CN1511850A

CN1511850A - Mhc-肽抗体多聚体的制备方法

Info

Publication number: CN1511850A
Application number: CNA021599734A
Authority: CN
Inventors: 徐小宁; 王小宁
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-12-31
Filing date: 2002-12-31
Publication date: 2004-07-14

Abstract

本发明涉及一种MHC－肽抗体多聚体的制备方法。通过制备纯化的MHC I类分子的重链和轻链，把纯化产物注射到动物体内使其产生抗体，纯化后标记上荧光标记物再把标记的抗体与新工艺制备的MHC－肽单聚体混合，聚合成为MHC－肽抗体多聚体。制备的MHC－肽抗体多聚体可用于各种条件下的特异性T细胞的检测、分选和活化。

Description

MHC-肽抗体多聚体的制备方法

技术领域：

本发明涉及一种MHC-肽抗体多聚体的制备方法。属于生物制药领域。

背景技术：

MHC分子是可识别和提呈特异性抗原肽以共TCR识别的分子。

I型MHC分子是一种由可变重链和恒定轻链组成的二聚化蛋白复合物，可识别和呈递内源性肽段，即I型MHC可在胞内加工、载入MHC中的结合裂缝并转运至细胞表面的肽类，其中所述的复合物通过MHC重链被锚定在膜内。肽类通常有8-11个氨基酸长，这取决于在MHC中结合时引入抗原肽的弯曲程度。由MHC重链的膜远端α1和α2结构域形成的结合裂缝具有“封闭”端，从而对抗原肽的长度产生相当严格的限制。

II型MHC也是一种由α和β链组成的二聚化蛋白质，两条链是可变的糖蛋白并通过跨膜结构镶嵌在细胞中。II型MHC识别和呈递外源性肽段，类似于I型MHC，II型分子形成结合裂缝，其中***了氨基酸14-17个氨基酸，其结合裂缝是“开放”的，对抗原肽的长度限制不十分严格。

各细胞呈递高达6种不同的I型分子和大量类似II型分子形成的肽类，所呈递的MHC复合物的总数在10⁵-10⁶/细胞的范围。据估计存在于I型分子中的肽类的多样性一般在1,000-10,000，它们中的90％以100-1,000个拷贝/细胞存在(Hunt，Michel等，1992；Chicz，Urban等，1993；Engelhard，Appella等，1993；Huczko，Bodnar等，1993)。认为最大量的肽类构成所呈递总肽的0.4-5％，这意味着可能存在高达20,000个相同的复合物。然而，最大量的单一肽复合物的平均数可能在2,000-4,000/细胞的范围，且可识别T细胞表位的一般呈递水平在100-500个复合物/细胞的范围(参见Engelhard，1994的综述)。

T细胞对特异性MHC-肽复合物的识别是由α-和β-链组成的T细胞受体(TCR)介导的，所述的α-和β-链被锚定在膜中。在类似于对抗体基因所观察到的重组过程中，TCRα和β基因由在胞外抗原结合结构域中产生大量多样性的可变、连接、多样和恒定的元件重新排列(10¹³-10¹⁵种不同的可能性)。TCRs还以带有γ和δ链的不同形式存在，但它们仅存在于大约5％的T细胞上。

抗体和TCRs是唯一两类以特异性方式识别抗原的分子且由此TCR是对存在于MHC中特定肽抗原具有特异性的唯一受体。

以大量不同的方式表达TCRs，各TCR对一种或几种MHC-肽复合物具有特异性。TCR与MHC-肽配体之间的连接是机极其短寿命的，半衰期通常低于1秒。T细胞与靶细胞(假定是TCR/MHC-肽)之间的粘附依赖于多种TCR/MHC-肽连接物以及一定量的共同受体-配体连接物的相互作用。

TCR与MHC肽的各种相互作用在生理温度下即37℃下是极为短寿命的。使用对由HLA-A 0201(HLA-A2)呈递的流感病毒“基质”肽具有特异性的人TCR测定的TCR-MHC-肽抗体相互作用半衰期的近似数值是0.7秒。CD8分子与这种MHC-肽抗体复合物的相互作用的半衰期低于0.01秒即至少比前者快18倍。

