。同样，在老年个体中更容易观察到盐敏感性。
因此，在本发明的一种实施方案中，需要治疗的受试者是至少55岁的盐敏感个体，优选至少约60岁，更优选至少约65岁，并且具有或易患胰岛素抵抗，特别是I型或II型糖尿病，和/或葡萄糖抵抗。
解毒的和恢复的酗酒者
解毒的和恢复的酗酒者一般也是盐敏感的(Genaro C et al.：Hypertension 2000：869-874)。因此，在本发明的另一种实施方案中，需要治疗的受试者是盐敏感个体，并且，是解毒或恢复的酗酒者。
肥胖
肥胖个体一般是盐敏感的。Bonner的研究(MMW Fortschr Med1999；14：34-6)估计，44％的高血压患者是超重的，并进一步与盐敏感性、细胞内钙升高、钠潴留、和心输出量的增加相关。此外，Dimsdaleet al.(Am J Hypertens 1990；3：429-35)报道了肥胖病人更容易反应于盐负荷而增加收缩压。此外，盐敏感儿童也增加了肥胖和心血管病的可能性(Falkner B et al.：Am J Clin Nutr 1997；65：618S-621S)。甚至在血压正常的个体中，钠敏感个体的体重容易超过钠抵抗个体(Rocchini AP et al.：Am JMed Sci 1994；307 Suppl 1：S75-80)。因此，在本发明的另一种实施方案中，需要治疗的受试者是盐敏感个体，并且肥胖。
盐敏感性的治疗
本发明也涉及用醛固酮拮抗剂减少和/或逆转盐敏感性的进展。盐敏感性是卒中等心血管病导致的死亡的独立危险因子，不论该盐敏感个体是高血压、吸烟者或具有高胆固醇(Myron H.Weinberger，54″Annual Conference of the American Heart Association′sCouncil for High Blood Pressure Research，Washington，D.C.，2000)。
因此，在本发明的一种实施方案中，需要治疗的受试者是盐敏感个体，他或多或少具有正常的临床表现。这里用到的正常临床表现表示没有明显的高血压，并且没有发生肾脏、心脏、心血管***、脑血管***疾病的明显迹象，或任何胰岛素病的指征。根据本发明在这种个体中使用依普利农将防止醛固酮/盐介导病变的发生。
一般地，在大多数人中发生年龄相关的盐敏感性进展。已知这种进展部分是因为一些醛固酮介导的现象。首先，在食用高盐饮食的非调节者中，具有异常血管紧张素介导的醛固酮释放的控制以及导致高血压的肾血供。其次，当受试者年龄增加时，血管顺应性受到醛固酮介导的血管僵硬的危害，导致血管失去了吸收部分血压的能力。第三，年龄相关的胰岛素产生增加加剧了醛固酮介导的EnaC活性增加。
根据本发明给予醛固酮拮抗剂将减少和/或逆转盐敏感性和相关状况的进展，相关状况包括，但不限于，反应于钠摄取增加的血压升高，以及肾、心血管和脑病变。给予该拮抗剂将减少和/或逆转年龄相关作用的进展。此外，这种给药也将减少和/或逆转这些个体中盐敏感性对肾、心血管和脑病变的遗传和饮食影响。
钠食欲抑制
本发明也涉及在有需要的个体中用醛固酮拮抗剂抑制钠食欲。尽管许多医学状况的许多病理学结局可以通过限制饮食钠摄取而减少，对该限制的依从性通常不佳。当达到这种依从性时，甚至仅仅是部分达到时，尝试这种限制的个体通常经历了盐渴望和生活质量降低。因此本发明作为这些医学状况的其它治疗的辅助手段对这些个体有益，并进一步提供了生活质量的改进。
治疗和/或预防中枢醛固酮介导的病理
已经假设盐敏感个体经历的血压的升高部分是由于醛固酮的中枢活性。RAAS的激活导致了脑的脑室内(″ICV″)区域的血管加压或交感神经反应。醛固酮在脑中是血管加压的，特别是在脑内的细胞内钠水平升高的个体中更是如此。这种醛固酮水平的升高特别容易发生在盐敏感个体中。个体中醛固酮在脑中的血管加压作用(″中枢醛固酮″)被认为是部分介导神经原性血管舒缩张力和动脉压力伸缩受损。此外，认为中枢醛固酮在应激/焦虑诱导的下丘脑-垂体-肾上腺(″HPA″)轴的激活中是关键的。尽管在这些个体中标准抗高血压治疗受到饮食钠摄取的妨碍，本发明提供了即使在钠摄取增加时也是有效的治疗，这将导致高血压控制的改进。
因此，本发明包括从醛固酮拮抗剂从功能上灭活个体脑内的醛固酮，特别是在具有或易患脑内细胞内钠水平升高的个体中。这种钠水平的升高特别容易发生在盐敏感个体中和饮食钠摄取增加的个体中。“功能上灭活”表示部分或完全阻断由醛固酮介导的一种或多种作用。
本发明特别包括了醛固酮拮抗剂在治疗或预防由以下一种或多种原因导致的高血压个体中的用途：HPA轴激活、神经原性血管舒缩张力增加、或动脉压力伸缩受损。
本发明进一步包括醛固酮拮抗剂在治疗或预防盐敏感高血压个体，以减少和/或预防脑中醛固酮水平异常导致的不良作用中的用途。
治疗和/或预防肾-醛固酮介导的病理
本发明也涉及用醛固酮拮抗剂治疗细胞内钠水平升高的高血压受试者，从而防止异常的肾钠潴留。因此，本发明包括用醛固酮拮抗剂功能上灭活人类受试者，特别是具有盐敏感和/或饮食钠摄取增加的受试者肾内的醛固酮。“功能性灭活”表示部分或完全阻断一种或多种由醛固酮介导的作用。
钠摄取的增加可以导致盐敏感个体中钠水平的增加以及高血压周期的增加。在这些个体中，RAAS通常不被刺激，肾素和醛固酮水平相对低，因为钠潴留是部分不必要的。因此，醛固酮上游的RAAS抑制剂(如ACE抑制剂和血管紧张素II受体拮抗剂)效力有限。尽管作为低肾素/盐敏感性高血压的基础的生化缺陷是不明确的，这些个体中异常的肾钠潴留导致高血压。具有充分治疗控制的尝试通常包括联合治疗，这可以导致比单一治疗更多的副作用。醛固酮在肾脏中是血管加压的，特别是在细胞内钠升高的个体中更是如此。这些个体特别包括盐敏感个体。然而，本发明的新方法有效阻断了未刺激和刺激的醛固酮的高血压效用。尽管高钠摄取阻碍标准的抗高血压治疗，根据本发明的方法给予醛固酮拮抗剂可以纠正肾脏中的缺陷性尿钠***调节并恢复血压。
因此，在本发明的另一种实施方案中，致病作用全部或部分由钠水平升高时的醛固酮作用所导致。致病作用优选全部或部分由细胞内钠水平升高条件下的醛固酮作用导致。
在本发明的另一种实施方案中，致病作用全部或部分由脑内存在的醛固酮介导。致病作用优选全部或部分由细胞内钠水平升高时的醛固酮作用导致。更优选地，该致病作用选自高血压和卒中。
在本发明的另一种实施方案中，致病作用全部或部分由肾内存在的醛固酮介导。致病作用优选全部或部分由细胞内钠水平升高时的醛固酮作周导致。更优选地，该致病作用选自肾性高血压和肾硬化。
在本发明的另一种实施方案中，致病作用全部或部分由受试者中醛固酮和饮食钠摄取的增加的联合作用所导致。
醛固酮拮抗剂
用于本发明的方法中的醛固酮拮抗剂一般是螺内酯型的甾族化合物。“螺内酯”型表示一种结构，它包含连接于甾核的内酯部分，一般在甾族“D”环处通过螺键结构连接。螺内酯型醛固酮拮抗剂化合物的一种亚类由环氧-甾族醛固酮拮抗剂化合物组成，例如依普利农。螺内酯型醛固酮拮抗剂化合物的另一种亚类由非环氧-甾族醛固酮拮抗剂化合物组成，例如螺内酯。
用于本发明的方法的环氧-甾族醛固酮拮抗剂化合物一般具有被环氧型部分取代的甾核。“环氧型”部分意欲包括特征在于具有作为两个碳原子之间的桥的氧原子的任意部分，其例子包括以下部分：
    
     环氧乙基                1，3-环氧丙基            1，2-环氧丙基
用于短语“环氧-甾族”中的“甾族”表示由环戊烯菲部分提供的核，具有传统的″A″，″B″，″C″和″D″环。环氧型部分可以在任何可连接或可取代的位置连接于环戊烯菲核，即，与甾核的环之一融合，或该部分可以在环体系的一个环成员上取代。“环氧-甾族”包括具有一个或多个与其连接的环氧型部分的甾核。
适用于本发明的方法的环氧一甾族醛固酮拮抗剂包括具有与甾核“C”环融合的环氧部分的化合物家族。特别优选的是20-螺烷化合物，其特征在于存在9α，11α-取代的环氧部分。下面的化合物1-11是示例性的可用于本发明的方法的9α，11α-环氧-甾族化合物。这些环氧甾族化合物可以通过Grob等的美国专利4,559,332描述的方法制备。其它制备9，11-环氧-甾族化合物及其盐的方法公开于Ng et al.，WO97/21720和Ng et al.，WO98/25948。
                      表1：醛固酮受体拮抗剂
                     表1：醛固酮受体拮抗剂
Figure C0081981600371
                      表1：醛固酮受体拮抗剂
                      表1：醛固酮受体拮抗剂
                      表1：醛固酮受体拮抗剂
                      表1：醛固酮受体拮抗剂
特别感兴趣的是化合物依普利农(也称作环氧孕甲酯丙酮(epoxymexrenone))，即前面所示的化合物1。依普利农是一种醛固酮受体拮抗剂，它对醛固酮受体比螺内酯等具有更高的特异性。在本方法中将依普利农选作醛固酮拮抗剂将有益于减少使用特异性较低的醛固酮拮抗剂时产生的男性乳腺增生等副作用。
适用于本方法的非环氧-甾族醛固酮拮抗剂包括由式I限定的螺内酯型化合物家族：
Figure C0081981600421
其中
Figure C0081981600422
是
或
Figure C0081981600424
其中R为最多5个碳原子的低级烷基，并且
其中 是
或
其中烷基包括支链基和非支链基，优选甲基、乙基和正丙基。
式I中的具体感兴趣的化合物如下：
7α-乙酰基硫代-3-氧-4，15-雄二烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氢化呋喃-2′-酮；
3-氧-7α-丙酰基硫代-4，15-雄二烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氢化呋喃-2′-酮；
6β，7β-亚甲基-3-氧-4，15-雄二烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氢化呋喃-2′-酮；
15α，16α-亚甲基-3-氧-4，7α-丙酰基硫代-4-雄烯[17(β-1′)-螺-5′]全氢化呋喃-2′-酮；
6β，7β，15α，16α-二亚甲基-3-氧-4-雄烯[17(β-1′)-螺-5′]全氢化呋喃-2′-酮；
7α-丙酰基硫代-15β，16β-亚甲基-3-氧-4-雄烯[17(β-1′)-螺-5′]全氢化呋喃-2′-酮；
15β，16β-亚甲基-3-氧-7β-丙酰基硫代-4-雄烯[17(β-1′)-螺-5′]全氢化呋喃-2′-酮；
6β，7β，15β，16β-二亚甲基-3-氧-4-雄烯[17(β-1′)-螺-5′]全氢化呋喃-2′-酮；
制备式I的化合物的方法描述于1978年12月12日授权的Wiechart等的美国专利4,129,564。
感兴趣的另一种非环氧-甾族化合物家族由式II限定：
其中R1为C1-3烷基或C1-3酰基，并且R2为H或C1-3烷基。
式II中的具体化合物如下：
1α-乙酰基硫代-15β，16β-亚甲基-7α-甲基硫代-3-氧-17α-孕-4-烯-21，17-碳内酯；和
15β，16β-亚甲基-1α，7α-二甲基硫代-3-氧-17α-孕-4-烯-21，17-碳内酯。
制备式II的化合物的方法描述于1988年12月6日授权的Nickisch等的美国专利4,789,668。
感兴趣的另一种非环氧-甾族化合物家族由式III限定：
其中R为低级烷基，优选为甲基、乙基、丙基和丁基。感兴趣的具体化合物包括：
3β，21-二羟基-17α-孕-5，15-二烯-17-羧酸γ-内酯；
3β，21-二羟基-17α-孕-5，15-二烯-17-羧酸γ-内酯3-乙酸酯；
3β，21-二羟基-17α-孕-5-烯-17-羧酸γ-内酯；
3β，21-二羟基-17α-孕-5-烯-17-羧酸γ-内酯3-乙酸酯；
21-羟基-3-氧-17α-孕-4-烯-17-羧酸γ-内酯；
21-羟基-3-氧-17α-孕-4，6-二烯-17-羧酸γ-内酯；
21-羟基-3-氧-17α-孕-1，4-二烯-17-羧酸γ-内酯；
7α-酰基硫代-21-羟基-3-氧-17α-孕-4-烯-17-羧酸γ-内酯；和
7α-乙酰基硫代-21-羟基-3-氧-17α-孕-4-烯-17-羧酸γ-内酯。
制备式III的化合物的方法描述于1966年6月21日授权的Patchett等的美国专利3,257,390。
感兴趣的另一种非环氧-甾族化合物家族由式IV限定：
其中E′选自乙烯基、亚乙烯基和(低级烷酰基)硫代乙烯基，E″选自乙烯基、亚乙烯基、(低级烷酰基)硫代乙烯基和(低级烷酰基)硫代丙烯基；除E′和E″分别为乙烯基和(低级烷酰基)硫代乙烯基时，R为甲基，当E′和E″分别为乙烯基和(低级烷酰基)硫代乙烯基时，R选自氢和甲基；E′和E″的选择使得至少存在一个(低级烷酰基)硫代基。
式IV中的优选非环氧-甾族化合物家族由式V表示：
Figure C0081981600451
更优选的式V化合物是1-乙酰基硫代-17α-(2-羧基乙基)-17β-羟基-雄-4-烯-3-酮内酯。
式IV中的另一种优选非环氧-甾族化合物家族由式VI表示：
更优选的式VI化合物包括以下化合物：
7α-乙酰基硫代-17α-(2-羧基乙基)-17β-羟基-雄-4-烯-3-酮内酯；
7β-乙酰基硫代-17α-(2-羧基乙基)-17β-羟基-雄-4-烯-3-酮内酯；
1α，7α-二乙酰基硫代-17α-(2-羧基乙基)-17β-羟基-雄-4，6-二烯-3-酮内酯；
7α-乙酰基硫代-17α-(2-羧基乙基)-17β-羟基-雄-1，4-二烯-3-酮内酯；
7α-乙酰基硫代-17α-(2-羧基乙基)-17β-羟基-19-去甲雄-4-烯-3-酮内酯；和
7α-乙酰基硫代-17α-(2-羧基乙基)-17β-羟基-6α-甲基雄-4-烯-3-酮内酯。
在式IV-VI中，式“烷基”包括含有1个至约8个碳原子的线性和分支烷基。“(低级烷酰基)硫代”包括式低级烷基 的基团。
特别感兴趣的是具有以下结构和正式名称的化合物螺内酯：
Figure C0081981600462
“螺内酯”：17-羟基-7α-巯基-3-氧-17α-孕-4-烯-21-羧酸γ内酯乙酸酯。
制备式IV-VI的化合物的方法描述于1961年12月12日授权的Cella等的美国专利3,013,012。螺内酯由G.D.Searle&Co.，Skokie，Illinois以商品名″ALDACTONE″出售，它是每片剂量为25mg，50mg和100mg的片剂。
固态形式的环氧-甾族醛固酮受体拮抗剂
醛固酮拮抗剂可以以其任意固态形式给药，可以作为一种或多种固态形式本身，或作为包含一种或多种固态形式的醛固酮拮抗剂的药物组合物。新型的固态形式包括，但不限于，溶剂化的晶形、非溶剂化的晶形、以及无定形形式。然而，出于说明的目的，以下讨论集中于固态形式的环氧-甾族化合物。
在一种实施方案中，根据本发明的方法给药的环氧-甾族化合物是一种非溶剂化依普利农的晶形，其X线粉末衍射图样见下文中的表1A(此处称作“高熔点多晶型物”或“H型”)。
在本发明的另一种实施方案中，根据本发明的方法给药的依普利农是一种非溶剂化的依普利农晶形，其X线粉末衍射图样见下文中的表1B(此处称作“低熔点多晶型物”或“L型”)。
未经制剂化的H型在较低的温度(即后面所讨论的低于对映性转变温度的温度)表现出比例如未制剂化的L型更快的溶解速度(大约高30％)。由于依普利农在胃肠道中的溶解是依普利农向靶细胞递送的限速步骤，更快的溶解一般导致生物利用度的改进。因此，H型可以提供相对于L型的改进的生物利用度特征。此外，选择溶解速度更快的固态形式的依普利农同样与在其它溶解速度较慢的固态形式相比为立即释放的药物组合物制剂中提供了选择赋形剂的灵活性。
L型在较低的温度下(即低于后面所讨论的对映性转变温度的温度)比例如H型具有更大的物理稳定性，例如L型等固态形式的依普利农不要求使用特殊的加工和储存条件，不需要经常变动储存的位置，这是理想的。例如，在生产过程中(例如在研磨依普利农以获得粒度减小和表面积增加的材料时)选择物理稳定的固态形式的依普利农可以避免对特殊加工条件和一般与这种特殊加工条件相关的成本增加的需要。同样，选择在不同储存条件下物理稳定的固态形式的依普利农(特别时考虑到依普利农产品有效期中不同的储存条件)可以有助于避免导致产量损失或生产效率变坏的依普利农的多晶型性或其它降解改变。因此，选择具有更大的物理稳定性的例如L型的固态形式的依普利农提供了比稳定性较低的依普利农形式更大的益处。
在本发明的另一种实施方案中，根据本发明的方法给药的依普利农是一种依普利农的溶剂化的晶形。优选地，溶剂化的晶形基本排除不可药用的溶剂。因为H型和L型在室温和大气压下一般比晶体的溶剂合物更具有物理稳定性，用于这些组合物的溶剂化晶形一般含有可药用的沸点更高的和/或具有氢键的溶剂，例如，但不限于丁醇。确信溶剂化的晶形总体上可以提供一定范围的不同溶解速度，并且当在胃肠道中的溶解为依普利农向靶细胞递送的限速步骤时，可提供相当于H型和L型的生物利用度。
在本发明的另一种实施方案中，根据本发明的方法给药的依普利农是一种无定形的依普利农。假定无定形的依普利农具有不同的溶解速度，并且当在胃肠道中的溶解为依普利农向靶细胞递送的限速步骤时，可提供相当于H型和L型的生物利用度。
在另一种实施方案中，根据本发明的方法给药的依普利农是包含第一种固态形式的依普利农和第二种固态形式的依普利农的组合。一般地，第一和第二种固态形式的依普利农选自H型、L型、溶剂化的依普利农和无定形的依普利农。这些组合可以进一步包含其它的固态形式的依普利农，并且可以用于例如，制备具有不同溶解特征的药物组合物，包括控释组合物。总的说来，所述第一种固态形式与所述第二种固态形式的重量比优选至少为约1∶9，更优选至少约1∶1，更优选至少约2∶1，更优选至少约5∶1，更优选至少约9∶1。
在另一种实施方案中，依普利农以药物组合物的形式给药，其中包含在组合物中的所有量的依普利农以纯相的H型存在。
在另一种实施方案中，依普利农以药物组合物的形式给药，其中包含在组合物中的所有量的依普利农以纯相的L型存在。
在另一种实施方案中，依普利农以药物组合物的形式给药，其中包含在组合物中的所有量的依普利农以纯相的溶剂化晶体依普利农存在。
在另一种实施方案中，依普利农以药物组合物的形式给药，其中包含在组合物中的所有量的依普利农以无定形依普利农存在。
在另一种实施方案中，依普利农以药物组合物的形式给药，其中该组合物包含第一种固态形式的依普利农和第二种固态形式的依普利农，第一和第二种固态形式的依普利农选自H型、L型、溶剂化的依普利农和无定形的依普利农。总的说来，所述第一种固态形式与所述第二种固态形式的重量比优选至少为约1∶9，更优选至少约1∶1，更优选至少约2∶1，更优选至少约5∶1，更优选至少约9∶1。
在另一种实施方案中，依普利农以药物组合物的形式给药，其中该组合物包含H型和L型。组合物中L型与H型的量比一般为约1∶20-约20∶1。在其它实施方案中，该比例例如时为约10∶1-1∶10；约5∶1-约1∶5；约2∶1-约1∶2；或约1∶1。
尽管上述实施方案的每一种都可以包括给予依普利农粒度范围很宽的固态形式的依普利农，已经发现固态形式的依普利农的选择和依普利农粒度的减少的偶联可以改善未经制剂化的依普利农和包含这种固态形式的依普利农的药物组合物的生物利用度。
在一种实施方案中，未制剂化的依普利农或用作药物组合物中的原料的依普利农的D90粒度一般小于约400微米，优选小于约200微米，更优选小于约150微米，更优选小于约100微米，更优选小于约90微米。在另一种实施方案中，D90粒度为约40-100微米。在另一种实施方案中，D90粒度为约30-50微米。在另一种实施方案中，D90粒度为约50-150微米。在另一种实施方案中，D90粒度为约75-125微米。
在一种实施方案中，未制剂化的依普利农或用作药物组合物中的原料的依普利农的D90粒度小于约15微米，优选小于约1微米，更优选小于约800纳米，更优选小于约600纳米，更优选小于约400纳米。在另一种实施方案中，D90粒度为约10纳米-1微米。在另一种实施方案中，D90粒度为约100-800纳米。在另一种实施方案中，D90粒度为约200-600纳米。在另一种实施方案中，D90粒度为约400-800纳米。
粒度小于约15微米的固态形式的依普利农可以根据本领域抑制的适当的粒度减小技术制备。这种技术包括，但不限于描述于美国专利5,145,684，5,318,767，5,384,124和5,747,001的技术。在此特别全文引入美国专利5,145,684，5,318,767，5,384,124和5,747,001作为参考。例如，根据美国专利5,145,684，适当粒度可以如此制备，将依普利农分散于液体分散介质并且在研磨介质存在下对混合物进行湿研磨，从而将颗粒减小至需要的粒度。如果需要或有利，可以在表面改性剂存在下减小粒度。
固态定义
应用于依普利农的名词“无定形”表示一种固态，其中依普利农分子以无序的排列存在，并且不形成一种可区别的晶格或晶胞。当进行X线粉末衍射时，无定形的依普利农不产生任何的特征性结晶峰。
在本申请中用到的物质或溶液的“沸点”是指在适用的加工条件下的物质或溶液的“沸点”。
用于依普利农的“晶形”是指一种固态形式，其中依普利农分子排列成一种可区别的晶格，它(i)包含可区别的晶胞，并且(ii)当接受X线辐射时产生衍射峰。
用于本申请的“结晶”可以指结晶和/或重结晶，这取决于涉及依普利农原料制备中的适用环境。
“消化”表示一种方法，其中在适用的加工条件下，在溶剂或溶剂混合物的沸点下加热溶剂或溶剂混合物中的固体依普利农浆液。
这里用到的“直接结晶”是指依普利农从适当的溶剂的直接结晶，而没有依普利农的中间溶剂化结晶固态形式的形成和去溶剂化。
这里用到的“粒度”是指由本领域公知的常规粒度测量技术测量得到的颗粒大小，所述技术例如激光散射、沉淀场流分级法、光子相关光谱、或盘式离心。
“D90粒度”表示由这些常规粒度测量技术测量得到的至少90％的颗粒的粒度。
“纯度”表示常规HPLC测定所测得的依普利农的化学纯度。这里用到的“低纯度依普利农”一般表示含有有效量的H型生长促进剂和/或L型生长抑制剂的依普利农。这里用到的“高纯度依普利农”一般表示不含或含有少于有效量的H型生长促进剂和/或L型生长抑制剂的体普利农。
“纯相度”表示特定晶体或无定形形式的依普利农的固态纯度，这是由这里所描述的红外光谱分析方法所测定的。
“XPRD”表示X线粉末衍射。
“Tm”表示熔解温度。
固态形式的特征
1.分子构象
单晶X线分析表明依普利农分子构象在H型和L型之间变化，具体是关于甾环的第7位的酯基的取向。酯基的取向可以由C8-C7-C23-02扭转角限定。
在H型晶格中，依普利农分子采用一种构象，其中酯的甲氧基大约与第7位的C-H键排成一行，羰基大约位于B甾环的中心。此构象中的C8-C7-C23-02扭转角大约为-73.0°。在此取向中，酯基的羰基氧原子(01)与9，11-环氧化合物环的氧原子(04)紧密接触。01-04距离为约2.97埃，这刚刚低于范得华氏接触距离3.0埃(假定氧的范得华氏半径为1.5埃)。
在L型晶格中，依普利农分子采用一种构象，其中酯基相对于H型的酯基旋转了大约150°，并且C8-C7-C23-02扭转角大约为+76.9°。在此取向中，酯的甲氧基直接指向A甾环的4，5-烯片段。在此取向中，酯基的任一氧原子(01，02)与9，11-环氧化合物环的距离相对于H型中测定的距离有所增加。02-04距离为约3.04埃，这刚刚高于范得华氏接触距离。01-04距离为约3.45埃。
在目前通过单一晶体X线衍射分析的溶剂化的晶形中，依普利农分子似乎采用L型的特征性构象。
2.X线粉末衍射
用Siemens D5000粉末衍射计或Inel Multipurpose粉末衍射计分析依普利农的各种晶形。对于Siemens D500粉末衍射计，测量2q值为2-50的原始数据，步进为0.020，步进期为2秒。对于InelMultipurpose粉末衍射计，将样品置于铝制样品容器中并且在30分钟内同时在所有两个θ值收集原始数据。
表1A，1B和1C分别说明了以2q值表示的主峰的主要参数以及依普利农的H型(通过将消化低纯度依普利农得到的乙醇溶剂合物去溶剂化而制备)、L型(通过将重结晶高纯度依普利农得到的甲基乙基酮溶剂合物去溶剂化而制备)、以及甲基乙基酮溶剂合物(通过在甲基乙基酮中对高纯度依普利农进行室温浆液转化而制备)晶形的强度(波长为1.54056埃的X线辐射)。
由于H型和L型的生产途径(即对溶剂合物的去溶剂化)而导致的晶体衍射平面上距离的非理想性，在H型和L型的衍射图样中可以存在峰定位的微小移动。此外，从消化粗依普利农而制备的溶剂合物中分离H型。这种方法产生导致H型的更低的总体化学纯度(大约90％)。最终，预计依普利农的溶剂化形式在衍射峰的定位上会表现出一些移动，这是因为在晶格中的溶剂通道内溶剂分子迁移率的增加。
      表1A：H型数据
  2-θ角   d-距离埃   强度   强度％
  6.994   12.628  1188   7.2
  8.291   10.655  2137   13
  10.012   8.827  577   3.5
  11.264   7.849  1854   11.3
  12.04   7.344  7707   46.8
  14.115   6.269  3121   19
  14.438   6.13  15935   96.8
  15.524   5.703  637   3.9
  16.169   5.477  1349   8.2
  16.699   5.305  1663   10.1
  16.94   5.23  1692   10.3
表1A：H型数据
  2-θ角   d-距离埃   强度   强度％
  17.147   5.167  2139   13
  17.66   5.018  6883   41.8
  17.91   4.949  16455   100
  18.379   4.823  3106   18.9
  18.658   4.752  1216   7.4
  19.799   4.48  1499   9.1
  20.235   4.385  383   2.3
  21.707   4.091  1267   7.7
  21.8   4.073  1260   7.7
  21.959   4.044  1279   7.8
  22.461   3.955  4264   25.9
  23.191   3.832  1026   6.2
  23.879   3.723  1000   6.1
  24.599   3.616  1688   10.3
  25.837   3.445  931   5.7
  26.034   3.42  686   4.2
  26.868   3.316  912   5.5
  27.093   3.288  1322   8
  27.782   3.209  1236   7.5
  28.34   3.147  1845   11.2
  28.861   3.091  957   5.8
  29.866   2.9892  745   4.5
  30.627   2.9166  992   6
  31.108   2.8726  1205   7.3
  33.215   2.6951  1287   7.8
  33.718   2.656  802   4.9
  34.434   2.6024  914   5.6
表1B：L型数据
  2-θ角   d-距离埃   强度   强度％
  7.992   11.054  11596   26.6
  10.044   8.799  12048   27.6
  11.206   7.889  4929   11.3
  12.441   7.109  1747   4
  12.752   6.936  4340   9.9
  13.257   6.673  2444   5.6
  14.705   6.019  43646   100
  15.46   5.727  2670   6.1
  15.727   5.63  7982   18.3
  16.016   5.529  3519   8.1
  17.671   5.015  8897   20.4
  17.9   4.951  2873   6.6
  18.352   4.83  612   1.4
表1B：L型数据
  2-θ角   d-距离埃   强度   强度％
  18.703   4.74   689   1.6
  19.524   4.543   1126   2.6
  20.103   4.413   3753   8.6
  20.63   4.302   1451   3.3
  21.067   4.214   876   2
  21.675   4.097   2760   6.3
  22.232   3.995   1951   4.5
  22.652   3.922   1657   3.8
  23.624   3.763   827   1.9
  24.279   3.663   1242   2.8
  25.021   3.556   5144   11.8
  25.485   3.492   1702   3.9
  25.707   3.463   2493   5.7
  26.251   3.392   1371   3.1
  26.85   3.318   1970   4.5
  27.319   3.262   1029   2.4
  27.931   3.192   440   1
  27.969   3.187   440   1
  28.937   3.083   1128   2.6
  29.703   3.005   1211   2.8
  30.173   2.9594   1506   3.5
  30.584   2.9206   1602   3.7
  30.885   2.8928   1550   3.6
  31.217   2.8628   1068   2.4
  31.605   2.8285   1038   2.4
  32.059   2.7895   1211   2.8
  32.64   2.7412   684   1.6
  32.747   2.7324   758   1.7
  33.46   2.6759   506   1.2
  34.194   2.6201   1085   2.5
  34.545   2.5943   915   2.1
表1C：甲基乙基酮数据
  2-θ角   d-距离埃   强度   强度％
  7.584   11.648   5629   32.6
  7.753   11.393   15929   92.3
  10.151   8.707   2877   16.7
  11.31   7.817   701   4.1
  12.646   6.994   1027   5.9
  13.193   6.705   15188   88
  13.556   6.526   14225   82.4
  14.074   6.287   1966   11.4
  14.746   6.002   2759   16
  15.165   5.837   801   4.6
  15.548   5.694   1896   11
  17.031   5.202   7980   46.2
  17.28   5.127   17267   100
  17.706   5.005   6873   39.8
  18.555   4.778   545   3.2
  18.871   4.699   1112   6.4
  19.766   4.488   1704   9.9
  20.158   4.401   1396   8.1
  20.725   4.282   2644   15.3
  21.787   4.076   1127   6.5
  22.06   4.026   451   2.6
  22.864   3.886   1542   8.9
  23.412   3.796   14185   82.2
  23.75   3.743   1154   6.7
  24.288   3.662   3063   17.7
  25.253   3.524   1318   7.6
  25.503   3.49   1736   10.1
  25.761   3.455   1225   7.1
  26.176   3.402   1346   7.8
  26.548   3.355   1098   6.4
  27.357   3.257   1944   11.3
  27.605   3.229   2116   12.3
  27.9   3.195   858   5
  28.378   3.142   583   3.4
  28.749   3.103   763   4.4
  29.3   3.046   1182   6.8
  29.679   3.008   2606   15.1
  30.402   2.9377   2184   12.6
  30.739   2.9063   648   3.8
依普利农的H型、L型和甲基乙基酮溶剂合物晶形的X线衍射图样的图例分别见图1-A，1-B，和1-C。H型表现出在7.0±0.2，8.3±0.2和12.0±0.2的2θ度数时具有可区别的峰。L型表现出在8.0±0.2，12.4±0.2，12.8±0.2和13.3±0.2的2θ度数时具有可区别的峰。甲基乙基酮溶剂化的结晶形式表现出在7.6±0.2，7.8±0.2和13.6±0.2的2θ度数时具有可区别的峰。
3.熔解/分解温度
用TA Instruments 2920示差扫描量热法测定非溶剂化的依普利农晶形的熔解和/或分解温度。将每种样品(1-2mg)置于密封或未密封的铝盘中，并且以10℃/分加热。从熔解/分解吸热线的开始外推至最大值，从而确定熔解/分解范围。
