CN1506094A - 一种治疗腹泻的香薷提取物颗粒制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种香薷挥发油的颗粒制剂及其质量控制方法，本发明香薷挥发油颗粒制剂有抗病毒、抗细菌、抗炎、止泻、止痛、退热的作用，并能抑制胃肠功能亢进。

Description

一种治疗腹泻的香薷提取物颗粒制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种中药提取物制剂及其制备方法，特别是涉及一种治疗腹泻的香薷提取物颗粒制剂及其制备方法。
背景技术
腹泻(感染性、非感染性)发病率高，在某些地区病死率亦较高，是遍及全球的严重问题。中医对腹泻的治疗则多进行辨证论治，寒湿证者藿香正气散主之，湿热证者葛根芩连汤主之，食滞证者保和丸主之，肝郁乘脾者痛泻要方主之，脾胃虚弱证者参苓白术散主之，肾阳虚衰证者四神丸主之。然亦有采用土单验方对肠胃炎进行辨病治疗者。近些年来，中医治疗病毒性腹泻的报导不少，但形成新药者较少。中医药的特点是擅长调理胃肠道功能，副作用少，但对病原体的作用强度略逊于西药。现代医学对感染性腹泻多用抗菌药配合液体疗进行治疗，明显提高了疗效。近十多年来微生态制剂的研究与应用引起了学者的重视，同时开展了疫苗研究，但是由于引起腹泻的病原体很多，彼此之间缺乏交叉免疫，故对疫苗的研制一直进展缓慢。随着研究的深入，对抗菌药的毒副作用也越来越清楚，如对肾、肝、神经精神、血液的毒性及胃肠道反应、过敏反应和二重感染等。目前对病毒性腹泻尚缺乏特效的药物，国外有用乳酸杆菌、干扰素、病毒唑等进行治疗的报导，国内有用病毒感染鸡，然后从鸡卵中制备抗体制剂进行治疗者，但仍在研发之中。近年研制了轮状病毒活疫苗，正在推广应用之中。据WHO的资料，全世界每年腹泻病例可达30-50亿例次，约有500-1000万病例因严重腹泻而死亡。亚、非、拉地区5岁以下儿童中，每年发生腹泻者在10亿人次以上，死者约500万。据报导，中国每年约8.36亿人次发生腹泻，其中5岁以下儿童约占2.09亿人次，约占1/4。据1993年***报告，我国急性胃肠炎两周患病率为11.74％，两周急病按病种构成约占8.36％，排在急性鼻咽炎和流行性感冒之后，居全国城乡居民两周患病的第三位。轮状病毒是1973年由Bishop等发现的。全世界5岁以下儿童每年可发生1.4亿人次轮状病毒腹泻，死亡可达100万人。轮状病毒是婴幼儿腹泻的重要病原，后来又发现了引起成人腹泻的成人轮状病毒。
发明内容
本发明目的在于提供一种治疗腹泻的香薷提取物制剂。
本发明目的还在于提供香薷及其提取物的质量控制方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
香薷挥发油的制备：香薷全草，切段，加6-10倍量水，水蒸气蒸馏提取4-8小时，分离出挥发油层，即得。
本发明挥发油(莫拉油)为微黄色的澄清液体，相对密度(20)为0.9572g/ml，折光率1.51。经气质联用色谱分析主要成分百里香酚及香芹酚含量不得低于55％，符合二类新药的要求。原料药挥发油组分的定性和相对定量研究，已知组分为百里香酚(Thymol)58.131％，香芹酚(Cavacrol)11.946％，对-聚伞花素(P-Cymene)10.274％，γ-松油烯(γ-Terpinene)5.733％，乙酰百里香酚(Thymol Acetate)2.626％，β-香叶烯(β-Myrcene)1.832％，a-律草烯(a-Humulene)1.638％，柠檬烯(Limonene)1.564％，反式-石竹烯(trans-Caryophyllene)0.970％，a-松油醇(a-Terpinene)0.718％，龙脑(Borneol)0.514％，乙酰香芹酚(CavacrolAcetate)0.384％，β-蒎烯(β-Pinene)0.317％，a-蒎烯(a-Pinene)0.256％，已知组分总计为96.5％，挥发油成分稳定，放置一年时间，各主要成分及其相对比例无明显变化。
本发明颗粒制剂(莫拉颗粒〕的制备方法：取香薷挥发油20-40重量份，加等量85-95％乙醇稀释；β-环糊精13-15倍量，加1500ml热水混溶，30-45℃保温混合搅拌3-8min，通过胶体磨包合2-4次，冰箱放置8-14小时以上，抽滤，包合物30-45℃鼓风干燥4-8小时，过筛，加入糊精至800-1000重量份，加硬脂酸镁1-3重量份，阿斯巴甜1-3重量份，混匀，干压制粒，整粒，制成颗粒，包装即得。
本发明颗粒制剂的质量控制方法包括如下鉴别和/或含量测定：