MHC-肽与TCR和CD8受体之间结合的半衰期很短。这个问题已经被使用MHC-肽复合物的四聚体分子的新技术(Altman等，1996)所克服。多聚体相互作用的高的亲和力使得与T细胞结合的分子的半衰期比以单聚体肽-MHC复合物结合的半衰期显著延长。这一技术在美国专利WO96/26962中也有描述。

MHC肽四聚体复合物使用合成肽，即β2微球蛋白(通常在大肠杆菌中表达)，和可溶性MHC重链(也在大肠杆菌中表达)构成的。在跨膜区的起始处截断MHC重链，用构成细菌修饰酶BirA的识别序列的蛋白质标记取代跨膜区(Barker和Campbell，1981；Schatz，1993)。BirA催化在有点冗余的识别系列中赖氨酸残基的生物素化(Schatz，1993)，然而，其特异性要足够高以确保绝大多数的蛋白质只在标记的特定位置上被生物素化。然后生物素化蛋白质便可与其中每个都有四个生物素结合位点的抗生物素蛋白、链酶抗生物素或外抗生物素蛋白(Sigma)非共价连接，生成肽-MHC复合物的四聚体分子(Altman等，1996)。

目前已报道的制备上述四聚体要有7个步骤(US Patent Number 5,635,363)：

1、克隆HLA重链的特异细胞区基因：在C末端上连接能结合生物素的位点，连于载体中，转染E.coli。

2、制备可溶性的HLA重链。

3、克隆β₂微球蛋白基因于载体中，转染E.coli。

4、制备可溶性的β₂微球蛋白。

5、通过把MHC重链、β₂微球蛋白和相关肽链一起复性制备出单MHC-肽抗体链单聚体。

6、用BirA酶催化，使单聚体生物素化。

7、用荧光标记的亲和素与单聚体结合生物素化形成四聚体。

用这种方法可以制备出能与T细胞牢固结合的四聚体。

发明内容：

但是用上述方法制备MHC-肽抗体多聚体，步骤繁复，制备单聚体时由于两种MHC蛋白和一种肽链，要共同复性得率很低；制备四聚体时要先把单MHC-肽单聚体复合物生物素化，这种生物素化要其特异性要足够高以确保绝大多数的蛋白质只在标记的特定位置上被生物素化。然后生物素化蛋白质才可与其中每个都有四个生物素结合位点的抗生物素蛋白、链酶抗生物素或外抗生物素蛋白(Sigma)共价连接，生成肽-MHC复合物的四聚体分子。最终的得率都很低。

本发明的目的是提供一种高效率制备MHC-肽抗体抗体多聚体的方法。

由于抗体-抗原相互作用通常亲和力相当高，所以我们用抗MHC-肽抗体复合物的抗体代替生物素-抗生物素，制备MHC-肽抗体抗体多聚体。这种制备方法只需要制备两个蛋白，所以简化了制备步骤。采用申请人的另一发明专利提交了单聚体的复性效率，比上述专利技术(USP5,635,363)提高120％。用抗体代替生物素合成多聚体提高了得率。

本发明所述的MHC-肽抗体抗体多聚体的制备方法，包括以下步骤：

1、克隆MHC重链基因到载体中，并把它转染到E.coli中合成重组可溶MHC重链蛋白。

2、克隆MHC轻链基因到载体中，转染到E.coli中，合成重组β2蛋白。

3、把目的MHC重链、β2微球蛋白和目的肽段一起复性制备出MHC-肽单聚体。

4、纯化单MHC/肽单聚体。

5、把纯化的重链、轻链免疫动物制备抗体。

6、纯化抗体。

7、将制备的抗体标记荧光。

8、把标记好的抗体和MHC-肽单聚体混合制备出MHC/肽抗体多聚体。

9、纯化MHC-肽抗体多聚体。

首先提取RNA并合成cDNA，用PBS冲洗B细胞，并把细胞重新悬浮在PBS中。把细胞加入到氯仿中，混匀，然后冰浴。离心；把上层移到新的试管里。加入异丙醇沉淀RNA，冰浴，离心。用乙醇洗两次RNA，并把它重新悬浮水中。把RNA加入到寡聚dT中合成cDNA，培育，放在室温下，然后加入RNAsin，稍微混匀。然后加入dNTP，MDTT和10×RT缓冲液，混匀后再加入逆转录酶。把混合液在培育1小时，然后用苯酚抽提，用乙醇沉淀，新合成的cDNA又重新悬浮在的水中。

