CN1778920A

CN1778920A - 大菱鲆抗菌肽基因及其酵母表达载体

Info

Publication number: CN1778920A
Application number: CN 200510104202
Authority: CN
Inventors: 陈松林; 李伟
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2005-09-27
Filing date: 2005-09-27
Publication date: 2006-05-31

Abstract

一种大菱鲆抗菌肽hepcidin基因及其酵母表达载体，它的方法是分离克隆了大菱鲆抗菌肽cDNA及基因组基因，将该基因成熟肽序列重组到酵母胞内表达载体pGAPZB上，构建成融合型表达载体pGAPZB－thep6his，转化毕赤酵母SMD1168，获得了能够稳定表达融合型抗菌肽蛋白的酵母菌株；通过SDS－PAGE和Western blot检测认为抗菌肽基因实现了表达.。本发明首次克隆了大菱鲆抗菌肽基因并构建了胞内融合型酵母表达载体，实现了胞内融合型表达重组大菱鲆抗菌肽，不需要对重组抗菌肽进行分离纯化，可直接以酵母菌的形式作为鱼类等水产动物的饲料添加剂。本发明方法可用于各种鱼类抗菌肽基因克隆和表达载体的构建，用于鱼类等水产动物的疾病防治。

Description

大菱鲆抗菌肽基因及其酵母表达载体

所属技术领域：

本发明属于生物技术领域中的鱼类基因工程技术，是一种能在鱼类病害防治中应用的鱼类抗菌肽基因及其酵母重组表达载体的研制方法。

背景技术：

随着抗生素的普遍使用，致病菌的抗药性问题已经越来越多的受到关注，研发新型抗菌药物迫在眉睫。鱼类是特异性免疫和非特异性免疫并存的脊椎动物。在鱼类对外界刺激及病原生物侵袭的防御反应中，非特异性免疫起着重要作用。抗菌肽是一类可以抵抗多种病原菌感染的非特异性免疫因子。有研究发现：抗菌肽在鱼、虾抵抗病原感染过程中起着重要作用。有许多种抗菌肽基因已经从不同种类的鱼体中获得。作为重要的鱼类天然免疫***组成成员，在鱼类抵抗外部病原物刺激时发挥重要作用(Chen SL，et al.，2005)。在目前抗病疫苗短缺的情况下，该类物质具备作为替代抗生素的巨大潜力。

鱼类的肝脏、皮肤、腮、头肾、肠和皮肤分泌物是抗菌肽物质主要存在的地方。目前已分离到的鱼类抗菌肽主要有：类组蛋白类抗菌肽(Fernandes JMO，2004)，Mi sgurnin(Park，CB.，1997)、Plerocidin(Pat rzykat A.，2003)、Moronecidin(Lauth，X.，2002)、Hepcidin(Shike，H.，2002；Douglas，SE.，2003；Chen SL.，2005)等。但发现并克隆的鱼类抗菌肽基因较少。

虽然鱼类抗菌肽基因工程开展的比较晚，但都取得了相当大的成果。有研究证实：转抗菌肽cecro pi n B的沟鲇鱼亲代和子代抗病原菌E.ictaluri和Fla vobacterium columnare的能力明显提高(DunhamRA.，2002)。抗菌肽B和P1被转入鲑鱼胚胎CHSE-214细胞系后，用RT-PCR和Southern杂交都可以检测到转基因的存在，同时表达分离的产物具有很强的抗菌活性(Sarmasik A.，et al，2003)。有关鱼类抗菌肽基因重组表达载体构建及其在酵母中的表达研究，目前尚无报道。

发明内容：

本发明的目的是为了构建鱼类抗菌肽(Hepcidin)基因重组酵母表达载体，建立将基因重组抗菌肽酵母作为鱼类饲料添加剂的技术，为鱼类抗病机理研究和病害防治提供基因材料和技术方法。

本发明其技术内容如下：一、大菱鲆抗菌肽(hepcidin)基因的克隆；二、重组hepcidin抗菌肽基因酵母表达载体的构建及在酵母中的表达。

一、大菱鲆抗菌肽(hepcidin)基因的克隆：包括cDNA克隆、基因组DNA序列的获得、基因组DNA序列分析与比对。

1、cDNA的扩增和克隆：利用TRIzol试剂盒从大菱鲆肝脏中提取总RNA，利用MMLV反转录得到cDNA第一条链。根据不同物种hepcidin的氨基酸序列的同源性设计简并引物，扩增得到大菱鲆hepcidin基因的cDNA全长编码框。序列分析表明大菱鲆hepcidin cDNA全长286bp，编码一个长90aa的蛋白质。该蛋白质前体肽包含有一个24氨基酸的信号肽，一个40氨基酸的前导肽和一个26氨基酸的成熟肽。该成熟肽区域包含有8个半光胺酸残基，符合该类抗菌肽的典型特征。