含量测定：对照品溶液的制备，精密称取百里香酚对照品8mg和百里香酚对照品4mg，置100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取上述溶液2.5ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得，每ml中含百里香酚20μg，含香芹酚10μg。供试品溶液的制备，取装量差异项下的内容物，研细，取0.12g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。测定方法照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VI D)测定。色谱条件与***适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；50-70∶50-30∶1-3甲醇-水-冰醋酸为流动相；检测波长为276nm。理论板数按百里香酚峰计算应不低于10000，按香芹酚峰计算应不低于15000。测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。每g颗粒含百里香酚(C10H14O)和香芹酚(C10H14O)的总量不得少于15mg。
鉴别：按莫拉颗粒含量测定方法，高效液相色谱图在与百里香酚和香芹酚对照品相同的保留时间，有相应的吸收峰。
本发明药物制剂和中化湿、解表退热。主治腹泻、腹痛、恶寒发热、头身疼痛、以及轮状病毒或某些细菌感染引起的腹泻。
本发明所述莫拉颗粒的药效学研究结果显示，莫拉颗粒具有如下功能：
1.莫拉颗粒的抗病毒作用：12.5～25nl/ml莫拉颗粒能抑制小儿轮状病毒RDTA-I型(Wa株)在非洲绿猴肾细胞上生长繁殖。
2.莫拉颗粒的抗细菌作用：莫拉颗粒能降低肠炎沙门氏菌腹腔感染小鼠的死亡率(P＜0.05)；能降低肠炎沙门氏菌经口感染的小鼠大便中致病菌的含量(P＜0.05～0.01)；在体外，对致病性大肠杆菌、志贺氏杆菌、普通变形杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等常见致病菌，有较强的抑制生长作用，试验用44株菌株中，最低抑菌浓度≤1ul油/ml的占79.5％。
3.莫拉颗粒的止泻作用：显著地降低100％番泻叶煎剂所致的腹泻模型小鼠的稀便率、腹泻率、腹泻指数及腹泻程度(P＜0.05～0.001)。
4.莫拉颗粒对胃肠功能的影响：该药能降低正常的和新斯的明所致亢进的小鼠小肠推进功能(P＜0.05～0.001)，延长排便时间、降低排便数量(P＜0.05～0.001)，减缓胃排空运动(P＜0.01～0.001)，降低胃分泌功能(P＜0.001)，抑制正常豚鼠离体肠平滑肌自律运动和乙酰胆碱所致肠平滑肌兴奋。
5.莫拉颗粒的止痛作用：莫拉颗粒非常显著地减少由0.7％醋酸所致的小鼠扭体数(均P＜0.001)，抑制率达51.3～55.7％。
6.莫拉颗粒的抗炎作用：莫拉颗粒显著地抑制由二甲苯所致小鼠耳肿胀(P＜0.01～0.001)，显著地抑制组织胺引起的血管通透性(P＜0.05～0.001)，抑制羧甲基纤维素钠所致腹腔白细胞游走(P＜0.05～0.001)。
7.莫拉颗粒的退热作用：莫拉颗粒对酵母菌所致的大鼠体温升高和内毒素所致家兔体温升高均有显著地抑制作用(P＜0.05～0.001)。
下列实验例用于进一步说明本发明。
实验例：莫拉颗粒抑制小儿轮状病毒ROTA-I型(Wa株)的作用
材料与方法：
1.药物：受试药莫拉颗粒，试验直接用莫拉油，淡黄色，比重0.95726g/ml，16mg油/g生药，批号：20000601，北京巨杉医药研究所提供。取0.5ml莫拉油加0.5ml吐温-80(上海第十八制药厂生产，批号：960520)混均后加4ml生长液稀释。放4℃冰箱备用。
对照药葛根芩连微丸，广西柳州市中药厂生产，桂卫准字(1991)第017004号，批号：990721。取1g药加蒸馏水10毫升溶解，2000转/分，离心10分钟，取上清液水浴煮沸10分钟灭菌，放4℃冰箱保存。
上述药用前调pH＝7.2
2.细胞：非洲绿猴肾(Vero)传代细胞，长成单层的细胞经胰酶消化液消化为单个细胞，用生长液配成6万个细胞/ml，接入细胞管，1ml/管。
3.病毒：小儿轮状病毒ROTA-1型(Wa株)，TCID50为10-7，由中国预防医学科学院病毒所提供，试验时用100个TCID50 0.1ml。Wa株用前，用1ml病毒液加0.05ml胰酶(200ug/ml)37℃水浴30分钟。