再次用PCR方法扩增HLA重链，这个重链已被去掉引导序列、跨膜序列和胞质尾。并在BirA酶的C末端(posion276)加上一个肽基因。用于A2/A68/A24的引物是(J Immunol Methods 2002 Dec 20；271(1-2)：177-84)：

3’Primer：

5’- cc ctc acc tta aga tgg gag ccg gga tcc ggt ggt ctg aac gat att ttt

A2 anneal Tm＝740C BAMH 1 avidity biotinlation

Tag

gaa gct cag aaa atc gaa tgg cat taa gct tcc ccc-3’

HIDIII

5’-primer：

5’-aca tac cca tgg gct ctc act cca tga ggt att tc-3’

NcoI

用常规方法纯化PCR产物。并根据《分子克隆》把质粒转染到大肠杆菌中，筛选出一个克隆，大量表达HLA重链。纯化此肽链。把纯化的重链、可溶的β微球蛋白和目的肽段一起复性，得到MHC-肽单聚体。(用重组蛋白提纯方法，中国专利号：96106778.0)

把纯化了的MHC/肽复合物注射到动物体内；制备多克隆抗体或单克隆抗体，荧光标记抗体，再与单聚体结合，形成MHC-肽抗体多聚体。

附图说明：图1多聚物结构图

图2制备MHC/肽复合物多聚体流程图

具体实施方式：

实施例1：克隆HLA重链，并在表达载体C端连接一个肽链基因。

(1)RNA提取和cDNA合成

用PBS一次洗涤5百万个B细胞，并把细胞重新悬浮在20μl的PBS中。把在Tris试剂中的200μl/百万细胞加入到1/10体积的氯仿中，混匀20秒，然后冰浴15分钟。把混合物在13000rpm，4℃下离心15分钟；把上层移到新的试管里。加入等体积的异丙醇沉淀RNA，冰浴45分钟，接着4℃离心15分钟。用70％的乙醇洗两次RNA，并把它重新悬浮在36μDEPC处理过的水中。把18μlRNA加入到0.2单位的寡聚dT(Collaborative Research Incorporated)中合成cDNA，在70℃下培育3分钟，放在室温下，然后加入0.5μlRNAsin(Promega)，稍微混匀。然后加入8μl 5mM dNTP，4μl 0.1MDTT和4μl10×RT缓冲液，混匀后再加入逆转录酶。把混合液在42℃培育1小时，然后用苯酚抽提，用乙醇沉淀，新合成的cDNA又重新悬浮在50μl的水中。

(2)PCR扩增带有肽链的HLA重链

这个重链已被去掉引导序列、跨膜序列和胞质尾。并在BirA酶的C末端(posion276)加上生物素标记。用于A2/A68/A24的引物是：

3’Primer：

5’- cc ctc acc tta aga tgg gag ccg gga tcc ggt ggt ctg aac gat att ttt

A2 anneal Tm＝740C BAMH 1 avidity biotinlation

Tag

gaa gct cag aaa atc gaa tgg cat taa gct tcc ccc-3’

HDIII

5’-primer：

5’-aca tac cca tgg gct ctc act cca tga ggt att tc-3’

NcoI

PCR反应体系(100μl)

10×PCR缓冲液：10μl

dNTP：0.2mM/每次

primer：0.1mM/每次

pfu(或taq)：1μl

PCR步骤：

95℃ 5分钟

95℃ 1分钟——60℃ 1分钟——72℃ 2分钟(30次)

