CN1560057A - 高纯度磷脂酰肌醇的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高纯度磷脂酰肌醇(PI)的制备方法。PE的溶解度在碱性乙醇中明显高于乙醇，使用碱性乙醇抽提，可有效地从大豆磷脂中去除磷脂酰胆碱(PC)和PE，将得到的PI粗品溶于非极性溶剂中，加入含碱性物质的含水极性溶剂进行液－液萃取，将PI萃取到含水极性溶剂中，再加入金属盐纯化，可得高纯度PI。

Description

高纯度磷脂酰肌醇的制备方法

(一)技术领域

本发明涉及一种高纯度磷脂酰肌醇的制备方法。

(二)背景技术

磷脂广泛分布于动物、植物、微生物、藻类等生物体内，主要作为细胞膜的构成成分，起着各种重要的作用。天然磷脂通常是由磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酸(PA)及鞘磷脂等组成的混合物，作为粉状大豆磷脂，PC含量19～31％，PE含量18～20％，PI含量18～21％，PS含量1％，PA含量15～20％。

肌醇脂类是80年代发现的在细胞生物信息跨膜传递上起重要作用的信使***，与细胞的生长调控等密切相关。PI是肌醇脂类***组分之一，约占细胞总磷脂的5～10％，它广泛存在于细胞膜与内质网上，代谢活跃，具有重要的生理功能。药理学实验证明高纯度的PI对某些中枢神经***紊乱疾病有一定的治疗作用，最近有研究发现其硫酸盐SPI是一种新型抗HIV(human immunodeficiency virus)药物。PI具有重要的生理功能以及独特的乳化性能，可被广泛用于食品、保健品、医药、化妆品和工业制剂等许多领域。

分离纯化PI对于深入研究它的代谢、生理作用及开发它的药用价值都有着重要的意义。Folch(Folch J.Complete fraction of brain cephalin：Isolation from it ofphosphatidylserine，phosphatidylethanolamine and diphosphoinositide.J.Biol.Chem.，1949，177：497)首先从脑中分离出肌醇磷脂。以后提取方法虽有许多改进，但仍较复杂，主要是使用甲醇、乙醇、丙酮、***、氯仿、二甲苯等有机试剂中的一种或几种的混合液进行抽提，再结合硅胶、氧化铝、离子交换树脂等吸附剂的柱层析法或薄层层析法分离纯化PI，费力费时，需要耗费大量有机溶剂，成本高、产量低。近几年，国外有人尝试通过化学合成、酶解法来制备高纯度的PI，但对技术和设备要求严格，且常常造成所含脂肪酸或磷酸酯的不饱和键衰败。目前，我国对高纯度PI开发利用的研究发展缓慢，一直停留在实验室研究阶段，PI的工业化生产是研究的难点。

据目前已有提取方法制备的PI纯度不高，常含有磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)。溶剂萃取与柱层析技术相结合可以提高PI的纯度，但溶剂耗量大，产品极少，得率很低，工业化规模生产受限，正因为如此，最终得到的产物很昂贵。

(三)发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种简单、有效、可工业化生产的高纯度磷脂酰肌醇(PI)的制备方法。

本发明的方法步骤如下：

1、将含磷脂原料与3～10倍体积的碱性乙醇混合，在室温到50℃之间，最好在40℃以下，不断搅拌抽提，去除混合磷脂原料中的PC、PE，得PI粗品；可以抽提一次，最好是分开多次抽提。

向乙醇中添加碱性物质以获得碱性乙醇。乙醇可以是无水乙醇，也可以是含水乙醇，最好是含水5％重量百分比以下的乙醇，以避免磷脂结块，使抽提、分离操作困难。

碱性物质可以是氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾、碳酸钠、醋酸钠、醋酸钾等，只要使抽提液变成碱性。碱性乙醇的pH为8.0～12.0，最好是9.0～11.0，碱性过高会增加设备的负担，造成部分磷脂的水解。