非溶剂化的依普利农晶形的熔解(H型和L型)与化学分解和晶格中丢失捕获的溶剂相关。熔解/分解温度也受分析前固体操作的影响。例如，通过从适当溶剂直接结晶或由适当溶剂或溶剂混合物中的高纯度依普利农结晶获得的溶剂合物去溶剂化制备的未研磨的L型(D90粒度大约为180-450微米)的熔解范围一般为约237-242℃。研磨的L型(D90粒度大约为80-100微米)(从适当溶剂或溶剂混合物中的高纯度依普利农溶液中结晶溶剂合物，对该溶解合物进行去溶剂化产生L型，并且研磨得到的L型而制备的L型)一般具有更低和更宽的熔解/分解范围，即223-234℃。通过将消化低纯度依普利农得到的溶剂合物进行去溶剂化而制备的未研磨的H型(D90粒度大约为180-450微米)具有更高的熔解/分解范围，即247-251℃。图2-A，2-B，2-C和2-D分别显示了(a)从甲基乙基酮直接结晶的未研磨的L型，(b)通过对从甲基乙基酮得到的高纯度依普利农结晶获得的溶剂合物进行去溶剂化而制备的未研磨的L型，(c)通过对从甲基乙基酮得到的高纯度依普利农结晶获得的去溶剂化的溶剂合物进行研磨而制备的研磨的H型，和(d)通过对从甲基乙基酮得到的低纯度依普利农结晶获得的溶剂合物进行去溶剂化而制备的未研磨的H型的DSC热像图的例子。
用Perkin Elmer Pyris 1示差扫描量热法测量溶剂化形式的依普利农的DSC热像图。将每种样品(1-10mg)置于未密封的铝盘中并以10℃/分加热。在较低温度下发生的一种或多种吸热事件与溶剂从溶剂合物晶格中的丢失时发生的焓改变相关。最高温度吸热线与L型或H型依普利农的熔解/分解相关。
4.红外吸收光谱
用Nicolet DRIFT(漫反射比红外傅立叶变换)Magna***550分光光度计获得非溶剂化形式的依普利农的红外吸收光谱。采用Spectra-Tech收集器***和微量样品杯。在溴化钾中分析样品(5％)，并且在400-4000cm-1进行扫描。用Bio-rad FTS-45分光光度计获得在稀释的氯仿溶液(3％)中或溶剂化的结晶形式的依普利农的红外吸收光谱。用具有氯化钠盐板的0.2mm径长的溶液隔室分析氯仿溶液样品。用IBM微MIR(多路内部反射比)附件采集溶剂合物FTIR光谱。在400-4000cm-1扫描样品。图3-A，3-B，3-C和3-D分别表示(a)H型，(b)L型，(c)甲基乙基酮溶剂合物，和(d)氯仿溶液中的依普利农的红外吸收光谱。
表2公开了H型、L型以及甲基乙基酮溶剂合物晶形的依普利农的示例性吸收带。也公开了氯仿溶液中的依普利农的吸收带作为比较。在例如光谱的羰基区观察到了H和L型或甲基乙基酮溶剂合物之间的差异。H型的酯羰基伸缩振动为大约1739cm-1，而L型和甲基乙基酮溶剂合物的相应伸缩振动分别为大约1724和1722cm-1。氯仿溶液中的依普利农的酯羰基伸缩振动为大约1727cm-1。H型和L型之间酯羰基伸缩振动频率的改变反应了两种晶型之间酯基取向的改变。此外，A甾环中共轭的酮的酯伸缩振动从H型或甲基乙基酮溶剂合物中的大约1664-1667cm-1改变为L型中的1655cm-1。稀释溶液中的对应羰基伸缩振动的发生在大约1655cm-1。
H型和L型之间的另一种差异发现于C-H弯曲区。H型在大约1399cm-1，而在H型、甲基乙基酮溶剂合物、或氯仿溶液中的依普利农则没有观察到。1399cm-1伸缩振动发生在临近于羰基的C2和C21亚甲基的CH2剪切区。
表2
  吸收区   H型(cm-1)   L型(cm-1)   甲基乙基酮溶剂合物(cm-1)   氯仿中的依普利农(cm-1)
  νC＝O(内酯)   1773   1775   1767   1768
  νC＝O(酯)   1739   1724   1722   1727
  νC＝O(3酮)   1664   1655   1667   1665
  νC＝C(3，4-烯烃)   1619   1619   1622   1623
  δasCH3，δCH2，δCH2(α至羰基)   1460，1444，1426   1467，1438，1422，1399   1467，1438，1422   1464，1438，1422
  δsCH3   1380   1381   ～1380   1378
5.核磁共振
在31.94MHz的磁场中获得13C NMR光谱。H型和L型依普利农的13C NMR光谱的例子分别见图4和图5。图4中反映的经分析获得的H型依普利农的数据不是纯相的，包括小量L型依普利农。通过在大约64.8ppm，24.7ppm和19.2ppm处的碳共振可以最清楚地区分H型。通过在大约67.1ppm和16.0ppm处的碳共振可以最清楚地区分L型。
6.热重量分析法
用TA Instruments TGA 2950热重量分析仪进行溶剂合物的热重量分析。在氮吹扫下将样品置于未密封的铝盘中。起始温度为25℃，温度以10℃/分的速度增加。甲基乙基酮的热重量分析图形的例子见图6-A。
7.晶胞参数
下面的表3A，3B和3C概括了对H型、L型和一些溶剂化的晶型的晶胞参数。
表3A
  参数   H型   L型   甲基乙基酮溶剂合物
  晶系   正交的   单斜的   正交的
  晶架群   P212121   P21   P212121
  a   21.22   8.78   23.53
  b   15.40   11.14   8.16
  c   6.34   11.06   13.08
  α   90°   90°   90°
  β   90°   93.52°   90°
  γ   90°   90°   90°
  Z   4   2   4
  体积()   2071.3   1081.8   2511.4
  ρ(计算的)   1.329g/cm3   1.275g/cm3   1.287g/cm3
  R   0.0667   0.062   0.088
表3B
  参数   丙酮溶剂合物   甲苯溶剂合物   乙酸丁酯溶剂合物1
  晶系   正交的   正交的   正交的
  晶架群   P212121   P212121   P212121
  a   23.31   23.64   23.07
  b   13.13   13.46   13.10
  c   8.28   8.16   8.24
  α   90°   90°   90°
  β   90°   90°   90°
  γ   90°   90°   90°
  Z   4   4   4
  体积()   2533.7   2596.6   2490.0
  ρ(计算的)   1.239g/cm3   1.296g/cm3   1.334g/cm3
  R   0.058   0.089   0.093
1由于通道中的溶剂分子的无序，溶剂合物分子没有完全提纯
表3C
  参数   乙酸异丁酯溶剂合物1   异丙醇溶剂合物1   乙醇溶剂合物1
  晶系   正交的   正交的   正交的
  晶架群   P212121   P212121   P212121
  a   23.19   23.15   23.51
  b   12.95   12.73   13.11
  c   8.25   8.25   8.27
  α   90°   90°   90°
  β   90°   90°   90°
  γ   90°   90°   90°
  Z   4   4   4
  体积()   2476.4   2433.2   2548.6
  ρ(计算的)   1.337g/cm3   1.296g/cm3   1.234g/cm3
  R   0.098   0.152   0.067
1由于通道中的溶剂分子的无序，溶剂合物分子没有完全提纯
其它关于所选择的溶剂化的依普利农晶形的数据报道于下面的表4。前面表3A中报道的甲基乙基酮溶剂合物的晶胞数据也代表许多其它的依普利农结晶溶剂合物的晶胞参数。所检测的大多数依普利农结晶溶剂合物之间基本为同结构。尽管由于掺入的溶剂分子的大小不同使溶剂化的晶形之间可能存在X线粉末衍射的一些微小变动，总体的衍射图样基本相同，对于所测试的大多数溶剂合物来说，晶胞参数和分子位置基本相同。
表4
  溶剂   化学计量(溶剂：依普利农)   与甲基乙基酮溶剂合物同结构？   去溶剂化温度1(℃)
  甲基乙基酮   1∶1   N/A   89
  2-戊酮   ---   ---   ---
  乙酸   1∶2   是   203
  丙酮   1∶1   是   117
  乙酸丁酯   1∶2   是   108
  氯仿   ---   是   125
  乙醇   1∶1   是   166
  异丁醇   ---   ---   ---
  乙酸异丁酯   1∶2   是   112
  异丙醇   1∶1   是   121
  乙酸甲酯   1∶1   是   103
  丙酸乙酯   1∶1   是   122
  正丁醇   1∶1   是   103
  正辛醇   ---   是   116
  正丙醇   1∶1   是   129
  乙酸丙酯   1∶1   是   130
  丙二醇   ---   是   188
  叔丁醇   ---   ---   ---
  四氢呋喃   1∶1   是   136
  甲苯   1∶1   是   83
  乙酸叔丁酯   ---   是   109
1定义为从最后的溶剂重量损失步骤外推的去溶剂化温度，这是通过在氮吹扫下以10℃/分的加热速度进行的热重量分析法所测定的。然而，去溶剂化温度可以受溶剂合物生产方法的影响。不同的方法可以产生不同数量的成核位点，该位点可以在低温下起始溶剂合物的去溶剂化。
溶剂合物的晶胞由四个依普利农分子组成。许多溶剂合物的晶胞中的依普利农分子和溶剂分子的化学计量也报道于上表4。H型的晶胞由四个依普利农分子组成。L型的晶胞由两个依普利农分子组成。当依普利农分子进行平移和旋转以填充溶剂分子留下的空间时，溶剂合物晶胞在去溶剂化为H型和/或L型晶胞的过程中被改变。表4也报道了许多不同溶剂合物的去溶剂化温度。
8.杂质分子的晶体性质
所选择的依普利农中的杂质可以诱导溶剂合物的去溶剂化过程中H型的形成。具体地，评价了以下两种杂质分子的效果：7-甲基氢4α，5α:9α-双环氧-17-羟基-3-氧-17α-孕烷-7α，21-二羧酸酯，γ-内酯3(“双环氧化合物”)；和7-甲基氢11α，12α-环氧-17-羟基-3-氧-17α-孕-4-烯-7α，21-二羧酸酯，γ-内酯4(“11，12-环氧化合物”)。
Figure C0081981600612
这些由去溶剂化导致的杂质分子对依普利农晶体形成的作用在本申请的实施例中有更详细的描述。
由于7-甲基氢17-羟基-3-氧-17α-孕-4，9(11)-二烯-7α，21-二羧酸酯，γ-内酯5(“9，11-烯烃”)和H型的相似性，假设9，11-烯烃也可以诱导溶剂合物去溶剂化过程中H型的形成。
可以分别按照Ng等的WO98/25948的实施例47C，47B和37H中的阐述制备双环氧化合物、11，12-烯烃和9，11-烯烃。
可以从每个杂质化合物分离单晶形。从双环氧化合物、11，12-环氧化合物和9，11-烯烃分离的晶形的代表型X线粉末衍射图样分别见图7、8和10。每种杂质分子的X线粉末衍射图样与H型的X线粉末衍射图样相似，提示H型和三种杂质化合物具有相似的单晶结构。
也分离了每种杂质化合物的单晶，并进行X线结构测定，以证实这三种化合物采用与H型相似的单晶结构。从甲基乙基酮中分离双环氧化合物的单晶。从异丙醇中分离11，12-环氧化合物的单晶。从正丁醇中分离9，11-烯烃的单晶。所测定的每种杂质化合物晶形的晶体结构数据见表5。所得到的H型、双环氧化合物和9，11-烯烃晶形的晶系和晶胞参数基本相同。
表5
  参数   H型   双环氧化合物 11，12环氧化合物  9，11烯烃
  晶系   正交的   正交的   正交的   正交的
  晶架群   P212121   P212121   P212121   P212121
  a   21.22   21.328   20.90   20.90
  b   15.40   16.16   15.55   15.74
  c   6.34   6.15   6.38   6.29
  α   90°   90°   90°   90°
  β   90°   90°   90°   90°
  γ   90°   90°   90°   90°
  Z   4   4   4   4
  体积()   2071.3   2119.0   2073.2   2069.3
  ρ(计算的)   1.329g/cm3   1.349g/cm3   1.328g/cm3   1.279g/cm3
  R   0.0667   0.0762   0.0865   0.0764
表5中报道的四种化合物结晶至相同的晶架群，并具有相似的晶胞参数(即，它们是等结构的)。假定双环氧化合物、11，12-环氧化合物和9，11-烯烃采用H型构象。从每种杂质化合物分离H型填充物(直接从溶液中分离)相对容易，这表示H型晶格对于这一系列结构相似的化合物是一种稳定的填充模式。
依普利农的制备
用于制备本发明的新的晶形的依普利农原料可以用描述于Ng等的WO97/21720；以及Ng等的WO98/25948中的方法制备，特别是WO97/21720和WO98/25948中的方案1中阐述的方法。
晶形的制备
1.溶剂化晶形的制备
依普利农的溶剂化晶形可以通过从适当的溶剂或适当溶剂的混合物中结晶依普利农而制备。适当的溶剂或适当溶剂的混合物一般包括有机溶剂或有机溶剂的混合物，它们在升高的温度下溶解依普利农和任意杂质，但在冷却时优先结晶溶剂合物。依普利农在这些溶剂或溶剂混合物中的溶解度在室温下一般为约200mg/mL。溶剂或溶剂化合物优选选自前面制备依普利农原料所使用的溶剂，如果包含在含有依普利农晶形的最终药物组合物中，则优选可药用的溶剂。例如，产生包含二氯甲烷的溶剂合物的包含二氯甲烷的溶剂***一般是不理想的。
所使用的溶剂优选是可药用溶剂，特别是″Impurities：Guideline For Residual Solvents″，International Conference OnHarmonisation Of Technical Requirements For Registration OfPharmaceuticals For Human Use(Recommended for Adoption atStep 4 of the ICH Process on July 17，1997 by the ICH SteeringCommittee)中所定义的2类或3类溶剂。更优选地，溶剂或溶剂混合物选自甲基乙基酮、1-丙醇、2-戊酮、乙酸、丙酮、乙酸丁酯、氯仿、乙醇、异丁醇、乙酸异丁酯、乙酸甲酯、丙酸乙酯、正丁醇、正辛醇、异丙醇、乙酸丙酯、丙二醇、叔丁醇、四氢呋喃、甲苯、甲醇和乙酸叔丁酯。更优选地，溶剂选自甲基乙基酮和乙醇。
为制备溶剂化的依普利农晶形，在一定体积的溶剂中溶解一定量的依普利农原料，冷却至形成晶体。将依普利农加入时的溶剂温度一般将根据溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线而选择。例如，对于此处描述的大多数溶剂，溶剂温度一般至少为约25℃，优选为约30℃至溶剂的沸点，更优选为溶剂沸点以下约25℃至溶剂的沸点。
作为选择，可以向依普利农加入热溶剂，并且可以冷却混合物直到形成晶体。将溶剂加入依普利农时溶剂的温度可以根据溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线而选择。例如，对于此处描述的大多数溶剂，溶剂温度一般至少为约25℃，优选为约50℃至溶剂的沸点，更优选为溶剂沸点以下约15℃至溶剂的沸点。
与一定体积的溶剂混合的依普利农原料的量同样将取决于溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线。一般地，加入到溶剂中的依普利农量在室温下不能完全溶解于该体积的溶剂中。例如，对于此处描述的大多数溶剂，与给定体积的溶剂混合的依普利农原料的量为在室温下将溶解于该体积的溶剂的依普利农量的至少约1.5至约4倍，优选约2.0至约3.5倍，更优选约2.5倍。
在依普利农原料完全溶解于溶剂中后，一般缓慢冷却溶液，以便结晶溶剂化的依普利农晶形。例如，对于这里描述的大多数溶剂，该溶液以低于约20℃/分或更低的速度冷却，优选以约10℃/分或更低的速度冷却，更优选以约5℃/分或更低的速度冷却，更优选以约1℃/分或更低的速度冷却。
收获溶剂化的晶形的终点温度将取决于溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线。例如，对于这里描述的大多数溶剂，终点温度一般为低于约25℃，优选低于约5℃，更优选低于约-5℃。降低终点温度一般将有利于形成溶剂化的晶形。
此外，可以用其它技术制备溶剂合物。这些技术的例子包括，但不限于，(i)将依普利农原料溶解于一种溶剂，并加入共溶剂以帮助溶剂合物晶形的结晶，(ii)溶剂合物的蒸汽扩散生长，(iii)通过蒸发，例如旋转蒸发分离溶剂合物，和(iv)浆液转化。
按前述方法制备的溶剂化的晶形的晶体可以通过适当的常规方法从溶剂中分离，例如通过过滤和离心。结晶过程中对溶剂***增加搅拌一般导致更小的晶体粒度。
2.从溶剂合物制备L型
L型依普利农可以通过去溶剂化直接从溶剂化的晶形制备。可以通过任何适当的去溶剂化方法完成去溶剂化，例如，但不限于加热溶剂合物、降低溶剂合物周围的环境压力，或其组合。如果加热溶剂合物以去除溶剂，例如在烤箱中加热，此过程中溶剂合物的温度一般不超过H型和L型的对映性转变温度。该温度优选不超过约150℃。
去溶剂化的压力和时间并不是非常关键。去溶剂化压力优选为约1个大气压或更低。然而，当去溶剂化压力降低时，可以进行去溶剂化的温度降低和/或去溶剂化的时间同样减少。特别是对于具有更高去溶剂化温度的溶剂合物，在真空下干燥将允许使用更低的干燥温度。去溶剂化的时间仅仅需要足够允许去溶剂化并由此形成L型，以达到完成。
为保证制备物中所包含的基本都是L型的产品，依普利农原料是高纯度依普利农，优选基本为纯依普利农。用于制备L型的依普利农原料一般为至少90％纯，优选至少95％纯，更优选至少99％纯。正如本申请中其它部分所详细讨论的，依普利农原料中的某些杂质可以对产率和从该过程得到的产品的L型含量造成不良影响。
用此方法从高纯度依普利农原料制备的结晶依普利农产品一般包含至少10％的L型，优选至少50％的L型，更优选至少75％的L型，更优选至少90％的L型，更优选至少约95％的L型，更优选基本为纯相的L型。
3.从溶剂合物制备H型
可以通过(i)用低纯度的依普利农原料代替高纯度的依普利农原料，(ii)用纯相的H型晶体作为溶剂***中的晶种，或(iii)结合(i)和(ii)，基本按照所阐述的制备L型的方法制备包含H型的产品。
A.用杂质作为生长促进剂和抑制剂
依普利农原料中所选择的杂质的存在和量，而不是依普利农原料中所有杂质的总量，影响溶剂合物的去溶剂化过程中H型晶体形成的可能。所选择的杂质一般是H型生长促进剂或F型生长促进剂。它可以包含在依普利农原料中，包含在加入依普利农原料之前的溶剂或溶剂混合物中，和/或在加入依普利农原料之后加入到溶剂或溶剂混合物中。Bonafede et al.：J Amer Chem Soc 1995；117：30讨论了在多晶型物***中使用生长促进剂和生长抑制剂，在此引入作为参考。对于本发明，杂质一般包含具有与H型的单晶结构基本相同的单晶结构的化合物。该杂质优选为具有与H型的X线粉末衍射图样相同的X线粉末衍射图样的化合物，更优选选自双环氧化合物、11，12-环氧化合物，9，11-烯烃及其组合。
制备H型需要的杂质量一般可以部分取决于溶剂或溶剂混合物和杂质相对于依普利农的溶解度。例如，在从甲基乙基酮中结晶H型的过程中，双环氧化合物与低纯度依普利农原料的重量比一般为至少约1∶100，优选至少约3∶100，更优选约3∶100-约1∶5，更优选约3∶100-约1∶10。11，12-环氧化合物在甲基乙基酮中的溶解度高于双环氧化合物，一般要求更大量的11，12-环氧化合物，它是制备H型晶体所必须的。当杂质包含11，12-环氧化合物时，双环氧化合物与低纯度依普利农原料的重量比一般为至少约1∶5，更优选至少约3∶25，更优选约3∶25-约1∶5。当制备H型晶体时同时使用了双环氧化合物和11，12-环氧化合物杂质时，每种杂质与依普利农原料的重量比可以低于当H型晶体的制备中仅使用杂质时的对应比。
当包含所选择的杂质的溶剂合物被去溶剂化时，一般获得了H型和L型的混合物。从溶剂合物的初始去溶剂化中得到的产品中的H型的重量比一般小于约50％。如下面所讨论的，通过结晶或消化对该产品的进一步处理一般将增加L型在产品中的重量比。
放入晶种
也可以通过在依普利农结晶之前将纯相的H晶体(或前面所讨论的H型生长促进剂和/或L型生长抑制剂)作为晶种放入溶剂***来制备H型晶体。依普利农原料可以是低纯度依普利农或高纯度依普利农。当从任意原料制备得到的溶剂合物被去溶剂化时，产品中的H型的重量比一般为至少约70％，并且可以高达约100％。
加入溶剂***的H型晶种与加入溶剂***的依普利农原料的重量比为至少约0.75∶100，优选约0.75∶100-约1∶20，更优选约1∶100-约1∶50。H型晶种可以通过本申请中H型晶体的制备中所讨论的方法制备，特别是下面所讨论的通过消化制备H型晶体。
H型晶种可以一次加入，多次加入或在一段时间中基本连续加入。然而，加入H型晶种一般在依普利农开始从溶液中结晶之前完成，即在达到浊点(亚稳态区的低端)之前完成放入晶种。放入晶种一般是当温度为高于浊点约0.5℃至高于浊点约10℃时进行，优选在高于浊点约2-3℃时进行。当加入晶种时的高于浊点的温度增加时，H型晶体结晶所需要的晶种量一般增加。
放入晶种优选不仅在高于浊点的温度进行，也在亚稳态区进行。浊点和亚稳态区都依赖于依普利农的溶解度和溶剂或溶剂混合物中的浓度。例如，对于甲基乙基酮的12体积稀释液，亚稳态区的高端一般为约70-73℃，低端(即浊点)一般为约57-63℃。对于甲基乙基酮的8体积浓度，压稳态区甚至更窄，这是因为溶液是过饱和的。在此浓度下，溶液的浊点发生在约75-约76℃。因为甲基乙基酮在环境条件下的沸点为约80℃，向该溶液中放入晶种一般发生在约76.5℃至沸点。
一种将H型作为晶种的说明性的非限制性实施例见下文中的实施例C-7。
用H型生长促进剂或L型生长抑制剂、和/或H型作为晶种所获得的结晶依普利农产品一般包含至少2％的H型，优选至少5％的H型，更优选至少7％的H型，更优选至少10％的H型。剩下的结晶依普利农产品一般是L型。
通过研磨依普利农制备的H型
在另一种选择中，发现小量H型可以通过适当研磨依普利农而制备。观察到经研磨的依普利农中的H型的浓度为约3％。
4.从低纯度依普利农制备的溶剂合物中制备L型
如前面所讨论的，通过结晶低纯度的依普利农以形成溶剂合物，然后对溶剂合物去溶剂化，一般产生包含H型和L型的产品。具有更高L型含量的产品可以从低纯度依普利农制备，其方式与前面所阐述的制备H型的方式基本相同，即在溶剂***中放入纯相的L型晶体作为晶种，或使用L型生长促进剂和/或H型生长抑制剂。放入晶种的方案和加入溶剂***的L型晶种量与加入溶剂***的依普利农原料的重量比一般与前面所讨论的通过放入纯相的H型晶体作为晶种而制备H型依普利农的该比例相同。
用此方法所制备的结晶依普利农产品一般包含至少10％的L型，优选至少50％的L型，更优选至少75％的L型，更优选至少90％的L型，更优选至少95％的L型，更优选基本为纯相的L型。
这部分和前一部分中描述的涉及制备H型依普利农的放入晶种的方案也可以允许对结晶依普利农的粒度大小进行改进控制。
5.从溶液直接结晶L型
L型依普利农也可以通过从适当的溶剂或溶剂混合物中直接结晶依普利农而制备，其中不形成中间溶剂合物并且不需要伴随的去溶剂化。一般地，(i)溶剂的分子大小与溶剂合物晶格中可得到的通道空间不相容，(ii)当温度升高时依普利农和任意杂质在溶剂中可溶，以及(iii)当冷却时，导致非溶剂化的L型依普利农的结晶。室温下，依普利农在溶剂中或溶剂混合物中的溶解度一般为大约5-200mg/mL。溶剂或溶剂混合物优选包含一种或多种选自甲醇、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙腈、硝基苯、水和乙基苯的溶剂。
为从溶液中直接结晶L型依普利农，将一定量的依普利农原料溶解于一定体积的溶剂中并冷却至形成晶体。将依普利农加入溶剂时溶剂温度的选择一般根据溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线而选择。例如，对于此处描述的大多数溶剂，该溶剂温度一般至少为约25℃，优选为约30℃至溶剂的沸点，更优选为溶剂沸点以下约25℃至溶剂的沸点。
作为选择，可以向依普利农加入热溶剂，并且可以冷却混合物直到形成晶体。将溶剂加入依普利农时溶剂的温度可以根据溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线而选择。例如，对于此处描述的大多数溶剂，溶剂温度一般至少为约25℃，优选为约50℃至溶剂的沸点，更优选为溶剂沸点以下约15℃至溶剂的沸点。
与一定量的溶剂混合的依普利农原料的量同样将取决于溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线。一般地，加入到溶剂中的依普利农量在室温下不能完全溶解于该体积的溶剂中。例如，对于此处描述的大多数溶剂，与给定体积的溶剂混合的依普利农原料的量为在室温下将溶解于该体积的溶剂的依普利农量的至少约1.5至约4倍，优选约2.0至约3.5倍，更优选约2.5倍。
为保证制备包含基本纯相的L型的产品，依普利农原料一般是高纯度依普利农，优选基本为纯依普利农。用于制备L型的依普利农原料一般为至少90％纯，优选至少95％纯，更优选至少99％纯。
在依普利农原料完全溶解于溶剂中后，一般缓慢冷却溶液，以便结晶溶剂化的依普利农晶形。例如，对于这里描述的大多数溶剂，该溶液优选以约1.0℃/分或更低的速度冷却，更优选以约0.2℃/分或更低的速度冷却，更优选以约5-0.1℃/分或更低的速度冷却。
收获L型的终点温度将取决于溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线。例如，对于这里描述的大多数溶剂，终点温度一般为低于约25℃，优选低于约5℃，更优选低于约-5℃。
此外，可以用其它技术制备L型晶体。这些技术的例子包括，但不限于，(i)将依普利农原料溶解于一种溶剂，并加入共溶剂以帮助L型依普利农结晶，(ii)L型依普利农的蒸汽扩散生长，(iii)通过蒸发，例如旋转蒸发分离L型依普利农，和(iv)浆液转化。
按前述方法制备的溶剂化的晶形的晶体可以通过适当的常规方法从溶剂中分离，例如通过过滤和离心。
此外，也可以通过在甲基乙基酮中消化高纯度依普利农的浆液(如下面的描述)并在浆液的沸点下过滤被消化的依普利农而制备L型依普利农。
6.从溶液中直接制备H型
假设在如果在H型和L型的对映性转变温度(Tt)之上进行结晶，特别是如果存在H型生长促进剂或L型生长抑制剂或将纯相H晶体作为晶种加入到溶剂中时，H型应该从溶液中直接结晶，这是因为H型在这些更高的温度下更稳定。采用的溶剂***优选包含高沸点溶剂如硝基苯。适当的H型生长促进剂应包括，但不限于，双环氧化合物和11，12-烯烃。
7.用溶剂消化依普利农
也可以通过在适当的溶剂或溶剂混合物中消化依普利农原料而制备溶剂化的晶形、H型和L型。在消化过程中，在溶剂或溶剂混合物的沸点下加热依普利农浆液。例如，将一定量的依普利农原料与一定体积的溶剂或溶剂混合物结合，加热或回流，当加入额外量的溶剂时同时去除馏出液。作为选择，可以浓缩馏出液，并且在消化过程中不加入更多溶剂的情况下再循环。一般地，一旦去除原始体积的溶剂或浓缩和再循环后，冷却浆液并且形成溶剂化的晶体形式。溶剂化的晶体可以通过任何适当的常规方法，例如通过过滤或离心从溶剂中分离。按前面所述对溶剂进行去溶剂化产生H型或L型，这取决于在溶剂化的晶体中是否存在所选择的杂质。适当的溶剂或溶剂混合物一般包含上文所公开的一种或多种溶剂。溶剂可以选自，例如甲基乙基酮和乙醇。
加入溶剂中的用于消化过程中的依普利农原料的量足够在溶剂或溶剂混合物的沸点下保持浆液(即，溶剂或溶剂混合物中的依普利农没有完全溶解)。说明性的值包括，但不限于，每4ml甲基乙基酮约1g依普利农，以及每8ml乙醇约1g依普利农。
一旦完成溶剂转换以使溶剂化的依普利农晶形结晶，一般则缓慢冷却溶液。例如，对于所检测的溶剂，该溶液以低于约20℃/分或更低的速度冷却，优选以约10℃/分或更低的速度冷却，更优选以约5℃/分或更低的速度冷却，更优选以约1℃/分或更低的速度冷却。
收获溶剂化的依普利农晶形的终点温度取决于溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线。例如，对于这里描述的大多数溶剂，终点温度一般为低于约25℃，优选低于约5℃，更优选低于约-5℃。
如果需要主要或只包含L型的产品，一般消化高纯度依普利农原料。高纯度依普利农原料优选为至少98％纯，更优选至少99％纯，更优选至少99.5％纯。用此方法所制备的消化的依普利农产品一般包含至少10％的L型，优选至少50％的L型，更优选至少75％的L型，更优选至少90％的L型，更优选至少95％的L型，更优选基本为纯相的L型。
如果需要主要或只包含H型的产品，一般消化低纯度依普利农原料。低纯度依普利农原料一般只需要足够产生H型的H型生长促进剂和L型生长抑制剂。以此方式制备的消化的依普利农产品一般包含至少10％的H型，优选至少50％的H型，更优选至少75％的H型，更优选至少90％的H型，更优选至少95％的H型，更优选基本为纯相的H型。
8.制备无定形的依普利农
无定形的依普利农可以用任何适当的固体依普利农粉碎方法进行少量制备，例如通过压碎、研磨和微粉化。
可以通过例如冻干依普利农溶液，特别是依普利农水溶液而制备纯相的无定形依普利农。这些方法说明于下面的实施例C-13和C-18。
剂量和治疗方法
醛固酮拮抗剂的给药量及本发明中的剂量方案依赖于多种因素，包括年龄、体重、性别、受试者的医学状况、致病作用的严重程度、给药途径和频率、以及应用的特定的醛固酮拮抗剂，因此变化范围很大。对受试者的每日给药剂量约为0.001-30mg/kg体重，优选约0.005-20mg/kg体重，更优选约0.01-15mg/kg体重，还更优选约为0.05-10mg/kg体重，最优选约为0.01-5mg/kg体重，这些都是合适的。对人类受试者的醛固酮拮抗剂给药量一般约为0.1-2000mg，优选约为0.5-500mg，更优选约为0.75-250mg，还更优选约为1-100mg。本发明中的方法也特别的包括基本上不产生利尿或抗高血压作用的醛固酮拮抗剂的每日剂量。每天可分1-4次来给予这些每日剂量。
可在对血压的测量或适当的替代指标(如利钠肽、内皮素和下文讨论的其他替代指标)基础之上确定和调节醛固酮拮抗剂的剂量。可将醛固酮拮抗剂给药后的血压和/或替代指标水平与给予醛固酮拮抗剂前相应的基线水平相比较，从而确定本发明中的方法的效力，如果需要可对其进行滴定。本发明中主要的有用替代指标是用于肾脏疾病和心血管疾病的替代指标。
一般而言，按照本发明，醛固酮在细胞内钠水平升高的个体(尤其是存在盐敏感和/或高钠摄取的人类受试者)中的致病性以及确定醛固酮拮抗剂的合适剂量最初要依赖于当时存在的病理。因此，最开始要对受试者进行高血压、微血管功能障碍、以及与微血管功能障碍相关的病理进行评估。相关的病理包括肾脏和心脏病理、神经病和视网膜病。
预防给药
在受试者易患致病作用的时期内，在对该致病作用进行诊断并继续给予醛固酮拮抗剂之前，预防性给予醛固酮拮抗剂是有益的，尤其是对那些在钠水平升高时的醛固酮介导的一或多种致病作用影响的受试者来讲是有益的。因此，可对不表现显著的临床症状但易患致病作用的个体给予醛固酮拮抗剂的预防剂量。这样的醛固酮拮抗剂预防剂量可以，但并非必须低于用于治疗特定致病作用的剂量。
高血压给药剂量
对于治疗具有盐敏感和/或高钠摄取的人类受试者的高血压来说，首先要在血压测定(袖带式水银血压计)的基础上将受试者分为血压正常、临界高血压或高血压受试者。例如，当受试者收缩压和舒张压分别为小于125mm Hg和小于80mm Hg时认为血压正常；当受试者收缩压和舒张压分别为125-140mm Hg和80-90mm Hg时可认为是临界高血压；当受试者收缩压和舒张压分别大于140mm Hg和大于90mm Hg时认为是高血压。当高血压的严重性增加时，醛固酮拮抗剂的给药剂量就要增加。在对给药后血压进行测量的基础上，对醛固酮拮抗剂的给药剂量进行滴定。在对个体对治疗效果的反应进行了最初的评价后，根据所要达到的血压降低效果相应地增加或减少给药剂量。
例如，可通过对收缩压进行监测来确定适当的给药剂量。如图10所示，依普利农剂量增加降低了收缩压。因此，按照本发明，可利用一种或多种醛固酮拮抗剂，以逐步增加这些化合物的剂量的方式对受试者进行治疗，直至收缩压降低到一个最低水平，然而，同时也要维持血清钾水平在正常范围之内。
同样的，可通过对舒张压进行监测来确定适当的给药剂量。如图11所示，依普利农剂量增加降低了舒张压。因此，按照本发明，可利用一或多种醛固酮拮抗剂，以逐步增加这些化合物的剂量的方式对受试者进行治疗，直至舒张压降低到一个最低水平，然而，同时也要维持血清钾水平在正常范围之内。
心血管疾病给药剂量
在对血液中利钠肽浓度进行测定的基础之上，可确定和调节用于治疗心血管功能病理的剂量。利钠肽是一组结构相似但遗传上有差别的肽，它们在心血管疾病、肾脏疾病和内分泌平衡中具有多种作用。心房利钠肽(″ANP″)和脑利钠肽(″BNP″)心肌细胞来源的，而C型利钠肽(″CNP″)是内皮来源的。ANP和BNP结合到利钠肽A受体(″NPR-A″)上，而利钠肽A受体是通过3′，5′-环鸟苷酸(cGMP)来介导尿钠增多、血管舒张、肾素抑制、抗有丝***以及松弛性等特性的。一般在存在血容量扩张或遭受血管损伤如急性心肌梗塞后的受试者身上可观察到升高的血利钠肽水平，尤其是血BNP水平，并且在急性心肌梗塞后这样的利钠肽水平升高还要持续一段时间。(Uusimaa et al.：Int.J.Cardiol 1999；69：5-14).