72℃ 10分钟

(3)纯化PCR产物：

a准备S300琼脂糖凝胶(分离：118bp)

凝胶通常在100％的乙醇中，必须用TE缓冲液至少冲洗3分钟，并能在TE缓冲液中保存较长的时间(室温)。

b把纯化液用1ml/s的速度冲洗，最后用一个小玻璃球终止，并加入1mlS300，在1750rpm下离心3分钟。

c把PCR产物放到试管中离心。

(4)酶消化和连接

a用NcoI和HIDIII消化PCR产物和载体(PET23d+)，37℃ 4小时后消化完全。

B用1％TBE琼脂糖凝胶，用Microdiberfiter洗提胶的边(whatman，cat.1822025)。分离到的PCR产物大约850-900bp。

C纯化S300的洗脱液，在此时能粗略的用UV检测浓度。

(5)连接，转化，克隆和制备质粒DNA。

用常规步骤，先用jm109细胞，则能制备出大量的质粒DNA。

(6)用测序或ARMS PCR筛选质粒DNA。

表达HLA重链

(1)少量表达重链：

a把1-4μl的质粒DNA转化到BL21pLysS大肠杆菌中。转化效率也许比JM109低。GG用37℃代替42℃热冲击5分钟。

B筛选出一个克隆，在2ml低盐LB(AMP)培养液中培养2-3小时，当OD值在600nm时为0.3-0.5，取出500μl，在剩下的溶液中加入0.5mMIPTG，37℃放置，振荡4小时(OD＝0.6-0.9)

C冻起100μl，剩下的在13000rpm离心3分钟，并在-20℃存储。D加入100μl1×储存缓冲液，混匀，95℃放置5分钟。

E13000rpm离心5分钟

F在12％SDS中储存10μl的上清液。

控制好：已知HC蛋白Marker和前诱导S/N

另外：用几个质粒开始很重要，因为不确定的原因一些质粒表达会比其他的好。

(2)表达大量的HC

A把原液接种到新鲜的低盐LB琼脂板中。

B挑取表达最高的单菌落，并在1L的低盐LB培养液中培养，37℃振荡O/N.

C第二天，测OD值(0.6-0.9)，取40ml培养液到每个摇瓶中，共六个摇瓶。

在37℃振荡摇瓶3-4小时，定期测OD_600nm至0.5-0.6。加入IPTG，诱导4h。

D表达的蛋白存在在细菌的包含体中

试剂和配方：

低盐LB培养基(1L)

胰化蛋白冻(10g)

酵母膏 (5g)

Nacl (5g)

H₂O 加至1L

Triton洗液(250ml)：——在4℃下保存

0.5％Triton×100(1.25ml Triton)

50mM Tris pH8(1.25ml of 1M Tris pH8)

100mM Nacl(25ml of 1M Nacl)

0.1％NaN3(2.5ml of 10％NaN3)

1mM EDTA(500μl of 0.5M EDTA)

1mM DTT(125μl of 2.2MDTT)重悬浮缓冲液(100mls)在4℃下存放

50mM Tris pH8(5ml of 1M Tris pH8)

100mM NaCl(10ml of 1M Nacl)

1mM EDTA(200μl of 0.5M EDTA)

1mM DTT(50μl of 2.2M DTT)

实施例2：重组蛋白的变性

1、菌体破碎

(1)取工程菌100克加1000ml 20mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，pH8.0，洗涤细菌，于4℃离心700rpm×10min，弃上清。

(2)湿菌加入溶菌酶5mg，50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，pH8.0缓冲液1000ml，于4℃搅拌2h(小时)，在-20℃放置过夜。

(3)将上述细菌融解后超声破菌，30sec(秒)×10次，每次间隔1min，至液体变稀薄、气泡为止。镜检细菌破碎率＞98％。

2、包涵体的洗涤

(1)取菌体破碎液离心4000rpm×5min，4℃，留沉淀。

(2)用20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，pH8.0液洗涤。

(3)用20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，2mmol/L 2-ME(2-巯基乙醇)，0.5％Tritonx-100(曲通X-100，一种去垢剂)，pH8.0液洗1次，去脂质。