2、将上述碱性乙醇抽提后得到的PI粗品溶于非极性溶剂，加入含碱性物质的含水极性溶剂进行液-液萃取，将PI萃取到含水极性溶剂中，得PI萃取液。

提取温度在所使用的溶剂的沸点以内，30～50℃为宜。

使用的含水极性溶剂，含水量为20～70％重量百分比，最好是40～60％重量百分比。含水极性溶剂中溶解的碱性物质可以是氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾、醋酸钠、醋酸钾、氨水、碳酸铵等，水溶液只要能变成碱性即可，其浓度最好是原料1摩尔对1/2～4摩尔。另外，也可以用缓冲液，pH为7.5～12.0，最好是8.0～10.0之间。

3、向上述PI萃取液，按每100ml提取液10～30mg的比例，添加钙、镁、铁、铝等金属的醋酸盐、硝酸盐、硫酸盐、有机酸盐等金属盐，搅拌后，避光阴凉处静置，过滤或离心得沉淀，经真空干燥或冷冻干燥，得高纯度的PI。

本发明优选使用粉状大豆磷脂为原料，本方法也适合于含有PI的其他原料，动物、植物、微生物和藻类混合磷脂，化学方法或发酵法得到的混合磷脂原料均可。这些原料可以直接使用，或用氯仿、甲苯、***、丙酮、甲醇、异丙醇等有机试剂抽提浓缩，预处理后使用。

本发明利用溶剂酸碱性、极性对磷脂溶解性的影响，通过简单的溶剂萃取、金属离子沉淀，可得到较高纯度的PI，提供了一种简单、有效、可工业化生产的制备PI的方法。

(四)具体实施方式

实施例1：将10g粉状大豆磷脂(PI含量为18％)，加入到40℃、五倍体积的碱性乙醇(无水乙醇∶氨水＝100∶3，V/V)抽提液中，搅拌浸提一小时，离心分离抽出液，将残渣与碱性乙醇混合，重复同样的操作二次，不溶物在60℃真空干燥，得到粉末状的磷脂酰肌醇粗品4.28g，其中含磷脂酰肌醇41.5％，磷脂酸39.4％。称取1g该磷脂酰肌醇粗品，溶于60ml正己烷，充分溶解后与溶有0.325g无水醋酸钠的55％含水乙醇100ml一同装入分液漏斗，在室温下振荡1分钟，静置过夜。分离含水乙醇层，加入0.03g氯化钙，搅拌15分钟，在4℃状态下静置过夜。离心分离沉淀，真空干燥得到高纯度磷脂酰肌醇0.18g，含磷脂酰肌醇为87.8％。

实施例2：称取DEAE-纤维素20g，悬浮于50ml 1N醋酸钠(pH7.0)中，静置过夜。过滤后加水缓慢搅拌、过滤，去除滤液，向纤维素中加入甲醇，慢慢搅拌，过滤后进一步用氯仿-甲醇(1∶4，V/V)洗净，完成纤维素的活化。重复实施例1中的操作得到高纯度磷脂酰肌醇样品，称取1g加入到100ml含有活化后纤维素的氯仿-甲醇(1∶4，V/V)混合液中，在室温下搅拌1小时，过滤，用200ml氯仿-甲醇(1∶4，V/V)混合液冲洗，然后再用400ml含0.1％醋酸钠(W/V)的氯仿(1∶4，V/V)洗脱，收集洗脱液，30℃真空浓缩，加入10倍体积的丙酮，分离沉淀溶于少量的氯仿，加入五倍体积的30％酒精浸洗3次，至氯仿溶液上层无白色物质后，再加入10倍体积的丙酮，离心后将沉淀冷冻干燥至恒重，可得到磷脂酰肌醇0.45g，磷脂酰肌醇含量为96.5％。

实施例3：将10g粉状大豆磷脂，加入到40℃、五倍体积的含0.01％NaOH的乙醇抽提液中，搅拌浸提一小时，离心分离抽出液，将残渣与碱性乙醇混合，重复同样的操作二次，不溶物在60℃真空干燥，得到粉末状的磷脂酰肌醇粗品4.46g，其中含磷脂酰肌醇37.5％，磷脂酸36.4％，磷脂酰乙醇胺1.7％，磷脂酰胆碱0.6％。称取1g磷脂酰肌醇粗品，溶于60ml正己烷。充分溶解后与溶有0.325g无水醋酸钠的55％的含水乙醇100ml一同装入分液漏斗，在室温下振荡1分钟，静置过夜。分离含水乙醇层，加入0.026g氯化钙，搅拌15分钟，在4℃状态下静置过夜。离心分离沉淀，真空干燥得到高纯度磷脂酰肌醇0.16g，含磷脂酰肌醇为80.6％。