相对于基线水平，给予醛固酮拮抗剂前检测到的利钠肽水平下降表明醛固酮的病理作用减少，从而与病理作用抑制建立了联系。因此，可将血液中期望达到的利钠肽水平与给予醛固酮拮抗剂前的相应基线水平进行比较，从而确定本发明中的方法在治疗病理作用上的功效。在这些利钠肽水平测定基础之上，可对醛固酮拮抗剂的剂量进行调整以减少心血管的病理作用。
同样的，根据循环和尿cGMP水平，也可对心脏病理进行鉴定并确定合适的给药剂量。血浆cGMP水平升高往往伴随着平均动脉压降低。cGMP的尿***升高与尿钠***相关联。
心脏病理也可通过减少的射血分数或心肌梗塞出现或心衰或左室肥厚来鉴定。左室肥厚可通过超声心动图或磁共振成像来鉴定，并且左室肥厚可用于监测治疗进程和剂量的合适程度。
因此，在本发明的另一实施方案中，本发明中的方法可用于降低利钠肽水平，尤其是降低BNP水平，因此也可治疗相关的心血管疾病。
肾脏病理给药剂量
在对蛋白尿、微白蛋白尿、肾小球滤过率(GFR)减少或肌酸酐清除率减少进行测定的基础之上，可确定和调节用于治疗肾脏功能病理的给药剂量。通过对24小时内收集的尿中大于0.3g的尿蛋白出现来鉴定蛋白尿。通过可免疫检测的尿白蛋白浓度的升高来鉴定微白蛋白尿。在这些测定基础之上，可对醛固酮拮抗剂的给药剂量进行调整来减少肾脏的病理作用。
神经病病理给药剂量
在感觉缺陷神经检测或感觉的运动能力神经检测基础上，可鉴定神经病，尤其是周围神经病，并进行给药调整。
视网膜病变病理给药
可在眼科检查基础上对视网膜病变进行鉴定并调节给药剂量。
基于血浆肾素或血清醛固酮水平的给药剂量
一般而言，按照本发明，在最初的评估期(也即受试者接受最初每日剂量的一或多种醛固酮拮抗剂的时期)内，开始时一般要对接受治疗的受试者给予一定量的一或多种醛固酮拮抗剂。最初的评估期约为1-4周，优选约为持续1-2周。在最初的评估期后，采集血样和尿样进行常规评估(也即一般的血和尿化学)。如果不存在对剂量增加的禁忌症(如高钾血症)，必要时就要增加这一或多种醛固酮拮抗剂的每日剂量。
通过对血浆肾素活性进行监测也可确定合适的剂量。如图12所示，增加依普利农的剂量可使血浆肾素活性水平提高。因此，按照本发明，可利用一或多种醛固酮拮抗剂、以逐步增加这些化合物的剂量的方式对受试者进行治疗，直至获得所想要的血浆肾素水平，然而，同时也要维持血清钾水平在正常范围之内。
也可通过对血清醛固酮水平进行监测来确定合适的剂量。如图12所示，依普利农剂量增加可使血清醛固酮水平升高。因此，按照本发明，可利用一或多种醛固酮拮抗剂、以逐步增加这些化合物的剂量的方式对受试者进行治疗，直至获得所想要的血清醛固酮水平，然而，同时也要维持血清钾水平在正常范围之内。
药物组合物
可通过合适的给药途径如口服给药、或通过静脉内、肌内或皮下注射来进行给药。
对于口服给药来讲，药物组合物可以如片剂、胶囊、悬浮液或液体形式存在。药物组合物优选以含有特定量的活性成分的剂量单位形式来进行制备。这些剂量单位的示例为片剂或胶囊。依赖于受试者的情况和其他因素，对哺乳动物给药的每日剂量可变化很大。
同样的，活性成分可以组合物形式通过注射进行给药，其中，例如盐、右旋糖或水可作为合适的载体。这些制剂可以丸剂或含水或含水等渗无菌注射液或悬浮液的形式存在。结合一或多种润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂，可从含有一或多种可药用的载体或稀释剂、或粘合剂如明胶或羟丙基甲基纤维素的无菌粉末或颗粒来制备这些溶液和悬浮液。
术语″可药用的″在此处用做形容词，表示其所修饰的名词是适合用做药物产品的。可药用的阳离子包括金属离子和有机离子。更优选金属离子包括，但并不局限于合适的碱金属盐、碱土金属盐和其他生理上可接受的金属离子。代表性的离子包括正常价态的铝离子、钙离子、锂离子、镁离子、钾离子、钠离子和锌离子。优选有机离子包括质子化的叔铵和季铵离子，部分包括三甲胺、二乙胺、N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(正甲葡糖胺)和普鲁卡因。代表性的可药用的酸包括，但并不局限于盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、乙酸、甲酸、酒石酸、马来酸、苹果酸、柠檬酸、异柠檬酸、琥珀酸、乳酸、葡糖酸、葡萄糖醛酸、丙酮酸、草酰乙酸、延胡索酸、丙酸、谷氨酸、苯甲酸等。
当用于治疗目的时，本发明中的活性成分一般与适合于给定给药途径的一或多种佐剂结合使用。如果口服，这些化合物可与乳糖、蔗糖、淀粉粉末、链烷酸的纤维素酯、纤维素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠或钙盐、明胶、***胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、和/或聚乙烯醇混合，随后制成片剂或胶囊以方便给药。这样的胶囊或片剂可含有控制释放的制剂，这些控制释放的制剂可由羟丙基甲基纤维素中的活性化合物的分散来提供。用于肠胃外给药的制剂可以含水或含水等渗无菌注射液或悬浮液的形式存在。这些溶液和悬浮液可从具有一或多种在用于口服给药制剂中所提及的载体或稀释剂的粉末或颗粒进行制备。这些成分可溶解在水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉子油、花生油、芝麻油、苯甲醇、氯化钠、和/或多种缓冲液中。其他佐剂和给药方式在药物学领域中是广为人知的。
联合治疗
本发明中的方法可进一步包括对其他活性成分给药或与给予醛固酮拮抗剂相结合的治疗方法。
例如，与用于治疗高血压和相关的心血管和肾脏病情及紊乱的其他活性药物相结合，本发明中应用的醛固酮拮抗剂可用于对受试者给药。与醛固酮拮抗剂结合给药的活性药物包括，如选自由肾素抑制剂、血管紧张素II拮抗剂、ACE抑制剂、基本不具有醛固酮拮抗剂作用的利尿剂及视黄酸组成的组中的药物。当与药物结合相关时，在一种治疗方法中术语″联合治疗″(或″共治疗″)包括对每种药物以序贯方式进行给药，也包括以基本上是同时的方式对这些试剂结合给药，例如以含有固定比的这些活性剂的单个胶囊或注射液形式给药，或以多个、分开的胶囊或注射液形式对每种药物给药。
短语“血管紧张素II拮抗剂”包括，如在WO96/40257中描述过的血管紧张素II拮抗剂。
短语“血管紧张素转化酶抑制剂”(″ACE抑制剂″)包括一种试剂或化合物或两种或多种试剂或化合物的联合，它们具有部分或完全阻断从十肽形式的血管紧张素的(″血管紧张素I″)到血管收缩性八肽形式的血管紧张素(″血管紧张素II″)的酶转化的能力。阻断血管紧张素II的形成可去除血管紧张素II的主要作用，从而能影响流体和电解质平衡、血压及血容量的调节。刺激肾上腺皮质合成和分泌醛固酮受体及通过直接收缩小动脉平滑肌来升高血压都包括在血管紧张素II的主要作用之内。
可用于联合治疗的ACE抑制剂的示例包括，但并不局限于，下列化合物：AB-103、ancovenin、贝那普利、BRL-36378、BW-A575C、CGS-13928C、CL-242817、CV-5975、Equaten、EU-4865、EU-4867、EU-5476、foroxymithine、FPL 66564、FR-900456、Hoe-065、15B2、吲哚普利、酮甲基脲、KRI-1177、KRI-1230、L-681176、libenzapril、MCD、MDL-27088、MDL-27467A、莫维普利、MS-41、烟酰胺、喷托普利、非那卡因、匹伏普利、伦噻普利、RG-5975、RG-6134、RG-6207、RGH0399、ROO-911、RS-10085-197、RS-2039、RS 5139、RS 86127、RU-44403、S-8308、SA-291、螺普利拉、SQ-26900、SQ-28084、SQ-28370、SQ-28940、SQ-31440、Synecor、utibapril、WF-10129、Wy-44221、Wy-44655、Y-23785、Yissum P-0154、扎比普利、Asahi Brewery AB-47、alatriopril、BMS 182657、Asahi Chemical C-111、AsahiChemical C-112、Dainippon DU-1777、mixanpril、Prentyl、佐芬普利、1-(-(1-羧基-6-(4-哌啶基)己基)氨基)-1-氧代丙基八水-1H-吲哚-2-羧酸、Bioproject BP1.137、Chiesi CHF 1514、Fisons FPL-66564、idrapril、Marion Menell Dow MDL-100240、培哚普利拉和Servier S-5590、培哚普利拉、贝那普利、卡托普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、福森普利、咪达普利、赖诺普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、醋酸肌丙抗增压素、temocapril、群多普利、西那普利、莫昔普利、喹那普利和螺拉普利。
值得特别注意的一组ACE抑制剂包括阿拉普利、贝那普利、卡托普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、福森普利、咪达普利、赖诺普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、醋酸肌丙抗增压素、temocapril、群多普利、西那普利、莫昔普利、喹那普利和螺拉普利。
这些ACE抑制剂中很多都可经商业购得。例如，非常优选的ACE抑制剂卡托普利在现在为Bristol-Myers-Squibb的一部分的E.R.Squibb & Sons，Inc.，Princeton，N.J.有售，以商标″CAPOTEN″进行销售，并以每片12.5mg、50mg和100mg剂量的片剂剂型存在。依那普利或马来酸依那普利以及赖诺普利是Merck&Co，WestPoint，Pa.销售的两种非常优选的ACE抑制剂，依那普利的销售商标为VASOTEC，存在形式是每片2.5mg、5mg、10mg和20mg剂量的片剂剂型。赖诺普利的销售商标是PRINIVIL，存在形式是每片5mg、10mg、20mg和40mg剂量的片剂剂型。
利尿剂选自已知的几类，如噻嗪类及相关的磺胺类、保钾利尿剂、袢利尿剂和有机汞化合物利尿剂。噻嗪类利尿剂的非限制性示例有苄氟噻嗪、苄噻嗪、***、环噻嗪、氢***、氢氟噻嗪、甲基***、多噻嗪和三***。与噻嗪类相关的磺胺类利尿剂的非限制性示例有氯噻酮、氯噻酮和美托拉宗。保钾利尿剂的非限制性示例有triameterene和阿米洛利。袢利尿剂，也即作用于肾亨氏袢的髓襻升支的利尿剂的非限制性示例有呋塞米和ethynacrylic酸。有机汞化合物利尿剂的非限制性示例有硫汞林钠、汞乙氧茶碱、普鲁卡因和含有茶碱的撒利汞。
在一个实施方案中，联合治疗包括对具有盐敏感性和/或高钠摄取的人类受试者给予ACE抑制剂、醛固酮拮抗剂及基本不具有醛固酮拮抗活性的袢利尿剂，其中，ACE抑制剂、醛固酮拮抗剂和袢利尿剂是以可产生下列一或多种效果的联合给药剂量给药的：(1)相对于不含醛固酮拮抗剂的所述联合治疗，在统计学上显著降低了死亡率；(2)相对于不含醛固酮拮抗剂的所述联合治疗，在统计学上显著降低了非致死性住院人数；(3)相对于不含醛固酮拮抗剂的所述联合治疗，在统计学上显著降低了死亡率或非致死性住院人数；(4)相对于不含醛固酮拮抗剂的联合治疗，在统计学上显著降低了在患有或易患心率变异性增加的受试者中由于猝死而造成的死亡率；(5)相对于不含醛固酮拮抗剂的所述联合治疗，在统计学上显著降低了由于心衰而造成的死亡率；(6)相对于不含醛固酮拮抗剂的所述联合治疗，在统计学上显著降低了左心室射血分数大于约26％的受试者的死亡率或非致死性住院人数；(7)相对于不含醛固酮拮抗剂的所述联合治疗，在统计学上显著降低了左心室射血分数约小于26％的受试者的死亡率或非致死性住院人数；和/或(8)相对于不含醛固酮拮抗剂的所述联合治疗，抑制了由于受试者的肺动脉纤维化增加或肺血压水平升高而造成的临床上显著的咳嗽。优选，接受联合治疗的受试者是：(1)易于猝死；(2)在进行联合治疗前，属于纽约心脏协会III类或IV类的受试者；(3)左心室射血分数大于26％的受试者；和/或(4)易患或患有由于肺动脉纤维化增加或肺血压水平低而造成的临床上显著的咳嗽这种咳嗽的受试者。
这样的联合治疗是有用的，例如，可在具有盐敏感和/或饮食钠摄取增加的受试者中降低死亡率或非致死性住院人数或预防或延迟心衰的发生，而心衰一般是起源于原发性高血压或心肌梗塞后的心脏状况。基本不具有醛固酮拮抗剂活性的利尿剂也可与ACE抑制剂和醛固酮拮抗剂结合使用。
另外，联合治疗可包括给予存在盐敏感和/或高钠摄取的人类受试者治疗有效剂量的ACE抑制剂、治疗有效剂量的醛固酮拮抗剂、治疗有效剂量的基本不具有醛固酮拮抗活性的袢利尿剂和治疗有效剂量的地高辛。
下列实施例含有对本发明中的方法的详细描述。这些详细描述在本发明的范围之内，并且用来例证本发明。这些详细描述仅用于说明性目的，并没有限制本发明的发明范围的意图。每个实施例中用到的依普利农原料基本上包含或曾经包含L型多晶形物和含有或曾经含有约少于10％的H型多晶形物。对绝大多数实施例来说，所用的依普利农物质含有或曾含有检测不到的数量的H型多晶形物(也即，约小于3％的H型多晶形物)。
实施例
A.生物学实施例
实施例A-1.利用依普利农阻断心肌梗塞和与血压无关的肾动脉病
为了证明依普利农能够预防醛固酮/盐介导的心脏早期心血管损伤，应用了在大鼠中建立的实验模型，此模型兼具升高的血压、中度的高盐摄取、激活的RAAS和受抑制的一氧化氮产生。此模型涉及在饮用1％NaCl的大鼠组中利用Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(″L-NAME″)对一氧化氮合成酶进行为期14天的长期抑制，并与在第11-14天进行为期3天的血管紧张素II输注相结合。在此实验中，通过在心脏损伤的14天L-NAME/血管紧张素II/NaCl模型中施行切除和替代实验确定了盐皮质激素对心脏和肾脏的早期病理作用。具体地，我们检验了通过肾上腺切除术或依普利农，一种选择性醛固酮受体阻断剂的药理拮抗作用而造成的盐皮质激素减少是否会在此模型中预防心脏和肾脏的损伤，以及在肾上腺切除后的大鼠中醛固酮替代是否能恢复这些损伤。此外，我们确定了何种类型的心脏损伤是由L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理诱导的，并将这些变化与那些在肾脏中的变化进行比较。
实验动物。在此研究中选用了得自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)的雄性Wistar大鼠(n＝44)，体重200-225克。所有实验动物都喂养在一个房间中，每天光照12小时，环境温度为22±1℃。实验动物运到后允许有1周的恢复时间，并且可自由接触Purina Lab Chow 5001(Ralston Purina Inc，St.Louis，MO)和自来水，直至实验开始。实验开始后，将所有组中的实验动物都放置在单个的代谢笼中，每天进行处理并称重。每天测量24小时的液体摄取，食物摄取和排尿量。在开始L-NAME处理前3天和第1、5、9和13天测量收缩压。在L-NAME处理的第14天，将实验动物去头，将躯干部血液收集到含有乙二胺四乙酸的冰冷试管中，取出心脏和肾脏，吸干并立即称重。将心脏和肾脏保存在10％磷酸缓冲***中，并随后进行处理以进行光学显微镜评估。
药物。依普利农是由G.D.Searle Pharmaceuticals(St.Louis，MO)提供的，溶解在0.5％甲基纤维素中，并通过灌胃每天给药两次。将***溶解在芝麻油中，每天以单次皮下剂量(12ug/kg/日)给药。已经有报导，此***剂量可维持肾上腺切除后大鼠的正常体重增加、肾小球滤过率、空腹血浆葡萄糖水平和胰岛素水平。Stanton，B.，Giebisch G et al.J.Clin.Invest 1985 75：1317-1326.在L-NAME处理的第14天对实验作出结论。血管紧张素II和醛固酮是通过Alzet微型渗透泵(分别为2001型和2002型，Alza Co，Palo Alto，CA)给药的，此微型渗透泵是皮下植入到利用异氟醚麻醉的实验动物的颈背。用于填充泵的血管紧张素II和醛固酮的浓度是基于生产商提供的平均泵速、泵植入前一天的动物体重以及计划的给药剂量计算出来的。血管紧张素II(人，肽纯度为99％)购自American Peptide Inc.(Sunny Vale，CA)并以以前报导的225ug/kg/日的剂量给药(Hou J etal.J.Clin.Islvest.1995 96：2469-2477)。醛固酮的剂量(40μg/kg/日)约比以前研究醛固酮诱导的心血管损伤时的给药剂量减少了50％。此低剂量在易于卒中的自发性高血压大鼠中诱导产生了损害(Rocha R et al.Hyperteftsion 1999 33：232-237.)。***、醛固酮和L-NAME购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。在大鼠每天的流体摄取和体重的基础上，对饮用水中的L-NAME浓度进行每日调整以提供40mg/kg/日的剂量。
手术操作。在L-NAME处理开始前3天，利用戊巴比妥钠(Nembutal，Abbott Laboratories，North Chicago，IL；60mg/kg，i.p.)对组4和组5中的大鼠进行麻醉。在两侧分别切口，利用背腰方法实施双侧肾上腺切除术。手术操作后，肾上腺切除后的实验动物随意饮用1％NaCl。没有发生任何术后死亡。
检测和分析。利用Natsume K正210测压计和流速计(PeninsulaLaboratories Inc，Belmont，CA)通过尾缚带式体积描记法对清醒的实验动物进行收缩压测量。让大鼠在37℃下暖和10分钟，并允许在血压测定前在Lucite室中静静的休息。在实验最后一天，利用磺基水杨酸浊度法确定收集的尿样中的尿蛋白浓度。尿蛋白浓度与排尿量/24小时的乘积就是尿蛋白的分泌量。利用购自Diagnostic Products Co.(Los Angeles，CA)的标准放射免疫测定试剂盒来确定血浆醛固酮的浓度。对产生的血管紧张素I进行免疫检测(DiaSorin Inc.，Stillwater，MN)来确定血浆肾素活性(″PRA″)。
组织学。如别处所报导的，利用对胶原蛋白特异性的染料Sirius红对心脏进行染色来对纤维化进行确定(Young M et al.Am.J.Physiol 1995269：E657-E662)。利用自动化图象分析仪对间质胶原蛋白进行确定。也对心脏进行苏木精和伊红染色以进行光学显微镜分析。对取自每个实验动物的2或3片含有右和左心室的心脏不同部位切片进行分析。利用0-4这5个等级对心肌损伤水平进行评分，其中0分表示没有损伤。1分表示肌细胞表现出一些早期变化，如核固缩或核溶解、非收缩性边缘波状纤维和胞浆的嗜酸性染色，并出现分散的嗜中性细胞浸润。当观察到一个坏死透明区(具有严重的嗜中性细胞浸润的心肌细胞的丢失)时心脏评分为2分。当发现两或多个分开的坏死区(暗示在同一个心脏中出现了两个不同的心肌梗塞)，但这些区域覆盖并危害小于50％的心室壁时，对心脏的评分为3分。表现出大面积的坏死并危害了大约50％的左或右心室，这样的心脏评分为4分。
将肾脏的冠状切片切成3-4mm的小块，并且至少将3-4个这样的小块制备成石蜡包埋块。对组织学切片(2-3μm)进行酸-Schiff试剂定期染色，并由不了解不同实验方法的病理学工作人员在10×和40×的光学显微镜下进行检查。如果存在，那么肾小球损伤的特征为出现具有局部缺血变化或血栓形成变化的节段性硬化或球形硬化。肾动脉和小动脉损伤是以血管壁的纤维蛋白样坏死的出现来分类的。对呈现损伤的肾动脉和小动脉特征进行计数，将每个切片的损伤血管数目除以同一切片的肾小球数目以标准化检测过的组织的数量。肾血管病变伤是以每100个肾小球中的损伤血管数目来表示的。
统计分析。利用Kolmogorov-Smirnov检验对数据进行常态检验。利用重复的测量，即时间和处理组的方差分析对收缩压进行分析。利用一组变量对常态分布的数据进行单因素方差分析。利用NewmanKeuls多比较检验进行Post-hoc分析。利用Kruskal-Wallis检验对非常态分布的数据进行分析。随后，利用精确的Wilcoxon检验进行选择的成对比较。数据以常态分布的数据平均值±SE和非正常分布的数据的具有较高的四分位值和较低的四分位值的中位数进行报道。
定量给药方案。饮用了1％NaCl的Wistar大鼠接受下列定量给药方案中的一个方案：1)仅仅给予大鼠1％NaCl，作为对照组(NaCl，n＝8)；(2)L-NAME/血管紧张素II/NaCl：在饮用溶液中进行为期14天的L-NAME处理(40mg/kg/日)(n＝8)。在L-NAME处理的第11天时，在每个动物皮下植入含有血管紧张素II(0.225μg/kg/日)的微型渗透泵；(3)L-NAME/血管紧张素II/NaCI+依普利农：从第0-14天，L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理组接受额外的依普利农(100mg/kg/日，p.o.；n＝8)给药。在L-NAME/血管紧张素II处理开始前三天对两个额外的饮用NaCl的大鼠进行肾上腺切除。手术后立即利用***对组4(L-NAME/血管紧张素II/NaCl+ADX，n＝11)进行糖皮质激素替代。在给予***外，在L-NAME处理的同时，在第0天开始对组5(L-NAME/血管紧张素II/NaCl+ADX/ALDO，n＝9)给予醛固酮。
结果
对血压的作用
所有处理组的基线收缩压都类似。相对于饮用NaCl的对照组，所有接受L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理的实验动物在收缩压上有渐进且显著的升高(P＜0.01)。在实验最后观察到的高血压的程度没有受到依普利农处理或肾上腺切除的明显影响(图A-1)。
血浆肾素活性和醛固酮水平
PRA数据和循环的醛固酮水平在图A-2中示出。相对于饮用盐水的对照组，L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理显著降低了未进行切除手术的实验动物中的PRA。通过给予醛固酮防止了在进行肾上腺切除后的L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理大鼠中观察到高水平PRA(图A-2A)。尽管在L-NAME/血管紧张素II/NaCl或L-NAME/血管紧张素II/NaCl+依普利农处理组中的肾上腺完整的实验动物中观察到PRA的显著抑制，但其血浆醛固酮水平与饮用盐水的对照组实验动物相似(图A-2B)。正如所预期的，在肾上腺切除后的大鼠中的血浆醛固酮水平降低到检测不到的水平，而施行了肾上腺切除并进行了醛固酮输注给药的大鼠具有升高的醛固酮水平。
醛固酮在心脏损伤中的作用
表A-1A中总结的数据是在实验最后获得的。三组肾上腺完整的实验动物的体重没有差别。然而，相对于肾上腺完整的实验动物组，肾上腺切除后的两个实验动物组大鼠表现出体重的显著降低。心脏总重和总体重的比可作为心脏肥厚的一个指标。相对于饮用NaCl的对照组，所有接受L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理的实验动物组的心脏肥厚指标都偏高。相对于在L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理组大鼠中所观察到的，依普利农处理和肾上腺切除显著减轻了心脏肥厚。醛固酮输注逆转了肾上腺切除对心脏肥厚指数的影响，并将其恢复到与L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理组没有差别的水平。
表A-1A
  组   n   BWg   SBPmm Hg   HWmg   HW/BWmg/g
  NaCl   8   331±4   139±4   924±2   2.79±.05
  L-NAME/AngII/NaCl   8   311±15   180±5   1150±4   3.87±.09
  L-NAME/AngII/NaCl/Epl   8   330±4   177±8   1144±4   3.46±.05
  L-NAME/AngII/NaCl/ADX   11   278±4   176±3   880±3   3.2±.13
  L-NAME/AngII/NaCl/ADX/ALDO   9   267±6   192±7   951±16   3.57±.06
对心脏进行的组织学检验表明在各个处理组间存在显著的差异，P＜0.0001(图A-3和A-4)。L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理大鼠产生了血管损伤和心肌坏死。图A-3A展示了这些损伤的一个代表性显微照片。心肌坏死的特征是失去肌纤维的交叉条纹、胞浆均化、细胞膜丢失、核固缩及最终核溶解、以及包括多形核细胞和单核细胞在内的炎性细胞的流入。在小冠状动脉和小动脉中出现了纤维蛋白样坏死(没有展示)。相反，在那些长时间给予依普利农或施行了肾上腺切除手术的实验动物中，由于对L-NAME/血管紧张素II/NaCl作出反应而产生的心脏损伤显著减少(图A-3B，A-4)。这两组实验动物显示的心肌坏死水平与在饮用NaCl的对照组实验动物中观察到的类似。而额外的醛固酮输注完全逆转了肾上腺切除产生的保护作用。
利用Sirius红(一种胶原蛋白特异性染料)进行的染色表明，接受L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理的任何组实验动物心脏的间质胶原蛋白体积比没有增加(数据没有展示)。此外，心肌坏死区域的胶原蛋白沉积没有增加(图A-3A和A-3C，分别利用苏木精伊红和Sirius红对相邻切片染色)。
醛固酮在肾脏损伤中的作用
在2周处理期最后，NaCl组实验动物的尿蛋白***(24小时)测定结果正常(图A-5)。LNAME/血管紧张素II/NaCl处理显著增加了尿蛋白的***。依普利农处理和肾上腺切除术防止了在接受LNAME/血管紧张素II/NaCl处理的实验动物中发生蛋白尿。相反，对肾上腺切除后的大鼠给予醛固酮完全恢复了LNAME/血管紧张素II/NaCl处理对蛋白尿的影响。
对肾脏进行的组织学评估也显示了各组间的显著差异，P＜0.001(图A-6和A-7)。虽然在饮用NaCl的对照组的肾脏中没有发现肾动脉病，但接受L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理的实验动物显示了主要涉及弓形动脉和小叶间动脉及小动脉在内的严重的肾脏血管损伤(图A-6)。这些血管显示了具有中层增厚和血管周***增生的血管壁的纤维蛋白样坏死。许多分离的肾小球具有局灶性血栓形成区域。在L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理组大鼠的远端小管水平上经常观察到蛋白管型，而在近端小管中可经常观察到蛋白颗粒的重吸收。在接受依普利农处理的实验动物中的肾脏动脉病倾向于减少。然而，相对于L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理组大鼠，对组织病理学评分分析来说，60％的损伤减少没有达到统计学上的显著性(P＝0.1)。肾上腺切除术将L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理诱导的肾脏动脉病显著减少到与饮用NaC的1对照组没有显著差别的水平(图A-7)。正如在对心脏的处理中所观察到的，对肾上腺切除后的、L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理组大鼠进行醛固酮输注时，损伤显著增加。
我们发现，对饲以高钠食物的大鼠联合给予血管紧张素II和一氧化氮合成抑制剂L-NAME可引起高血压、心脏肥厚、心肌坏死、蛋白尿及肾脏动脉病的发生。相反，没有发现通常与慢性心血管损伤相关的心肌纤维化的证据。肾上腺切除清除了醛固酮的存在，防止了心肌坏死、蛋白尿和血管损伤的发生。当对肾上腺切除后的大鼠输注醛固酮时，肾上腺切除术的保护作用丧失。同样的，依普利农的醛固酮拮抗作用减少了心血管损伤。因此，环氧甾族化合物在L-NAME/血管紧张素II/NaCl处理组大鼠中防止和减少了急性心血管损伤的发生。
这项研究表明，L-NAME/血管紧张素II/NaCl在心脏和肾脏水平上诱导高血压和晚期器官损伤方面是非常有效的。依普利农在防止这样的作用方面是有效的。此外，由于依普利农不显著改变收缩压，所以其疗效与其对钠潴留、体积扩张和高血压的影响无关。最后，这些数据暗示依普利农不防止纤维化，但减少了小动脉的中层纤维蛋白样坏死以及随后的组织坏死。纤维化可能是一个修复过程。
实施例A-2在大鼠和狗中阻断醛固酮诱导的盐潴留而产生的急性作用
方法：确定了利用醛固酮处理过的、施行了肾上腺切除术的盐水负荷大鼠的抗盐皮质激素药理学活性。在进行醛固酮注射前要对待检测化合物进行为期30分钟的灌胃给药。对尿钠、钾和水***量进行测量。结果用***的尿钠与钾的比(Na/K)±SEM来表示(表A-2A)。
也在饮用盐水的清醒的狗(n＝6)中评价了抗盐皮质激素药理学活性，这些狗进行了静脉内输注醛固酮和口服给予依普利农。对***的尿钠和钾的浓度进行测定。测定结果以尿钠和钾的变化及Na/K比来表示，并与经醛固酮处理的数据进行单独比较(表A-2B)。
结果：这些结果证明了依普利农对醛固酮诱导的钠和水潴留及体内钾损失这两方面产生的药理学逆转。在这些模型中，在口服给予单剂量后，依普利农引起了效果显著的尿钠增多。
表A-2A
  处理   尿Na/K±SEM
  无   5.15±0.15*
  醛固酮   1.68±0.04
  醛固酮&依普利农(1mg/kg)   2.53±0.23*
  醛固酮&依普利农(3mg/kg)   4.08±0.26*
  醛固酮&依普利农(10mg/kg)   4.11±0.27*
  醛固酮&依普利农(1mg/kg)   2.26±0.25*
  醛固酮&依普利农(3mg/kg)   2.90±0.25*
  醛固酮&依普利农(10mg/kg)   4.38±0.26*
  *与醛固酮处理组有显著差异(p＜0.05).