(4)用20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，pH8.0液洗2次，以去除Tritonx-100

(5)用2mol/L尿素，20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，pH8.0液洗1次，去除杂蛋白。

(6)70％异丙醇，20mmol/L Tris-HCl，2mmol/LEDTA，pH8.0液洗1次，去除脂多糖。

(7)用20mmol/L Tris-HCl，pH8.0洗2次，去除异丙醇。以上步骤加缓冲液500ml，于4℃离心12000rpm×20min后，弃上清。

3、重组蛋白变性纯化

(1)包涵体溶于变性剂：取包涵体沉淀物，加入7mol/L盐酸胍，10mmol/LDDT(二硫苏糖醇)，1mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0，浓度为20％。充分搅拌溶解30min后，于4℃离心12000rpm×30min，取上清，得到重组蛋白粗提物，并将其稀释到50μg/ml。

(2)向7mol/L盐酸胍溶解的包涵体中加入含10mmol/L DDT，1mmol/LEDTA，20mmol/L Tris-HCl pH8.0缓冲液，将盐酸胍浓度分两次降低，至重组蛋白全部析出，4℃离心12000rpm×20min，弃上清，沉淀用20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，pH8.0的缓冲液洗2次，10000rpm×10min离心得沉淀。

4、重组蛋白二次变性纯化

8.0mol尿素，1mmol/L EDTA，100mmol/L 2-ME，20mmol/L NaAc，pH4.0溶解上述沉淀，离心(12000rpm×20min)去不溶物，调整蛋白浓度为8-10mg/ml。

尿素溶液(50ml)

8M尿素(40ml of 10M尿素)

100mM NaH₂PO₄(5mls of 1M)

10mM Tris pH8(250μl of 2M)

0.1mM EDTA(10μl of 0.5M)

0.1mM DTT(2.2μl of 2.2M DTT)

实施例3：HLA重链和β2微球蛋白、抗原肽的复性

将实施例2中在二性变性液中的HLA重链及β₂微球蛋白等量混合并加入4倍量的抗原肽。抗原肽是各种T细胞识别抗原表位，可以是病原体、组织相容性抗原、肿瘤抗原上的表位。在尿素缓冲液中缓慢加入复性液(1mmol/LEDTA，1mmol/L还原型谷胱苷肽(GSH)，0.1mmol/L氧化型谷胱苷肽(CSSG、100mMTris PH8.0)，20mmol/L NaAc，pH4.0)，即在80min内降低尿素浓度至1.0mol/L，再一次稀释到0.1mol/L，复性物4℃过夜，然后用20mmol/L Tris pH8.0中透析或超滤平衡去除复性剂。

试剂：

复性缓冲液：(1L)

100mM Tris PH8(100ml 1M PH8的Tris)

2mM EDTA(4ml 0.5M EDTA)

加H2O至1L

高压冷冻于4℃

400mM L-精氨酸-HCL(84.28g L-精氨酸)

5mM还原型谷胱甘肽(1.54g)

0.5mM氧化型谷胱甘肽(0.31g)

实施例4：复性后的MHC重链和轻链的纯化

1、离子交换层析(去核酸、热源)

DEAE Sepharose fast flow，用5倍柱体积的20mmol/L Tris(PH8.0)平衡，以3ml/min上样复性的β_2m样品，用含1.0mmol/L NaCl的20mmol Tris PH8.8梯度洗脱收集目的蛋白峰，得到纯化的β_2m，用PEG8000浓缩。

2、分子筛层析(去除异构体、热源、交换体系)

(1)SephacrylS-200(一种凝胶排阻层析填料)层析柱去热源处理。

(2)用5倍柱体积20mmol/L Tris，PH8.0平衡层析柱。

(3)按10％柱体积在上述缓冲体系中上样并洗脱，流速60ml/h。收集蛋白峰，得到纯化的HC用PEG8000浓缩。

实施例5：用纯化的MHC重链和轻链免疫蛋鸡制备抗体

取健康蛋鸡，用已预先纯化完成的MHC重链和轻链与完全佐剂(CompleteFreund’s adjuvand)以1∶1的比例混合为抗原，以肌肉注射方式注射，以诱发抗体的生成。两周后，再以不完全佐剂(Incomplete Freund’s adjuvant)以1∶1的比例进行追加反应(booster dose)。两周后加强免疫一次，鸡蛋中即有抗体生成。

