CN1193353A - 变应原－xcd32融合蛋白 - Google Patents

Abstract

包含一种或多种抗原和一种或多种与人类Fcγ受体Ⅱ(FcγRⅡ)(CD32)相互作用的部分的融合蛋白。

Description

变应原-XCD32融合蛋白

本发明涉及人类IgG和抗原/变应原(或抗原/变应原的组合体)的复合物。其有关抗-CD32分子和抗原/变应原(或抗原/变应原的组合体)之间的融合蛋白。变应原本文定义为特应性患者以过敏反应对其作出反应的抗原。本文所使用的抗原可以是各种来源的，例如环境变应原(如房间尘螨、桦树花粉、草花粉、猫抗原、蟑螂抗原)或食物变应原(如牛奶、花生、虾、大豆)或两者的组合体，或者非相关抗原(如牛血清白蛋白(BSA))。

***反应是一种疾病，其中IgE抗体介导效应细胞(肥大细胞、嗜碱细胞、嗜曙红细胞)的活化，而且通过IgE的低和高亲和性受体(B细胞、单核细胞、树状细胞)增强抗原呈递。IgE的这些作用可以被特异性IgG抗体抵消，所述IgG抗体在效应和诱导细胞两者上与CD32(FcγRII)相互作用。因此，***反应应该被认为是具有不平衡的Th1对Th2细胞的一种疾病。IgG抗体体内抵消IgE成功与否取决于特异性IgE超过特异性IgG的相对浓度，也取决于IgG的同型。所有人类同型对CD32具有低的亲和性，这可以由形成与变应原的复合物克服，但是许多变应原不形成足够大的使得可以稳定地结合到CD32上的与IgG分子的复合物。

迄今使用了利用变应原的活性接种的两种形式。最普遍的是所谓的“免疫疗法”，这依赖于用相对高浓度的变应原频繁免疫。这种技术仅仅在少数变应性疾病(如蜂刺***反应)和鼻炎和结膜炎的某些病例中有一定的效果，前不久一些报道显示了在哮喘和特应性皮炎中的有效性。经典的皮下途径用于施用变应原，但是最近将这一途径与口头施用甚至局部施用进行了比较，结果总的来说是正的但是不一致。一种最新的免疫疗法，即所谓的Saint-Remy技术(参见例如EP 0 178 085和0 287 361)，其使用体外与相关的变应原复合的自身IgG抗体。这种方法使得可以使用低得多的量的变应原，具有更小的副作用。

两种疗法的机制不清楚。在经典方法中，虽然不是所有的特异性IgG的明显增加都与成功的免疫疗法有关，但疗法引起特异性IgG抗体增加时显得具有有益的作用。这一现象的一个可能的理由是IgG抗体对B细胞、单核细胞和肥大细胞上的CD32的比较低的亲和性。Saint-Remy法从病人选择特异性IgG抗体，随后体外将其与相关变应原混合。以这种方式，他们保证变应原不能与细胞或在细胞上的其它抗体同型(如在肥大细胞上的IgE)自由地进行反应。此外，抗个体基团型抗体可能是针对特异性IgG分子而产生的，随后将阻止***反应，虽然这一点还没有由实验数据确认。

IgG分子在指导免疫反应针对单核细胞而非B细胞中是重要的。当一般性变应原-特异性IgG代替供体-特异性变应原-特异性IgG使用时，Saint-Remy法因此应该起作用。然而，Saint-Remy法的问题在于人类IgG抗体对其在B细胞上的Fcγ受体的低的亲和性，这与IgE相反，后者易于结合几乎所有的抗原-呈递细胞(包括B细胞)，导致散布***反应和诱导Th2细胞。复合物的用途应该绕过低亲和性问题，因为与单个IgG分子比较复合物提高的抗体亲抗原性；然而，在复合物中的变应原/IgG的组合体也是不合乎需要的，因为结合人类IgG分子的变应原的表位的自然数不到5，太少以致不能增强复合物对受体的抗体亲抗原性。

采用本发明，经典的免疫疗法的风险因素被降低，并且在分离特异性IgG分子中所遇到的问题和这些IgG抗体对CD32的低亲和性问题得到解决。

IgE结合至肥大细胞和嗜碱细胞上引起组胺释放(当由抗原交联时)。此外，IgE能够提高人类B细胞的抗原呈递(图1)。此外，在不存在IgE时，B细胞是非常差的抗原-呈递细胞，除了很小部分的B细胞外，其是特异性抗原受体。可通过胞饮发生抗原摄取，但是这需要高的抗原浓度和/或长的培养时间。

图2显示，超过5天的变应原胞饮能够模仿IgE-介导的抗原呈递，但是IgG-介导的抗原呈递不引起T细胞的刺激作用。事实上，数据表明复合变应原和IgG阻止变应原呈递。

在另一系列实验中，研究了这些IgG-变应原复合物对IgE-介导的抗原呈递或变应原的胞饮摄取的作用。图3显示IgG复合物以剂量-依赖性方式抑制IgE-介导的抗原呈递，此外，在胞饮之后的抗原呈递受到抑制。这种作用不是抗原-特异性的(IgG/BSA复合物抑制Der P1-特异性刺激作用)，单体(非复合的)IgG不抑制抗原呈递。

由图4中所示的实验排除了IgG/变应原复合物的毒性。与人类单核细胞一起(预)温育的IgG3-Der P1复合物能够引起一种正常的T细胞反应。这意味着IgG/变应原复合物抑制B细胞的变应原呈递，同时刺激单核细胞和树状细胞。同样地，aCD32抗体或涂布在孔底(刺激作用在其中进行)的聚集的IgG也抑制B细胞的抗原呈递(图5)。CD32定向分子抑制抗原呈递的效率很可能依赖于CD32分子的交联的量。然而，对在B细胞上的CD32的导向抗原(如在天然IgG/抗原复合物中(图2)的或在按照本发明的aCD32/抗原融合蛋白中(图13a和13b)的)不引起复合物中抗原的抗原呈递。另一方面，定向单核细胞的相同复合物确实引起抗原-特异性T细胞反应(图4、13a和13b)。这种现象可以通过B细胞上CD32B的存在予以解释，而单核细胞以及树状细胞表达CD32A。因此，IgG/抗原复合物以及aCD32/抗原融合蛋白指导对单核细胞和树状细胞谱系的细胞的免疫反应，这引起主要的Th1型B细胞的T细胞反应，主要表达CD32B的其它APC不呈递复合物中的抗原，因此这些复合物阻止(进一步的)诱导B细胞的Th2细胞反应。复合物和CD32之间的相互作用不依赖强的交联(超过2个CD32分子)，只要复合物的结合强度足以使得可以进行稳定的相互作用。事实上，已经显示在单核细胞上引起CD32多重交联(通过涂布聚集的IgG模仿)的非常大的复合物的结合导致对于抗原-特异性T细胞的刺激作用重要的辅助受体(例如CD80)的下调(表1)。