实施例4：将100g粉状大豆磷脂，加入到40℃、三倍体积的无水乙醇抽提液中，搅拌浸提一小时，离心分离抽出液，残渣加入乙醇重复同样的操作二次，得到不溶物66.7g，其中含磷脂酰肌醇29.7％，磷脂酸21.5％，磷脂酰乙醇胺18.3％，磷脂酰胆碱7.2％。将20g大豆磷脂乙醇不溶物，加入到40℃、五倍体积的碱性乙醇(无水乙醇∶氨水＝100∶3，V/V)抽提液中，搅拌浸洗一小时，离心分离抽出液，将残渣与碱性乙醇混合，重复同样的操作二次，不溶物在60℃真空干燥，得到粉状的磷脂酰肌醇粗品11.2g，其中含磷脂酰肌醇45.7％，磷脂酸39.9％，几乎不含磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱。将上述磷脂酰肌醇粗品10g溶于600ml正己烷，用2升溶有6.5g醋酸钠的55％含水乙醇，在连续逆向提取装置中、40℃状态下提取己烷相，得到含有磷脂酰肌醇的含水乙醇相，加入0.56g氯化钙，搅拌15分钟，在4℃状态下静置过夜，离心分离沉淀，真空干燥得到高纯度磷脂酰肌醇3.5g，含磷脂酰肌醇为88.3％。

Claims (9)

1、一种高纯度磷脂酰肌醇的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将混合磷脂原料与3～10倍体积的碱性乙醇混合，在室温到50℃之间，不断搅拌抽提，去除混合磷脂原料中的PC、PE，得PI粗品；

(2)将上述碱性乙醇抽提后得到的PI粗品溶于非极性溶剂，加入含碱性物质的含水极性溶剂进行液—液萃取，将PI萃取到含水极性溶剂中，得PI萃取液，提取温度在所使用的溶剂的沸点以内；

(3)向上述PI萃取液，按每100ml提取液10～30mg的比例，添加钙、镁、铁、铝的醋酸盐、硝酸盐、硫酸盐或有机酸盐，搅拌后，避光阴凉处静置，过滤或离心得沉淀，经真空干燥或冷冻干燥，得更高纯度的PI。

2、如权利要求1所述的高纯度磷脂酰肌醇的制备方法，其特征在于，向乙醇中添加碱性物质以获得碱性乙醇，乙醇可以是无水乙醇或含水5％重量百分比以下的乙醇。

3、如权利要求2所述的高纯度磷脂酰肌醇的制备方法，其特征在于，碱性乙醇的pH为8.0～12.0，优选9.0～11.0。

4、如权利要求2所述的高纯度磷脂酰肌醇的制备方法，其特征在于，向乙醇中添加的碱性物质可以是氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾、碳酸钠、醋酸钠或醋酸钾。

5、如权利要求1所述的高纯度磷脂酰肌醇的制备方法，其特征在于，使用的含水极性溶剂，含水量为20～70％，优选40～60％。

6、如权利要求1所述的高纯度磷脂酰肌醇的制备方法，其特征在于，使用的含水极性溶剂中溶解的碱性物质可以是氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾、醋酸钠、醋酸钾、氨水或碳酸铵，其浓度是原料1摩尔比1/2～4摩尔。

7、如权利要求1所述的高纯度磷脂酰肌醇的制备方法，其特征在于，使用粉状大豆磷脂为原料，或者含有PI的动物、植物、微生物和藻类混合磷脂，或者化学方法或发酵法得到的混合磷脂原料。

8、如权利要求5所述的高纯度磷脂酰肌醇的制备方法，其特征在于，所述原料可以直接使用，或用氯仿、甲苯、***、丙酮、甲醇、异丙醇等有机试剂抽提浓缩，预处理后使用。

9、如权利要求5所述的高纯度磷脂酰肌醇的制备方法，其特征在于，所述原料为乳状磷脂或油脚，经过丙酮提取，乳状磷脂或油脚∶丙酮＝1∶18～30(V/V)，1400转/分离心5～10分钟，经真空干燥，40～50℃，真空度0.07～0.09，制得粉状磷脂。