取鸡蛋，此鸡蛋为新鲜产蛋或经4℃保存的冷藏蛋，打破以取出蛋黄加入约为其体积的6-20倍的水，利用一般搅拌器或磁性搅拌器(magnetic stirrer)将其混合均匀。而后以冷冻高速离心机于4℃及5000rpm的状态下，予以分离，并收集富含IgY的上清液。

加入饱和硫酸铵(Ammonium sulfate(NH₄)₂SO₄)于富含IgY的上清液中，使达50％硫酸铵饱和度，经充分均匀搅拌后，同样利用冷冻高速离心机于4℃，15000rpm离心，收集沉淀。用DEAE Sephrose fast flow纯化。

实施例6：用纯化的MHC重链和轻链免疫小鼠制备单克隆抗体

将纯化底HC和β₂m抗原与完全弗氏佐剂按1∶1混匀乳化后，腹腔注射BALB/c小鼠，每只小鼠抗原接种剂量为30ug，间隔两周后以同样抗原剂量加不完全弗氏佐剂腹腔注射，两周后以同样抗原剂量腹腔注射，七天后再加强一次，融合前三天，加强免疫三次。当效价达到1∶2000时，停止免疫。

分别取1×10⁸免疫鼠脾细胞与3×10⁷NS-1骨髓瘤细胞加入50ml的离心管中，补加不完全培养基至30ml，充分混匀。1000rpm离心7min，弃上清，轻弹管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状。均匀地转动离心管，同时用1ml吸管吸取50％PEG1500溶液0.7ml沿管壁60s内加入(尽量接近细胞处)，然后立即于30s内加入25ml不完全培养液，第1min加1ml，第2min加4ml，然后3min内将剩余液体加完(均边加培养液边轻轻转动离心管)。800rpm离心7min，弃上清。加入40mlHAT培养液，轻轻吸吹沉淀使其悬浮并混匀。将细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1ml，共四块培养板。将培养板置37C，含5％CO₂的培养箱中培养。

融合后根据情况7～10天用HAT培养液半量换液，以后每隔2～3天半量换液一次，两周后改用HT培养液。以纯化的重组蛋白为抗原，用间接ELISA反应检测，筛出强阳性克隆，对筛出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行亚克隆，直至100％孔为阳性，随后转入24孔细胞培养板，继而转入细胞培养瓶中进行扩大培养及时对细胞进行液氮冻存。

在接种杂交瘤细胞前两周，先给10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡，两周后，将培养的杂交瘤细胞吹打下来，100rpm离心10min，弃上清，用无血清培养液稀释细胞至1-2×10⁶/ml，每只小鼠腹腔注入0.5ml杂交瘤细胞，待腹部胀大后抽取腹水。IgG类抗体用正辛酸法，IgM类抗体用葡聚糖G-200凝胶过滤纯化，并进一步用蛋白A或G亲和层析柱精纯。

实施例7：荧光标记抗体

用50mmol/L PBS，PH7.5分别调整纯化的卵黄抗体或单克隆抗体及RPE的浓度至16mg/ml和4mg/ml，分别取125ul和0.9ml。使RPE与卵黄抗体或单克隆抗体的质量比为3.6mg∶2mg，摩尔比1.2∶1。加入琥珀酰亚胺基-4-(N-甲基马来酰亚胺)环己烷-1-碳酸酯(以下简记为：SMCC)，使其与蛋白的摩尔比为100∶1；4℃摇床，中速往复振荡，反应4h。活化反应后，脱盐除去未反应活化试剂，并调整各反应物体积之比为1∶1，混合反应，室温(15～25℃)，摇床中速往复振荡，反应时间为90min。加入终止液(80mmol/L NEM)100ul中止交联反应，室温，摇床中速往复振荡30min：将反应产物装入透析卡中，浓缩调整体积至0.5ml，以便上样洗脱。葡聚糖G-25凝胶过滤纯化，测卵黄抗体或单克隆抗体与RPE的克分子比。