除抗原呈递之外，按照本发明的IgG/抗原复合物或aCD32/抗原融合蛋白也抑制正常的人类B细胞产生Ig。图14显示在aCD32抗体或聚集的涂布的人类IgG存在下用aCD40和IL-4刺激的扁桃体B细胞(与CD32有效地相互作用)不再能够产生抗体。以aCD32F(ab)片段处理与用完全抗体一样有效(图5)，表明对aCD40和IL-4刺激之后Ig产生的抑制作用而言，不需要受体的交联。通过其B细胞受体(BCR)受到抗原刺激的B细胞需要BCR和CD32的共交联。Ig产生的下调是可逆的和时间依赖性的。当在aCD40加IL-4刺激后4天将aCD32抗体加入到B细胞时，没有观察到Ig产生的抑制作用。图16显示，抗体产生的抗原-特异性诱导也受B细胞的aCD32处理抑制。

本质上，IgG分子通过与CD32的相互作用控制B细胞反应。尤其是，IgE抗体的作用(这一般对(CD23阳性)B细胞具有正向作用)能由IgG分子抵消。这阻止有机体对抗原的超反应性免疫反应。在IgE抗体大量存在的***反应中，很明显天然IgG抗体不能控制免疫反应。有趣的是，在人类中IgE和IgG4由相同的白介素(即IL-4)调节。然而，IgG4具有对所有CD32的人类IgG亚类的最低的亲和性。

本发明涉及融合蛋白，其包含a)一种或多种抗原和b)一种或多种与人类Fcγ受体II(FcPII)(CD32)相互作用的部分，例如来源于抗体分子的部分，在下文，将这种融合蛋白简称为“按照本发明的融合蛋白”。

按照本发明的融合蛋白克服了由人类IgG分子对CD32的低亲和性产生的问题。通过将具有K_d＜10^-6的aCD32抗体与抗原组合，获得了天然IgG分子的负向(B细胞)和正向两种作用，所述作用包括在缺少抗体产生下导致Th1/Th0记忆诱导的免疫***的选择性刺激作用。该作用是无害的，并且指导免疫反应针对表达CD32的抗原-呈递细胞，从而，主要表达CD32A的细胞介导导致Th1细胞的诱导和活化的抗原呈递(作为由CD32A-表达抗原-呈递细胞产生的IL-12的结果)。

按照本发明的融合蛋白优选地没有强的交联。CD32的结合位点的数目优选地是有限的，以避免刺激性辅助-受体(如CD40、CD80或CD86)的下调。

它们也破坏了肥大细胞的效应器功能，这些细胞携带融合蛋白的IgE-特异性部分。它们有下列独特的特征：1)使B细胞-介导的抗原呈递沉默(阻止诱导Th2细胞)；2a)阻止IgE开关诱导；2b)阻止B细胞中的Ig产生；3)通过与单核细胞和/或树枝状细胞的相互作用刺激T细胞区室(Th1细胞的刺激作用)；和4)使对携带有对融合蛋白的部分特异性的IgE的肥大细胞沉默。

它们包括a)一种或多种抗原和b)一种或多种与人类Fcγ受体II相互作用的部分，例如来源于抗体的部分。

与Fcγ受体II相互作用的融合蛋白的部分可以是例如1)完全或不完全(修饰的)人类或人源化IgG抗体部分，只要与这些受体的相互作用仍然可能，这意味着全部或部分Fc片段应该存在；或2)人类或人源化aCD32抗体部分或其一部分，例如Fab片段，其仍然特异性地识别和结合FcγRII(CD32)抗原，如在B细胞、肥大细胞、单核细胞和树枝状细胞上表达的，例如操作的人类或人源化aCD32或IgG抗体部分或其一部分，其以比天然aCD32或IgG抗体更高的亲和性识别FcγRII(CD32)。

所述抗原可以来源于完全蛋白质或其仍然具有T细胞表位(存在于融合蛋白中的序列上)的部分。可以使用具有IgE-介导的超敏性反应的变应性患者对其作出反应的任何抗原，如特应性皮炎、变应性哮喘、变应性鼻炎和变应性结膜炎的变应原。最普通的环境变应原是：房尘螨、桦树花粉、草花粉、猫、蟑螂。每个这样的变应原有一种或多种“主要的变应原”(例如：对于房尘螨，主要的变应原是Der P1；对于桦树花粉，主要的变应原是Bet V1)。然而，完全抗原不是必需的，因为融合蛋白通常仅引起T细胞反应，和对小(8-12个氨基酸长)肽的T细胞反应。因此，选择的T细胞表位可以包括在每种变应原的融合蛋白中，这样降低复合物的大小及分子量。这样，融合蛋白可以是从一种或多种包含T细胞表位的DNA骨架产生的，而不是从完全抗原的基因产生的。变应原之间的重叠交叉反应性表位是优选的。融合蛋白应当特异性地结合CD32，并包含一种或多种(例如两种或多种)T细胞表位(其是一种或多种抗原/变应原的)。为了可以进行正确的抗原加工，比实际T细胞表位稍长的DNA骨架最好应当包括在融合蛋白的制剂中。