表A-2B
  处理         尿***(mmol/2h)   Na/K比
  钠   钾
  醛固酮   1.0   10.5   0.09
  依普利农(10mg/kg)   24.4±3   11.9±1   2.1
  螺内酯(10mg/kg)   12.6±2   7.4±0.7   1.7
实施例A-3：对大鼠皮下和口服给予依普利农的比较
方法：确定了利用醛固酮处理过的、施行了肾上腺切除术的盐水负荷大鼠的抗盐皮质激素药理学活性。在进行醛固酮注射前对依普利农进行为期30分钟的灌胃或皮下注射给药。对尿钠、钾和水***量进行测量。结果以***的尿钠与钾的比(Na/K)±SEM来表示
结果：这些结果表明依普利农在拮抗醛固酮介导的肾脏作用方面的体内效力(表A-3A)。皮下注射提供了比口服给药更好的效力(表XVIII和XIX)。
表A-3A
  组   平均Na/K   SEM
  盐水   9.57   1.81
  醛固酮   1.68   0.68
  醛固酮+螺内酯(3)   1.64   0.41
  醛固酮+螺内酯(10)   1.56   0.32
  醛固酮+螺内酯(30)   3.02   0.74
  醛固酮+螺内酯(100)   4.02   1.50
  醛固酮+螺内酯(3)   1.37   0.25
  醛固酮+依普利农(10)   2.17   0.61
  醛固酮+依普利农(30)   2.98   0.34
  SEM＝标准误平均值；括弧中的数字表示给予的拮抗剂的剂量(单位为mg/100g大鼠)；每组的实验动物数量为6-9。
表A-3B
  组   平均Na/K   SEM
  盐水   10.07   1.72
  醛固酮   1.21   0.25
  醛固酮+依普利农(3)   0.90   0.13
  醛固酮+依普利农(10)   1.34   0.30
  醛固酮+依普利农(30)   1.18   0.27
  醛固酮+依普利农(100)   2.10   0.22
  醛固酮+依普利农(300)   4.79   1.24
  醛固酮+依普利农(1000)   5.70   1.04
  SEM＝标准误平均值；括弧中的数字表示给予的拮抗剂的剂量(单位为mg/100g大鼠)；每组的实验动物数量为8-11。
实施例A-4：高血压模型：容量扩张的高血压大鼠
方法：对单侧肾切除大鼠给予1％NaCl饮用水并利用2002型Alza渗透泵对醛固酮(0.5g/kg/hr)进行皮下输注。每天对待检测化合物皮下注射给药两次。利用遥测技术，通过与压力传感器相连接的植入式发送器对血压和心率进行连续测定，而此压力传感器是插管到腹主动脉上的。
结果：在利用遥测技术进行连续监测的情况下，两种待测剂量的依普利农都降低了啮齿类动物模型的血压(表A-4A，数据是3周后的24小时平均值)。依普利农没有导致心率的显著变化。
表A-4A
  处理   SAP   HR
  醛固酮&载体   202±7   346±6
  醛固酮&依普利农(100mg/kg)   155±7*   352±4
  醛固酮&依普利农(200mg/kg)   174±5*   339±4
  醛固酮&螺内酯(100mg/kg)   171±5*   338±4
表A-4A
  醛固酮&螺内酯(200mg/kg)   170±9*   336±7
  与载体处理组有显著差异(p＜.05)。SAP：动脉收缩压(mmHg±SEM)。HR：心率(心跳次数/分±SEM)
实施例A-5：依普利农对易于卒中的自发性高血压大鼠(SHR-SP)，即一种高血压与卒中遗传模型的影响
依普利农对易于卒中的自发性高血压大鼠(SHR-SP)的影响
方法：SHR-SP是在New York Medical College的动物机构饲养的，饲养以正常食物和非盐饮用水(也即自来水)。在13周龄时对实验动物(n＝7-8)给予依普利农(100mg/kg/日，p.o.BID)或载体。通过尾缚带式体积描记法对收缩压的间接测量值进行评估。
结果：结果在表A-5A中示出。在研究开始时，两组实验动物具有类似的、升高的血压。在仅接受载体处理的实验动物中，实验动物的收缩压在为期3周的实验过程中持续升高。相反，利用依普利农处理的动物的收缩压维持在处理前的水平上。这些数据证明，在此高血压和卒中的遗传模型中，依普利农是一种有效的抗高血压药物。
表A-5A
  第13周   第14周   第15周   第16周
  载体   203.8±1.3   200.3±3.3   224.6±6.0   236.0±4.8
  依普利农(100mg/kg/日)   201.4±1.6   202.8±1.8   208.0±4.2*   203.1±6.2*
  n＝*与载体处理组有显著差异(p＜0.05)，mmHg＝毫米汞柱
实施例A-6：用于治疗心肌损伤的醛固酮受体拮抗剂
Sprague Dawley大鼠(250g)是单侧肾切除的，并为其提供1％NaCl溶液作为唯一的水源。随后在大鼠中植入可皮下递送醛固酮(0.75ug/hr)或载体的Alzet微型泵。将这两个处理组进一步分为接受正常大鼠食物或接受含有依普利农(100mg/k/d)的食物的组。利用植入腹主动脉中的无线遥测技术单位来测量血压。将大鼠处死进行心脏检查。
如图A-8所示，在此高盐/单侧肾切除大鼠模型中，醛固酮引起了组织病理学可证明的心脏损伤。处理后2-4周，心脏特征性地显示出血管周炎症、血管壁肥厚、内皮增厚(新血管内膜)、冠状动脉的纤维蛋白样坏死。极少量的心肌细胞发生变化，且没有明显的纤维化。处理后6-8周，出现了组织学上明显的心肌细胞坏死、修复性纤维化(瘢痕)、以及反应性间质纤维化。相反，在大鼠食物中补充依普利农防止了组织学损伤(图A-9)。
正如图A-10所示，单侧肾切除大鼠的心肌损伤要求有高盐摄取和醛固酮的存在。钠不能单独引起心肌损伤，通过给予依普利农而产生的醛固酮阻滞可防止醛固酮+高钠引起的心肌损伤。
实施例A-7：利用依普利农预防卒中和脑血管损伤
实验选用了15只雄性的9周龄、饮用盐水的SHRSP。如图A-11所示，载体处理的所有SHRSP(n＝8)出现卒中症状并在15.2±0.6龄时死亡，而将依普利农处理的SHRSP(100mg/kg/日，n＝7)在18.5周龄时处死用于进一步评估前没有表现任何卒中症状(P＜.005)。依普利农处理也防止了显著的蛋白尿产生(38±18 v 136±19mg/日，P＜.005)，但并不防止严重的高血压的产生(237±3 v 242±4mmHg)(图A-12)。如图A-13所示，大脑组织学分析显示，在所有载体处理过的SHRSP中有液化的坏死出现，并与存在局灶性出血的脑动脉和小动脉纤维蛋白样病变相关。通过给予依普利农可显著减少这些病变。利用一个0-4的半定量评分***对大脑损伤进行评分(图A-14)，在载体处理过的大鼠中观察到的评分为3.5±3，而在接受依普利农给药的动物中观察到的评分为0.5±2(P＜0.001)。因此，依普利农通过与动脉血压下降无关的机制为饮用盐水的SHRSP的大脑提供了血管保护作用。在饮用钠的大鼠中的实验结果显示了内源性盐皮质激素(如醛固酮)在发生卒中方面的一个迄今未被认识的作用。此外，在存在饮食钠摄取增加的大鼠中，依普利农给药防止了由醛固酮引起的卒中的发生。
实施例A-8：依普利农对易于卒中的自发性高血压大鼠的血管保护作用
在第一个方案中，利用为期5-6周的口服给予依普利农(100mg/kg/d)对饮用盐水的SHRSP(n＝9)进行处理。相对于载体处理组(n＝9)，依普利农防止了蛋白尿(16±2 v 85±11mg/d，P＜.001)和肾脏损伤(1±1 v 40±5％，P＜.0005)的发生，但并不防止严重的高血压(219±6 v 227±4mmHg)的发生。在第二个实验方案中，在内源性血管紧张素II形成受到抑制和长期输注载体或外源性血管紧张素II的情况下，在卡托普利处理过的SHRSP中检查了盐皮质激素在血管病变发生方面的作用。卡托普利处理过的SHRSP接受了下列三种处理方案中的一种方案：(i)输注载体来溶解血管紧张素II，但不给予依普利农(n＝5)；(ii)血管紧张素II输注(25ng/分，皮下；n＝7)加灌胃给予2ml/kg/d的0.5％甲基纤维素；(iii)血管紧张素II输注(25ng/分，皮下；n＝7)加依普利农(100mg/kg/d，通过灌胃给药)。两周后，所有三组SHRSP的收缩压都是相当的，并且升高很多。在接受卡托普利加载体处理的SHRSP中，血浆醛固酮水平下降，并且没有注意到任何肾脏病理存在。血管紧张素II输注的增加升高了血浆醛固酮水平，逆转了卡托普利在防止蛋白尿(分别为96mg/d)和肾脏损伤方面的保护作用。尽管有连续的血管紧张素II输注，相对于载体处理组，依普利农处理仍显著减弱了蛋白尿(28±5 v96±13mg/d，P＜.001)和肾脏损伤(3±1 v 18±4％，P＜.0001)。这些发现表明，内源盐皮质激素在饮用盐水的SHRSP中介导肾脏损伤的发生，并且不依赖于血管紧张素II及其对血压的影响。
材料与方法
实验动物。按照已制定的指导原则，利用本地动物群体的雄性SHRSP/A3N大鼠(F-75-F-78代)，n＝37，来进行研究。这些大鼠是从NIH原种培育的，源自Okamoto和同事最开始描述的SHRSP/A3N亚株(Okamoto K et al.Circ.Res.34 and 35(suppl I)：I-143-I-153)。将所有实验动物喂养在New York Medical College的动物管理设施的房间内，维持12∶12小时光照∶黑夜循环，环境温度为22±1℃。大鼠在4周龄时断奶，并允许其自由接触Purina Lab鼠食5001(Ralston Purina，St.Louis，MO)和自来水，直至实验开始。
方案1：依普利农对肾脏病理变化的影响
从8.1周龄开始，对18只SHRSP给以1％ NaCl饮用水，并饲以易于卒中的啮齿类动物食物(#39-288，Zeigler Brothers，Inc.，Gardners，PA)。这些食物较标准食物含有较低的钾(0.7wt％ v 1.2wt％)和蛋白(17wt％ v 22wt％)，并可在SHRSP中诱发高卒中发生率(Stier CT et al.Hypertension.13：115-121)。在8.4周龄时，将所有动物等分为两组，开始长期进行依普利农或载体处理。依普利农(SC-66110)是由G.D.Searle&Co.，(St.Louis，MO)提供的。将依普利农以50mg/ml的浓度悬浮在0.5％的甲基纤维素(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)中，并通过灌胃每天给药两次，以提供每天100mg/kg的总剂量。与螺内酯不同，由于依普利农不产生活性代谢物，所以要给予高剂量。载体对照组大鼠接受了2ml/kg/d的0.5甲基纤维素溶液给药。将实验动物单独饲养在代谢笼中以便测量24小时排尿量和蛋白***量。每天对实验动物检查卒中的神经学症状。每周对清醒的大鼠测量动脉收缩压和心率。进行了为期5周的处理后，动物达到13.1周龄，实验结束。在上午10:00-下午12:00快速将实验动物去头，随后将躯干部血液收集到冷冻的EDTA试管中。将收集的血液保存在-20℃下以用于日后的血浆醛固酮水平检测。迅速取出肾脏，称重，随后保存在固定剂中以用于日后的组织学检验。
方案2：依普利农对血管紧张素II诱导的SHRSP肾脏损伤的影响
在第二组的19只SHRSP中，对内源盐皮质激素在血管紧张素II诱导的肾脏损伤发生中的作用进行了评估。在8.3周龄时，对SHRSP随意饲养以易于卒中的啮齿类动物食物(#39-288，Zeigler BrosInc.，Gardners，PA)和1％ NaCl饮用溶液。为了在实验动物中提供一致的内源血管紧张素II水平的本底抑制，将卡托普利(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)添加到所有动物的饮用溶液中以提供50mg/kg/d的剂量。以前已经有报导表明，在不进行血管紧张素II输注的情况下，这样的卡托普利剂量可在饮用盐水的SHRSP中防止发生肾脏和脑血管损伤(Rocha R et al.Hypertension.33：232-237)。在9.3周龄时，将含有血管紧张素II(human type，American PeptideInc.，Sunnyvale，CA)或载体(sterile 0.9％ NaCl)的2002型Alzet微型渗透泵(Alza Co.，Palo Alto，CA)植入到通过异氟醚(OhmedaCaribe Inc.，Guayama，PR)吸入麻醉后的SHRSP的颈背皮下。将大鼠饲养在单个的代谢笼中并接受下列三种处理方式中的一种：(i)输注载体来溶解血管紧张素II，但不给予依普利农(n＝5)；(ii)输注血管紧张素II(25ng/分，皮下；n＝7)加利用灌胃给予2ml/kg/d的0.5％甲基纤维素；(iii)输注血管紧张素II(25ng/分，皮下；n＝7)加依普利农(100mg/kg/d，通过灌胃给药)。在预实验中，我们证明了利用25ng/分的血管紧张素II剂量就可逆转在饮用盐水的SHRSP中利用依那普利进行ACE抑制剂处理所产生的血管保护性作用。选定的依普利农剂量的依据是方案1中的实验结果，而方案1中的实验结果表明，在不依赖于收缩压的变化的情况下，在饮用盐水的SHRSP的13周龄时间内几乎完全保护了大鼠免于遭受蛋白尿和肾脏损伤。每天对实验动物进行处理并称重。收集尿样以用于蛋白尿评估。每周测量收缩压和心率。在2周处理之后，将实验动物去头，将躯干部血液收集到冷冻的EDTA试管中，取出肾脏，吸干，并立即称重。将肾脏的冠状切片进行固定，随后进行处理以进行光学显微镜评估。
测定和分析。利用Natsume K正210测压计和流速计(PeninsulaLaboratories Inc，Belmont，CA)通过尾缚带式体积描记法对清醒的实验动物进行收缩压测量。让大鼠在37℃下暖和10分钟，并允许在血压测定前在Lucite室中安静地休息。利用称重法对尿量进行测定。利用磺基水杨酸浊度法确定尿蛋白浓度。以125I-醛固酮作示踪剂(Coat-a计数醛固酮)，Diagnostic Products Co.，Los Angeles，CA)，通过免疫测定对血浆醛固酮进行测量。
组织学。将肾脏保存在10％磷酸缓冲***中。利用苏木精和伊红对其冠状切片(2-3μm)进行染色，并如以前所述以盲法进行光学显微镜检查(Stier CT et al.J Pharmacol Exp Ther(1992)260：1410-1415)。肾小球损伤分为局部缺血性病变和血栓形成性病变。局部缺血性病变定义为存在或不存在可感知的系膜溶解的肾小球毛细管从回缩。肾小球血栓形成性病变定义为下列任一种或其结合：节段性或球形纤维蛋白样坏死、肾小球毛细管的局灶性血栓、毛细管内(内皮和系膜)和/或毛细管外细胞(新月体)的肿胀和增生、以及存在或不存在显著的细胞过多的网状系膜基质扩张。将每个肾脏中表现任一种病变的肾小球的数目清点出来，并以其占每个中央冠状切片所呈现的肾小球的总数的百分比来表示(平均值±SEM＝218±7个肾小球/实验动物；方案1的范围＝162-261个肾小球以及平均值±SEM＝229±7个肾小球/实验动物；方案2的范围＝196-290个肾小球)。通过计算同一中央冠状切片的总动脉数和表现血栓形成性和/或增生性动脉病的小动脉数来评估血管损伤。血管血栓形成性病变定义为下列情况的任一种或其结合：血管壁纤维蛋白样坏死、红细胞的外渗和破碎、血管腔和/或血管壁血栓形成。增生性动脉病的特征在于具有肿胀的圆形到卵圆形小泡状核的肿胀的肌内膜细胞显著增生，而这些肌内膜细胞为细胞外粘液性基质(″洋葱皮″)所包围并经常造成结节性肥厚。血管损伤是以每100个肾小球中存在的病变动脉和小动脉的数目来表示的。对管型和管状(局部缺血的)回缩和简化的存在进行半定量评估。
统计分析。利用二因素方差分析对处理方法和时间的显著作用进行了确定。利用斯氏成对t-检验对仅具有一组变量的数据进行统计分析。当对多于两组的数据进行比较时，就要在post-hoc Newma正Keul′s多比较检验后进行单因素方差分析。利用2.01版GraphPadPrism统计软件包(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)进行数据分析。P＜.05时认为在统计上是显著的。数据以平均值±SEM来进行报道。
结果
方案1
图A-15展示了长期进行依普利农(100mg/kg/d)或载体处理的SHRSP的实验结束前收缩压和尿蛋白***结果。此柱状图展示了实验结束前易于卒中的自发性高血压大鼠的(A)动脉收缩压(SBP)和(B)尿蛋白***(UPE)，而这些高血压大鼠从8.4到13.1周龄接受了长期的依普利农(100mg/kg/d)或载体处理。从8.1周龄开始，给予实验动物饮用1％NaCl溶液并随意饲以易于卒中的啮齿类动物食物。相对于载体处理的同窝大鼠，其***P＜.001。数值以平均值±SEM来表示。
相对于同窝大鼠对照，依普利农防止了蛋白尿(85±11 v 16±2mg/d，P＜.001)发生，但并不防止严重的高血压(227±4 v 219±6mm Hg)发生。在研究过程中，依普利农处理组和载体处理组在收缩压和心率上也没有差别。
表A-8A总结了肾脏病变的组织学分析结果。如图A-16A所示，载体处理且饮用盐水的SHRSP的肾脏35±5％的肾小球显示出局部缺血性或血栓形成性损伤，并且在小的动脉和小动脉中展示出大量的血栓形成性和增生性损伤。此图展示了利用苏木精和伊红对饮用盐水的易于卒中的自发性高血压大鼠的中央冠状切片进行染色而得到的代表性显微照片(原始放大倍数，×130)，而这些高血压大鼠从8周龄开始就接受为期5周的依普利农或载体处理。接受载体处理的实验动物的肾皮质显示了典型的恶性肾硬化，如局部缺血性回缩(小箭头)、毛细管丛血栓形成(大箭头)、存在碎裂的和渗出的红细胞的小动脉纤维蛋白样坏死、以及同心增生性动脉病(箭头)。几个更小的动脉和小动脉显示出由于中层肥厚而造成的血管壁增厚(双箭头)。也存在斑块状局部缺血性回缩和小管简化。其他的是扩张和蛋白管型。相反，在为期5周的依普利农处理后，年龄匹配的同窝大鼠仅表现出很少的局部缺血性或血栓形成性肾小球实例。(图A-16B；接受依普利农(100mg/kg/d，通过灌胃给药)处理的实验动物的肾皮质没有显示显著的病理).
在载体处理过的SHRSP中，10±5％的小管存在蛋白管型，而依普利农处理过的SHRSP中有0.11±0.04％的小管存在蛋白管型(P＜.001)。同样的，与在依普利农处理过的SHRSP仅有0.5±0.2％的小管表现出缺血性回缩相比，载体处理过的SHRSP有48±7％的小管表现出缺血性回缩(P＜.001)。这两组中的血浆醛固酮浓度没有显著的差异，载体处理过的SHRSP中的平均值为305±68pg/ml，而在依普利农  处理过的SHRSP中的平均值为315±35pg/ml。9只接受载体处理的SHRSP中的6只表现出明确的卒中症状，而依普利农处理过的SHRSP中没有表现卒中症状(P＜.01，Fisher′s精确检验)。
在处理的前3周中，体重没有受到依普利农影响(数据未给出)。其后，载体处理组的体重下降，但依普利农处理组SHRSP的体重维持不变或增加。尸体解剖时，载体处理后的SHRSP的肾绝对重量平均为2.42±0.11g，依普利农处理后的SHRSP的肾绝对重量平均为2.58±0.06g，没有受长期的依普利农给药影响。因为载体处理后的SHRSP的最终体重较依普利农处理后的SHRSP的最终体重轻(220±7g v279±7g，P＜.001)，所以此组的肾重量与体重之比明显较高。
方案2
图A-17A展示了经卡托普利处理、饮用盐水的SHRSP的收缩压，而这些SHRSP在伴随或不伴随依普利农口服给药的情况下接受了载体(盐水)或血管紧张素II输注。图A-17含有一个线形图，其展示了在进行卡托普利加载体(CAP)、卡托普利加血管紧张素II(CAP+血管紧张素II)或卡托普利加血管紧张素II加依普利农(CAP+血管紧张素II+EPL)处理过程中，饮用盐水的易于卒中的自发性高血压大鼠的(A)动脉收缩压和(B)尿蛋白***。从8.3周龄开始进行卡托普利处理(50mg/kg/d)。在9.3周龄时皮下植入含有血管紧张素II(25ng/分)的Alzet微型渗透泵，并开始利用载体(n＝5)、单独应用血管紧张素II(n＝7)或血管紧张素II加EPL(100mg/kg/d)(n＝7)进行伴随处理。与CAP或CAP+血管紧张素I1+EPL处理相比***P＜.001。数值为平均值±SEM。所有SHRSP发生了严重的高血压，但在各组间没有显著差别。在卡托普利加载体处理组中的实验结束前收缩压平均值为224±6mm Hg，在卡托普利加血管紧张素II加载体处理组中的收缩压平均值为224±4mm Hg，在卡托普利加血管紧张素II加依普利农处理的SHRSP的收缩压平均值为231±5mmHg。结果表明，将血管紧张素II添加到卡托普利中没有较卡托普利加载体处理进一步升高血压。此外，在接受血管紧张素II加依普利农的卡托普利处理组SHRSP中的血压测定是相似的。在开始血管紧张素II输注后两天，也即9.5周龄时，所有三组SHRSP中的尿蛋白***水平仍然是低水平的(图A-17B)。其后，卡托普利加载体处理的SHRSP没有产生蛋白尿。然而，接受卡托普利加血管紧张素II加载体处理的SHRSP产生了显著的蛋白尿。相反，在接受卡托普利加血管紧张素II加依普利农的SHRSP中防止了蛋白尿产生。研究进行的最后，在卡托普利处理组中的尿蛋白***的平均值为14±1mg/d，在卡托普利加血管紧张素II处理组中的尿蛋白***的平均值为96±13mg/d，在卡托普利加血管紧张素II加依普利农处理组中的尿蛋白***的平均值为28±5mg/d(卡托普利组或卡托普利加血管紧张素II加依普利农组与卡托普利加血管紧张素II组对比时，P＜.001)。在卡托普利加血管紧张素II处理组中的血浆醛固酮浓度平均值为404±160pg/ml，在接受卡托普利加血管紧张素II加依普利农处理的组中的血浆醛固酮浓度平均值为231±37pg/ml(P＝NS；图A-18)。图A-18是一条柱状图，其表明易于卒中的自发性高血压大鼠中的血浆醛固酮水平，而这些大鼠是在8.3周龄时接受卡托普利处理(50mg/kg/d)和1％NaCl/易于卒中的啮齿类动物食物的。在9.3周龄时对含有载体或血管紧张素II(25ng/分)的微型渗透泵进行皮下植入，并开始进行含有或不含有依普利农的伴随处理。2周后将实验动物处死(相对于单独接受卡托普利处理组，*P＜.05)。相对于单独接受卡托普利处理组(107±26pg/ml；P＜.05)，这些值有显著的提高，但却与方案1中的观测值相似。
与高水平蛋白尿相一致，在2周处理的最后，卡托普利处理、饮用盐水的SHRSP的肾脏没有出现任何损伤。对卡托普利处理的SHRSP给予血管紧张素II加载体诱导了恶性肾硬化显著的、可影响肾小球和微血管的血栓形成性微血管病发生(表A-8B)。相反，同时接受依普利农的卡托普利处理组实验动物显著减少了作为对血管紧张素1I输注的反应而产生的肾硬化。图A-19展示了饮用盐水、卡托普利处理组SHRSP的肾脏组织学变化的代表性显微照片(对盐水饮用组易于卒中的自发性高血压大鼠(SHRSP)的肾皮质进行苏木精和伊红染色)(原始放大，×130)。卡托普利加载体处理防止了肾脏病理发生(图A-19A)。进行血管紧张素II加载体输注的卡托普利处理组SHRSP(图A-19B)展示出与那些进行载体处理的饮用盐水的SHRSP(图A-16A)相似的肾脏病变。相反，在卡托普利加血管紧张素II加依普利农处理组实验动物中，肾脏血管和肾小球病变显著减少(图A-19C)。如方案1中所述，对肾小管局部缺血的出现进行半定量评估。在卡托普利加载体处理组SHRSP中没有这些变化。卡托普利加血管紧张素II加载体处理的SHRSP的21±3％的小管显示出局部缺血性回缩和简化，然而，在卡托普利加血管紧张素II加依普利农处理的SHRSP中仅有2.5±0.9％的小管展示出相似的变化(P＜.0001)。
整个研究过程中，各组实验动物的体重没有差别，在实验最后，卡托普利加载体处理组为258±6g，卡托普利血管紧张素II加载体处理组为223±7g，卡托普利血管紧张素II加依普利农处理组为234±5g。对SHRSP进行解剖时，卡托普利加载体处理组的绝对肾重为2.56±0.06g，卡托普利血管紧张素II加载体处理组为2.12±0.06g，卡托普利血管紧张素II加依普利农处理组为2.00±0.03g。绝对肾重或肾重量是以其占体重的百分比来表示的，并且不受依普利农处理的影响。
表A-8A
  病变   载体(n＝9)   依普利农(n＝9)
  肾小球损伤(病变/100个肾小球)局部缺血性血栓形成性合计肾脏血管病(病变/100肾小球)血栓形成性增生性合计 24±211±435±525±49±134±4 1.0±1.0***0.1±0.1***1.0±1.0***1.0±1.0***0.1±0.1***1.0±1.0***
从8.4周龄开始，对易于卒中的自发性高血压大鼠(SHRSP)长期给予依普利农(100mg/kg/d，灌胃给药，分为两剂)或载体(0.5％甲基纤维素，2ml/kg/d，灌胃给药)处理。在8.1周龄时，开始对所有实验动物饲以1％ NaCl饮用溶液和易于卒中的啮齿类动物食物，5周后，大鼠为13.1周龄，此时结束实验。相对于载体处理组***表示P＜.001。数值为平均值±SEM。
表A-8B
病变 卡托普利(CAP)+载体(n＝5) CAP，血管紧张素II+载体(n＝7) CAP，血管紧张素II+依普利农(n＝7)
肾小球损伤(病变/100个肾小球))局部缺血性血栓形成性合计肾脏血管病(病变/100肾小球)血栓形成性增生性合计 0±00±00±00±00±00±0 13±32±115±315±1±116±2 3.0±1.0**1.0±0.33.0±1.0**4.0±1.0***0.1±0.14.0±1.0***
在8.3周龄时开始对盐水饮用组易于卒中的自发性高血压大鼠(SHRSP)进行卡托普利处理(50mg/kg/d)。9.3周龄时，在所有实验动物中皮下植入含有血管紧张素II(25ng/分)的微型渗透泵，并开始进行依普利农(100mg/kg/d)或载体处理。所有实验动物持续饲以1％ NaCl饮用溶液和易于卒中的啮齿类动物食物，并在2周后将它们处死。相对于卡托普利加血管紧张素II加载体处理组，**表示P＜.01；***表示P＜.001。数值为平均值±SEM。
接受依普利农处理的饮用盐水的SHRSP显著减少了蛋白尿并几乎完全防止了肾小球和肾脏血管损伤。依普利农处理也在很大程度上防止了在载体处理的实验动物中观察到的可能是肾小管的局部缺血、收缩(回缩)和简化的斑块。与依普利农在饮用盐水的SHRSP中防止其发生肾脏病变相一致的是发生在这些大鼠和那些具有盐皮质激素-盐高血压大鼠中的恶性肾硬化的紧密平行，而具有盐皮质激素-盐高血压的大鼠是严重高血压的低肾素模型。
依普利农的有益作用不依赖于血压降低。在存在盐皮质激素诱导的高血压的大鼠中，我们不清楚此病理(血栓形成性微血管损伤)是否能归因于由于严重高血压、不依赖于高血压的盐皮质激素的直接作用、或二者的结合或其他因素引起的直接的机械损伤。升高的动脉血压是作为对醛固酮的反应的血栓形成性微血管损伤发生的先决条件。我们的结果表明，单单高血压不足以在SHRSP中产生血管损伤，内源盐皮质激素介导了恶性肾硬化的发生。在饮用盐水的SHRSP中，严重的肾脏血管病变开始的很早，这表明在这些实验动物中产生了病变的盐敏感性。同样的，在盐皮质激素(去氧皮质酮醋酸盐)处理的大鼠中诱导肾脏损伤，高盐摄取是必需的。我们的观察结果显示，同高血压一样，高盐摄取可作为醛固酮诱导的病变形成的一个先决条件，但单单高盐摄取不足以引起病变发生。
虽然致死是SHRSP卒中的典型结果，但不是本研究的终点，我们观察到依普利农在预防卒中的神经症状发生方面具有一定的保护作用。依普利农对血浆醛固酮水平没有产生作用(依普利农处理的SHRSP中为315±35pg/ml，载体处理过的SHRSP中为305±68pg/ml)，这与其抑制醛固酮的作用而不是抑制醛固酮的合成相一致。本研究的结果共同说明了SARA在饮用盐水的SHRSP中可对血管产生保护。
在这些条件下，这两组中的血管紧张素II水平应该相似，因为内源血管紧张素II的形成受到了抑制，而外源血管紧张素II的输注是稳定的。尽管同时伴随着卡托普利处理，但低剂量的血管紧张素II(25ng/分)输注可有效诱导蛋白尿及与肾小球的局部缺血性和血栓形成性病变相关的血栓形成性和增生性动脉病发生。在初步研究中，低剂量的血管紧张素II(也即25ng/分)没有升高SHRSP的血压。与我们在没有进行卡托普利处理的饮用盐水的SHRSP(方案1)中的发现类似，我们观察到依普利农对在卡托普利处理的饮用盐水的SHRSP中预防血管紧张素II诱导的肾脏血管损伤方面有显著的保护作用，并且此保护作用与血压降低无关。这些观察结果与ACE抑制剂的血管保护作用特别的涉及内源RAAS干扰这个主张相一致，也确定了内源盐皮质激素在血管紧张素II诱导的肾脏损伤中起着重要的作用。
血管紧张素II的已确定的作用是作为高血压血管疾病的致病因子。血管紧张素II不仅是有效的血管收缩剂，也是肾上腺素反应的促进剂。ACE抑制剂的有益功效一般归因于降低了血管紧张素II对血管的作用；然而，这些药物也能抑制血浆醛固酮水平。相对于卡托普利处理的SHRSP，在存在或不存在依普利农的情况下接受血管紧张素II的SHRSP的血浆醛固酮水平显著升高，而与在方案1的载体处理组SHRSP中观察到的结果相似。此外，血管紧张素II输注与肾脏病变发生相关，这种作用在很大程度上为依普利农的MR拮抗作用所弱化。我们的研究是在SHRSP中进行的，当饲以高盐食物时，SHRSP一般表现出RAAS抑制的损害。这种现象可用来解释我们在实验中所观察到的差异。本研究揭示了内源盐皮质激素对低剂量输注血管紧张素II所诱导的SHRSP的肾脏损伤进展的关键作用。这些发现表明，盐皮质激素是SHRSP中血管紧张素II血管毒性作用的重要介质，这与我们以前在不进行血管紧张素II输注情况下所观察到的醛固酮输注逆转了卡托普利对血管损伤作用的保护相一致。这些发现共同证明了依普利农给药是在SHRSP中防止病变形成的有效处理方法，该病变是在RAAS激活之后发生的。
总之，依普利农长期给药可有效减少饮用盐水的SHRSP的蛋白尿、恶性肾硬化的肾脏病变以及卒中症状。此外，长期的外源低剂量血管紧张素II(25ng/分)给药逆转了已知的卡托普利处理在降低饮用盐水的SHRSP血浆醛固酮水平和防止肾脏发生上的能力。然而，血管紧张素II诱导肾脏病变的能力在很大程度上为依普利农的选择性醛固酮阻滞所削弱。这些作用不依赖于血压上的主要变化。
实施例A-9：作用的机理和特异性：盐皮质激素
体内的受体结合
药代动力学及吸收
在IV和口服给予剂量为15mg/kg的作为水溶液的[14C]依普利农后的雄性和雌性大鼠中研究依普利农的药代动力学和代谢。对血浆、尿和粪便样品进行总放射性分析。利用LC/MS/MS法，对已收集的未酸化的血浆中的依普利农浓度和以开放内酯环形式存在的依普利农浓度进行分析。此外，利用独立LC/MS/MS法，对已收集的酸化的血浆中的“总依普利农”浓度(内酯环闭合形式和开放形式)进行分析。
在IV给予[14C]依普利农后，雄性大鼠和雌性大鼠中的总放射性的清除半衰期分别为1.9和1.6小时。在对雄性大鼠和雌性大鼠口服给予[14C]依普利农水溶液后1.1和0.8小时，达到总放射性的平均峰血浆浓度(Cmax)，这表明放射性药剂的吸收速度是很快的。雄性和雌性大鼠的平均Cmax值分别为7.64和7.67pg当量/mL。口服给予[14C]依普利农后，雄性大鼠和雌性大鼠中总放射性的全身利用度分别为59.6％和66.4％，表明他们对依普利农有很好的吸收。
在IV给药后，雄性大鼠和雌性大鼠中的总放射性的清除半衰期分别为0.803和1.14小时。雄性大鼠和雌性大鼠体内依普利农的血浆清除率(CL)值分别为1.22和1.20L/kg/hr。总依普利农的相应值分别为0.983 and 0.694L/kg/hr。
口服给药后，母体药物血浆浓度有一个可观察到的性别差异，在雌性大鼠血浆中的浓度较高。依普利农在体内很快吸收，在雄性大鼠中，给药后0.5小时达到1.71ug/mL的Cmax，而在雌性大鼠中，给药后在1小时就达到了3.54ug/mL的Cmax。雄性大鼠和雌性大鼠体内的依普利农全身利用度分别为25.6％和66.1％。雄性大鼠和雌性大鼠体内总依普利农的Cmax分别为3.20和6.35ug/mL。雄性大鼠和雌性大鼠体内的依普利农的全身利用度分别为29.4％和74.2％。
分布
在对色素沉着的雄性大鼠(Long-Evans Hooded)口服给予作为水溶液的20mg/kg[14C]依普利农后，开始进行大鼠组织分布研究。组织吸收放射性药物的速度很快，在0.5小时绝大多数组织就达到了Cmax。血液和血浆中的平均Cmax分别为4.90和8.64微当量/g。除胃肠道组织外，具有最高平均Cmax值的组织为肝、胰和肾，浓度分别为41.1、12.1和10.1微克当量/g。具有最低Cmax的组织为眼(除晶体)、脑和脊髓，浓度分别为0.045、0.516和0.630微克当量/g。至给药后96小时，除盲肠、肾、大肠和肝的放射性浓度为小于0.024微克当量/g外，其他所有组织的放射性浓度都在检测限以下。
实施例A-10：选择性醛固酮受体阻滞改善了饮食诱导的动脉粥样硬化中的内皮的功能：
对依普利农在提高一氧化氮生物利用度方面的功效进行了检验，以确定依普利农是否能改善或预防由于动脉粥样硬化而引发的内皮功能障碍。