4.试剂：Eagles MEM干粉，美国GIBCO产品。胎牛血清，天津血液研究所生产；批号：9925。L-谷氨酰胺，Sigma进口分装，批号：911015。青霉素、链霉素。
试剂配制：
生长液：Eagles加1％青链霉素、1％谷氨酰胺、10％小牛血清，用前调PH＝7.4。
维持液：Eagles加1％青链霉素、1％谷氨酰胺，200ug/ml胰酶(终浓度为2ug/ml)，用前调PH＝7.4。
细胞消化液：0.25％胰酶，用无钙镁磷酸盐缓冲液配制。
5.试验用品及仪器：
培养瓶、试管、刻度吸管、温箱、冰箱、烤箱、水浴箱、低温冰柜、液氮罐等，均为国产。
6.试验方法：
(1)莫拉油、葛根芩连微丸和吐温-80对Vero细胞的毒性作用：将稀释好的药物、吐温-80接入长成单层细胞的试管中，放37℃温箱培养，每日观察细胞变化。
(2)药物对病毒的直接杀伤作用：将稀释好的药物与病毒等量混合后放37℃温箱1小时。然后接入长成单层细胞的试管中，每管0.2ml，放37℃吸附1小时。用维持液洗两次后加入维持液1ml。放37℃温箱培养，每日观察细胞病变(CPE)，当病毒对照出现++++时，终止试验。
(3)药物对病毒在细胞内繁殖的抑制作用：将已处理的病毒接入细胞管中，每管0.1ml放37℃吸附1小时，用维持液洗两次后分别加入含不同药物浓度的维持液1ml，放37℃培养，每日观察细胞病变，当病毒对照管出现++++时，终止试验。
注：细胞病变：+25％、++50％、+++75％、++++100％。
以上试验同时设药物对照、病毒对照、细胞对照，每试验组4管细胞，重复做试验2次。
结果：
1.莫拉油对Vero细胞的毒性试验结果见表1。
             表1莫拉油对Vero细胞的毒性试验结果
组别         药物浓度/ml       细胞管数       细胞毒性管数
               100nl              4                4
               50nl               4                0
莫拉油
               25nl               4                0
               12.5nl             4                0
               5mg                4                4
葛根芩连微丸   2.5mg              4                0
               1.25mg             4                0
               200nl              4                2
吐温-80
               100nl              4                0
Vero对照                          4                0
将4个浓度莫拉油分别接入细胞管，终浓度为100、50、25、12.5nl/ml。每个浓度4管，观察7天。结果莫拉油浓度为100nl/ml时对细胞有毒性，浓度为50，25，12.5nl/ml时对细胞没有毒性；葛根芩连微丸5mg/ml时对细胞有毒性，2.5mg/ml和1.25mg/ml时对细胞没有毒性；吐温-80 100nl/ml时对细胞没有毒性。
2.莫拉油对病毒的直接杀伤作用试验结果：结果见表2。
               表2莫拉油对病毒的直接杀伤作用试验结果
组别            药物浓度/ml      接种管数      阳性管数    阴性管数
                   50nl             8             8           0
莫拉油组
                   25nl             8             8           0
                   10mg             8             8           0
葛根芩连微丸组
                   5mg              8             8           0
                   100nl            8             8           0
吐温-80组