对编码aCD32抗体的基因的融合，优选地使用来源于主要变应原的克隆基因的短的DNA序列，如房尘螨主要变应原I(Der P1)或桦树花粉变应原(Bet V1)。这些短的DNA序列包含一种或多种T细胞表位的遗传密码，所述表位在加工后出现在抗原-呈递细胞表面，并由此引起应答变应原-特异性T细胞的免疫反应。对于Der P1，大多数T细胞表位可以在用氨基酸单字母代码表示的序列(SEQ.ID.No.1)的101-143位上发现：QSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNANKIREALAQPQRYCRHYWT101       110      120      130       140

尤其是用氨基酸单字母代码表示的序列(SEQ.ID.No.2)的101-131位：QSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNANKIREAL101       110      120      130包含至少三个T细胞表位，其结合一些HLAII类分子。

在例如aCD32和抗原之间的融合可以在蛋白质水平(化学融合)或在基因水平(重组融合蛋白)上实现，本发明也包括用于生产如上所限定的融合蛋白的方法。其按照常规方式进行，优选地包括采用重组基因技术或化学交联。

重组融合蛋白是优选的。

可以经已知方法(如以下方法)进行利用重组基因技术的制备：从例如IV.3 cDNA PCR-扩增一个基因区段并克隆，所说基因区段含有抗原-结合位点和部分Fc区，后者在aCD32单克隆抗体(例如克隆IV.3)的CH2外显子下游。适当的RNA纯化来作为PCR-扩增的来源，例如，从房尘螨纯化的RNA用于Der P1基因的扩增。将变应原基因与分离的重链区段一起连接进适当的哺乳动物表达载体，如p350。此外，分离例如IV.3的完全相应的轻链基因并克隆进适当的哺乳动物表达载体，如p345，其具有类似于p350的特征。两种重组质粒用于在例如COS细胞中共-转染，使得可以将形成的重组融合蛋白释放到培养介质中。优选地经免疫亲和纯化(基于容易大量获得的抗轻链抗体柱)进行所说产物的纯化。

另外，来源于合适的噬菌体展示文库(例如，De Kruif等，美国科学院学报，92(1995)3938-3942所描述的)的CD32(scFv)特异性单链抗体可以用于由克隆的变应原基因制造重组融合蛋白(图6)。从结合噬菌体提取DNA，分离含有经柔性接头(scFv片段)融合进一个VL链的半-合成VHDJH区的DNA片段并克隆。采用编码T-细胞表位的限定的合成的寡核苷酸从Der P1和其它主要的变应原(由它们的高(T细胞)交叉反应性潜力选择，以便用一种融合蛋白覆盖尽可能多的患者)完成与例如Der P1基因的融合。将这些寡核苷酸与scFv抗体片段一起共-连接进适当的哺乳动物表达载体中。将所说的重组载体(例如质粒)稳定地转染进适当的细胞(如COS和/或CHO细胞)中，经以上所述的免疫亲和色谱从细胞上清液纯化所形成的融合蛋白。

所形成的基因构建体可以在例如CHO细胞中表达，特别是用于大规模生产；然而，经重组基因技术的其它产生***也是适当的，尤其当仅使用T细胞表位(即不需要糖基化)时。可以从人类Ig噬菌体展示文库(其仅含有天然抗体的F(ab)片段)获得aCD32抗体。然而，编码抗体或抗原/变应原的遗传物质的来源不是关键的。

采用Calsson等[生物化学杂志173(1978)723-737]，Cumber等[酶学方法112(1985)207-224]和Peeters等[免疫学方法杂志120(1989)133-143]所描述的方法，经用于例如Mc.a-CD32和Der P1之间的融合蛋白的已知方法进行化学交联的制备。

简言之，Der P1和Mc.a-CD32分别单独地用SPDP(摩尔比分别为1/20和1/5)衍生化以引入2-吡啶基二硫化物残基。在温和还原和凝胶色谱脱盐之后，将SPDP-衍生化的Mc.a-CD32(其二硫化物基团被还原成巯基基团)与SPDP-衍生化的Der P1以1/1.6摩尔比一起温育。然后，形成的DerP1-Mc.a-CD32产物通过凝胶过滤(在例如Superose-12上的)和阴离子交换色谱(在例如FPLC-MonoQ上的)纯化。

起始物质是已知的物质，或者可以按照已知的方法或已知方法的类似方法或本文所描述的(例如实施例中的)方法的类似方法制备。

按照本发明的融合蛋白对预防和/或治疗***反应，特别是食物***反应是有用的。它对患有对特定变应原的***反应的患者以及患有对一种或多种其它变应原的这样一种反应的患者是常见的。通过本发明的方法使同时涉及两种或多种变应原的患者脱敏是可能的，其是经施用包含针对各种这样的变应原的抗原的融合蛋白进行的。优选地按照本发明的融合蛋白将用于预防和/或治疗具有食物***反应危险(例如对奶的***反应)的新生婴儿中的***反应，或者预防和/或治疗具有针对包含在所使用的特定的融合蛋白中的变应原的***反应之患者的已有的***反应。

对于这些疾病，合适的剂量当然随着，例如，所使用的特定的融合蛋白、宿主、施用方式和预期治疗的疾病而变化。然而，一般来说，1-2年内的一至三次接种显示可获得令人满意的结果，但是如果必要，可以进行重复的附加的接种。已显示对这些治疗而言，本发明的融合蛋白可以以类似常规使用的剂量和施用方案来施用。

   因此本发明也涉及以上所限定的融合蛋白在***反应(包括食物***反应)的预防和/或治疗中的用途，和治疗***反应的方法(该方法包括对需要这种治疗的受治疗者施用预防或治疗上有效量的以上所限定的融合蛋白以及至少一种常规的药学上可接受的载体或稀释剂)以及将以上所限定的融合蛋白用作药物(尤其是抗-变应性剂)。

按照本发明的融合蛋白可以与常规的药学上可接受的稀释剂和载体以及可有可无的其它赋形剂混合，经肠胃外、静脉内或肠内施用(例如经肌内或皮下施用)。当然，融合蛋白的浓度随着所使用的化合物、所需的治疗和药物形式的性质而变化。

这样，本发明也包括药物组合物，其包含以上所限定的融合蛋白以及至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。