方法：将New Zealand白兔随机分到四个处理组中。对32只兔子饲以正常的(NC)或1％胆固醇食物(HC)，为期8周。最开始的2周后，随机挑选出16只兔子来接受灌胃给予盐水(S)或依普利农(E，50mg/kg，每天两次)，持续6周。8周后对兔子实施安乐死，提取主动脉进行等张研究，并通过光泽精化学发光(250uM)来估计血管片段中产生的超氧化物(O2 -)。利用苯福林(3×10-7)对血管进行预先收缩至约50％的最大收缩程度，并检测其对已酰胆碱(Ach)和***(NTG)的剂量反应。
结果：Ach、NTG的峰值舒张、ED50(M)值、及O2 -计数(每mg干重)在表A-10中有描述：
表A-10
  组   ％Ach   ED50Ach   ％NTG   ED50NTG   O2 -计数
  NC-S   97±2   2.5×10-8   104±2   7.1×10-9   1478±352
  NC-E   97±3   3.2×10-8   107±2   5.7×10-9   1110±373
  HC-S   61±4#   1.2×10-7#   104±3   1.3×10-8   3445±863#
  HC-E   82±6*   6.8×10-8   112±4   1.0×10-8   1400±504*
*＝与HC-S的p≤0.01，#＝与NC-S和NC-E的p＜0.05
结论：在饮食诱导的动脉粥样硬化情况下，依普利农改进了内皮的功能并减少了O2 -的产生。这些数据提供了证据证明依普利农可为内皮功能损害的状况提供附加的治疗策略。
药代动力学数据表达中用到的缩写：
ANCOVA      协方差分析
AUC         血浆浓度-时间曲线下的面积
Cmax       最大血浆浓度
Cmin       最小血浆浓度
CI          置信区间
CL/F        表观血浆清除率
CRF         病例报告表
CV          变异系数
Kel        终末期清除速度常数
lqc         最后的可定量浓度
T1/2       血浆清除半衰期
Tmax       达到最大血液/血浆浓度的时间
XU          尿中收集的分析物总量
实施例A-11：药代动力学研究
进行了五项研究(包括在日本(日本)和欧洲(日本外)受试者中进行的单剂量和多剂量耐受性及食物影响实验)来获取依普利农的药代动力学数据。总共有76位欧洲受试者和38位日本受试者参加了单剂量和多剂量耐受性和食物影响实验。其中3个研究是日本外研究，包括的剂量范围为10mg-1000mg。其他两项研究是在日本进行的，包括的剂量范围为50mg-600mg。
日本外的实验包括(i)单剂量耐受性实验，和(ii)多剂量耐受性实验，以及(iii)食物影响研究。单剂量日本外实验对10、50、100、300或1000mg的依普利农给药剂量进行了调查。对40名健康男性受试者口服给予单剂量依普利农。日本外多剂量耐受性实验对为期11天的100、300和1000mg依普利农的多剂量作用进行了研究。以剂量逐渐增加的方式对24位健康的男性受试者给予依普利农。在12位健康的男性受试者身上进行了日本外食物影响研究，而对此12位健康受试者在两个单独的时间，在整夜禁食后或摄取高脂肪(75g)食物之后立即以交叉方式口服给予单剂量100mg依普利农。
单剂量和多剂量耐受性实验都是在日本通过健康的男性日本受试者来进行的。日本受试者单剂量耐受性实验对向32位受试者口服给予单剂量50、100、200、400和600mg依普利农进行了研究。接受100mg剂量的6位受试者参加了单剂量耐受性实验的食物影响处理。对这六位受试者在两独立的场合以交叉方式口服给予单剂量100mg依普利农；在整夜禁食后或摄取脂肪食物之后立即给药。在6位健康男性受试者中进行多剂量耐受性实验(JE399-06-401)，而这些受试者已经接受了7次每日一次的400mg依普利农。
结合得自所有5项研究的单剂量空腹药代动力学数据，对国家(日本，日本外)、在国家内进行的研究、根据剂量标准化Cmax实施的给药剂量以及AUC等因素进行方差分析以对国家(群体)的影响进行评估。进行剂量标准化以最大限度地降低剂量(单剂量为10mg，多剂量为100mg)。在缺乏静脉内数据的情况下，分布体积(V/F)和清除率(CL/F)参数用表观值来代表，并标准化为70kg体重。日本与日本外实验在所有分析过的药代动力学参数上没有统计学上显著的差异。相对于日本外实验中的3个剂量，由于在日本实验中仅有400mg依普利农剂量，所以没有进行标准的统计分析和多剂量数据比较。
图A-20到A-24到A-25到A-29分别图示了得到的对依普利农和无活性开放内酯环形式依普利农的剂量的单剂量药代动力学参数。
表A-11A和A-11B展示了日本外研究和日本研究中依普利农及其无活性开放内酯环形式的单剂量药代动力学参数的最小均方。在对得到的参数进行评估方面，日本和日本外总体间没有统计学上的显著差异。
表A-11C包含有日本和日本外食物影响实验中喂养和禁食实验的几何最小均方、平均值的比以及平均值比的相应95％置信区间(CI)。利用包含有顺序效应、顺序内的受试者、实验时间和实验方法在内的方差分析(ANOVA)模型对Cmax和AUC参数进行分析，从而得到几何最小均方、平均值的比以及平均值比的相应95％CI。
表A-11D和A-11E展示了日本外100、300及1000mg依普利农剂量和日本400mg依普利农剂量实验的剂量标准化药代动力学参数的算术平均。没有进行标准的统计分析，实验得到的数据仅仅用于比较。
对日本与日本外单剂量药代动力学数据进行的比较表明，得到的药代动力学参数间没有统计学上的显著差异。如AUC参数所反映的，从完全暴露的日本实验数据所观察到的食物影响与在日本外实验中观察到的数据类似。在日本实验(400mg)中的平均多剂量药代动力学参数与日本外实验中得到的数据有很好的平行性。
表A-11A.单剂量依普利农药代动力学参数的最小均方
  日本   日本外   P-值2
  剂量标准化的Cmax(ng/mL)   120.0   131.0   0.412
  剂量标准化的AUC(0-lqc)hr·ng/mL   779.0   790.0   0.932
  剂量标准化的AUC(0-inf)hr·ng/mL   826.0   792.0   0.782
  CL/F(L/hr)   13.79   13.69   0.955
  CL/F(L/hr/70kg)   13.52   14.44   0.639
  Vss/F(L)   80.11   80.58   0.944
  Vss/F(L/70kg)   81.42   83.83   0.796
a-F-检验，利用ANOVA模型对日本和日本外实验进行对比的P值
表A-11B.单剂量SC-70303药代动力学参数的最小均方
  日本   日本外   P-值2
  剂量标准化的Cmax(ng/mL)   9.71   8.93   0.518
  剂量标准化的AUC(0-lqc)hr·ng/mL   49.8   40.6   0.295
  剂量标准化的AUC(0-inf)hr·ng/mL   52.4   48.5   0.669
a-F-检验，利用ANOVA模型对日本和日本外实验进行对比的P值
表A-11C.喂养和禁食状态下依普利农药代动力学参数的最小均方
  日本外食物影响研究   饲养组   禁食组   平均比(95％置信区间)   P-值2
  Cmax(ng/mL)   1318   1619   0.814(0.745-0.889)   0.0004
  AUC(0-lqc)hr·ng/mL   9647   8938   1.079(0.915-1.273)   0.328
  AUC(0-inf)hr·ng/mL   9781   9062   1.079(0.916-1.272)   0.324
  日本食物影响研究   饲养组   禁食组   平均比(95％置信区间)   P-值2
  Cmax(ng/mL)   1517   1311   1.157(1.070-1.252)   0.0066
  AUC(0-lqc)hr·ng/mL   10818   8880   1.218(0.958-1.550)   0.085
  AUC(0-inf)hr·ng/mL   10929   8971   1.218(0.956-1.553)   0.087
a-F-检验，利用ANOVA模型对Japan和日本外实验进行对比的P值
表A-11D.多剂量依普利农药代动力学参数的算术平均
日本外多剂量研究 100mg 300mg 1000mg
  剂量标准化的Cmax(ng/mL)   1903.6   1194.1   739.4
  剂量标准化的AUC(0-24)hr·ng/mL   11771.99   8838.0   6324.9
  CL/F(L/hr/70kg)   9.38   15.8   17.0
  日本多剂量研究   400mg
  剂量标准化的Cmax(ng/mL)   1030.8
  剂量标准化的AUC(0-24)hr·ng/mL   6380.0
  CL/F(L/hr/70kg)   16.2
表A-11E.多剂量SC-70303药代动力学参数的算术平均
  日本外多剂量研究   100mg   300mg   1000mg
  剂量标准化的Cmax(ng/mL)   128.5   121.4   83.03
  剂量标准化的AUC(0-24)hr·ng/mL   663.4   733.4   631.0
  日本多剂量研究   400mg
  剂量标准化的Cmax(ng/mL)   84.68
剂量标准化的AUC(0-24)hr·ng/mL 467.5
本研究是单盲的、随机的、安慰剂对照的、逐步增加口服剂量的连续研究，其中对40位日本健康男性受试者给予5组剂量(50，100，200，400 and 600mg)中的一组剂量。每组包括给予依普利农的6位受试者和给予安慰剂的2位受试者。在禁食和喂养两种状态下交叉设计以对受试者给予单剂量100mg依普利农，从而也在同一研究的六位受试者中对食物影响进行评估。在48小时内收集一系列的血样和尿样以对依普利农的药代动力学进行评估。
在测量的临床实验参数中没有临床上显著的反常状况，没有报道任何参加本研究的志愿者的副作用。
实施例A-12：多剂量日本人药代动力学研究
在日本，以日本受试者做实验对象进行了多剂量安全和药代动力学研究。这是单盲的、随机的且以安慰剂做对照的研究。总共有8位日本男性受试者参与了这项研究(其中6位接受了400mg依普利农的单剂量给药，另2位接受了连续7天的安慰剂给药)。在整个研究过程中收集一系列的血样和尿样以用于在单剂量给药的第1天和给药后7天进行药代动力学参数、肾脏和激素参数研究，
接受依普利农给药的一个实验受试者在第二天出现了轻微的疲劳，但另7位受试者没有报道有其他的副作用。
实施例A-13：肝损害
这是一项在16位正常的健康受试者和16位患有中度肝损害的受试者中进行的开放标记的多剂量研究。按照Child-Pugh分类***，参与实验者的肝损害是B级(存在腹水情况)。这些肝损害个体在性别、年龄、体重和吸烟状况上与正常的健康志愿者相匹配。
在第一天早上，对所有的参与研究者给予400mg单剂量依普利农。在第二天没有对他们进行研究药物给药。在第3-7天，对受试者给予400mg单剂量依普利农。在给药前和给药后第1和7天，收集血样和尿样以进行药代动力学分析。
对于患有肝损害的受试者来讲，允许对与受试者的肝病或其并发症相关的疾病进行治疗。不允许进行对研究结果具有潜在影响的治疗方式。在整个研究中，伴随治疗的给药要一致。
从对第一剂研究药物给药前5天到给药期结束，受试者要接受一种受控制的含盐食品(每天50mEq钠和80mEq钾)。在研究药物的给药期内，确定基线的和每24小时的肌酐清除率和钠分泌率。
主要在几何平均值的比及标准药代动力学变量的对数字的平均值比的的95％置信区间基础上，将适度肝损害受试者的依普利农生物利用度与健康的受试者的依普利农生物利用度进行比较。按照下面步骤就可得到几何平均值的比和平均值的比的95％置信区间：利用SAS GLM程序的LSMEANS选项可得到最小差并利用ANCOVA得到它们相应的标误估计值以构建平均差的95％置信区间；反对数转化平均差和平均差的置信区间的终点，从而得到几何平均值的比和平均值的比的95％置信区间。
在依普利农给药的第4-8天，分别对这两组肝损害组的最低血浆浓度(Cmin)数据进行总结。在依普利农给药的第6-8天，对Cmin数据进行重复的测量分析以评估在对依普利农进行400mg QD多剂量给药的第四天时依普利农是否达到了稳态。
在利用多剂量AUC0-24和单剂量AUC0-∞间的几何平均值及平均值比的95％置信区间对多剂量AUC0-24和单剂量AUC0-∞进行比较的基础上对线性动力学进行了评估，而其中的平均值的比是利用对数转化的AUC数据、通过成对t-检验得到的。
由于正常的受试者与那些患有肝损害的受试者相匹配，所以患有肝损害的受试者和与其相对应的正常受试者间在性别、体重和年龄上没有统计学上的显著差异。在每个肝损害组及相匹配的正常组中，受试者主要是高加索人(＞82％)。受试者年龄在32-64岁，每个组的平均年龄约为46-51岁。每个组中的绝大多数受试者是男性(65％)。
确定了肝损害的病因主要是酒精性肝硬化(56％)、随后是感染性肝硬化(17％)、慢性活动性肝炎(6％)及其他(17％)。患有中度肝损害的受试者的平均诊断了6.6年。28％(5/18)患有适度肝损害的受试者吸烟，而相对应的35％(6/17)的正常受试者吸烟。
表A-13A单剂量和多剂量给药后的依普利农数据统计总结
  依普利农
  单剂量   多剂量
  参数(a)   正常的   中度的   正常的   中度的
  AUC(ng/mL*hr)(b)n平均值％CV 1631015.37(38.73) 1751438.98(46.50) 1733784.48(46.94) 1648821.25(32.87)
  Cmax(ng/mL)n平均值％CV 173840.23(28.30) 183787.53(35.69) 173883.18(33.17) 184168.10(26.95)
  Tmax(hr)n平均值％CV 172.03(49.64) 182.56(42.38) 172.12(49.05) 182.81(50.83)
  T1/2(hr)N平均值％CV 166.31(37.20) 176.78(25.49) 177.61(26.67) 188.07(26.58)
  CL/F(L/hr)(c)n平均值％CV 1615.21(46.33) 1710.51(81.02) 1713.82(36.01) 168.96(29.33)
  XU0-48(μg)n平均值％CV 168.78(64.97) 1410.27(75.25) 169.12(86.79) 1016.92(71.42)
表A-13B展示了依普利农的药代动力学参数的最小几何均方、95％置信区间和相应的p值
表A-13B生物利用度评估
  参数   最小均方   中度/正常的平均值之比   平均值比的95％CI   p-值
  中度损害   正常
  依普利农单剂量AUC(0-∞)(ng/mL*hr)AUC(0-1qc)(ng/mL*hr)CL/F(L/hr)Cmax(ng/mL)Tmax(hr)XU(0-48)(mg) 43578.342766.89.23406.82.77.9 29114.130276.513.73812.52.17.8 1.4971.4130.6680.894--1.016 (1.056，2.121)(1.004，1.988)(0.471，0.947)(0.723，1.105)--(0.540，1.915) 0.025*0.048*0.025*0.2880.0840.958
  依普利农多剂量AUC(0-24)(ng/mL*hr)CL/F(L/hr)Cmax(ng/mL)Tmax(hr)XU(0-48)(mg) 43765.99.13808.82.914.9 30066.413.33674.62.17.4 1.4560.6871.037--2.007 (1.163，1.821)(0.549，0.860)(0.863，1.245)--(1.007，3.999) 0.002**0.002**0.6930.0910.047*
  p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001
表A-13C线性动力学评估
  参数   最小均方   平均值之比AUC(0-24)/AUC(0-∞)   平均值之比的95％CI
  单剂量AUC(0-∞)   多剂量AUC(0-24)
  依普利农中度肝损害正常 49815.4728713.97 47239.7829318.67 0.951.02 (0.84，1.07)(0.93，1.12)
在第6-8天对最低血浆浓度进行的重复测量分析结果表明，在依普利农400mg QD剂量给药的第4天就得到了依普利农的稳态浓度(正常受试者日作用的p值为0.0761，而患有适度肝损害的受试者的p值为0.1118)。
在单剂量给药后3小时和多剂量给药后的所有时间内，患有适度肝损害的受试者的依普利农血浆浓度始终比正常受试者的要高(图A-30)。
本研究表明，依普利农的代谢不会受到适度肝损害的负面影响。单剂量(400mg)和多剂量(400mg QD)依普利农给药后，患有适度肝损害的受试者血浆中的依普利农(由AUC表示)在统计上要显著高于与之对应的正常组受试者(依普利农要高41-50％)。在依普利农多剂量400mg QD给药后的第四天，血浆依普利农浓度达到稳态。
在单剂量(AUC0-∞，43578.3对29114.1ng/mL hr)和多剂量(AUC0-24，43765.9对30066.4ng/mL hr)给药后，相对于与之对应的正常受试者，患有适度肝损害的受试者的AUC值在统计学上具有显著的增加。在患有适度肝损害的受试者中，相对于与之对应的正常受试者，单剂量给药后的平均依普利农AUC值要高41-50％，多剂量给药后的平均依普利农AUC值要高46％。然而，在这两组间，平均峰值依普利农血浆浓度(Cmax)和达到依普利农Cmax的时间(Tmax)在统计学上没有显著差异。在多剂量400mg依普利农QD给药后，确立了依普利农的线性动力学。对这两个待分析对象来讲，平均AUC值的比(AUC0- 24/AUC0-∞，)的95％置信区间包括等同点1.0。在第6-8天对最低血浆浓度进行的重复测量分析结果表明，在这两个组中，在依普利农400mg QD剂量给药的第4天依普利农就达到了稳态浓度(日作用的p值≥0.0761)。
虽然患有适度肝损害的受试者的总的依普利农浓度较正常受试者的要高，但这两组的受试者都同样很好的耐受了本研究治疗。肝功能正常的受试者中有35％的受试者报告产生了副作用，而患有中度肝损害的受试者中有44％的受试者报告产生了副作用。副作用在程度上一般是轻微到中度的，并与研究方法有不确定的或可能的联系。没有导致退出本研究的不利事件，也没有报告有严重的不利事件出现。
依普利农给药后，与其对应的正常受试者相比，患有中度肝损害的受试者的血浆依普利农浓度(由AUC表示)在统计学上显著较高(依普利农浓度高41-50％)。在多剂量依普利农400mg QD给药后4天，依普利农的血浆浓度达到稳态。虽然患有中度肝损害的受试者的依普利农浓度较正常受试者的要高，但这两组的受试者都同样很好的耐受了本研究方法。
实施例A-14：依普利农在治疗高血压上的临床作用
在患有高血压的受试者中进行了多中心、随机、双盲的平行组研究。研究设计是要将多种剂量的依普利农(EPL)对血压(BP)、耐受性和安全的影响与安慰剂(PL)进行比较。给予螺内酯作为主动对照组。本研究包括两周预处理时间来完成筛选操作并终止现行的任何抗高血压治疗。筛选期后是为期4周的单盲安慰剂入组治疗期。随后是为期8周的随机双盲主动或安慰剂治疗期。
主要的有效性测量值是与安慰剂相比的用缚带测量的最低点的舒张压从基线的改变。次要的有效性测量值包括缚带确定的谷底收缩压的变化和通过移动血压监测确定的24小时内舒张压和收缩压平均值的变化。通过常规的临床实验监测、体检、ECGs、和副作用监测来进行安全评估。
对总共417名受试者进行随机分配来接受下列三种每日剂量：(1)依普利农(50、100或400mg，QD给药或以多次剂量给药)，(2)螺内酯(100mg/天，每天多次给药)，或(3)安慰剂。从基线血压到最后的诊视血压(mm Hg)的校正的平均改变在表A-14A中有描述。
表A-14A：在利用依普利农、螺内酯和安慰剂进行的双盲治疗中的血压变化
  EPL   SPL   PL
  mg/天(方案)   50mg(25BID)   100mg(50QD)   100mg(50BID)   400mg(100QD)   400mg(200BID)   400mg(400QD)   100mg(50BID)
  缚带   DBPSBP   -4.4-8.1   -4.5-4.4   -7.8-11.7   -4.4-7.9   -8.9-14.8   -8.7-15.0   -9.5-16.7   -1.11.6
  ABPM   DBPSBP   -4.1-7.5   -5.1-6.2   -6.6-11.6   -5.6-9.6   -9.0-16.1   -7.7-13.7   -8.7-15.8   0.40.0
  ABPM＝移动血压监测QD＝每日一次BID＝每日两次
这些反应与对安慰剂的反应有显著差异(p±0.05)。不管EPL是以QD或BID方式给药，在最低点(后4小时)的24小时ABPM DBP和SBP减少都是类似的。对所有剂量来讲，QD和BID给药的峰与谷之比是类似的，这表明24小时内每日一次的依普利农给药的抗高血压效力是持续不变的。受试者对依普利农具有很好的耐受性，副作用发生率与安慰剂的类似，并且没有男性乳腺增生发生。
在如这样的因素如种族(黑人、非黑人、日本人等)、性别、年龄、血浆肾素水平、醛固酮/肾素活性比、尿钠与尿钾之比、糖尿病、高血压病史、心衰病史、肾脏功能障碍病史等的基线记录基础之上，对亚群进行主要的和次要的有效性测量值的亚组分析。基于亚组的连续测量值，如年龄，可以在中位数处一分为二。
实施例A-15：在患有左室肥厚和原发性高血压的受试者中对依普利农和依那普利单独给药及两者联合给药的有效性和安全性进行对比研究.
在患有左室肥厚(LVH)和原发性高血压的受试者中，对血压(BP)变化和左室心肌重量(LVM)变化进行为期9个月的处理后，进行了一项临床研究来评估依那普利和依普利农单独给药和将两者联合给药的影响，其中血压(BP)变化和左室心肌重量(LVM)变化是通过磁共振成像(MRI)来进行测定的。此项研究是多中心、随机、双盲、安慰剂入组的平行组实验，而此实验最后最少涉及150位患有LVH和原发性高血压的受试者，且此实验包括1-2周的预处理筛选期，随后是为期2周的单盲安慰剂入组期和为期9个月的双盲治疗期。
将要进入单盲安慰剂入组期的受试者(1)(a)按照Sokolow Lyonvoltage标准(Sokolow M et al.Am Heart J 1949；37：161)或(b)按照Devereux标准(对男性受试者来说，其LVMI＝134g/m2，对女性受试者来说，其LVMI＝110g/m2；见Neaton JD et al.JAMA1993；27：713-724)，以前的心电图显示其患有LVH；以及(2)具有如下所示的坐位血压：(a)如果目前接受抗高血压治疗，那么seDBP＜110mmHg及seSBP＝180mmHg，或(b)如果目前没有接受抗高血压治疗，那么seDBP＝85mmHg和＜114mmHg以及seSBP＞140mmHg和＝200mmHg。
在第2次诊视的单盲安慰剂入组期内，所有受试者必需具有可证明其患有符合Devereux标准的LVH的超声心动图。在为期两周的单盲安慰剂入组期和MRI检查后，在中心实验室认为可以接受进入实验的情况下，将受试者随机分配到3个组中：依普利农、依那普利或依普利农加依那普利各给予10mg剂量。在开始两周的双盲治疗期内，病人将接受(1)依普利农50mg加安慰剂，(2)依那普利10mg加安慰剂，或(3)依普利农50mg加依那普利10mg。在第2周，强制滴定给予所有受试研究药物(1)依普利农100mg加安慰剂，(2)依那普利20mg加安慰剂，或(3)依普利农100mg加依那普利10mg。在第4周，强制滴定给予所有受试研究药物(1)依普利农200mg加安慰剂，(2)依那普利40mg加安慰剂，或(3)依普利农200mg加依那普利10mg。表A-15A图示了上述的剂量方案。
表A-15A.研究药物剂量水平
  剂量水平   随机化的研究药物   片剂/胶囊的数目
  依普利农   依那普利   依普利农+依那普利
  安慰剂入组   安慰剂   安慰剂   安慰剂   1片剂/1胶囊
  剂量1   50mg   10mg   (50+10)mg   1片剂/1胶囊
  剂量2   100mg   20mg   (100+10)mg   1片剂/1胶囊
  剂量3   200mg   40mg   (200+10)mg   2片剂/2胶囊
氢***12.5
氨氯地平10mg
如果在第8周时未对BP进行控制(DBP＝90mmHg或SBP＞180mmHg)，就要添加开放标记的12.5mg氢***(HCTZ)。如果在第10周没有对BP进行控制，(1)如果HCTZ给药是在第8周开始的，那么HCTZ剂量要增加到25mg，或(2)如果在第8周没有进行HCTZ给药，那么就要添加给予12.5mg HCTZ。如果在第12周没有对BP进行控制，(1)如果在第8或10周没有对HCTZ给药，那么要添加给予12.5mg开放标记的HCTZ，或(2)如果在第10周没有对HCTZ给药，那要将HCTZ给药量增加到25mg，或(3)如果受试者接受了25mg HCTZ给药，那要对其添加给予10mg氨氯地平。如果在第16周和随后的诊视时，受试者呈现持续未控制的DBP(也即seDBP＝90mmHg或seSBP＞180mmHg，保持连续两次诊视时间，间隔3-10天)，此受试者就要从研究中退出。
如果受试者仅仅单独接受双盲治疗并在研究进程的任何时间显示出低血压症状，那此受试者也要退出实验。那些正在接受开放标记治疗的受试者的滴定将以与添加时相反的顺序进行，直至他们的低血压症状解决。如果终止给予开放标记药物后低血压症状仍然存在，受试者将要从实验中退出。在本研究任何时候，在间隔1-3天的连续两次诊视时间内，如果重复检测到的血清钾水平升高(＞5.5mEq/L)(BUN肌酐水平下降也可，对样品进行分配并送到本地和中心实验室，在本地实验室的测量值基础上做出处理决定)，那么此受试者也要退出实验。注意：如果BUN和/或肌酐水平显著高于基线水平(肌酐＝2.0mg/dL或＝1.5×基线值或BUN＝35mg/dL或＝2×基线值)，则应对此受试者进行治疗直至问题解决。
在第0、2、4、6、8、10、12、16周让受试者返回诊所进行评估，以后每月一次评估，持续9个月。每次诊视要对心率、BP、血清钾水平以及副作用进行评估。在第2和第6周对BUN和肌酐水平进行确定。每月额外对血液进行临床安全性实验室评估。每三个月进行一次常规的尿液分析。在第0、12周和第6和9月进行神经激素特征(血浆肾素[总的和活性的]、血清醛固酮以及血浆可的松)和特殊研究(PIIINP、PAI、微白蛋白尿及tPA)。在第0周收集血样用于基因分析。在筛选期和第9月进行12导联ECG和体检。在第0周和第9月，利用MRI对LV重量变化进行检验、对血样进行存储潴留检验、对血样进行促甲状腺激素(TSH)检验、对24小时采集的尿样进行白蛋白、钾、钠和肌酐分析。在第0和12周及在第6和9月对收集的24小时尿样进行尿醛固酮检测。在提前结束的情况下，对那些已经接受至少3月的双盲治疗的受试者进行MRI并对血样进行TSH检测。在第0和12周及第6和9月，收集所有受试者的数据。
下表图解了研究方案：
Figure C0081981601171
(1)每个患有LVH的受试者的心电图或超声心动图               (6)如果DBP≥90mmHg或SBP≥180mmHg，如果在第8周没有进行任何
(2)对未受控制的BP的补救标准，如4，5部分所描述。          添加给药，那要进行开放标记的，12.5mg HCTZ添加给药，如果在第8周
(3)MRI                                                   进行了12.5mg HCTZ添加给药，那将添加给药的HCTZ剂量增加到25mg。
(4)强制滴定。在本研究任何时候，在间隔1-3天的连续两次     (7)如果在第12周没有对BP进行控制，如果在第8或10周没有对HCTZ给药，
诊视时间内，如果重复检测到血清钾水平升高                 那么要添加给予12.5mg开放标记的HCTZ，或如果在第10周没有对
(K＞5.5mEq/L)，那么此受试者也要退出实验。                HCTZ给药，那要将HCTZ给药量增加到25mg，或如果受试者接受了
(5)对于DBP≥90mmHg或SBP＞180mmHg，                       25mg HCTZ给药，那要对其添加给予10mg氨氯地平。
添加给予开放标记的12.5mg HCTZ。                          (8)如果在第l6周和随后的任何诊视时间，受试者呈现持续未控制的BP，
                                                         也即seDBP≥90mmHg或seSBP＞180mmHg，并持续连续两次间隔
                                                         3-10天的诊视时间，此受试者就要从研究中退出。
Pb0＝安慰剂En＝依那普利
在依普利农组与依那普利组中，主要的有效性测量值是如利用MRI所检测的LVM从基线开始的变化。另外，需要利用tertile对受试者的盐敏感程度进行有效性评估(其中tertile是通过对盐刺激产生的血压反应增加来进行经验确定的)。
次要的有效性测量值如下：(1)三个治疗组的受试者中从基线开始的LVM变化；(2)每个治疗组的受试者中从基线开始的袖带式血压计测量的坐位血压(seDBP)和SBP(seSBP)变化；(3)主动脉顺应性和心室充盈参数；以及(4)具体研究(PIIINP、微白蛋白尿、PAI及tPA)。另外，对三个组中的受试者进行长期的安全性和耐受性比较。
本项研究的主要目的是在患有LVH和原发性高血压的受试者中对依那普利和依普利农在左室心肌重量(LVM)变化上的作用进行比较。次要的研究目的如下：(1)比较三个治疗组受试者中从基线开始的LVM变化(2)通过测量坐位的袖带式血压计测量的最低DBP和SBP来对三个治疗组受试者中的抗高血压作用进行比较；(3)在三组受试者中通过MRI检测来对两种给药在主动脉顺应性和心室充盈参数上的影响进行比较；(4)在三个治疗组中，通过测定III型原胶原蛋白(PIIINP)的氨基末端前肽来比较不同给药对纤维化指标的影响、通过测定微白蛋白尿来比较不同给药在肾脏肾小球功能上的影响及通过测量纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂(PAI)和组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)来比较不同给药在纤维蛋白溶解平衡上的影响；以及(5)对三个治疗组进行长期安全性和耐受性比较。
在如这样的因素如性别、年龄、血浆肾素水平、醛固酮/肾素活性比、尿钠与尿钾之比、糖尿病存在、高血压病史、心衰病史、肾脏功能障碍病史等的基线记录基础之上，对其他亚群进行主要的和次要的有效性测量值分析。基于亚组的连续测量值，如年龄，可以在中位数处一分为二。
实施例A-16：在患有低肾素性高血压的受试者中进行依普利农和洛沙坦作用对比研究
在患有低肾素高血压的受试者中进行了一项旨在对比依普利农和洛沙坦在抗高血压方面的作用的临床研究。此项研究是多中心、双盲、随机、安慰剂入组的平行组实验，而此实验最后最少涉及150位受试者。利用刺激-单向试验对每位受试者进行盐敏感性检验。实验也包括1-2周的预处理筛选期，随后是为期2周的单盲安慰剂入组期和为期16周的双盲治疗期。在安慰剂入组期结束，将在连续两次插补诊视中都符合入组血压标准(平均坐位舒张压[seDBP]＝90mmHg和＝115mmHg及平均坐位收缩压[seSBP]＜200mmHg)的受试者随机分配到接受依普利农或洛沙坦给药的组中。在开始的4周内，要对受试者给予100mg依普利农或50mg洛沙坦。如果在第四周时血压没有得到控制(DBP＝90mmHg)，那就要增加研究治疗剂量至200mg依普利农或100mg洛沙坦。如果在第8周时BP没有得到控制，就要补加给药12.5mg氢***(HCTZ)。如果在第12周时BP没有得到控制，如果没有在第8周补加给药，那就要补加给予12.5mg HCTZ，如果在第8周开始补加给药，那就将HCTZ的给药剂量增加到25mg。对受试者进行持续治疗直至第16周。表A-16A图示了上述的剂量方案。
表A-16A.研究药物剂量水平
  剂量水平   随机化研究治疗   片剂/胶囊数目依普利农片剂/洛沙坦胶囊*
  依普利农   洛沙坦   安慰剂
  安慰剂入组   相应的安慰剂   相应的安慰剂   相应的安慰剂   1片剂/1胶囊
  剂量1   50mg   50mg   相应的安慰剂   1片剂/1胶囊
  剂量2   100mg   100mg   相应的安慰剂   1片剂/1胶囊