实施例8：制备MHC/肽抗体多聚体

水浴或冰冻孵箱预冷1L折叠缓冲液(装于有搅拌子的1L的烧杯中)，在折叠缓冲液加入还原型谷胱酐肽至5mM，氧化型谷胱酐肽至0.5mM，PMSF至0.2mM。计算加入1uM重链、2uM轻链和30mg/L肽的必需量，将重链和轻链加入5ml注射缓冲液中，于室温抽入5ml注射器中。并根据多肽的氨基酸序列(疏水性)于500ul双蒸水或DMSO中稀释多肽。将1L重悬缓冲液放于搅拌器上高速搅拌(避免反应液起泡)，用移液器逐滴加多肽于搅拌的反应液中。用26号针头在尽可能接近搅拌子的位置猛烈将重链和轻链注射于搅拌的反应液中。加入轻链后，折叠缓冲液应变得轻微不透明。存放于10℃，过夜。

将复性反应物超滤浓缩至7ml。用Superdex75凝胶过滤纯化MHC-肽单聚体。用SDS-PAGE检测，并用ELISA法鉴定其构象，一抗为BB7.2。

将MHC-I单聚体与制备的荧光标记的卵黄抗体按比例混合，37℃温浴1h，用Superdex200凝胶过滤纯化。FPLC检测。

将MHC-I单聚体与制备的荧光标记的单克隆抗体按比例混合，37℃温浴1h，用Superdex200凝胶过滤纯化。FPLC检测。

Claims

1、一种制备MHC/肽抗体多聚体的方法，其特征是制备纯化的MHC-I类分子的重链和轻链，再把纯化产物注射到动物体内使其产生抗体，纯化所得抗体，得到纯化的抗体后，再在抗体和MHC-肽单聚体混合形成MHC/肽抗体多聚体。

2、如权利要求1所述的一种制备MHC-肽抗体多聚体的方法，所述的MHC/肽复合物是通过如下步骤合成：

(1)将MHC-I类分子各种重链的基因克隆至相应载体中，转染E.coli，合成MHC-I类分子的重链重组蛋白；

(2)将MHC-I类分子的轻链β微球蛋白基因克隆至相应载体中，转染至E.coli中，合成轻链重组蛋白；

(3)把目的MHC-I类蛋白的重链、β微球蛋白和目的肽链一起复性制备出MHC-I单聚体；

3、如权利要求1所述的一种制备MHC-肽抗体多聚体的方法，所述的抗体是通过用纯化MHC-I类分子的重链和轻链重组蛋白免疫动物制备得到。

4、如权利要求1所述的一种制备MHC-肽多聚体的方法，所述的荧光标记物为异硫氰酸荧光素FITC或藻蓝藻红蛋白PE。

5、如权利要求2所述的一种制备MHC/肽抗体多聚体的方法，其步骤(1)中的MHC重链基因为MHCI族重链基因。

6、如权利要求2所述的一种制备MHC-肽抗体多聚体的方法，其步骤(3)中MHC/肽链复合物的制备方法为重组蛋白提取纯化方法。

7、如权利要求3所述的一种制备MHC-肽抗体多聚体的方法，所述的纯化重组HLA重轻链蛋白为人类的。

8、如权利要求3所述的一种制备MHC-肽抗体多聚体的方法，所述的动物可以为鼠、家兔、鸡、马、羊。

9、如权利要求3所述的一种制备MHC-肽抗体多聚体的方法，所述的动物优选小鼠或鸡。

10、如权利要求1所述的一种制备MHC-肽抗体多聚体的方法，所述的MHC-肽抗体复合物中的肽是任何T细胞识别的抗原表位，是来自各种病原体、肿瘤、自身抗原组织相容性抗原。