本发明还涉及制备针对***反应的药物的方法(该方法包括将以上所限定的融合蛋白与药学上可接受的载体或稀释剂混合)和以上所限定的融合蛋白在制造预防和/或治疗***反应(包括食物***反应)之药物上的用途。

本文使用了下列缩写：aCD32    针对CD32的抗体(抗CD32抗体)Ag       抗原APC      抗原-呈递细胞BCR      B细胞受体BetV1    主要的桦树花粉变应原BSA      牛血清白蛋白CNBR     氰溴化物DerP1    主要的房尘螨(Dermatophagoides pteronvssinus)变应原DPT      房尘螨抗原DTT      二硫苏糖醇EBV      Epstein-Barr病毒ELISA    酶联免疫吸附测定FACS     荧光活化细胞分选仪FcγRII   人类Fcγ受体II(＝CD32)Fig.      附图编号FPLC      快速压力液相色谱GaM       山羊抗小鼠抗体HAc       醋酸HLA       人类白细胞抗原HPHT      羟基磷灰石IC        免疫复合物Ig        免疫球蛋白IL-12     白介素-12LST       淋巴细胞刺激作用试验min       分钟MR        摩尔比PBS       磷酸盐缓冲盐溶液PCR       聚合酶链式反应pNPP      对硝基苯磷酸酯sd        标准偏差SPDP      3-(2-吡啶基硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯

在下列说明本发明但不限制本发明的实施例中，所有温度都是摄氏度。

    实施例：制备和纯化Dre P1--单克隆抗CD32融合蛋白A)方法：

通过使用SPDP(一种双功能偶合试剂)将Der P1共价连接到Mc.a-CD32上。简言之，分别用SPDP(摩尔比分别为1/20和1/5)衍生化Der P1和Mc.a-CD32，以引入2-吡啶基二硫化物残基。在温和还原和凝胶色谱脱盐之后，将SPDP-衍生化的Mc.a-CD32(全部二硫化物基团被还原成巯基基团)与SPDP-衍生化的Der P1以1/1.6摩尔比一起温育。然后，形成的DerP1-Mc.a-CD32缀合物通过在Superose-12上的凝胶过滤和在FPLC-MonoQ上的阴离子交换色谱纯化。B)材料：a)SPDP：分子量312.4；25.61mM二甲基甲酰胺贮存溶液(8mg/ml)，就在偶联之前制备。b)Der P1：通过在共价连接到CNBR-Sepharose 4B上的Mc.a-DerP1(4C1/BS/3F8)上的免疫亲和色谱纯化。分子量28kD；等电点5.0(PHAST-IEF)；无菌过滤，用PBS稀释。c)单克隆抗-CD32(IV.3)：同型：小鼠IgG2b-κ链；分子量150kD；等电点6.2(PHAST-IEF)；在Protein-A和HPHT上从培养基上清液纯化，并用PBS透析。反应混合物A：

向1.2ml Der P1溶液(0.84mg)中加入23.4μl SPDP贮存溶液(20摩尔过量)，于室温(22℃)下在2.5ml锥形反应瓶(Pierce)中搅拌混合物45分钟。反应混合物用PBS和未缀合的SPDP添加至2.5ml。在9.1mlPharmacia PD-10一次性脱盐柱(Sephadex G-25)(用50ml PBS平衡过)上经脱盐除去释放的N-羟基琥珀酰亚胺。此后用3.5ml PBS洗脱并收集含有2-吡啶基二硫化物-活化的Der P1的组分。浓度约为0.17mg/ml，相当于0.6mg。由2-吡啶基二硫化物取代的程度的估计：

100μl样品用PBS添加至150μl，加入用PBS稀释的50μl 150mMDTT。通过测定在343nm的吸光度(摩尔消光系数：8080M^-1cm^-1)测定加入DTT后释放的吡啶-2-硫酮的浓度，其相当于引入的2-吡啶基-二硫化物残基。对测定的OD 343nm增加0.074(校正稀释)，计算出取代的程度为1.5Mol 2-吡啶基二硫化物/Mol Der P1。反应混合物B：

向0.5ml Mc.a-CD32溶液(4.2mg)中加入5.5μl SPDP贮存溶液(5摩尔过量)，在室温下搅拌混合物45分钟。将反应混合物加到2.5ml Pierce GF-5一次性脱盐柱(用10ml 0.1M乙酸钠/HAc缓冲液，0.1M NaCl，pH 4.5平衡过)上，此后，用1.5ml乙酸盐缓冲液(pH 4.5)洗脱并收集脱盐的组分，用0.22μm MILLEX-GV(低蛋白结合)滤器过滤。SH-基团的引入：

通过用DTT还原将蛋白质-结合的2-吡啶基二硫化物基团转变成蛋白质-结合的巯基基团。于室温在搅拌下将1.5ml脱盐样品与1ml 62.5mMDTT(用乙酸盐缓冲液稀释)一起温育30分钟(最终DTT浓度25mM)。因为在酸性pH下，2-吡啶基二硫化物增加其亲电性(electrophilicity)，在低的pH下还原仍能进行，而天然蛋白质二硫键不受影响。

对测定的OD 343nm增加0.447，计算出取代的程度为7Mol巯基基团/Mol Mc.a-CD32。

将反应混合物加到Pharmacia PD-10柱(用50ml PBS平衡过)上，此后，用3.5ml PBS洗脱并收集脱盐的组分。用CENTRIPLUS-10(YM10膜)浓缩器将样品浓缩到0.6ml。浓度约为3.1mg/ml，相当于1.86mg。C)偶联方法：

将3.3ml(0.56mg)Der P1(吡啶-二硫化物活化的)和0.6ml(1.86mg)Mc.a-CD32(SH-活化的)混合，在5ml Pierce反应瓶中在室温(22℃)下搅拌2小时，在+4℃搅拌15小时。在反应混合物中Der P1/Mc.a-CD32的分子比是1.6/1。通过测定由于释放的吡啶-2-硫酮的增加引起的OD 343nm的增加来监测偶联反应：

   时间         OD(343nm)