  剂量3   200mg   1000mg   相应的安慰剂   2片剂/2胶囊
*“依普利农片剂”指活性依普利农或与之相匹配的安慰剂，″洛沙坦胶囊″指活性洛沙坦或与之相匹配的安慰剂。
每次诊视(0、2、4、6、8、10、12、14和16周)，对心率、BP、血清钾水平和副作用进行评估。在第0周，收集血样以用于基因分析和存贮潴留分析，收集24小时尿样以用于醛固酮、钾、钠、肌酐和肌酐清除率分析；贮藏第0周时的一份24小时尿样收集物以在筛选期确定血浆肾素水平；在第0、8、16周确定血清醛固酮、血浆肾素和血浆可的松水平。在第0、4、8、12、16周对临床安全性进行额外的实验室评估(血液学、血液化学和尿液分析)。在第0和16周进行12导联心电图。在筛选期和第16周完成体检。
下表图解了研究方案：
*简短的办公室诊视以评估重要的生命体征、K+和副作用
(1)对未受控制的BP的补救标准，如4、5部分所描述。
(2)受试者必需在连续两次诊视时符合入组BP标准以进入双盲阶段
(3)用于基因分析的血样
(4)如果BP没有得到控制(DBP≥90mmHg)，将剂量增加到200mg依普利农或100mg洛沙坦
(5)如果BP没有得到控制(DBP≥90mmHg)，添加给予12.5mg HCTZ。
(6)如果BP没有得到控制(DBP≥90mmHg)，如果在第8周没有进行任何添加给药，那要添加给予12.5mg HCTZ，如果在第8周进行了12.5mg HCTZ添加给药，那将HCTZ的添加给药剂量翻倍。
对于依普利农和洛沙坦给药，主要的有效性测量值是第8和16周时袖带式血压计测量的坐位血压seDBP从基线开始的平均变化。另外，利用tertile对受试者的盐敏感程度进行作用评估(其中tertile是通过对盐刺激产生的血压反应增量来进行经验确定的)。
次要的有效性测量值如下：(1)第8和16周时，袖带式血压计测量的最低坐位血压seSBP从基线开始的平均变化；(2)需要HCTZ增加给药的受试者的百分数；及(3)符合目标BP(DBP＜90mmHg)或降低10mmHg血压的DBP的百分数。其他次要的有效性测量值可用以在接受依普利农和洛沙坦治疗的受试者中评估seDBP从基线开始的变化和预处理醛固酮/肾素比及24小时尿样检测(尿醛固酮，钾、钠、肌酐和肌酐清除率)之间的联系，并通过报告的副作用、临床实验评估结果、体检和心电图来对依普利农和洛沙坦的安全性和耐受性进行评定。
在本研究中的受试者是患有低肾素性高血压的受试者，将依普利农的作用与选择性血管紧张素II受体拮抗剂洛沙坦来进行比较。在第8和12周，向两组中患有未控制的高血压的受试者添加给予氢***(HCTZ)。HCTZ可激活RAAS，从而证明了其在药物成功中的激活作用。本项研究的主要目的是在第8和16周，在患有低肾素高血压的受试者中对依普利农和洛沙坦在袖带式血压计测量的坐位收缩压BP(seDBP)从基线开始的变化上的作用进行比较。次要的研究目的如下：(1)在依普利农和洛沙坦治疗组受试者中对比第8和16周时袖带式血压计测量的坐位收缩压(seSBP)从基线开始的平均变化、对比需要增加HCTZ给药的受试者的百分数、以及对比符合目标BP(DBP＜90mmHg和DBP存在10mmHg的血压下降)的受试者的百分数；(2)在依普利农和洛沙坦治疗组受试者中评估seDBP从基线开始的变化和预处理期醛固酮/肾素比及预处理期24小时尿样检测(尿醛固酮，钾、钠、肌酐和肌酐清除率)之间的联系；以及(3)通过报告的副作用、临床实验评估结果、体检和心电图来对依普利农和洛沙坦的安全性和耐受性进行评定。
在如这样的因素如种族(黑人、非黑人、日本人等)、性别、年龄、血浆肾素水平、醛固酮/肾素活性比、尿钠与尿钾之比、糖尿病存在、高血压病史、心衰病史、肾脏功能障碍病史等的基线记录基础之上，对其他亚群进行主要的和次要的有效性测量值分析。在连续测定如对年龄的连续测定的基础上，在中位数处将亚群一分为二。
实施例A-17：在黑人和白人高血压受试者中进行依普利农、安慰剂及洛沙坦在抗高血压作用和安全性上的比较研究
在黑人和白人高血压受试者中，进行旨在对比依普利农、安慰剂和洛沙坦在抗高血压作用及安全性和耐受性的临床研究。在此研究中，高血压定义为坐位舒张压(DBP)＝95mmHg和＜110mmHg及坐位收缩压(SBP)＜180mmHg。此项研究是多中心、随机、双盲、安慰剂和主动对照、安慰剂入组的平行组实验，其最后最少涉及500位患有适度高血压的随机的黑人和白人受试者。利用刺激-单向试验对每位受试者进行盐敏感性检验。实验进一步包括1-2周的预处理筛选期，随后是2-4周的单盲安慰剂入组期和为期16周的双盲治疗期。实验中要维持黑人受试者与白人受试者约2∶1的平衡比例，在每个研究中心要进行预先安排。在单盲安慰剂入组期结束后，对符合条件的受试者随机给予依普利农、安慰剂或洛沙坦。
在开始的4周内，要对双盲治疗受试者给予100mg依普利农、50mg洛沙坦或与之相应的安慰剂。如果在第4、8或12周时血压没有得到控制(DBP＝90mmHg或SBP＝140mmHg)，那就要增加研究治疗剂量至100mg依普利农或100mg洛沙坦或与之相应的安慰剂。对于能完全控制血压的受试者来讲，给药剂量不变。如果在第8或12周时血压没有得到控制(DBP＝90mmHg或SBP＝140mmHg)且受试者接受100mg依普利农或100mg洛沙坦或与之相应的安慰剂给药，那就要增加研究治疗剂量至200mg依普利农或100mg洛沙坦或与之相应的安慰剂。在第2、6、10周，不在增加研究治疗剂量，留出时间以使现有剂量的作用发挥完全。表A-17A图示了上述的剂量方案。
 表A-17A.研究药物剂量水平
  剂量水平   随机化研究治疗   片剂/胶囊数目
  依普利农   洛沙坦   安慰剂
  安慰剂入组   相应的安慰剂   相应的安慰剂   相应的安慰剂   1片剂/1胶囊
  剂量1   50mg   50mg   相应的安慰剂   1片剂/1胶囊
  剂量2   100mg   100mg   相应的安慰剂   1片剂/1胶囊
  剂量3   200mg   1000mg   相应的安慰剂   2片剂/2胶囊
如果在12周或其后时间内的血压得不到控制(DBP＝95mmHg或SBP＝150mmHg)，并且受试者接受的是研究药物的最高耐受剂量，他/她就要退出本研究。如果在研究进行中的任何时间出现了低血压症状(也即头昏目眩、眩晕、或与低血压相关的昏厥)，可将研究药物减量给药至下一个更小的剂量；然而，如果受试者接受的是研究药物的最小剂量(依普利农50mg、洛沙坦50mg、或与之对应的安慰剂)，或者在实验期内1-3天间隔的连续两次诊视时，如果DBP＝110mmHg或SBP为180mmHg，那么此受试者也要退出本研究。受试者要接受为期16周的研究治疗。
受试者要在第0、2、4、6、8、10、12、14、16和17周返回诊所进行评估。每次诊视要对心率、BP、血清钾水平和副作用进行评估。在第0、16、17周或最后一次诊视时对安全性进行血液学和生物化学评估及尿液分析。另外，在第0、16周和最后一次诊视时收集神经激素特征(血浆肾素[总的和活性的]、血清醛固酮以及血浆可的松)。在第0、16、17周或最后一次诊视时当时就进行尿样的微白蛋白尿检验。在筛选期、第17周和最后一次诊视时进行12导联心电图检查并体检。
作为实验的一部分，通过100位受试者/部分(总共300位受试者)进行了旨在确定群体药代动力学的亚研究。在第0天、3A和SA诊视时要对血浆依普利农浓度进行确定。在第0天、3A和5A诊视时收集两份7mL血样。在第0天时，在第0小时(给药前)收集第一份血样并在对研究药物起始给药后1小时收集第二份血样；对3A和5A诊视来讲，受试者要在早上回去进行临床评估前在他/她通常安排的时间服用研究药物，间隔1小时收集两份血样。在3A和5A诊视时，要将受试者安排在一个上午或一个下午进行诊视。
下表图解了研究方案：
Figure C0081981601241
(1)在研究中的任何时间，如果在间隔1-3天的连续两次诊视时受试者的DBP≥110mmHg或SBP≥180mmHg，则此受试者需退出研究。
(2)如果BP没有得到控制(DBP≥90mmHg或SBP≥140mmHg)，那就要增加研究治疗剂量至100mg依普利农或100mg洛沙坦或与之相应的安慰剂。
(3)如果BP没有得到控制(DBP≥90mmHg或SBP≥140mmHg)，如果以前接受的剂量是100mg依普利农或100mg洛沙坦或与之相应的安慰剂，那就要增加剂量至200mg依普利农或200mg洛沙坦加安慰剂或与之相应的安慰剂。
(4)如果实验中任何时间出现了低血压症状并且受试者不是接受研究药物的最低剂量给药，则可将研究药物给药剂量降低到下一个更低的剂量：然而，如果受试者接受的是最低剂量(依普利农50mg或洛沙坦50mg或与之相应的安慰及)。他/她必需退出研究实验。
(5)收集群体PK样品
(6)如果在间隔1-3天的连续两次诊视时钾水平都升高(钾浓度＞5.5mEq/L)，如果接受的最是低剂量研究药物给药，那此受试者就必需退出研究。如果不是接受的最低剂量给药，可将研究药物剂量降低一个水平。研究药物降低给药后，如果在间隔1-3天的连续两次诊视时钾水平仍然＞5.5mEq/l，那此受试者就必需退出研究。如果在间隔1-3天的连续两次诊视时钾水平＞5.0mEq/L但第12周后DBP≥95mmHg或SBP≥150mmHg，那此受试者就必需退出研究。≤5.5mBq/L，则需增加研究药物的给药剂量。这种情况下，如果在第12周前DBP≥90mmHg或SBP≥140mmHg或在第12周时或
(7)如果在第12周前BP没有得到控制(DBP≥90mmHg或SBP≥140mmHg)或在第12周时或第12周后DBP≥95mmHg或SBP≥150mmHg并且受试者接受的是研究药物最大给药剂量，他/她必需退出研究。
对于对所有受试者(黑人和白人)给予依普利农和洛沙坦，主要的有效性测量值是第16周时袖带式血压计测量的坐位最低DBP从基线开始的平均变化。另外，利用tertile对受试者的盐敏感程度进行作用评估(其中tertile是通过对盐刺激产生的血压反应增加来进行经验确定的)。主要的安全性终末点是严格的，并且在为期16周的实验期内没有出现严重的副作用、受试者退出和实验室异常情况。
次要的终末点如下：(1)第16周时，在所有患者和各种族内及种族间，依普利农相对于安慰剂给药时，袖带式血压计测量的坐位血压DBP从基线开始的平均变化；(2)第16周时，在所有患者及各种族内和种族间，依普利农给药时相对于洛沙坦，袖带式血压计测量的坐位血压从基线开始的平均变化；(3)第16周时，在所有患者及各种族内和种族间，依普利农相对于安慰剂或洛沙坦给药时，袖带式血压计测量的坐位血压DBP从基线开始的平均变化；(4)第16周时，在所有患者及各种族内和种族间，依普利农相对于安慰剂或洛沙坦给药时，通过微白蛋白尿与肌酐之比确定的微白蛋白尿从基线开始的平均变化；(6)第16周时，在所有患者及各种族内和种族间，依普利农相对于安慰剂或洛沙坦给药时，血清钾、镁、钠、白蛋白及肌酐从基线开始的平均变化；(7)第16周时，在所有患者及各种族内和种族间，依普利农相对于安慰剂或洛沙坦给药时，神经激素特征(血浆肾素[总的和活性的]、血清醛固酮以及血浆可的松)从基线开始的平均变化；(8)在所有患者及各种族内和种族间，依普利农相对于安慰剂及洛沙坦给药时，研究药物在选定的亚群，如女人、老年人(65岁)、肥胖者(体重指数＝30kg/m2)、微白蛋白尿(尿白蛋白与肌酐之比＞.041mg白蛋白/mg肌酐)以及特殊的高血压患者(SBP＝160mmHg)中对神经激素、代谢、肾脏和抗高血压所产生的作用从基线开始的平均变化；以及(9)依普利农相对于可影响药物表观清除率的患者因素(共变量)的血浆浓度-时间图。
本研究的主要目的是(1)第16周时，按照测量的坐位舒张压(DBP)值，比较依普利农、安慰剂在所有患有轻微到中度高血压的受试者(黑人和白人)的抗高血压作用；及(2)在接受为期16周治疗的所有受试者中，对比依普利农与安慰剂的安全性和耐受性。
本研究的次要目的为(1)按照DBP测量结果，对比依普利农和安慰剂在黑人和白人高血压患者内和黑人和白人高血压患者之间产生的抗高血压作用；(2)按照DBP测量结果，对比依普利农和洛沙坦在黑人和白人高血压患者内和黑人和白人高血压患者之间产生的抗高血压作用；(3)按照坐位收缩压(SBP)测量结果，对比依普利农和安慰剂或洛沙坦给药在黑人和白人高血压患者内和黑人和白人高血压患者之间产生的抗高血压作用；(4)按照现场尿样的微白蛋白尿检验结果，对比依普利农和安慰剂或洛沙坦给药在黑人和白人高血压患者内和黑人和白人高血压患者之间对肾脏的作用；(5)按照血清钾、镁、钠、白蛋白和肌酐水平的检测结果，对比依普利农和安慰剂或洛沙坦给药在所有黑人和白人高血压患者内和黑人和白人高血压患者之间对肾脏产生的作用；(6)对比依普利农和安慰剂或洛沙坦给药在所有黑人和白人高血压患者内和黑人和白人高血压患者之间对神经激素特征(血浆肾素[总的和活性的]、血清醛固酮以及血浆可的松)产生的作用；(8)依普利农和安慰剂或洛沙坦在所有黑人和白人高血压患者内和黑人和白人高血压患者之间给药时，对比研究药物在选定的亚群，如a)女人、b)老年人(65岁)、c)肥胖者(体重指数＝30kg/m2)、d)微白蛋白尿(尿白蛋白与肌酐之比＞.041mg白蛋白/mg肌酐)以及e)特殊的高血压患者(SBP＝160mmHg)的神经激素、代谢、肾脏和抗高血压方面所产生的作用；以及(9)将依普利农的血浆浓度-时间图模型化并确定可影响药物表观清除率的患者因素(共变量)。
在如这样的因素如性别、年龄、血浆肾素水平、醛固酮/肾素活性比、尿钠与尿钾之比、糖尿病存在、高血压病史、心衰病史、肾脏功能障碍病史等的基线记录基础之上，对其他亚群进行主要的和次要的有效性测量值分析。在连续测定如对年龄的连续测定基础上，在中位数处将亚群一分为二。
实施例A-18：依普利农和依那普利给药在患有2型糖尿病、白蛋白尿和高血压的受试者中的抗高血压、肾脏和代谢作用对比研究
在患有2型糖尿病、白蛋白尿和高血压的受试者中进行了一项临床研究，以此来对比依普利农、依那普利及两者结合给药在抗高血压、肾脏和代谢上的作用。此项研究是多中心、随机、双盲、主动对照、安慰剂入组的平行实验，而在此实验最后最少涉及200位患有II型糖尿病、白蛋白尿和高血压的随机受试者。利用刺激-单向试验对每位受试者进行盐敏感性检验。实验进一步包括1-2周的预处理筛选期，随后是为期2-4周的单盲安慰剂入组期和为期24周的双盲治疗期。在单盲安慰剂入组期结束后，将符合条件的受试者随机分配到下列三组中：依普利农加安慰剂、依那普利加安慰剂、或依普利农加依那普利。在双盲治疗期的最开始两周，受试者接受50mg依普利农加安慰剂、10mg依那普利加安慰剂、或50mg依普利农加10mg依那普利给药。在第2周时，将研究药物剂量强制增加到100mg依普利农加安慰剂、20mg依那普利加安慰剂、或100mg依普利农加10mg依那普利。在第4周时，将研究药物剂量强制增加到200mg依普利农加安慰剂、40mg依那普利加安慰剂、或200mg依普利农加10mg依那普利。表A-18A图示了上述的剂量方案。
表A-18A.研究药物剂量水平
  剂量水平   随机化的研究治疗   片剂/胶囊的数目
  依普利农   依那普利  依普利农+依那普利
  安慰剂入组   安慰剂   安慰剂   安慰剂入组   安慰剂
  剂量1   50mg   10mg   (50+10)mg   1片剂/1胶囊
  剂量2   100mg   20mg   (100+20)mg   1片剂/1胶囊
  剂量3   200mg   40mg   (200+40)mg   1片剂/1胶囊
氢***12.5mg
氨氯地平10mg
如果在第8周时血压(BP)没有得到控制(舒张BP[DBP]＝90mmHg)，那么10mg氨氯地平将会作为第一种开放标记药物进行给药。如果在第10周时DBP没有得到控制，如果在此之前没有进行附加给药，那就要对10mg氨氯地平增加给药，或者如果在此之前增加了10mg氨氯地平给药，那么12.5mg氢***(HCTZ)就作为第二种开放标记药物增加给药。如果在第12周或其后BP没有得到控制，那么如果在此之前没有进行附加给药，那就要对10mg氨氯地平增加给药，或者如果在此之前增加了10mg氨氯地平给药而没有增加12.5mg HCTZ给药，那么就增加12.5mg HCTZ给药，或如果以前增加了12.5mg HCTZ给药，那就将HCTZ的给药剂量增加到25mg。如果在第15周或随后的任何诊视时，受试者在连续两次间隔3-10天的诊视时持续显示相同的、未受控制的DBP＝95mmHg并且受试者接受了上述所有附加的开放标记治疗，那此受试者就要从实验研究中退出。
如果低血压症状出现并且受试者接受了增加的开放标记治疗，那就以与添加相反的顺序逐渐撤去该药物，直至低血压症状消失。如果受试者没有接受开放标记治疗，那他/她就必须退出本项研究。
在研究进程中的任何时期，在连续两次间隔3-10天的诊视时，如果受试者持续显示DBP＝110或收缩BP[SBP]＝180mmHg，或如果重复测定下血清钾水平升高(＞5.5mEq/L)(对样品进行分配并送到本地和中央实验室)，此受试者必须退出研究。
受试者要在第0、2、4、6、8、10、12、15、18、21、24和25周返回诊所进行评估。每次诊视要对心率、BP、血清钾水平和副作用进行评估。在第0、4、6、8、10、15、21、24和25周时对安全性进行血液学和生物化学评估及尿液分析。在第0、8、15和24周对胶原蛋白标记(III型原胶原的氨基末端前肽[PIIINP]、IV型胶原蛋白的7S域[7SIVC]、I型胶原蛋白端肽[ICTP])、纤维蛋白溶解平衡(纤溶酶原激活剂抑制剂[PAI-1]及组织纤溶蛋白酶原激活剂[t-PA])、胰岛素和糖化血红蛋白进行测定。在第0、8、15和24周收集药物数据。在第0、8和24周对24小时收集的尿样进行白蛋白尿测定。在筛选期和第25周进行12导联心电图检查并体检。在第0周对基因型、腰围、血浆肾素(总的和活性的)水平、以及血清醛固酮水平进行测定。
下表图解了上述的研究方案。
(1)在研究进程中的任何时期，如果受试者显示DBP≥110mmHg       (6)在第15周或其后的时间，受试者展示了持续的、未控制的BP
或SBP≥180mmHg，并持续连续两次间隔3-10天的诊视时，          (DBP≥95mmHg，并持续连续两次间隔3-10天的诊视)并且
此受试者必须退出实验。                                      受试者接受了上述的增加给予开放标记治疗，那此受试者必须
(2)强制性增加给药。在研究进程中的任何时期，如果重复测量     从本研究退出。
到血清钾水平升高(K＞5.5mEq/L)，比受试者必须退出实验。       (7)如果低血压症状出现，那此受试者必须从本研究退出。
(3)对DBP＞90mmHg的受试者开放标记、增加给药10mg氨氯地平。    (8)如果低血压症状出现并且受试者接受了给于开放标记药物，
(4)如果DBP＞90mmHg，如果以前没有增加给药，那就要开放标记    那就以与其添加相反的顺序逐渐撤去添加的药物，直至低血压
增加给药10mg药氨氯地平，或者如果以前已对氨氯地平增加给药，  症状消失。
那就要对12.5mg HCTZ开放标记增加给药。
(5)如果DBP＞90mmHg，如果以前没有增加给药，那就要增加给予
开放标记的氨氯地平，或者如果以前没有增加给药，那就增加
给予12.5mg HCTZ，或将HCTZ的剂量增加到25mg。
在第24周，主要的有效性测量值是依普利农、依那普利或两者结合给药时尿白蛋白从基线开始的变化。另外，利用tertile对受试者的盐敏感程度进行作用评估(其中tertile是通过对盐刺激产生的血压反应增加来进行经验确定的)。
次要的有效性测量值如下：(1)在第8和24周，依普利农、依那普利或两者结合给药时袖带式血压计测量的最低坐位DBP(″seDBP″)和SBP(seSBP)从基线开始的平均变化；(2)在第8和24周，依普利农、依那普利或两者结合给药时胶原蛋白指标(PIIINP、7SIVC和ICTP)、纤维蛋白溶解平衡(PAI-1和t-PA)、代谢效应(胰岛素、糖化血红蛋白、空腹血清葡萄糖、及脂质[甘油三酯、总胆固醇和HDL胆固醇])从基线开始的平均变化；(3)在依普利农、依那普利或两者结合给药时，归因于基因型、基线躯干性肥胖、基线血浆肾素水平(总的和活性的)、或基线血清醛固酮水平的抗高血压、代谢或尿白蛋白***反应从基线开始的平均变化；及(4)通过副作用、临床实验室评价、体检、生命体征及心电图来对安全性和耐受性进行评估。
相对于依那普利给药，双盲、主动对照研究是设计来确定依普利农对存在NIDDM和白蛋白尿的高血压受试者在胰岛素、甘油酯控制、肾脏功能和脂质特征上的最终影响。本项研究的主要目的是在第24周时，在依普利农、依那普利或两者结合给药的受试者中比较尿白蛋白***从基线开始的平均变化。本项研究次要目的是(1)在第8和24周，比较依普利农、依那普利或两者结合给药对袖带式血压计测量seDBP和seSBP从基线开始的平均变化的影响；(2)第24周，比较依普利农、依那普利或两者结合给药的影响，这是对胶原蛋白指标(III型原胶原的氨基末端前肽[PIIINP]、IV型胶原蛋白的7S域[7SIVC]、I型胶原蛋白端肽[ICTP])、纤维蛋白溶解平衡(纤溶酶原激活剂抑制剂[PAI-1]及组织纤溶蛋白酶原激活剂[t-PA])及代谢效应(胰岛素、糖化血红蛋白、空腹血清葡萄糖、及脂质[甘油三酯、总胆固醇和HDL胆固醇])从基线开始的平均变化进行测量得到的；(3)在依普利农、依那普利或两者结合给药时，对抗高血压、代谢或尿白蛋白***反应从基线开始的平均变化的任何差异进行测定，而这些变化要归因于基因型、基线躯干性肥胖(腰围)、基线血浆肾素水平(总的和活性的)、或基线血清醛固酮水平；以及通过副作用、临床实验室评价、体检、生命体征及心电图进行评估来对比二者的安全性和耐受性。
在如这样的因素如种族(黑人、非黑人、日本人等)、性别、年龄、血浆肾素水平、醛固酮/肾素活性比、尿钠与尿钾之比、糖尿病存在、高血压病史、心衰病史、肾脏功能障碍病史等的基线记录基础之上，对其他亚群进行主要的和次要的有效性测量值分析。在连续测定如对年龄的连续测定基础上，在中位数处将亚群一分为二。
实施例A-19：在患有升高的收缩压的受试者中进行依普利农和氨氯地平的抗高血压作用的对比研究
在患有收缩期高血压的受试者中进行了一项旨在对比依普利农和氨氯地平对舒张压的作用的临床研究。此项研究是多中心、随机、双盲、主动对照、安慰剂入组的平行组实验，此实验最后最少涉及200位患有收缩期高血压的随机受试者，而收缩期高血压定义为1)坐位收缩压(SBP)＝＝150mmHg和＜165mmHg，及脉压(PP)＝70mmHg，或2)SBP＝165mmHg和＜200mmHg，及坐位舒张压(DBP)＜95mmHg。利用刺激-单向检验对每位受试者进行盐敏感性检验。
实验进一步包括1-2周的预处理筛选期，随后是2-4周的单盲安慰剂入组期和为期24周的双盲治疗期。在单盲安慰剂入组期结束后，对符合条件的受试者随机给予依普利农或氨氯地平。双盲治疗期的最开始两周，对受试者给予50mg依普利农或2.5mg氨氯地平。在第2周，如果SBP没有得到控制(SBP＝140mmHg)，那就要将研究治疗剂量升高一个水平至100mg依普利农或5mg氨氯地平；对于能完全控制BP的受试者来讲，剂量不变。如果在第6或其后时间内SBP没有得到控制(SBP＝140mmHg)，如果没有在第2周增加剂量，那就要将研究治疗剂量提高一个水平至100mg依普利农或5mg氨氯地平，或者如果已经在第2周增加了给药剂量，那就要将研究治疗给药剂量增至200mg依普利农或10mg氨氯地平。对于能完全控制SBP的受试者来讲，剂量不变。在第10周或其后时间，如果在连续两次间隔1-3天的诊视SBP＝170mmHg并且受试者正接受最大剂量的研究药物，那他/她就必须退出研究。受试者就接受总共24周的双盲研究治疗。表A-19A图示了上述的剂量方案。
表A-19A.研究治疗剂量水平
  剂量水平   随机化的研究治疗   片剂/胶囊的数目
  依普利农   氨氯地平
  安慰剂入组   相应的安慰剂   相应的安慰剂   1片剂/1胶囊
  剂量1   50mg   2.5mg   1片剂/1胶囊
  剂量2   100mg   5mg   1片剂/1胶囊
  剂量3   200mg   10mg   2片剂/2胶囊
如果在研究进行中的任何时间出现了低血压症状(SH)(也即头昏目眩、眩晕、或与低BP相关的昏厥)，并且正在给予受试者不是最小研究药物剂量，那就要对其减少给药剂量。如果SH发生在研究药物的最低剂量给药时，那此受试者必须退出实验。
在研究进程的任何时期，如果受试者间隔1-3天的连续两次诊视时SBP＝200mmHg或DBP＝110mmHg那么此受试者必须退出本研究。受试者需接受为期24周的双盲研究治疗。
受试者要在第0、2、6、10、14、19、24和25周返回诊所进行评估。每次诊视要对心率、BP、血清钾水平、伴随治疗和副作用进行评估。在筛选期和第0、24及25周对安全性进行血液学和生物化学评估及尿液分析。在第0、14和24周或最后一次诊视时对胶原蛋白标记[III型原胶原的氨基末端前肽(PIIINP)、IV型胶原蛋白的7S域(7SIVC)、I型胶原蛋白端肽(ICTP)]、纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)及组织纤溶蛋白酶原激活剂(t-PA)、微白蛋白尿进行特殊研究，并在选定地点进行移动血压测量(ABPM)和动脉顺应性研究。在2A诊视(单盲治疗开始)和第0、14和24周或最后一次诊视时进行生活质量问卷调查。在基线期进行DNA基因分析。在筛选期和第25周或最后一次诊视时进行12导联心电图检查并体检。
下表图解了上述研究方案：
(1)在本研究的任何时间段，如果在连续两次间隔1-3天的诊视时SBP≥200mmHg或DBP≥110mmHg，则此受试者必须从本研究退出。
(2)如果BP没有得到控制(SBP≥140mmHg)，那就要增加给药剂量。
(3)如果在连续两次间隔1-3天的诊视时间内BP没有得到控制(SBP≥170mmHg)，并且受试者接受的是最大给药剂量，那他/她必须从本研究退出。
(4)如果出现了低血压症状(SH)，可将依普利农氨氯地平的给药剂量降低到下一个更低的剂量水平。然而，如果SH出现在研究治疗的最低给药剂量(依普利农50mg或氨氯地平2.5mg)时，受试者必须从本研究退出。
(5)如果在连续两次间隔1-3天的诊视时间内钾水平持续升高(钾浓度＞5.5mEq/L)，可将研究药物的给药剂量降低一个水平。如果在连续两次间隔1-3天的诊视时间内钾水平维持＞5.5mEq/L，则受试者必须退出实验。如果在连续两次间隔1-3天的诊视时间内钾水平＞5.0mEq/L但≤5.5mEq/L，则必须降低研究药物的给药剂量。这种情况下，如果在第10周前SBP≥140mmHg或第10周或其后时间SBP≥170mmHg，受试者必须退出实验。
主要的有效性测量值是第24周依普利农对氨氯地平给药时袖带式血压计测量的坐位SBP从基线开始的平均变化。次要的有效性测量值如下：(1)第24周依普利农相对于氨氯地平给药时脉压(SBP-DBP)从基线开始的平均变化；(2)第24周依普利农相对于氨氯地平给药时袖带式血压计测量的坐位舒张压(DBP)从基线开始的平均变化；(3)第24周依普利农相对于氨氯地平给药时通过ABPM记录判断的心率(HR)、PP、SBP和DBP从基线开始的平均变化；(4)第24周依普利农相对于氨氯地平给药时动脉顺应性从基线开始的平均变化；(5)第24周依普利农相对于氨氯地平给药时PAI-1、t-PA和胶原蛋白标记从基线开始的平均变化；(6)第24周依普利农相对于氨氯地平给药时，通过尿白蛋白与肌酐之比判断的位量尿蛋白从基线开始的平均变化；(7)相对于基因型，患者对依普利农和氨氯地平给药的反应；(8)依普利农相对于氨氯地平给药的安全性和耐受性；以及(9)在第14和24周依普利农相对于氨氯地平给药时，生活质量评估从基线开始的平均变化。
另外，利用tertile对受试者的盐敏感程度进行作用(上述1-9项)评估(其中tertile是通过对盐刺激产生的血压反应增量来进行经验确定的)。
在患有收缩期高血压的群体中进行的此项实验是设计来确定依普利农相对于氨氯地平给药的抗高血压作用，来对比依普利农治疗组和氨氯地平治疗组受试者的生活质量，来对比依普利农治疗和氨氯地平治疗对老年人的副作用，来评估这两个治疗组受试者的动脉顺应性、血浆激活剂抑制因子(PAI-1)和胶原蛋白代谢的标记物。本研究的主要目的是在第24周，利用对seated trough cuff SBP从基线开始的平均变化的评估来比较依普利农和氨氯地平给药对SBP的作用。次要的研究目的为：(1)在第24周时比较依普利农和氨氯地平给药对脉压(SBP-DBP)从基线开始的平均变化的影响；(2)在第24周，通过测量seated trough cuff舒张BP(DBP)从基线开始的平均变化来比较依普利农和氨氯地平给药的抗高血压作用；(3)在第24周，通过ABPM记录来比较依普利农对氨氯地平给药时HR、PP、SBP和DBP从基线开始的平均变化；(4)在第24周，通过测量从基线开始的平均变化来比较依普利农和氨氯地平给药对动脉顺应性的作用；(5)在第24周，通过测量从基线开始的平均变化来比较依普利农和氨氯地平给药对PAI-1、组织纤维蛋白溶酶原激活质(t-PA)及校验蛋白标记物[III型酸溶原胶原的氨基末端前肽(PIIINP)、IV型胶原蛋白的7S域(7SIVC)及I型胶原蛋白telopeptide(ICTP)]的作用；(6)在第24周，通过测量从基线开始的平均变化来比较依普利农和氨氯地平给药对微白蛋白尿的作用，而微白蛋白尿是以尿白蛋白与肌酐之比来表示的；(7)相对于基因型，比较受试者对依普利农和氨氯地平给药的反应；(8)在为期24周的治疗中，按照利用报告的副作用、临床实验室评估、体检、生命体征和心电图得到的评估结果来对比依普利农和氨氯地平给药的安全性和耐受性；以及(9)在第14和24周，通过测量从基线开始的平均变化来比较依普利农和氨氯地平给药对与生活质量相关的受试者健康的影响。
在如这样的因素如种族(黑人、非黑人、日本人等)、性别、年龄、血浆肾素水平、醛固酮/肾素活性比、尿钠与尿钾之比、糖尿病存在、高血压病史、心衰病史、肾脏功能障碍病史等的基线记录基础之上，对其他亚群进行主要的和次要的有效性测量值分析。在连续测定如对年龄的连续测定的基础上，在中位数处将亚群一分为二。
实施例A-20：在显示心衰症状的受试者中进行依普利农相对于安慰剂给药的剂量范围研究
在患有心衰并同时进行ACE抑制剂和袢利尿剂给药治疗的受试者中进行了临床研究来评估依普利农给药的剂量范围的安全性和耐受性，来评定它们对神经激素功能的作用，并检查它们在改善临床体征和症状上的潜能。另外，对于上述每个参数来说，都要利用利用tertile对受试者的盐敏感程度进行评估(其中tertile是利用对盐刺激产生的血压反应增加通过经验确定的)。此项研究是随机、双盲、多中心、安慰剂对照平行组实验，其对依普利农相对安慰剂给药的三个不同的日剂量进行了评估。本研究至少有100位受试者参加。利用刺激-单向试验对每位受试者进行盐敏感性检验。
参与研究的群体是显示射血分数为40％的心衰症状的受试者，他们在纽约心脏协会(NYHA)的功能分级中属于II-IV级。合格的实验受试者将接受下列治疗：依普利农25mg QD、50mg QD、100mg QD给药或安慰剂，为期12周。神经激素的评估措施是确定正末端心房利钠肽(正末端ANP)、脑利钠肽(BNP和前BNP)、血浆肾素(总的和活性的)以及血浆和尿醛固酮水平。利用NYHA的功能分级来对受试者的体征和症状进行评定。通过对高钾血症和低血压症状、其他负面体验和临床实验室异常情况的发生率进行测定来对安全性进行评估。本研究是设计来检测依普利农和安慰剂治疗在神经激素水平及临床体征和症状的主要变化上的差异。
本研究的主要目的是(1)在患有HF并同时接受ACE抑制剂和袢利尿剂给药治疗的受试者中，评估依普利农给药剂量范围的安全性和耐受性；(2)在患有HF并同时接受ACE抑制剂和袢利尿剂给药治疗的受试者中，评估依普利农给药剂量范围对神经激素功能测量值[正末端心房利钠肽(正末端ANP)、脑利钠肽(BNP)及其前体形式(前BNP)、血清和尿醛固酮以及血浆肾素(总的和活性的)]的影响；及(3)按照对NYHA功能分类从基线开始的变化的评估，评估依普利农给药剂量范围在为期12周的实验中在改善HF体征和症状上的作用。本研究的次要目的是(1)评估与ACE抑制剂和袢利尿剂联合给药的依普利农的给药剂量范围对心率(HR)、BP和体重的影响；以及(2)当ACE抑制剂和袢利尿剂与依普利农同时给药时，评估依普利农对ACE抑制剂和袢利尿剂给药剂量改变产生的影响。
下表图解了上述研究方案：
Figure C0081981601371
注意：
并行治疗包括ACE-I+袢利尿剂
有效性评估：NYHA功能分类、醛固酮、肾素、正末端ANP、BNP、前BNP。
如果受试者对研究治疗变得不能耐受，在研究治疗剂量调整前就应考虑改变伴随治疗(如钾补充，、ACE-I等)的剂量。如果在研究进行的任何阶段血清钾水平＝6.0mEq/L，那研究治疗就要暂时中止。如果血清钾水平持续＝6.0mEq/L，那就对此受试者终止研究治疗。如果观察到升高的血清钾水平＜6.0mEq/L，即便是停止补充钾，也要继续对受试者进行研究治疗。如果研究治疗终止，应该按照良好的临床操作对伴随治疗进行复查，如果可能，调整伴随治疗的给药剂量。