2.基因组DNA序列的获得：用一对来自于cDNA的特异性引物扩增大菱鲆的基因组DNA，得到包含有内含子的大菱鲆hepcidin基因序列。

3、DNA序列分析与比对：序列测定表明该基因组DNA全长571bp，包含有2个内含子分别为114nt和172nt。将cDNA和基因组DNA序列与美国GENBANK序列数据库中已存的DNA序列进行比对，用BLASTN和BLASTX程序计算我们获得的cDNA克隆片段与GENBANK序列数据库中已存的DNA序列的同源性。

二、大菱鲆抗菌肽基因酵母胞内融合表达载体的构建及在酵母中的表达：包括表达载体的构建、表达载体向酵母细胞的转化、含大菱鲆抗菌肽基因的重组酵母的筛选、重组抗菌肽小量表达。

1.酵母表达载体的构建：

根据测定出的大菱鲆抗菌肽成熟肽基因的序列，设计一对含有适当酶切位点(EcoRI和Xba I)的特异引物，分别为pcTBHN1(5’-ATCGAATTCATGCAATCCCACATCTCCCTTTGC-3’)和pcTBHC1(5’-GCAAGTCTCTAGAAACTTGCAGCAGAAACCACA-3’)。从肝脏提取的cDNA中扩增抗菌肽成熟肽序列，经酶切后连接到用同样的酶消化的酵母胞内表达载体pGAPZB，构建成大菱鲆抗菌肽基因酵母胞内融合型表达载体。

2.表达载体向酵母细胞的转化：

将大量制备的大菱鲆抗菌肽Hepcidin基因表达载体pGAPZB-thep6his用BlnI酶切，使其线性化，通过电穿孔方法将线性化的抗菌肽基因酵母表达质粒转化到巴氏毕赤酵母SMD1168细胞内，于30℃培养1-2天筛选阳性转化子。

3.含大菱鲆抗菌肽基因的重组酵母的筛选：

通过使用特异的引物进行PCR，进一步证实所筛选出来的、整合了外源抗菌肽基因的酵母菌落。所用PCR引物为pGAPF(5’-gtccctatttcaatcaattgaa-3’)和pGAPR(5’-gcaaatggcattctgacatcc-3’)。

4.重组抗菌肽小量表达：

挑取阳性单菌落，接种于YPD培养基中进行扩大培养。培养结束后，将培养液以最大速度离心5-10min。将上清以及离心后的菌液放于-80℃备用。取适量的菌体，加入含蜗牛酶的SCE消化溶液，37℃消化3小时。离心取上清进行蛋白质电泳分析。

本发明与已有技术对比其特点是：本发明以大菱鲆为材料首次构建了鱼类抗菌肽(hepcidin)基因融合型酵母表达载体，并实现了胞内融合型表达抗菌肽物质，适宜用作鱼类等水产动物的饲料添加剂，用于鱼类等水产动物的疾病防治.本发明的技术方法可在其它鱼类上进行应用。

附图说明：

图1：大菱鲆Hepeidin基因和推导的氨基酸序列；

图2：大菱鲆抗菌肽Hepeidin基因表达载体；

具体实施方式：

下面以大菱鲆抗菌肽hepcidin基因的克隆和表达载体构建为例，结合附图，对本发明的技术内容进行详细说明。

本发明其技术内容如下：一、大菱鲆抗菌肽(hepcidin)基因的克隆；包括cDNA克隆、基因组DNA序列的扩增、基因组DNA序列分析与比对。二、重组hepcidin抗菌肽基因酵母表达载体的构建及在酵母中的表达：包括表达载体的构建、表达载体向酵母细胞的转化、含大菱鲆抗菌肽基因的重组酵母的筛选、重组抗菌肽小量表达。

一、大菱鲆抗菌肽hepcidin基因的克隆：

1.cDNA的扩增和克隆：利用TRIzol试剂盒从大菱鲆肝脏中提取总RNA，利用MMLV反转录得到cDNA第一条链。根据不同种类鱼的已知hepcidin序列的氨基酸同源性设计简并引物，扩增得到hepcidin的全长编码区。序列测定发现，cDNA全长286bp，编码一个长90aa的蛋白质。该蛋白质前体肽包含有一个24氨基酸的信号肽，一个40氨基酸的前导肽和一个26氨基酸的成熟肽。该成熟肽区域包含有8个半光胺酸残基，符合该类抗菌肽的典型特征。

2.基因组DNA序列的扩增：用一对来自于cDNA的特异引物扩增大菱鲆的基因组DNA，得到包含有内含子的大菱鲆hepcidin基因序列。序列测定认为该基因组DNA(见图1)全长571bp，包含有2个内含子，分别为114nt和172nt。