   开始         0.1112

   15分钟       0.1257

   30分钟       0.1342

   45分钟       0.1412

   60分钟       0.1470

   75分钟       0.1519

   120分钟      0.1590D)缀合物的纯化：Superose-12：

用一个0.22μm MILLEX-GV滤器过滤反应混合物(3.9ml)，并用Centriplus-10浓缩器浓缩至0.5ml。缀合物的最终浓度是3.7mg/ml，相当于1.9mg。

将样品加到用PBS平衡过的Superose-12(HR10/30)柱(Pharmacia)上。柱床体积24ml；流速0.2ml/分钟；体积/组分0.4ml；记录图表速度1.5mm/分钟；压力0.3MPa；扫描波长280nm。将洗脱的高分子量组分按照洗脱轮廓分成3组：

  1.2ml A组：  组分#21-23

  1.2ml B组：  组分#24-26

  1.2ml C组：  组分#29-31

将各组无菌过滤(0.22μm MILLEX-GV)，并于+4℃在无菌条件下贮存。总蛋白质浓度约为：A组：100μg/ml；B组：200μg/ml；C组：390μg/ml。FPLC-Mono O：

1ml C组(390μg)用20mM乙醇胺/HCl，0.01％NaN₃缓冲液pH 9.0透析，经在FPLC-Mono Q(HR5/5)阴离子交换剂上的离子交换色谱纯化。起始缓冲液A：20mM乙醇胺/HCl，0.01％NaN₃ pH 9.0；限制缓冲液B：A+0.5M NaCl pH 9.0；流速1ml/分钟，体积/组分1ml；记录图表速度5mm/分钟；压力1.2Mpa；扫描波长280nm。此后，开始一个线性梯度程序30分钟(传导率50-1260μS/cm)。相关的峰在组分#8中洗脱(在340μS/cm下)。蛋白质浓度约为45μg/ml(OD 280nm，E_1％14.0)。用PBS透析样品并无菌过滤。最终纯化的物质的蛋白质浓度为20μg/ml(OD 280nm)。E)分析测定：a)总蛋白质浓度：

按照Bradford的方法，使用BIO-RAD蛋白质测定试剂盒I估计总蛋白质浓度；标准品：牛IgG。b)经ELISA测定Der P1、Mc.a-CD32和Der P1-Mc.a-CD32缀合物

在PVC微滴板上进行固相ELISA。将涂布缓冲液0.1MNaHCO₃/Na₂CO₃，0.01％NaN₃ pH 9.6，具有0.05％Tween-20的PBS用作洗涤溶液，2％在洗涤缓冲液中的胎牛血清用作样品、生物素和酶缀合物的稀释剂。底物是用1M二乙醇胺/HCl缓冲液(pH 9.8)稀释的1mg/mlp-NPP。终止溶液是2M NaOH。在人源化的腔室中进行所有的温育。样品加工和在405nm的OD读数的设备是Beckman Biomek-1000实验室工作站。定量评价：Beckman Immunofit；曲线拟合：4-参数推理。b)1)测定Der P1(图7)：

涂布：100μl/孔Mc.a-Der P1(5H8)10μg/ml，在+4℃过夜。洗涤后，加入100μl/孔样品：

  a)Der P1(偶联的起始物质)(250-0.49ng/ml)作为标准品

  b)Superose-12A组(4000-7.81ng/ml)

  c)Superose-12B组(4000-7.81ng/ml)

d)Superose-12C组(4000-7.81ng/ml)

于+37℃温育2小时。洗涤后，以100μl/孔加入1/500稀释的Mc.a-DerP1(4C1/B8/3F8)-生物素缀合物，在+37℃温育2小时。洗涤后，以50μl/孔加入1/1000稀释的抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶缀合物，在+37℃温育1小时。洗涤后，以100μl/孔加入底物，在37℃温育60分钟并终止。从标准曲线定量评价：

  Superose-12A组：16.1μg/ml

  Superose-12B组：54.9μg/ml

  Superose-12C组：135μg/mlb)2)测定Mc.a-CD32(小鼠IgG2b)(图8)：

涂布：100μl/孔山羊Pc.a-小鼠IgG2b(Southern)5μg/ml，在+4℃过夜。洗涤后，以100μl/孔加入样品：

  a)Mc.a-CD32(偶联的起始物质)(1000-1.96ng/ml)作为标准品

  b)Superose-12A组(8000-15.63ng/ml)

  c)Superose-12B组(8000-15.63ng/ml)

  d)Superose-12C组(8000-15.63ng/ml)

在+37℃温育2小时。洗涤后，以50μl/孔加入1/1000稀释的山羊Pc.a-小鼠IgG2b-碱性磷酸酶缀合物(Southern)，在+37℃温育2小时。洗涤后，以100μl/孔加入底物，在室温下温育15分钟并终止。从标准曲线定量评价：

  Superose-12A组：17.7μg/ml

  Superose-12B组：58.8μg/ml

  Superose-12C组：190μg/ml

按照ELISA评价Der P1/Mc.a-CD32在缀合物中的摩尔比：

  Superose-12A组：4.9/1

  Superose-12B组：5.0/1

  Superose-12C组：3.8/1b)3)Der P1--Mc.a-CD32缀合物的检测：b)3)1)涂布：Mc.a-Der P1(小鼠IgG2a)(图9)：

涂布：100μl/孔Mc.a-Der P1(5H8)10μg/ml，在+4℃过夜。洗涤后，以100μl/孔加入样品：

  a)Der P1(偶联的起始物质)(4000-7.81ng/ml)

  b)Superose-12A组(4000-7.81ng/ml)

  c)Superose-12B组(4000-7.81ng/ml)

  d)Superose-12C组(4000-7.81ng/ml)

  在+37℃温育2小时。洗涤后，以50μl/孔加入1/1000稀释的山羊Pc.a-小鼠IgG2b-碱性磷酸酶缀合物(Southern)，在+37℃温育2小时。洗涤后，以100μl/孔加入底物，在室温下温育30分钟并终止。通过Mc.a-CD32在各Superose-12纯化组分组中的分配检测Mc.a-Der P1-结合的Der P1--Mc.a-CD32缀合物。b)3)2)涂布：Pc.a-小鼠1gG2b(图10)：