表A-20A总结了相对于血清钾水平的必要的给药剂量变化。在治疗开始后一周内对血清钾进行确定，并且在给药剂量改变后一周内也要确定血清钾水平。如果观察到血清钾水平升高到＞5.5mEq/L，那就要将研究药物的给药剂量减少到下以个更低的剂量水平，也即从1片QD到1片QOD或从1片QOD到暂时终止。当血清钾水平＜5.5mEq/L时，从1片QOD剂量重新启动研究治疗，并按表A-20B提供的方案增加给药剂量。如果钾水平增加是不真实的(也即由于溶血或最近的钾补充给药)，可在此钾水平上进行重复给药。
表A-20A.相对于血清钾水平的研究药物剂量调整
  如果血清钾水平为：   现行剂量为：   剂量变化：   片剂数目：
  ＜5.0mEq/L   停止   增加   1片QOD
  ＜5.0mEq/L   1片QOD   增加   1片QOD
  ＜5.0mEq/L   1片QD   不变   1片QD
  ＝5.0和＜5.5mEq/L   停止   增加   1片QOD
  ＝5.0和＜5.5mEq/L   1片QOD   不变   1片QOD
  ＝5.0和＜5.5mEq/L   1片QD   不变   1片QD
  ＝5.5和＜6.0mEq/L   停止   不变   无
  ＝5.5和＜6.0mEq/L   1片QOD   减少   无
  ＝5.5和＜6.0mEq/L   1片QD   减少   1片QOD
  ＝6.0mEq/L   任何剂量   *   无
*如果持续升高，终止治疗。如果在个别时期升高，保留治疗。
在如这样的因素如性别、年龄、血浆肾素水平、醛固酮/肾素活性比、尿钠与尿钾之比、糖尿病存在、高血压病史、心衰病史、肾脏功能障碍病史等的基线记录基础之上，对其他亚群进行主要的和次要的有效性测量值分析。在连续测定如对年龄的连续测定基础上，在中位数处将亚群一分为二。
实施例A-21：在对轻微到中度高血压的治疗中，依普利农给药剂量范围的有效性和安全性评估
实施了一项多中心、随机、双盲、安慰剂对照的平行组实验来评估依普利农相对于安慰剂的3种不同的每日给药总剂量(50、100和200mg)的安全性和有效性。本研究包括为期2周的预处理期，在此期间内淘汰了目前所有的抗高血压治疗方法并完成了受试者筛选操作。在淘汰高血压治疗方法后，利用刺激-单向试验对每位受试者进行盐敏感性检验。盐敏感性检验后是为期4周的、单盲的、安慰剂入组治疗，随后是为期8周的、双盲的、活性的与安慰剂治疗期。表A-21A图示了上述的给药剂量方案。
表A-21A.剂量方案
  片剂
  剂量方案   50mg   100mg
  安慰剂入组&治疗期   (1)相应的安慰剂50mg   (1)相应的安慰剂100mg+(1)相应的安慰剂100mg
  依普利农50mg   (1)50mg活性的   (1)相应的安慰剂100mg+(1)相应的安慰剂100mg
  依普利农100mg   (1)相应的安慰剂50mg   (1)100mg活性的+(1)相应的安慰剂100mg
  依普利农200mg   (1)相应的安慰剂50mg   (1)100mg活性的+(1)100mg活性的
如果在研究中的任何阶段出现了低血压症状(SH)，也即，头昏目眩、眩晕、或与低血压(BP)相关的昏厥，则此受试者必须退出实验。在双盲治疗期的任何时间，如果在连续两次间隔1-3天的诊视时间内收缩压(SBP)＝180mmH g或舒张压(DBP)＝110mmHg，那此受试者必须退出实验。在研究中的任何阶段，如果在连续两次间隔1-3天的诊视时间内、在重复测定(对样品进行分配，并分送到当地和中央实验室，在当地实验室的测量结果基础上作出处理决定)的基础上血清钾水平升高到＞5.5mmol/L，则此受试者必须退出实验。
主要的有效性测量值是相对于安慰剂给药，在袖带式血压计测量的最低坐位DBP从基线开始的变化。次要的有效性测量值是包括利用袖带式血压计测量的最低坐位SBP的变化及通过移动BP监测(仅在选定的研究地点进行检测)确定的24小时DBP和SBP的平均值的变化。给药8周后神经激素(血浆肾素、血清醛固酮)的变化也时次要的有效性测量值。也要利用tertile对受试者的盐敏感程度进行作用评估(其中tertile是利用对盐刺激产生的血压反应增量并通过经验确定的)
本研究的主要目的是当依普利农相对于安慰剂以每日50、100和200mg剂量对患有轻微到中度高血压的受试者进行为期8周的给药时，利用袖带式血压计测量的DBP测量值从基线开始的变化来评估其抗血压作用。依普利农相对于安慰剂给药8周后，本发明的次要目的是(1)对袖带式血压计测量的SBP从基线开始的变化进行评估；(2)利用移动血压检测(ABPM)确定依普利农相对于安慰剂给药的24小时抗高血压作用；(3)对血浆肾素和血清醛固酮水平进行评估；及(4)按照对报告的不良事件、临床实验室结果、体检、生命体怔和心电图的评估结果，确定依普利农给药在抗高血压治疗上的安全性和耐受性。
下表图解了上述的研究方案：
Figure C0081981601411
(1)对于不受控制的BP，也即DBP≥115mmHg或SBP≥190mmHg的补救标准。
(2)对于不受控制的BP，也即DBP≥110mmHg或SBP≥180mmHg的补救标准。
(3)如果在研究过程的任何时间血清钾水平的重复测定值＞5.5mEq/L，则此受试者必须退出实验。
(4)仅在那些参与ABPM的研究地点进行移动血压检测(ABPM)。
在如这样的因素如性别、年龄、血浆肾素水平、醛固酮/肾素活性比、尿钠与尿钾之比、糖尿病存在、高血压病史、心衰病史、肾脏功能障碍病史等的基线记录基础之上，对其他亚群进行主要的和次要的有效性测量值分析。在连续测定如对年龄的连续测定基础上，在中位数处将亚群一分为二。
实施例A-22：依普利农对患有急性心肌梗塞后心衰的受试者的安全性和作用
在患有急性心肌梗塞(AMI)后心衰(HF)的受试者中进行了一项旨在比较依普利农加标准治疗和安慰剂加标准治疗对所有原因引起的死亡率的影响的临床实验。次要的终末点包括心血管发病率和死亡率。本研究是多中心、随机、双盲、安慰剂对照、两个群体的平行组实验，本实验要持续到发生1012例死亡为止，估计需要大约6200名随机受试者参与，估计平均约需2.5年的时间。
本研究的合格受试者要患有(1)由(a)异常的心脏酶(肌酸磷酸激酶[CPK]＞2倍的正常范围的上限[ULN]和/或CPK-MB＞总CPK的10％)和(b)MI(在存在或不存在病理Q波情况下，与AMI共存的ST段和T波的递增变化)的展开心电图(ECG)诊断所证明的AMI(指标事件)；和(2)AMI后和随机化前确定的、由LV射血分数(LVEF)＝40％证明的左心室(LV)功能障碍；及(3)至少由下列情况中的一种情况所证明的HF的临床证据：(a)肺水肿(不存在显著的慢性肺疾病情况下，双侧咳嗽后引发的爆裂音延伸到至少1/3的肺野上部)；或(b)胸部X线摄影证明存在肺静脉充血，并且有间质或肺泡水肿；(c)存在第三心音(S3)持续亢进(＞100次/分)的听诊证据。在急诊室评估和对AMI后HF的假定性诊断后的任何时间，可对合格受试者进行鉴定以参与本研究。如果他们的临床状况为，如不存在血管加压药给药、不存在影响肌肉收缩力的药物的给药、未植入主动脉内气球泵、未患有低血压(收缩压[SBP]＜90mmHg)或未患有可能导致急性冠状动脉造影的复发性胸痛，那在AMI后3(＞48小时)-10天间对有资格参加本研究的受试者进行随机化。带有植入的心脏除颤器的受试者排除在本研究之外。
受试者接接受包括ACE抑制剂、利尿剂、硝酸盐和β-阻滞剂给药在内的标准治疗，也可已经接受抗凝剂和抗血小板药物给药，也可已经接受溶栓给药或紧急血管成形术。将受试者随机分配来接受依普利农25mg QD(每日一次)或安慰剂给药。在第4周时，如果血清钾水平＜5.5mEq/L，则将研究药物给药剂量增加到50mg QD(两片)。在研究进程中的任何时间，如果血清钾水平＞5.5mEq/L但＜6.0mEq/L，则将研究药物的给药剂量降低到下一个更低的剂量水平，也即从从50mg QD降至25mg QD(1片)、从25mg QD降至25mg QOD(每隔一日给药)或从25mg QOD降至暂时中止。在研究进程中的任何时间，如果血清钾水平＝6.0mEq/L，那研究治疗应该暂时终止，并且当血清钾水平＜5.5mEq/L时可从25mg QOD剂量重新启动研究药物治疗。在研究进程中的任何时间，如果血清钾水平持续＝6.0mEq/L，那那研究治疗应该永远停止。如果受试者变得不能对研究治疗不能耐受，那在研究治疗剂量调整前就应该考虑改变伴随治疗的给药剂量。在治疗开始后48小时、第1和5周，在预定的其他诊视时间和任何剂量改变后一周内，确定血清钾水平。
在筛选期、基线期(随机化)、第1和4周、第3个月及之后每隔3个月直至研究结束进行研究性诊视。在筛选期对病史、心脏酶类、Killip分类、再灌注(如果可能)时间、AMI和HF的证据、LVEF确定、可能分娩的妇女的血清妊娠检验进行评估。在筛选期和最后一次诊视(体制研究药物给药)时进行体检和12导联ECG。在筛选期、第4周、第3和6个月及其后每隔6个月直至研究结束对安全性进行血液学和生物化学评估及尿液分析。在筛选期额外收集血样以进行DNA分析。每次诊视时对生命体怔(坐位心率和BP)、纽约心脏学会(NYHA)功能分类、不良事件、以及所选的并行治疗进行记录。在筛选期、第4周、第3、6、12个月和最后一次诊视时完成生活质量评估。每隔3个月直至研究结束，观察所有的随机化受试者是否到达终点。
下表图解了本研究的研究方案：
1并行治疗包括：ACE、±利尿剂，β-阻滞剂、±阿司匹林、±其他一般的AMI后疗法。
2如果受试者对现行剂量可以耐受并且血清钾水平＜5.5mEq/L，那么增加给药剂量。见3.6部分，表1对研究治疗剂量调整给出了完全的指导。
3在第48小时、第1和5周及任何研究治疗剂量改变后一周内，必须确定血清钾水平。剂量调整是在最近的血清钾水平上进行的。在研究进行的任何时间，如果血清钾水平＞5.5mEq/L但＜6.0mEq/L，降低研究治疗给药剂量至下一个更低的水平。在研究进行的任何时间，如果血清钾水平≥6.0mEq/L，暂时中止研究治疗。如果研究治疗暂时中止了，当血清钾水平＜5.5mEq/L时，可从1片QOD给药剂量重新启动研究治疗，并按照表1的3.6部分的指导进行滴定。在研究进行的任何时间，如果血清钾水平持续≥6.0mEq/L，永远停止研究治疗。
*在给药开始后48小时确定血清钾的水平。
主要的终末点是所有原因造成的死亡率。本实验是设计来检测所有原因造成的死亡率的18.5％降低的，并且本实验在研究结束前要求发生1012例死亡。次要的终末点包括(1)心血管疾病死亡；(2)心脏性猝死；(3)由于进展性的心衰而导致的死亡；(4)所有原因的住院治疗；(5)心血管病的住院治疗；(6)心衰的住院治疗；(7)所有原因引起的死亡率加所有原因引起的住院治疗；(8)心血管病死亡加心血管病住院治疗；(9)心血管病死亡加心衰住院治疗；(10)房性纤颤的新诊断；(11)复发性非致死性AMI和致死性AMI的住院治疗；(12)卒中的住院治疗；及(13)生活质量。
本发明的主要目的是在患有AMI后心衰(HF)的受试者中比较依普利农加标准治疗和安慰剂加标准治疗对所有原因引起的死亡率的影响。本研究的次要目的是对比两治疗组的以下指标：(1)心血管疾病死亡；(2)心脏性猝死；(3)由于累进的心衰而导致的死亡；(4)所有原因的住院治疗；(5)心血管病的住院治疗；(6)心衰的住院治疗；(7)所有原因引起的死亡率加所有原因引起的住院治疗；(8)心血管病死亡加心血管病住院治疗；(9)心血管病死亡加心衰住院治疗；(10)房性纤颤的新诊断；(11)复发性非致死性AMI和致死性AMI的住院治疗；(12)卒中的住院治疗；及(13)生活质量。
在前4周的治疗时对受试者给予依普利农25mg QD或安慰剂(1片)。在第4周时，如果血清钾＜5.0mEq/L，将研究药物给药剂量增加到50mg QD(2片)。如果在第4周时血清钾水平＝5.0mEq/L，但5周时血清钾水平＜5.0mEq/L，那就研究药物给药剂量增加到50mg QD(2片)。在这种情况下，要在第6周进行血清钾水平检测。
表A-22A总结了对于血清钾水平所要求的剂量变化。在治疗开始后48小时、第1和5周、以及在任何剂量改变后1周内对血清钾水平进行确定。在研究进行的任何时间，如果血清钾水平＞5.5mEq/L，那就要将研究药物的给药剂量减少到下一个更低的剂量水平，也即从50mg QD到25mg QD、从25mg QD到25mg QOD或从25mg QOD到暂时终止。按照表A-22A给出的方案，当血清钾水平＜5.5mEq/L时，可从25mg QOD剂量重新启动研究治疗。如果认为钾水平增加是不真实的(也即由于溶血或最近的钾补充给药)，可在此钾水平上进行重复给药。
如果受试者对研究治疗变得不能耐受，在研究治疗剂量调整前就应考虑改变伴随治疗(如钾补充，、ACE-I等)的剂量。如果在研究进行的任何阶段血清钾水平＝6.0mEq/L，那研究治疗就要暂时中止。如果血清钾水平持续＝6.0mEq/L，那就对此受试者终止研究治疗。如果观察到升高的血清钾水平＜6.0mEq/L，即便是停止补充钾，也要继续对受试者进行研究治疗。如果研究治疗终止，应该按照良好的临床操作对伴随治疗进行复查，如果可能，调整伴随治疗的给药剂量。
表A-22A.对于血清钾水平进行的研究治疗剂量调整
  如果血清钾水平为：   现行剂量为：   剂量变化：   片剂数目：
  ＜5.0mEq/L   停止   增加   1片QOD
  ＜5.0mEq/L   1片QOD   增加   1片QD
  ＜5.0mEq/L   1片QD   增加   1片QD
  ＜5.0mEq/L   2片QD   不变   2片QD
  ＝5.0和＜5.5mEq/L   停止   增加   1片QOD
  ＝5.0和＜5.5mEq/L   1片QOD   不变   1片QOD
  ＝5.0和＜5.5mEq/L   1片QD   不变   1片QD
  ＝5.0和＜5.5mEq/L   2片QD   不变   2片QD
  ＝5.5和＜6.0mEq/L   停止   不变   无
  ＝5.5和＜6.0mEq/L   1片QOD   减少   无
  ＝5.5和＜6.0mEq/L   1片QD   减少   1片QOD
  ＝5.5和＜6.0mEq/L   2片QD   减少   1片QD
  ＝6.5mEq/L   任何剂量   *   无
*如果血清钾水平持续升高，停止治疗。如果在个别时期升高，保留给药剂量。
在如这样的因素如种族(黑人，非黑人)、性别、年龄、糖尿病存在、射血分数、血清钾、血清肌酐、β-阻滞剂应用、地高辛应用、钾补充剂应用、最开始苄吲酸随后AMI、Killip分类、再灌注状况、高血压病史、HF病史、吸烟史、咽峡炎病史、从指标AMI到随机化的时间、以及地域的基线记录基础之上，对其他亚群进行主要的和次要的有效性测量值分析。在连续测定如对年龄、射血分数、血清钾和血清肌酐连续测定基础上，在中位数处将亚群一分为二。
实施例A-23：利用依普利农来预防或治疗内皮功能障碍：
在20分钟仰卧休息之后，在局部麻醉的情况下对非优势臂动脉进行插管。30分钟盐水输注后，通过前臂静脉阻塞体积扫描测定基线前臂血流量。随后利用恒定速度的注入器向待研究的臂中输注药物。在每个基线期时和每次药物输注的最后两分钟内测定前臂血流量。在整个研究过程中，在有规则的时间间隔内测定非输注(对照)臂的血压。
药物输注。首先，以25、50及100mmol/分钟的速度输注乙酰胆碱(内皮依赖型血管舒张药)，每个速度各5分钟。随后以4.2、12.6及37.8nmol/分的速度输注硝普钠(内皮非依赖型血管舒张药)，每个速度各5分钟，随后以1、2及4umol/分的速度输注正单乙基-L-精氨酸(L-NMMA；竞争性NO合成酶抑制剂)，每个速度各5分钟。随后以64、256及1024pmol/分的速度输注血管紧张素I(只能通过转化为血管紧张素II来发挥作用的血管收缩剂)，每个速度各7分钟。在不同的药物输注中间，用盐水对药物输注冲洗20-30分钟以给出充足时间使前臂血流量回复到基线值。
结果，我们预期依普利农会显著增加前臂血流量以对乙酰胆碱作出反应(前臂血流量变化的百分数)，并且由于L-NMMA而会出现相关的血管收缩。在依普利农存在情况下，我们进一步预期血管紧张素I的反应也会显著降低，而血管紧张素II反应无变化。本研究进一步表明醛固酮与内皮功能障碍相关并在心衰受试者中降低了NO生物活性。此外，我们预期依普利农能预防这样的功能障碍和其他由此而产生的病理变化。
B.组合物实施例
下列实施例例证了本发明的一些方面，但不要将其作为本发明的限制。在下文对产生给出的数据的实验方法有更详尽的描述。在这些实施例中所用的符号和准则与同时代的药理学文献中所用的符号和准则相一致。除非有另外的声明，(i)在这些实施例中提及的所有百分比是在组合物总重量基础上的重量百分比，(ii)胶囊的组合物总重是总的胶囊填充重量，不包括实际应用的胶囊的重量，以及(iii)包衣片剂包被的是传统的包衣物质如Opadry White YS-1-18027A，并且包衣的重量比约为包衣片剂总重量的3％。
实施例B-1
通过将下表所列的成分过筛并按给定的量混合就可制备成口服药剂。随后可将此口服药剂置于硬明胶胶囊中。
成分                    用量
依普利农                12.5mg
硬脂酸镁                10mg
乳糖                    100mg
实施例B-2
通过混合和粒化10％明胶溶液制备口服药剂。对湿颗粒进行筛选、烘干并与淀粉、滑石和硬脂酸混合，筛选并压制成片剂。
成分                   用量
依普利农               12.5mg
二水合硫酸钙           100mg
蔗糖                   15mg
淀粉                   8mg
滑石                   4mg
硬脂酸                 2mg
实施例B-3
通过将下表所列的成分过筛并按给定的量混合就可制备成口服药剂。随后可将此口服药剂置于硬明胶胶囊中。
成分                   用量
依普利农               12.5mg
硬脂酸镁               10mg
乳糖                   100mg
实施例B-4
通过混合和粒化10％明胶溶液制备口服药剂。对颗粒进行筛选、烘干并与淀粉、滑石和硬脂酸混合，筛选并压制成片剂。
成分                   用量
依普利农               12.5mg
二水合硫酸钙                100mg
蔗糖                        15mg
淀粉                        8mg
滑                          4mg
硬脂酸                      2mg
实施例B-5：25Mg剂量的立即释放片剂
制备了含有下列组分的25Mg剂量的立即释放片剂(片剂直径为7/32″)：
成份                        片剂的重量％          含量(mg)
依普利农                    29.41                 25.00
一水合乳糖                  42.00                 35.70
(#310，NF)
微晶纤维素                  18.09(7.50％颗        15.38
(NF，Avicel PH101)          粒内10.59％
                            颗粒外)
交联羟甲纤维素钠            5.00                  4.25
(NF，Ac-Di-Sol)
羟丙基甲基纤维素            3.00                  2.55
(#2910，USP，Pharmacoat 603)
十二烷基硫酸钠              1.00                  0.85
(NF)
滑石                        1.00                  0.85
(USP)
硬脂酸镁                    0.50                  0.42
(NF)
合计                        100                   85
Opadry White YS-1-18027A    3.00                  2.55
实施例B-6：50Mg剂量的立即释放片剂
制备了含有下列组分的50Mg剂量的立即释放片剂(片剂直径为9/32″)：
成份                        片剂的重量％      含量(mg)
依普利农                    29.41             50.00
一水合乳糖                  42.00             71.40
(#310，NF)
微晶纤维素                  18.09(7.50％颗    30.75
(NF，Avicel PH101)          粒内加10.59％
                            颗粒外)
交联羟甲纤维素钠            5.00              8.50
(NF，Ac-Di-Sol)
羟丙基甲基纤维素            3.00              5.10
(#2910，USP，Pharmacoat 603)
十二烷基硫酸钠              1.00              1.70
(NF)
滑石                        1.00              1.70
(USP)
硬脂酸镁                    0.50              0.85
(NF)
合计                        100               170
Opadry White YS-1-18027A    3.00              5.10
实施例B-7：100Mg剂量的立即释放片剂
制备了含有下列组分的100Mg剂量的立即释放片剂(片剂直径为12/32″)：
成份                    片剂的重量％        含量(mg)
依普利农                29.41               100.00
一水合乳糖              42.00               142.80
(#310，NF)
微晶纤维素              18.09(7.50％颗      61.50
(NF，Avicel PH101)      粒内加10.59％
                        颗粒外)
交联羟甲纤维素钠        5.00                17.00
(NF，Ac-Di-Sol)
羟丙基甲基纤维素                 3.00         10.20
(#2910，USP，Pharmacoat 603)
十二烷基硫酸钠                   1.00         3.40
(NF)
滑石                             1.00         3.40
(USP)
硬脂酸镁                         0.50         1.70
(NF)
合计                             100          340
成份                             片剂的重量％ 含量(mg)
Opadry White YS-1-18027A         3.00         10.20
实施B-8：10mg剂量的立即释放胶囊
制备了含有下列组分的10mg剂量的立即释放胶囊：
成份                         含量(mg)       代表性批料含量(kg)
依普利农                     10.0           1.00
乳糖，水合的，NF             306.8          30.68
微晶纤维素，NF               60.0           6.00
滑石，USP                    10.0           1.00
交联羟甲纤维素钠，NF         8.0            0.80
十二烷基硫酸钠，NF           2.0            0.20
胶体二氧化硅，NF             2.0            0.20
硬脂酸镁，NF                 1.2            0.12
总的胶囊填充重量             400.0          40.00
硬明胶胶囊，大小#0，         1胶囊          100,000胶囊
白色不透明
实施例B-9：25mg剂量的立即释放胶囊
制备了含有下列组分的25mg剂量的立即释放胶囊：
成份                     含量(mg)            代表性批料含量(kg)
依普利农                 25.0                2.50
乳糖，水合的，NF         294.1               29.41
微晶纤维素，NF                  57.7        5.77
滑石，USP                       10.0        1.00
交联羟甲纤维素钠，NF            8.0         0.80
十二烷基硫酸钠，NF              2.0         0.20
胶体二氧化硅，NF                2.0         0.20
硬脂酸镁，NF                    1.2         0.12
总的胶囊填充重量                400.0       40.00
硬明胶胶囊，大小#0，            1胶囊       100,000胶囊
白色不透明
实施例B-10：50mg剂量的立即释放胶囊
制备了含有下列组分的50mg剂量的立即释放胶囊：
成份                          含量(mg)       代表性批料含量(kg)
依普利农                      50.0           5.00
乳糖，水合的，NF              273.2          27.32
微晶纤维素，NF                53.6           5.36
滑石，USP                     10.0           1.00
交联羟甲纤维素钠，NF          8.0            0.80
十二烷基硫酸钠，NF            2.0            0.20
成份                          含量(mg)       代表性批料含量(kg)
胶体二氧化硅，NF              2.0            0.20
硬脂酸镁，NF                  1.2            0.12
总的胶囊填充重量              400.0          40.00
硬明胶胶囊，大小#0，          1胶囊          100,000胶囊
白色不透明
实施例B-11100mg剂量的立即释放胶囊
制备了含有下列组分的100mg剂量的立即释放胶囊：
成份                         含量(mg)         代表性批料含量(kg)
依普利农                     100.0            10.00
乳糖，水合的，NF             231.4            23.14
微晶纤维素，NF               45.4             4.54
滑石，USP                 10.0      1.00
交联羟甲纤维素钠，NF      8.0       0.80
十二烷基硫酸钠，NF        2.0       0.20
胶体二氧化硅，NF          2.0       0.20
硬脂酸镁，NF              1.2       0.12
总的胶囊填充重量          400.0     40.00
硬明胶胶囊，大小#0，      1胶囊     100,000胶囊
白色不透明
实施例B-12：200mg剂量的立即释放胶囊
制备了含有下列组分的200mg剂量的立即释放胶囊：
成份                         含量(mg)      代表性批料含量(kg)
依普利农                     200.0          20.00
乳糖，水合的，NF             147.8          14.78
微晶纤维素，NF               29.0           2.90
滑石，USP                    10.0           1.00
交联羟甲纤维素钠，NF         8.0            0.80
十二烷基硫酸钠，NF           2.0            0.20
胶体二氧化硅，NF             2.0            0.20
硬脂酸镁，NF                 1.2            0.12
总的胶囊填充重量             400.0          40.00
硬明胶胶囊，大小#0，         1胶囊          100,000胶囊
白色不透明
C.固态实施例
下列实施例中包含对本发明应用中所描述的多种固态形式依普利农的制备方法的详细描述。这些详细描述在本发明的范围之内并且用来例证本发明。给出这些详细描述仅仅是出于说明性目的，并没有限制本发明的发明范围的意图。除非另外指出，所有部分是以重量表示而温度是以摄氏度来表示的。按照Ng等在专利WO98/25948中所提出的方案来制备下列实施例中所用到的依普利农原料。
实施例C-1：(a)从高纯依普利农原料制备甲基乙基酮溶剂合物及(b)从得到的溶剂合物制备L型结晶依普利农
A.制备甲基乙基酮溶剂合物：
在转速900rpm的磁力搅拌下，在加热板上加热至沸腾，使高纯依普利农(437mg；纯度大于99％，少于0.2％双环氧化合物和11，12环氧化合物存在)溶解在10mL甲基乙基酮中。在持续磁力搅拌下，将得到的溶液冷却至室温。一旦达到室温，将溶液转移到1℃的水浴中，并维持搅拌1个小时。1小时后，通过真空过滤收集固态甲基乙基酮溶剂合物。
B.制备L型结晶依普利农：
在常压下，将步骤A中制备的固态甲基乙基酮溶剂合物置于100℃烘箱中烘干4小时。利用DSC和XPRD分析，确定烘干后的固态物质为纯的L型依普利农。
实施例C-2：从高纯依普利农原料制备另外的溶剂合物
利用下列物质替代甲基乙基酮就可制备另外的溶剂化结晶形式的依普利农：正丙醇、2-戊酮、醋酸、丙酮、乙酸丁酯、氯仿、乙醇、异丁醇、乙酸异丁酯、异丙醇、乙酸甲酯、丙酸乙酯、正丁醇、正辛醇、乙酸丙酯、丙二醇、叔丁醇、四氢呋喃及甲苯，并基本上如实施例C-1的步骤A进行结晶。基本上如实施例C-1的步骤B来制备L型依普利农。
实施例C-3：利用蒸汽扩散培养来制备甲基乙基酮
在加热板上加热使依普利农(400mg；纯度大于99.9％)溶解在20mL甲基乙基酮中从而制备成贮存液。将8mL贮存液转移到第一个20mL闪烁管中并用甲基乙基酮(80％)稀释到10mL。将10mL贮存液转移到第二个20mL闪烁管中并用甲基乙基酮(40％)稀释到10mL。利用甲基乙基酮(20％)将最后2mL贮存液稀释到10mL。将此四个含有稀释液的小管转移到含有少量己烷做干燥剂的干燥瓶中。此干燥瓶是密封的，并且允许己烷扩散到甲基乙基酮溶液中。第二天，80％稀释液样品中的甲基乙基酮溶剂合物晶体增长了。
实施例C-4：通过旋转蒸发来制备甲基乙基酮溶剂合物
称量约400mg依普利农(纯度大于99.9％)，置于250mL圆底烧瓶中。向烧瓶中添加溶剂(150mL)，如果必要，对溶液轻轻加热，直到固体熔化。将生成的清澈溶液置于Buchi旋转蒸发器中，水浴温度约为85℃，在真空下将溶剂蒸出。当圆底烧瓶中剩余约10mL溶剂时，停止旋转蒸发。利用适当的方法(XPRD、DSC、TGA、显微技术等)来分析产生的固体物质以确定其形式。
实施例C-5：浆液转化
将约150mg L型依普利农和150mg H型依普利农添加到5mL乙酸乙酯中。形成的浆液在300rpm下搅拌(磁力搅拌)过夜。第二天，过滤收集固体样品。通过XPRD进行的样品分析表明此样品全部由L型依普利农组成。
实施例C-6：(a)从低纯依普利农原料制备溶剂合物及(b)利用得到的溶剂合物制备H型结晶依普利农