3.DNA序列分析与比对：将cDNA和基因组DNA的序列与美国GENBANK序列数据库中已存的DNA序列进行比对，用PHRAP聚类程序鉴定共同序列和单一序列；用BLASTN和BLASTX程序计算我们获得的cDNA克隆片段与GENBANK序列数据库中已存的DNA序列的同源性。

二、重组hepcidin抗菌肽基因酵母表达载体的构建及在酵母中的表达：

1.酵母表达载体的构建：根据测定出的大菱鲆抗菌肽成熟肽基因的序列，设计含有适当酶切位点的特异引物，从大菱鲆肝脏提取的cDNA中扩增抗菌肽成熟肽序列，经酶切后连接到用同样的酶消化的酵母表达载体pGAPZB，构建成鱼类抗菌肽基因酵母表达质粒。为了扩增大菱鲆hepcidin基因成熟肽序列，根据表达载体pGAPZB的特点设计了一对特异性的引物，分别为pcTBHN1(5’-atcgaattcatgcaatcccacatctccctttgc-3’)和pcTBHC1(5’-gcaagtctctagaaacttgcagcagaaaccaca-3’)。引物序列在不改变hepcidin成熟肽编码氨基酸的基础上，根据酵母的密码子偏好性对部分氨基酸的密码子进行了突变，同时在上游引物pcTBHN1和下游引物pcTBHC1上分别引入了EcoRI和XbaI酶切位点，在N端引物pcTBHN1上引入了转录启始密码子ATG。设计的C端引物把hepcidin成熟肽最后一个密码子TTC突变为TTT，同时使得载体的XbaI位点的序列由(tctaga)变成(ctaga)经过适当的酶切后，与用同样的酶消化的pGAPZB载体进行连接，产生大菱鲆抗菌肽基因表达载体pGAPZB-thep6his(见图2)。

2、表达载体向酵母细胞的转化：将大量制备的大菱鲆抗菌肽Hepcidin基因酵母表达载体pGAPZB-thep6his用BlnI酶切，使其线性化，通过电穿孔方法将线性化的抗菌肽基因酵母表达质粒转化到巴氏毕赤酵母SMD1168细胞内，在含有300μg/ml Zeocin抗生素的YPDS平板上，30℃培养1-2天筛选阳性转化子。

3、含大菱鲆抗菌肽基因的重组酵母的筛选：通过使用特异的引物进行PCR，进一步证实所筛选出来的、整合了外源抗菌肽基因的酵母菌落。所用PCR引物为pGAPF(5’-gtccctatttcaatcaattgaa-3’)和pGAPR(5’-gcaaatggcattctgacatcc-3’)。

4、重组抗菌肽小量表达：挑取阳性单菌落，接种于YPD培养基中进行扩大培养。每24小时取样。整个操作过程保持无菌操作。培养结束后，将培养液以最大速度离心5-10min。将上清以及离心后的菌液放于-80℃备用。取适量的菌体，加入含蜗牛酶(30mg/ml)的SCE消化溶液(ph7.0)(0.9M山梨醇，0.1M柠檬酸钠，0.06M EDTA，PH8.0)，37℃消化3小时。离心取上清进行蛋白质电泳分析。

序列表

<110>中国水产科学院黄海水产研究所

<120>大菱鲆抗菌肽hepcidin基因及其酵母表达载体

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>286

<212>DNA

<213>大菱鲆(Scophthalmus maximus)

<400>1

ctcaaaatga aggcattcag cattgcagtt gcagtgacac tcgtgctcgc ctttgtttgc 60

attctggaga gctctgccgt cccgttccct ggggtgcaag agctggaaga ggcagggagc 120

aatgacactc cagccgcggc acatcaagag acgtcaatgg aaccgtggac ggtgccgagt 180

cacatcaggc agaagcgaca gagccacatc tccctttgcc gctggtgctg caactgctgc 240

aaggccaaca agggctgtgg cttctgctgc aagttctgag gattcc 286

<210>2

<211>90

<212>PRT

<213>大菱鲆(Scophthalmus maximus)

<400>2

Met Lys Ala Phe Ser Ile Ala Val Ala Val Thr Leu Val Leu Ala Phe

1 5 10 15

Val Cys Ile Leu Glu Ser Ser Ala Val Pro Phe Pro Gly Val Gln Glu

20 25 30

Leu Glu Glu Ala Gly Ser Asn Asp Thr Pro Ala Ala Ala His Gln Glu

35 40 45

Thr Ser Met Glu Pro Trp Thr Val Pro Ser His Ile Arg Gln Lys Arg

50 55 60

Gln Ser His Ile Ser Leu Cys Arg Trp Cys Cys Asn Cys Cys Lys Ala

65 70 75 80

Asn Lys Gly Cys Gly Phe Cys Cys Lys Phe

85 90

Claims

1、一种大菱鲆抗菌肽hepcidin基因，其特征在于大菱鲆抗菌肽基因的克隆，主要包括全长cDNA、基因组DNA的获得，序列分析与比对；

cDNA的克隆：用TRIzol试剂盒从大菱鲆肝脏中提取总RNA，用MMLV反转录为cDNA的第一条链；根据不同物种的hepcidin的氨基酸序列的同源区域设计简并引物，扩增得到hepcidin基因的cDNA全长编码框；