涂布：100μl/孔山羊Pc.a-小鼠IgG2b(Southern)5μg/ml，在+4℃过夜。洗涤后，以100μl/孔加入样品：

  a)Der P1(偶联的起始物质)(1000-1.95ng/ml)

  b)Superose-12A组(8000-15.63ng/ml)

  c)Superose-12B组(8000-15.63ng/ml)

  d)Superose-12C组(8000-15.63ng/ml)

在+37℃温育2小时。洗涤后，以100μl/孔加入1/500稀释的Mc.a-DerP1(4C1/B8/3F8)-生物素缀合物(小鼠IgGI)，在+37℃温育2小时。洗涤后，以50μl/孔加入1/1000稀释的抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶缀合物，在+37℃温育1小时。洗涤后，以100μl/孔加入底物。在37℃温育60分钟并终止。通过Der P1在各Superose-12纯化组分组中的分配检测Pc.a-小鼠IgG2b-结合的Der P1--Mc.a-CD32缀合物。c)经天然聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳测定Der P1--Mc.a-CD32缀合物的分子量

用天然PHAST凝胶4-15％梯度(Pharmacia)(分离范围：1000kD-150kD)，与天然高分子量标准蛋白质(试剂盒，Pharmacia)比较估测在Superose-12纯化组分组中的Der P1--Mc.a-CD32缀合物的分子量。检测：银染(银染试剂盒，Pharmacia)(图.11)评价：

Superose-12A组：在MW 700kD的带

Superose-12B组：在MW 460kD，330kD的带

Superose-12C组：在MW 330kD，170kD的带

最终FPLC-Mono Q纯化的Der P1--Mc.a-CD32缀合物的分子量估计为330kD(图12)。F)试验结果：a)采用aCD32 Der P1融合蛋白的T细胞克隆CFTS4：3.1的抗原-特异性刺激作用：

用标准的LST以不同浓度将以上与纯化的Der P1化学交联的aCD32(Medarex克隆IV.3)用于刺激Der P1-特异性T细胞克隆CFTS4：3.1。在第一组试验中，使用化学融合制备的A组和B组，A组含有700kD(与10个Der P1分子融合的2个aCD32分子)的单一带，B组由460kD和330kD的两个带(分别为1个aCD32与10个Der P1，和1个aCD32与5个Der P1分子)组成。

在第二组试验中，使用C组的纯化蛋白质，其由约330kD的单一带(1个aCD32分子与5个分子的Der P1融合)组成。将单核细胞和B细胞在室温下与图13a和13b所示的各种组分一起预温育1小时。作为对照刺激，在完全培养期间将100μg/ml DPT加入到T细胞加抗原呈递细胞中。B细胞能够刺激具有DPT但不具有A组，B组或C组的CFTS4：3.1，而单核细胞能够刺激具有DPT和具有A组，B组和C组的CFTS4：3.1。这证实了有关以上所称的天然IgG变应原复合物的以前的发现。此外，这也表明，对由单核细胞CD32引起的抗原刺激，交联不是必需的，因为所有组分完全等同地刺激T细胞。b)IgE合成的抑制：

在存在和不存在市售的aCD32抗体(以所示的浓度(图14)添加)下用aCD40和IL-4刺激纯化的人类扁桃体B细胞。9天后，将培养物上清液用于试验IgE和IgG1含量。所有aCD32抗体以剂量依赖性方式抑制IgE以及IgGI产生。图15显示，即使是Medarex克隆IV.3的Fab片段也能够抑制IgE合成。这说明，不由其BCD活化的B细胞经与CD32的单体相互作用阻断其抗体产生。对以抗原-特异性方式刺激的B细胞，在CD32和BCR之间的共交联是必需的。这意味着，在例如B细胞通过IgE和CD23吸收抗原(如Der F1)，接着成为刺激的Der P1-特异性Th2细胞，导致B细胞产生IgE的***反应中，在B细胞表面的与CD32的相互作用可以使得这些B细胞停止产生。事实上，即使在相关的B细胞T细胞相互作用中，aCD32抗体阻断抗体合成(图16)。

                  表    1

刺    激	％CD80	％CD40	％HLA-DR
				0天(新分离的)	1	26	99
1天IFN-γ	31	82	99
				1天IFN-γ+聚集的IgG	13	61	99
1天IFN-γ+聚集的IgG+aCD32	32	82	99

在存在或不存在5μg/ml聚集的人类IgG(涂布到各孔，在4℃下过夜)和/或10μg/ml单克隆小鼠抗-人类aCD32(Medarex IV.3)下，将经淘析来源于正常供体的单核细胞(91％CD14阳性)与100 U/ml IFN-γ温育24小时，接着染色用于指示标记的FACS分析。IFN-γ-诱导的CD80和CD40上调作用可以被强的受体与单核细胞上的聚集的人类IgG交联抑制。用aCD32的预温育被聚集的人类IgG抵消，说明1)由聚集的人类IgG引起的抑制通过CD32介导，和2)仅仅对CD32的结合不引起辅助受体的下调。

HLA-DR表达不受处理的影响。附图说明：图1：Der-P1-(3)NIP复合物对有关抗原呈递的CD23的结合：A图＝荧光；B图＝增殖。

用预形成的IC′s脉冲EBV B细胞，所述IC′s由恒定浓度的IgE(▲7.5μg/ml，●5.0μg/ml，■2，5μg/ml)和可变浓度的Der-P1-(3)NIP组成。

A图显示了预形成的IC′s与B细胞的结合。具有相同MR的IC′s用一条线连接，实际MR(0.1，0.25，0.5，1，7)以靠近线的***数字表示。在Der P1浓度约为0.2μg/ml时，IgE结合达到平台(plateau)。不存在DerP1-(3)NIP时的IgE结合用右边Y-轴上的有点方框表示。

B图显示了由用相同的IC′s脉冲的照射的EBV-B细胞的抗原呈递。这里，连接线表示用相同IgE浓度制成的复合物，以强调抗原呈递不受IC′s的MR影响(相关系数＝0.96)。单体复合物[各线的最高Der P1-(3)NIP浓度]也被有效地呈递给T细胞。在不存在IgE分子时，用任何使用的DerP1-(3)NIP浓度(黑色区域)都没有T细胞刺激。数据显示在第5天的³H-胸苷掺入(三重孔的平均值±sd)。图2：与非脉冲的B细胞的抗原呈递比较：