向7ml闪烁管中添加想要的量的杂质，并与足以提供100mg总样品量的依普利农混合来制备含有各种的量的杂质7-甲基氢4α，5α:9α，11α-双环氧-17-羟基-3-氧-17α-孕烷-7α，21-二羧酸酯，γ-内酯(“双环氧化合物”)或杂质7-甲基氢11α，12α-环氧-17-羟基-3-氧-17α-孕-4-烯-7α，21-二羧酸酯，γ-内酯(11，12，-环氧化合物)的样品。双环氧化合物或11，12-环氧化合物在每个样品中的重量百分数在表C-6A和C-6B中分别给出。将微蚤磁力搅拌器连同1ml甲基乙基酮添加到每个闪烁管中。小管的盖子不能盖紧，在磁力搅拌下，通过加热板加热使小瓶中的液体回流并使其中的固体溶解。一旦固体溶解，在加热板上使容易冷却至室温。冷却时继续磁力搅拌。将溶液冷至室温后，通过真空过滤收集固体物质，并立即利用X-射线粉末衍射(XPRD)对其进行分析。随后在常压下将固体物质置于100℃烘箱中烘干1小时。通过XPRD、在约12.1°的2θ下检测H型衍射峰的面积来分析烘干后的固体中H型的含量。利用Inel Multipurpose衍射计记录下所有的XPRD衍射图样。
表C-6A
  双环氧化合物的重量百分比   依普利农重量(mg)   双环氧化合物重量(mg)
  0％   100.44   -
  1％   99.08   1.24
  2％   98.09   2.24
  3％   97.08   3.04
  5％   95.09   5.04
表C-6B
  11，12环氧化合物的重量百分比   依普利农重量(mg)   11，12-环氧化合物重量(mg)
  0％   101.38   0
  1％   99.23   1.10
  5％   94.97   5.36
  10％   90.13   10.86
A.双环氧化合物结果
图C-1展示了掺杂(a)0％、(b)1％、(c)3％及(d)5％双环氧化合物的甲基乙基酮结晶湿饼(甲基乙基酮溶剂合物)的X-射线粉末衍射图样。对峰强度进行标准化以利于进行比较。在衍射图样中没有出现H型或双环氧化合物的特征峰。此图样是依普利农甲基乙基酮溶剂合物的特征图样。
图C-2展示了掺杂(a)0％、(b)1％、(c)3％及(d)5％双环氧化合物的甲基乙基酮干燥固体的X-射线粉末衍射图样。对峰强度进行标准化以利于进行比较。在干燥的样品中没有检测到与双环氧化合物掺杂量为0和1％时形成的甲基乙基酮结晶相对应的H型。在干燥的样品中检测到了与双环氧化合物掺杂量为3和5％时形成的甲基乙基酮结晶相对应的H型。在约12.1°的2θ下的H型衍射峰的面积和每个样品中H型的估计含量在下表C-6C中给出。
表C-6C
  双环氧化合物在依普利农起始混合物中的重量百分比   双环氧化合物在生成的晶体中的重量百分比(HPLC)   12°的2θ峰处的H型峰面积  H型重量百分比的估计值
  05   --   未检测   未检测
  1％   0.29％   未检测   未检测
  3％   0.58％   1168   10％
  5％   1.05％   4175   30％
表C-6C中报道的结果进一步证实了在去溶剂化过程中双环氧化合物的存在影响了H型依普利农的形成。这些结果表明当将其混合和/或吸收到甲基乙基酮溶解化晶体中时，双环氧化合物可有效的诱导H型依普利农的形成。
重复双环氧化合物掺杂量3％的实验，以此分析制备途径对去溶剂化过程中H型依普利农生成量的影响。在此实验中，将得自掺杂双环氧化合物的结晶的甲基乙基酮溶剂合物分为两部分。第一部分不进行任何处理，而将第二部分置于研钵中，用杵轻轻研磨以导致高水平的晶体缺损。在常压下，在100℃下将这两部分烘干1小时。利用XPRD对烘干后的固体进行分析。图C-3中给出了从掺杂有3％双环氧化合物的甲基乙基酮结晶得到的干燥固体在(a)在干燥前没有对溶剂合物进行研磨及(b)干燥前对溶剂合物进行了研磨两种情况下的XPRD图样。XPRD图样表明，相对于没有研磨的样品，研磨过的样品中形成了更大量的H型依普利农。这些结果暗示，甲基乙基酮溶剂合物分离和处理的条件可影响去溶剂化过程中的晶体形成。
B.11，12-环氧化合物的结果
图C-4展示了掺杂(a)0％、(b)1％、(c)5％及(d)10％的11，12-环氧化合物的甲基乙基酮结晶湿饼(甲基乙基酮溶剂合物)的X-射线粉末衍射图样。对峰强度进行标准化以利于进行比较。在衍射图样中没有出现H型依普利农或11，12-环氧化合物的特征峰。此图样是依普利农甲基乙基酮溶剂合物的特征图样。
图C-5展示了掺杂(a)0％、(b)1％、(c)5％及(d)10％11，12-环氧化合物的甲基乙基酮结晶的干燥固体的X-射线粉末衍射图样。对峰强度进行标准化以利于进行比较。在干燥的样品中没有检测到与11，12-环氧化合物掺杂量为0和1％和5％时形成的甲基乙基酮结晶相对应的H型。在干燥的样品中检测到了与11，12-环氧化合物掺杂量为10％时形成的甲基乙基酮结晶相对应的H型依普利农。在约12.1°的2θ下的H型衍射峰的面积和每个样品中H型依普利农的估计含量在下表C-6D中给出。
表C-6D
  11，12-环氧化合物在依普利农起始混合物中的重量百分比   11，12-环氧化合物在生成的晶体中的重量百分比(HPLC)   12°的2θ峰处的H型峰面积   H型重量百分比的估计值
  0％   未得到   未检测   未检测
  1％   未得到   未检测   未检测
  5％   未得到   未检测   未检测
  10％   未得到   1541   10-15％
表C-6D中报道的结果进一步证实了在去溶剂化过程中11，12-环氧化合物的存在影响了H型依普利农的形成。对于掺杂11，12-环氧化合物和掺杂双环氧化合物来讲，在诱导形成H型依普利农时，甲基乙基酮结晶中所需杂质的百分含量在前者情况下要更高。
实施例C-7：结晶和干燥对最终晶形的影响
进行了下列四个实验来分析结晶和干燥对最终晶形的影响：(i)依普利农的甲基乙基酮结晶(利用23+3统计设计来进行实验设计)，(ii)质量较差的母液残渣的结晶，(iii)含有H型晶种的高纯依普利农的结晶，及(iv)含有L型晶种的低纯依普利农的结晶。实验设计中的变量包括冷却速度、原料的纯度水平、以及结晶的终点温度。对于本实施例的意图来讲，高纯依普利农定义为超纯的研磨过的依普利农(HPLC分析表明此物质的纯度为100.8％)，低纯依普利农定义为纯度为89％的依普利农。为了制备低纯依普利农，就需要对依普利农制备过程中的母液进行分析并进行混合来产生一种含有61.1％依普利农、12.8％双环氧化合物和7.6％11，12-环氧化合物的物质。随后将这种物质与足量的高纯依普利农混合来产生纯度为89％的依普利农。
甲基乙基酮结晶
在甲基乙基酮结晶实验中，利用60g高纯依普利农来进行各项反应。高终点定义为45℃，而低终点定义为5℃。高冷却速度定义为3℃/分冷却，而低冷却速度定义为0.1℃/分冷却。中心点为1.5C/分冷却、纯度为94.5％的依普利农及25℃的终点。
利用FTIR得到进行本底记录后，将250mL甲基乙基酮加入到1L的Mettler RC-1，MP10反应器中，并以100rpm的速度进行搅拌。多次细查之后，将依普利农加入到反应器中，随后再向其中加入另外470mL甲基乙基酮。将搅拌速度增加到500rpm使固体悬浮到液体中，并将批料温度升高到80℃。将批料温度保持在80℃以保证依普利农溶解。一般在形成的透明溶液中能看到黑色或白色的斑点。随后以期望的速度将批料温度降低到期望的终点，其中在转移到烧瓶中进行过滤前要维持1小时。真空是反应器，随后利用120ml丙酮来冲洗转移烧瓶和饼。一旦冲洗液流过饼就停止冲洗。在额定的75℃、微量氮气吹扫条件下，从每个湿饼中取约10克置于真空烘箱中烘干。对下文所述的“高、高、高”和“低、低、低”实验来讲，在高温和低温条件下进行流化床干燥。高温流化床干燥定义为100℃和鼓风机设置为“4”，而低温流化床干燥定义为40℃和鼓风机设置为“1”。
质量较差的母液残渣的结晶
在质量较差的母液残渣的结晶实验中，将60g纯度为61.1％的物质和720mL甲基乙基酮直接加入到1L的Mettler RC-1，MP10反应器中。在加入到反应器中之前，不将纯度为61.1％的物质与高纯依普利农混合。将生成的混合物升温至80℃，此混合物在此温度下是不透明的浆液。继续结晶，在45℃快速冷却条件下对混合物进行过滤。
H型晶种
在H型晶种实验中，将60g纯(100.8％)依普利农和720mL甲基乙基酮加入到1L Mettler RC-1，MP 10反应器中。将混合物加热到80℃，随后以1.5℃/分的速度冷却到25℃。当溶液冷却到62℃时，向其中接种3g纯相的H型晶体来开始结晶。H型晶体是通过下文实施例C-9中的消化过程制备的。
L型依普利农晶种
在L型晶种实验中，将66.6g纯度为89.3％的依普利农(通过将48.3g纯度为100％的依普利农与18.3g纯度为61.1％的依普利农混合产生的)和720mL甲基乙基酮加入到1L Mettler RC-1，MP10反应器中。将混合物加热到80℃，随后以1.5℃/分的速度冷却到25℃。当溶液冷却到63℃时，向其中接种3g纯相的L型晶体来开始结晶。L型晶种晶体是通过上文实施例C-1中的结晶和去溶剂化过程制备的。
实验结果在表C-7A中有报道。在n+1结晶实验中，仅在应用低纯依普利农的实验中检测到了H型，其中此低纯依普利农中含有双环氧化合物。在高冷却速度下，也在最终产物中观察到双环氧化合物水平升高。
质量较差的母液残渣结晶实验产生了治疗较差的物质，当进行X-射线粉末衍射分析时，显示其为双环氧化合物和H型的混合物。
H型晶种实验(其中向高纯依普利农中接种的是H型)产生了一种产品，利用X-射线粉末衍射进行分析证明其含有77％H型，而DSC分析证明其含有100％的H型。然而，X-射线粉末衍射模型没有对超出约15％的H型进行线性分析。此实验是本实施例的4个实验中唯一一个在不存在双环氧化合物的情况下产生H型的。
在L型晶种实验中(其中向低纯依普利农中接种的是L型)产生了含有100％L型的产物。
从依普利农高温流化床干燥得到的数据与从真空烘箱干燥得到的数据相对应。低温流化床干燥产生的结果与真空烘箱干燥的结果有差异。
表C-7A
  冷却速度1   冷却终点2   杂质水平3   成核温度(℃)   11.12-环氧化合物的重量百分比4   双环氧化合物的重量百分比4   去溶剂化晶体测定   百分产率   H型的重量百分比(XPRD)
  +   +   -   57.0   ND   ND   100.3   66.1   ND
  +   -   -   54.9   ND   ND   100.3   98.1   ND
  -   +   -   60.9   ND   ND   100.3   ND
  -   -   -   63.4   ND   ND   100.5   79.3   ND
  +   +   ++   N/A   4.8   36.6   43.3   27   1005
  +   +   +   52.2   0.49   0.88   98.3   62   29
  +   -   +   53.3   0.56   1.0   98.1   87   9
  0   0   0   59.0   0.18   0.36   99.4   75   5
  -   +   +   63.3   0.20   0.44   99.4   36   31
  -   -   +   61.4   0.18   0.40   99.5   87   ND
  0   0   0   60.6   0.18   0.36   99.5   79.2   ND
  0   0   0   55.9   0.38   0.80   98.6   80.5   3％
  0   0   接种H型的、纯度为100.8％的依普利农   0.03   ND   100.4   82.2   77/1006
  0   0   接种H型的、纯度为89.3％的依普利农   0.03   0.50   97.5   80.2   ND
1冷却速度：(+)＝3℃/分.；(0)＝1.5℃/分.；以及(-)＝0.1℃/分。
2冷却终点：(+)＝45℃；(0)＝25℃；以及(-)＝5℃。
3杂质水平：(+)＝纯度为89.3％的依普利农原料；(++)＝纯度为61.1％的依普利农原料；(0)＝纯度为100.8％的依普利农  原料；及(-)＝纯度为94.5％的依普利农原料。
4在75℃真空烘箱中干燥溶剂合物后的重量百分比
5当利用XPRD分析时，产物为H型和双环氧化合物的混合物。
6利用XPRD分析时产物含有77％的H型，而利用DSC分析时产物含有100％的H型。
A.物质纯度
在表C-7A报道的实验数据的基础上，产品纯度、原料纯度、冷却速度和终点温度的立方图如图C6所示。立方图暗示，在开始结晶时利用较高纯度的物质会形成较高纯度的产物。结晶的终点温度对产物的纯度影响不大。然而，冷却速度轻微影响了纯度较低的产物，而纯度稍低的产物由于较快的冷度速度而形成的。实际上，在较高冷却速度下生成的产物中双环氧化合物的水平一般较高。
图C-7展示了利用立方图数据制备的半标准图，如果这样的变量存在，可利用其来确定对产品纯度具有统计学上的显著影响的变量。虽然也可认为冷却速度及冷却速度和原料纯度的相互作用在统计学上具有显著的影响，但是原料纯度对产品纯度具有统计学上最大的影响。
图C-8是在这些结果基础之上的相互作用图，它表明了原料纯度和冷却速度的相互作用对产物纯度的影响。在高纯依普利农(纯度为100.8％的依普利农原料)存在的情况下，冷却速度似乎对最终产物的纯度有很小的或没有影响。然而，在低纯依普利农(纯度为89.3％的依普利农原料)存在的情况下，随着冷却速度升高，产品纯度下降。结果暗示，在高冷却速度下的依普利农结晶过程中有更多的杂质进行结晶出来。
H型的含量
在表C-7A报道的实验数据的基础上，H型重量分数、原料纯度、冷却速度和终点温度的立方图如图C-9所示。立方图暗示，在开始结晶时利用较高纯度的依普利农会形成较少量的H型。结晶的终点温度也对最终产物的形成产生影响。虽然一些H型是在杂质存在、低终点温度和快速冷却条件下形成的，但冷却速度对H型的形成影响不大。
图C-10展示了利用立方图的结果制备的半标准图表，如果这样的变量存在，可利用其来确定对最终产品中的H型含量具有统计学上的显著影响的变量。可认为原料纯度、结晶的终点温度和这两个变量之间的相互作用在统计学上具有显著影响。
图C-11是在这些结果基础之上的相互作用图，它表明了原料纯度和终点温度的相互作用对最终H型含量的影响。在高纯依普利农(纯度为100.8％的依普利农原料)存在的情况下，终点温度似乎对H型含量的影响很小。在纯依普利农存在的情况下，没有生成任何H型。然而，在低纯依普利农(纯度为89.3％的依普利农原料)存在时，两种情况都有H型存在，在高终点温度下H型含量显著更高。
表C-7B报告了在利用流化床(LAB-LINE/P.R.L.Hi-SpeedFluid Bed Dryer，Lab-Line Instruments，Inc.)或真空烘箱(Baxter Scientific Products Vacuum Drying Oven，Model DP-32)干燥的物质中H型的重量比。在利用高温流化床或真空烘箱干燥的相似的物质中观察到了类似的H型含量。然而，在利用低温流化床和真空烘箱干燥的相似的物质中观察到了差异。
表C-7B
  冷却速度   终点   杂质水平   干燥类型  H型的重量百分比
高 高 高 真空烘箱 29％
  高   高   高   高温流化床   25％
  高   高   高   低温流化床   4.7％
  低   低   低   真空烘箱   ND
  低   低   低   高温流化床   ND
  低   低   低   低温流化床   5.5％
实施例C-8：从用来制备溶剂合物的甲基乙基酮制得的H型和L型的混合物的结晶，及(b)用于制备L型的溶剂合物的去溶剂化
将H型依普利农(10g)与80mL甲基乙基酮相结合。将混合物加热至开始回流(79℃)并在此温度下搅拌30分钟。随后通过将浆液在65℃、50℃、35℃和25℃各维持90分钟，将生成的浆液以逐步的、holdpoint方式冷却。对浆液过滤，并利用20ml甲基乙基酮漂洗。将得到的固体先在过滤器上烘干，随后在40-50℃的真空烘箱中烘干。在90-100℃的真空烘箱中完成烘干。得到去溶剂化的固体，回收率为82％。通过XPRD、MIR和DSC分析确定此固体含有L型结晶结构。
实施例C-9：利用制备L型的溶剂来对低纯依普利农原料进行消化
利用乙醇消化：
将低纯依普利农(24.6g；利用HPLC进行重量测定，结果其重量百分比为64％)与126mL乙醇3A相结合。将浆液加热至回流并通过蒸馏去除溶剂。在通过大气蒸馏将126ml溶剂去除的同时添加另外的126mL乙醇3A。一旦完成乙醇更新，将混合物冷却到25℃并搅拌1小时。将固体进行过滤并利用乙醇3A漂洗。对此固体物质进行空气干燥以生成乙醇溶剂合物。将此溶剂合物进一步在90-100℃真空烘箱中干燥6小时，得到14.9g H型依普利农。
利用甲基乙基酮消化
在另一消化方法中，将1g低纯依普利农(纯度约为65％)在4mL甲基乙基酮中消化2小时。2小时后，将混合物冷却至室温。一旦冷却，通过真空过滤收集固体物质，并通过XPRD分析来确定此甲基乙基酮溶剂合物。将此固体物质在100℃下干燥30-60分钟。利用XPRD分析干燥后的固体物质为纯H型。
实施例C-10：利用制备L型的溶剂来对高纯依普利农原料进行消化
利用乙醇消化：
将高纯依普利农(1g)在8mL乙醇中消化约2小时。随后将生成的溶液冷却至室温并利用真空过滤收集固体物质。过滤后立即利用XPRD对此固体物质进行分析，结果表明此固体物质是溶剂合物(推测是乙醇溶剂合物)。随后，在空气压力下，将此固体物质在100℃干燥30分钟。对干燥后的固体物质进行XPRD分析，确定其中L型占绝大多数(没有检测到H型)。
利用甲基乙基酮消化
将低纯度依普利农(1g)在4mL甲基乙基酮中消化2小时。2小时后，将溶液冷却至室温并通过真空过滤收集固体物质。立即通过XPRD分析来确定此固体物质为溶剂合物(推测为甲基乙基酮溶剂合物)。随后，在常压下，将此固体物质在100℃下干燥30-60分钟。利用XPRD对干燥后的固体物质进行分析，确定其主要含有L型，而没有H型的衍射峰出现。
实施例C-11：直接从溶液开始的L型的结晶
方法A：通过将其加热至75℃，将依普利农(2.5g)溶解在乙酸乙酯中。一旦依普利农溶解，将溶液在75℃下维持30分钟以保证其完全溶解。随后将溶液以1℃/分的速度冷却到13℃。一旦冷却到13℃，利用高架搅拌器，以750rpm的转速对此浆液进行持续2小时的搅拌。利用真空过滤收集晶体并在40℃的真空烘箱中烘干1小时。此固体物质的XPRD图样和DSC热像图是L型依普利农的典型特征。对此固体进行的热重量分析(TGA)分析表明直到升温至200℃，此固体物质没有重量损失。
方法B：在另一方法中，在磁力搅拌存在的情况下，通过加热板加热使2g依普利农溶解在350mL 15/85％乙腈/水中。一旦依普利农溶解，就在磁力搅拌存在的情况下，将溶液冷却到室温并过夜。利用真空干燥收集产生的固体物质。此晶体是双折射的，并具有三角形的盘状晶型。此固体物质具有L型依普利农的XPRD和DSC特征。TGA显示直到200℃，此固体物质没有重量损失。
方法C：在另一方法中，将640mg依普利农置于含有20mL乙基苯的50mL烧瓶中。将产生的浆液加热到116℃而变成透明的溶液。将此透明的溶液冷却到25℃并维持30分钟。在冷却时间内，在84℃开始成核。从溶液中过滤产生的固体，空气干燥，产生530mg固体物质(83％回收率)。温台显微镜和XPRD确定此固体物质是L型晶体。
方法D：在另一方法中，将1.55g依普利农添加到2.0mL硝基苯中并加热至200℃。将生成的浆液200℃下搅拌过夜。在随后的白天时间内将溶液冷却至室温(自然空气对流)。利用XPRD和极化光显微镜确定此固体为L型依普利农。
方法E：在另一方法中，将5.0g依普利农(纯度大于99％)添加到82g甲醇(104mL)中。在搅拌状态(210rpm)下，将溶液加热到60℃并在此温度下维持20分钟以保证依普利农完全溶解。随后，在搅拌下，以0.16℃/分的速度将此溶液冷却到-5℃。通过过滤收集晶体并在40℃真空烘箱中干燥20小时。利用DSC和XPRD分析确定此干燥物质为纯L型依普利农。
方法F：在另一方法中，将6.0g依普利农(含有9％乙醇的乙醇溶剂合物，校正后的纯度为95.2％)添加到82g甲醇(104mL)中。在搅拌(210rpm)下，将溶液加热到60℃并在此温度下维持20分钟以保证完全溶解。随后以0.14℃/分的速度将溶液冷却到50℃并在此温度下维持2.5小时。随后在同时搅拌下，以0.13℃/分的速度将溶液冷却到5℃。利用过滤收集晶体并在40℃烘箱中烘干16小时。利用DSC和XPRD分析确定此干燥的固体物质为纯的L型依普利农。
实施例C-12：直接从溶液开始的H型的结晶
将150.5mg双环氧化合物和2.85g依普利农添加到1.5mL硝基苯中。将此混合物在200℃下磁力搅拌数小时。随后利用天然空气对流将此浆液冷却到室温。将样品干燥并利用极化光显微镜和XPRD对其进行分析。XPRD分析表明此样品是H型和L型的混合物。通过极化光显微镜证明此晶体是半透明的，这表明没有发生去溶剂化(转化为H型或L型)。
实施例C-13：通过粉碎来制备无定形依普利农
将约一半体积的钢制Wig-L-Bug容器中充满约60g依普利农(纯度大于99.9％)。将钢球和钢盖置于样品容器上，通过Wig-L-Bug装置搅动30秒。将Wig-L-Bug容器表面的依普利农刮掉，搅动30秒。利用XPRD和DSC对产生的固体物质进行分析，确定其为无定形依普利农和L型结晶依普利农的混合物。
实施例C-14：通过冷冻干燥来制备无定形依普利农
向含有400mL水的烧杯中称量约100mg粗依普利农。将此溶液略微加热5分钟，随后，在搅拌的同时进行超声处理并进行另外5分钟加热。将大约350mL依普利农溶液过滤到含有50mL HPLC水的1000mL圆底烧瓶中。在1-2分钟内，在干冰/丙酮浴中对溶液进行瞬时冷冻。将此烧瓶置于Labconco Freezone 4.5冷冻干燥器中，干燥过夜。将烧瓶中的固体转移到一个小棕色瓶中。在极化光显微镜的10×、1.25×视野下、在cargille油(1.404)中观察一等份固体，结果发现其中至少有95％是无定形依普利农。图C-12和C-13展示了得到的无定形依普利农的XPRD图样和DSC热像图。图C-12中，在39°的2θ下观察到的峰可归因于铝制样品容器。
实施例C-15：依普利农多晶形物组合物
制备了含有25mg、50mg、100mg和200mg剂量的L型依普利农并含有下列组分的片剂：
  成分   片剂重量％
  L型依普利农   29.41
  H型依普利农   未检测到
  一水合乳糖(#310，NF)   42.00
  微晶纤维素(NF，Avicel PH101)   18.09
  交联羟甲纤维素钠(NF，Ac-Di-Sol)   5.00
  羟丙基甲基纤维素(#2910，USP，Pharmacoat 603)   3.00
  十二烷基硫酸钠(NF)   1.00
  滑石(USP)   1.00
  硬脂酸镁(NF)   0.5
  合计   100.00
实施例C-16：依普利农多晶形物组合物
制备了含有100mg依普利农并含有下列组分的胶囊(硬明胶较囊，#0)：
  成分   含量(mg)
  L型依普利农   90.0
  H型依普利农   10.0
  乳糖，水合，NF   231.4
  微晶纤维素，NF   45.4
  滑石，USP   10.0
  交联羟甲纤维素钠，NF   8.0
  十二烷基硫酸钠，NF   2.0
  胶体二氧化硅，NF   2.0
  硬脂酸镁，NF   1.2
  总的胶囊填充重量   400.0
实施例C-17：依普利农多晶形物组合物
制备了含有200mg依普利农并含有下列组分的胶囊(硬明胶较囊，#0)：
  成分   含量(mg)
  L型依普利农   190.0
  H型依普利农   10.0
  乳糖，水合，NF   147.8
  微晶纤维素，NF   29.0
  滑石，USP   10.0
  交联羟甲纤维素钠，NF   8.0
  十二烷基硫酸钠，NF   2.0
  胶体二氧化硅，NF   2.0
  硬脂酸镁，NF   1.2
  总的胶囊填充重量   400.0
实施例C-18：制备研磨的依普利农
首先通过将溶剂合物在Fitzmill上过2目筛从而将干燥的甲基乙基酮解团块。随后在供给流速约250kg/hr的液氮冷却下，利用AlpineHosakawa柱盘精细磨对解团块的固体物质进行精细研磨。精细研磨产生了D90大小约为65-100微米的研磨的依普利农。
由上文看来，本发明的数个目的都已实现。由于在不偏离本发明的范围的情况下，可对上述本发明中的方法、结合和组合物做多种变化，所以应该指出，包含在上述说明中的任何内容都解释为例证性的，并且没有对本发明做任何限制的意思。本专利申请中提及的所有文献特别包含在本发明中，全文引用作为参考。
当介绍本发明的要素或其优选实施方案时，冠词″一种″、″该″和″所述″是指其中存在一或多个要素。名词″包含″，″包括″和″具有″指包含在内的，意思是在列出的要素之外还有其他的附加要素。

Claims (21)

1.依普利农在制备用于治疗或预防患有或易患肾功能障碍的人类受试者的肾功能障碍的药物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中受试者具有一种或多种选自低于正常的醛固酮水平、盐敏感性和饮食钠摄取增加的状况。
3.权利要求1的用途，其中肾功能障碍选自肾高血压、肾小球硬化、晚期肾脏疾病、糖尿病肾病、肾血流减少、肾小球滤过分数增加、蛋白尿、肾小球滤过率减少、肌酐清除率减少、微白蛋白尿、肾血管病变、缺血性病变、血栓形成性病变、肾小球纤维蛋白样坏死、肾小球毛细血管局灶性血栓形成、毛细血管内细胞肿胀和增生、毛细血管外细胞肿胀和增生、有细胞增生的网状系膜基质扩张、无细胞增生的网状系膜基质扩张和恶性肾硬化。
4.权利要求1的用途，其中肾功能障碍选自肾小球滤过率减少、微白蛋白尿和蛋白尿。
5.权利要求1的用途，其中肾功能障碍为肾小球滤过率减少。
6.权利要求1的用途，其中肾功能障碍为微白蛋白尿。
7.权利要求1的用途，其中肾功能障碍为蛋白尿。
8.权利要求1的用途，其中肾功能障碍为恶性肾硬化。
9.权利要求1的用途，其中肾功能障碍为糖尿病肾病。
10.权利要求1的用途，其中肾功能障碍为晚期肾脏疾病。
11.权利要求1的用途，其中肾功能障碍为肾血流减少。
12.权利要求1-11中任一项的用途，其中受试者具有低于正常的血清醛固酮水平。
13.权利要求12的用途，其中受试者血清醛固酮水平少于3ng/dL。
14.权利要求1-11中任一项的用途，其中受试者具有盐敏感性。
15.权利要求1-11中任一项的用途，其中受试者的饮食钠摄取增加。
16.权利要求15的用途，其中受试者日均饮食钠摄取为至少50毫当量。
17.权利要求15的用途，其中受试者日均饮食钠摄取为至少200毫当重。
18.权利要求1-11中任一项的用途，其中受试者血浆醛固酮与血浆肾素的活性比大于30，其中血浆醛固酮的单位为ng/dL，血浆肾素的单位为ng/ml/hr。
19.权利要求1-11中任一项的用途，其中受试者清晨血浆肾素水平小于或等于1.0ng/dL/hr。
20.权利要求1-11中任一项的用途，其中受试者的尿钠与尿钾的比小于6。
21.权利要求1-11中任一项的用途，其中受试者全部或部分为黑人种族的成员。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030162759A1 (en) * 2000-07-27 2003-08-28 Ricardo Rocha Aldosterone blocker therapy to prevent or treat inflammation-related disorders
BR0214924A (pt) 2001-12-12 2004-11-30 Pharmacia Corp Métodos para tratamento de distúrbios oftálmicos com antagonistas de receptor de aldosterona de epóxi esteroidal
CA2469950A1 (en) * 2001-12-13 2003-06-26 Pharmacia Corporation Methods for treatment or prophylaxis of aldosterone-mediated pathogenic effectgs in a subject using an epoxy-steroidal aldosterone antagonist
WO2003080068A1 (en) * 2002-03-18 2003-10-02 Pharmacia Corporation Combination of an aldosterone receptor antagonist and nicotinic acid or a nicotinic acid derivative
TW200400816A (en) 2002-06-26 2004-01-16 Lilly Co Eli Tricyclic steroid hormone nuclear receptor modulators
US20040048840A1 (en) * 2002-08-23 2004-03-11 Pharmacia Corporation Modulation of matrix metalloproteinase (MMP) activity with aldosterone blocker(s)
EP1558265B1 (en) * 2002-11-05 2010-01-06 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Use of drospirenone for the treatment of hypertension
US7786101B2 (en) 2002-11-05 2010-08-31 Bayer Schering Pharma Ag Cardiovascular protection using anti-aldosteronic progestins
US20050014732A1 (en) * 2003-03-14 2005-01-20 Pharmacia Corporation Combination of an aldosterone receptor antagonist and an anti-diabetic agent
US20070275941A1 (en) * 2006-05-17 2007-11-29 Vladimir Hanes Salt sensitivity and prevention of hypertension with drospirenone
DE102011012712A1 (de) * 2011-03-01 2012-09-06 Frank Lehmann-Horn Verwendung von Aldosteron-Rezeptor-Antagonisten zur Behandlung von weiblicher sexueller Dysfunktion
WO2021150715A1 (en) * 2020-01-21 2021-07-29 University Of Southern California Ketogenic fasting-mimicking diet to improve kidney function

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI77669C (fi) * 1983-04-13 1989-04-10 Ciba Geigy Ag 20-spiroxaner och analoger, som innehaoller en oeppen ring e, foerfarande foer deras framstaellning samt dessa innehaollande farmaceutiska preparat.
US5529992A (en) * 1992-04-21 1996-06-25 Curators Of The University Of Missouri Method for inhibiting myocardial fibrosis by administering an aldosterone antagonist which suppresses aldoster one receptors
AU4777896A (en) * 1995-02-10 1996-08-27 G.D. Searle & Co. Use of low dose amount of spironolactone for treatment of cardiovascular disease
CZ20011590A3 (cs) * 1998-11-06 2003-01-15 G. D. Searle & Co. Léčivo pro léčení kardiovaskulárních poruch a kompozice s obsahem inhibitoru enzymu konvertujícího angiotensin, antagonisty aldosteronu, kličkového diuretika a digoxinu

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