基因组DNA的获得：用一对来自于cDNA的特异性引物扩增大菱鲆基因组DNA，得到包含有内含子的hepcidin基因全序列；

DNA序列分析与比对：将从cDNA序列与GENBANK序列数据库中已存的hepcidin基因的序列进行比对，用PHRAP聚类程序鉴定共同序列和单一序列；用BLASTN和BLASTX程序计算我们获得的cDNA与GENBANK序列数据库中已存的hepcidin基因序列的同源性。

2、根据权利要求1所述的大菱鲆抗菌肽基因，其特征在于所述的cDNA序列：该基因的cDNA全长为286个碱基，包括273个碱基的开放阅读框，该阅读框编码90个氨基酸的前体，该前体又由3个区组成，24个氨基酸组成的信号肽，40个氨基酸组成的前导肽和26个氨基酸组成的成熟肽，该成熟肽包括8个半光胺酸残基.Hepeidin基因、cDNA和推导的氨基酸序列为：

1 CTCAAA ATGAAGGCATTCAGCATTGCAGTTGCAGTGACACTCGTGCTCGCCTTTGTTTGCATTCTGGAGAGCTCT

M K A F S I A V A V T L V L A F V C I L E S S

76 GCCGTCCCGTTCCCTGGGgtaaggcgtgaacttttaactcacttcatttgcccatgagctataaaatgttttggt

A V P F P G

151 ttttttgtcggggtgccaagatggcggctcgctaaaacatgcacgatccgttcacagGTGCAAGAGCTGGAAGAG

V Q E L E E

226 GCAGGGAGCAATGACACTCCAGCCGCGGCACATCAAGAGACGTCAATGGAACCGTGGACGgtatgttcaattgac

A G S N D T P A A A H Q E T S M E P W T

301 tggatgaattaggccaattactgtgagcaggttcaaattcaagtggcggcgttttccccacagagcagcctggcg

376 ctgtctccacgcagggggtggggggtgatggaatgctggggagagaaaaacgcctcgttcacgtctcttgtctcc

451 cacacagGTGCCGAGTCACATCAGGCAGAAGCGACAGAGCCACATCTCCCTTTGCCGCTGGTGCTGCAACTGCTG

V P S H I R Q K R Q S H I S L C R W C C N C C

526 CAAGGCCAACAAGGGCTGTGGCTTCTGCTGCAAGTTC TGAGGATTCC

K A N K G C G F C C K F *

3.一种酵母表达载体，其特征在于所述的胞内融合型表达载体的构建及其在酵母中的表达，它的方法是：

表达载体的构建：根据测定出的大菱鲆抗菌肽基因序列，设计一对基因特异引物，pcTBHN1(5’-ATCGAATTCATGCAATCCCACATCTCCCTTTGC-3’)和pcTBHC1(5’-GCAAGTCTCTAG AAACTTGCAGCAGAAACCACA-3’)，扩增大菱鲆抗菌肽Hepcidin成熟肽序列，经酶切后连接到用同样的酶消化的酵母胞内表达载体pGAPZB，构建成大菱鲆抗菌肽基因酵母胞内融合型表达载体；

表达载体向酵母细胞的转化：将大量制备的大菱鲆抗菌肽Hepcidin基因表达载体pGAPZB-thep6his用适当酶切，使其线性化，通过电穿孔方法将线性化的抗菌肽基因酵母表达质粒转化到巴氏毕赤酵母SMD1168细胞内，于30℃培养1-2天筛选阳性转化子；

含大菱鲆抗菌肽基因的重组酵母的筛选：通过使用特异的引物进行PCR，筛选整合了外源抗菌肽基因的酵母菌落，

所用PCR引物为：pGAPF(5’-gtccctatttcaatcaattgaa-3’)和pGAPR(5’-gcaaatggcattctgacat cc-3’)；

重组抗菌肽小量表达：挑取阳性单菌落，接种于YPD培养基中进行扩大培养；培养结束后，将培养液以最大速度离心5-10min；将上清以及离心后的菌液放于-80℃备用；取适量的菌体，加入含蜗牛酶的SCE消化溶液，37℃消化3小时；离心取上清进行蛋白质电泳分析。