在整个刺激期间留在培养介质中的游离Der P1-(2)NIP诱导T细胞的剂量依赖性刺激。将自体固有的(照射的)EBV-B细胞用作抗原-呈递细胞。存在于复合物中的IgE不明显增强抗原呈递，但IgGI和IgG3两者存在于IC′s中阻止Der P1-(2)NIP的抗原呈递给T细胞(与游离的Der P1-(2)NIP比较)。结果以第5天的³H-胸苷掺入表示(三重孔的平均值±sd)。图3：IgG-Der P1-(3)NIP复合物的抗原呈递抑制作用：

在不存在IgG3时，使用IgE-Der P1-(3)NIP复合物发现良好的T细胞刺激作用。以相同(1∶1)比率的预先形成的IgG3-Der P1-(3)NIP复合物滴定导致IgE-介导的抗原呈递的剂量依赖性抑制作用。为了获得这一作用，在T细胞刺激时需要IgG3复合物存在于培养基中。由于IgG3对B细胞上的CD32的低亲和性，用IgG3复合物B细胞预培养或“脉冲”是不成功的。不存在IgE和也用IgG3-BSA-(3)NIP复合物时，观察到类似的抗原呈递抑制作用。图4：新鲜人类单核细胞的IgG3-介导的抗原呈递：

在不存在或存在非相关的聚集人类IgG时，在冰上用预先形成的IgG3-Der P1-(3)NIP复合物脉冲人类单核细胞(比率1∶1)1小时。接着洗涤脉冲的单核细胞，并与Der P1特异性HLA-DP相配的T细胞克隆混合。5天后，以³H-胸苷掺入测定增殖。由人类单核细胞呈递的IgG3复合物诱导变应原-特异性T细胞反应，其可以被聚集的IgG阻断，说明IgG3与单核细胞相互作用的特异性。数据以三重孔的平均值±sd表示。图5：DPT-特异性T细胞增殖；aCD32或聚集的人类IgG对抗原呈递的影响：

用(实心条)或不用(空心条)250μg/ml DPT脉冲人类EBV B细胞一夜。照射后，将B细胞与Der P1-特异性T细胞克隆的T细胞混合，使细胞增殖5天。在存在不同浓度的由GaM交联的aCD32抗体时，观察到剂量依赖性增殖抑制作用。当aCD32或非-特异性聚集人类IgG涂布到培养孔时观察到相同的作用。图6：来源于噬菌体展示文库的aCD32 scFv(Fab)片段之间的重组融合蛋白的例子

可以从噬菌体展示文库(例如De Kruif等，美国科学院学报，92(1995)3938-3942所描述的)获得Fab片段。然而，与人类CD32有效相互作用的任何分子(或分子的一部分)可以替代aCD32 Fab片段。变应原可以是任何引起***反应的蛋白质或蛋白质组合体。此外，变应原可以由含有T细胞表位的变应原片段替代。重组蛋白质可以由任何可用的不依赖于糖基化和其它翻译后修饰的表达***产生。这种融合蛋白质也可以用于以(过度)产生不希望的Ig分子为特征的疾病(例如类风湿性关节炎，移植物宿主排斥(graft-versus-host)病)或其中自身抗体发挥作用的任何其它疾病。在这些情况下，变应原可以由简单的非限定的接头替代，以组合两种aCD32部分。然而，当变应原由引起疾病的“自身抗原”替代时可以获得最好的结果。图7：经夹心-ELISA测定Superose-12纯化的Der P1--Mc.a-CD32缀合物组分组中的Der P1图8：经夹心-ELISA测定Superose-12纯化的Der P1--Mc.a-CD32缀合物组分组中的Mc.a-CD32图9：经夹心-ELISA测定Superose-12纯化的组分组中的Der P1--Mc.a-CD32缀合物

涂布：Mc.a-Der P1。图10：经夹心-ELISA测定Superose-12纯化的组分组中的Der P1--Mc.a-CD32缀合物

涂布：Pc.a-小鼠IgG2b。图11：A.、B和C组组分的银染：

  泳道1：350ng Der P1

  泳道2：50ng Mc.a-CD32

  泳道3：500ng 高分子量标记

  泳道4：500ng Superose-12的起始物质

  泳道5：100ng Superose-12A组

  泳道6：100ng Superose-12B组

  泳道7：200ng Superose-12C组

  泳道8：250ng 高分子量标记

高分子量标记：

  669kD：甲状腺球蛋白

  440kD：铁蛋白

  232kD：过氧化氢酶

  140kD：乳酸脱氢酶

  67kD：牛血清白蛋白图12：C组纯化的融合蛋白的银染：

  泳道1：250ng高分子量标记

  泳道2：45ng FPLC Mono-S纯化的物质。图13a和13b：Ag-特异性T细胞增殖：

    图13a：APC-Mo 250495和CFB4：2

    图13b：单体纯化的CD32/Der P1的影响

使用标准的LST[Van Reijsen，F.C.等，(1992)***反应临床免疫学杂志，90 184]，以不同的浓度将与纯化的Der P1化学交联的aCD32(Medarex克隆IV.3)用于刺激Der P1-特异性T细胞克隆CFTS4：3.1。在第一组实验(图13a)中，使用化学融合制备的A组和B组：A组含有700kD的单一带(为2个aCD32分子与10个Der P1分子融合)，B组由在460kD和330kD(分别为1个aCD32与10个Der P1，和1个aCD32与5个Der P1分子融合)的两个带组成。

在第二组实验(图13b)中，使用C组纯化蛋白质(CP230595)，由约330kD(1个aCD32分子与5个分子的Der P1融合)的单一带组成。

将单核细胞和B细胞在室温下与图中所示各种组分一起预温育1小时。作为对照刺激，在完整的培养期间将100μg/ml DPT加入到T细胞加抗原-呈递细胞中。按照描述(Van Reijsen等，同上)，在5天后以³H-胸苷掺入测定T细胞刺激(4孔平均值±sd)。B细胞能够刺激CFTS4：3.1(有DPT但没有A组，B组，或C组)，而单核细胞能够刺激CFTS4：3.1(有DPT和有A组，B组，和C组)。这相应于用天然IgG变应原复合物的以前的发现[Bheekha Escura，R.等，免疫学(1995)86 343]。此外，这说明，对单核细胞的抗原刺激，多于两个CD32分子的交联不是必需的，因为所有组分在刺激T细胞上是等效的。图14：IgE和IgG1各自的合成抑制作用：

在存在和不存在市售的aCD32抗体(以所示的浓度添加)下，如Armerding，D.等，免疫生物学，188(1993)259-273所述，用aCD40和IL-4刺激纯化的人类扁桃体B细胞。9天后，按照描述(Armerding，D.等，同上)将培养物上清液用于试验IgE和IgG1含量。结果以9次重复的3组组分的抗体产生表示(平均值±sd)。所有aCD32抗体以剂量依赖性方式抑制IgE以及IgG1产生。IgM和IgA的抑制作用是相似的。图15：IgE合成的抑制：

在存在和不存在市售的aCD32抗体(Medarex IV.3)或其Fab片段(以所示的浓度添加)下，如Armerding，D.等，同上所述，用aCD40和IL-4刺激纯化的人类扁桃体B细胞。9天后，按照描述(Armerding，D.等，同上)将培养物上清液用于试验IgE和IgG1含量。结果以9次重复的3组组分的抗体产生表示(平均值±sd)。完整的Medarex克隆IV.3或其Fab片段两者都能够抑制IgE合成(IgG1，IgM和IgA)。图16：DPT特异性IgE诱导；aCD32的影响：

用(实心条)或不用(空心条)250μg/ml DPT脉冲人类扁桃体B细胞一夜。在照射后，将B细胞与Der P1-特异性T细胞克隆(CFTS4：3.1)的T细胞混合，使细胞增殖和产生抗体9天。9天后，按照Armerding，D.等，同上的描述将培养物上清液用于试验IgE和IgG1含量。结果以9次重复的3组组分的抗体产生表示(平均值±sd)。在存在不同浓度的aCD32抗体时，观察到剂量依赖性IgE产生抑制作用。这说明即使是相关的B细胞T细胞相互作用，aCD32抗体也阻断抗体合成。

                       序    列    表(1)一般信息：

(i)申请人：

      (A)名称：Sandoz有限公司。

      (B)街道：Lichtstrasse 35

      (C)城市：Basle

      (E)国家：瑞士

      (F)邮区代码(ZIP)：CH-4002

      (G)电话：61-324 5269

      (H)传真：61-322 7532

      (A)姓名：Mudde，Geert C.

      (B)街道：Ruzickagasse 88-104/Haus 39

      (C)城市：维也纳

      (E)国家：奥地利

      (F)邮区代码(ZIP)：A-1230

(ii)发明名称：融合蛋白

(iii)序列数：2

(iv)计算机可读形式：

      (A)介质类型：软盘

      (B)计算机：IBM PC兼容机

      (C)操作***：PC-DOS/MS-DOS

      (D)软件：PatentIn Release#1.0

            版本#1.25(EPO)

(v)当前申请的数据：

            申请号：WO PCT/EP96/......

(vi)在先申请的数据：

      (A)申请号：GB 9516760.7

      (B)申请日：16-8-1995(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

      (A)长度：43个氨基酸

      (B)类型：氨基酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：未知

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：否

(iii)反义：否

(v)片段类型：内部

(vi)原始来源：

      (A)有机体：Dermatophagoides pteronyssinus

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn Tyr1               5                   10                  15Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Ala Asn Lys Ile Arg Glu Ala Leu Ala

        20                  25                  30Gln Pro Gln Arg Tyr Cys Arg His Tyr Trp Thr

    35                  40(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

      (A)长度：31个氨基酸

      (B)类型：氨基酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：未知

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：否

(iii)反义：否

(v)片段类型：内部

(vi)原始来源：

      (A)有机体：Dermatophagoides pteronyssinus

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn Tyr1               5                   10                  15Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Ala Asn Lys Ile Arg Glu Ala Leu

        20                  25                  30

Claims (13)

1.融合蛋白，其包含

a)一种或多种抗原和

b)一种或多种与人类Fcγ受体II(FcγRII)(CD32)相互作用的部分。

2.按照权利要求1的融合蛋白，其中所说的抗原是在特应性皮炎、变应性哮喘、变应性鼻炎或变应性结膜炎中的变应原。

3.按照权利要求1的融合蛋白，其是从一种或多种包含T细胞表位的DNA骨架产生的，而不是从完全抗原的基因产生的。

4.按照权利要求1至3之任一所要求的融合蛋白，其中所说的与FcγRII相互作用的部分是人类或人源化aCD32抗体，或仍然特异性地识别并结合到FcγRII(CD32)抗原上的这些抗体的部分。

5.按照权利要求1至3之任一所要求的融合蛋白，其中所说的与FcγRII相互作用的部分是人类或人源化IgG抗体，或仍然特异性地识别并结合到FcγRII(CD32)抗原上的这些抗体的部分。

6.按照权利要求1至3之任一所要求的融合蛋白，其中所说的与FcγRII相互作用的部分是操作过的人类或人源化aCD32或IgG抗体或其部分，其以比天然aCD32或IgG抗体更高的亲和性识别FcγRII(CD32)。

7.药物组合物，其包含按照权利要求1的融合蛋白以及至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。

8.生产按照权利要求1的融合蛋白的方法，该方法包括使用重组基因技术或化学交联。

9.按照权利要求1的融合蛋白在预防和/或治疗***反应(包括食物***反应)上的用途。

10.按照权利要求1的融合蛋白在制造预防和/或治疗***反应(包括食物***反应)的药物上的用途。

11.用作药物的按照权利要求1的融合蛋白。

12.治疗***反应的方法，该方法包括对需要这种治疗的受治疗者施用预防或治疗上有效量的按照权利要求1的融合蛋白以及至少一种常规的药学上可接受的载体或稀释剂。

13.制备针对***反应的药物的方法，该方法包括将按照权利要求1的融合蛋白与药学上可接受的载体或稀释剂混合。

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