                   50nl             8             8           0
Wa株对照组                          8             8           0
细胞对照组                          8             0           8
如表所示：莫拉油各给药组对小儿轮状病毒ROTA-1型，没有直接灭活作用。
3.莫拉油对病毒在细胞内的繁殖抑制作用试验结果：结果见表3。
       表3：莫拉油对病毒在细胞内的繁殖抑制作用试验结果：
组别           药物浓度/ml       管数       阳性管      阴性管
                  25nl             8          0           8
                  12.5nl           8          0           8
莫拉油组
                  6.25nl           8          2           6
                  3.12nl           8          8           0
                  2.5mg            8          8           0
葛根芩连微丸组
                  1.25mg           8          8           0
                  100nl            8          8           0
吐温-80组
                  50nl             8          8           0
Wa株对照                           8          8           0
细胞对照                           8          0           8
如表所示，莫拉油浓度为25nl/ml、12.5nl/ml时，可以完全抑制病毒在细胞内的繁殖，浓度为6.25nl/ml时，对病毒在细胞内繁殖有一定的抑制作用，浓度为3.1nl/ml时对病毒在细胞内繁殖没有抑制作用。葛根芩连微丸、吐温-80各浓度组对病毒在细胞内繁殖没有抑制作用。
实施例1：取香薷挥发油33.3g，加等量95％乙醇稀释；β-环糊精500g，加1500ml热水混溶，40℃保温混合搅拌5min，通过胶体磨包合3次，冰箱放置12小时以上，抽滤，包合物40℃鼓风干燥6小时，过80目筛，加入糊精至996g，加硬脂酸镁2g，阿斯巴甜2g，混匀，干压制粒，20-80目整粒，制成1000g颗粒，包装即得。每包装1g。一日3次，一次1包。
实施例2：本发明颗粒制剂的质量控制方法
含量测定：对照品溶液的制备，精密称取百里香酚对照品8mg和百里香酚对照品4mg，置100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取上述溶液2.5ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得，每ml中含百里香酚20μg，含香芹酚10μg。供试品溶液的制备，取装量差异项下的内容物，研细，取0.12g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。测定方法照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VI D)测定。色谱条件与***适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；60∶40∶2甲醇-水-冰醋酸为流动相；检测波长为276nm。理论板数按百里香酚峰计算应不低于10000，按香芹酚峰计算应不低于15000。测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。每g颗粒含百里香酚(C10H14O)和香芹酚(C10H14O)的总量不得少于15mg。
鉴别：按莫拉颗粒含量测定方法，高效液相色谱图在与百里香酚和香芹酚对照品相同的保留时间，有相应的吸收峰。

Claims (4)

1、一种香薷挥发油颗粒制剂，其特征在于该制剂是由如下方法制成的：
取香薷挥发油20-40重量份，加等量85-95％乙醇稀释；β-环糊精13-15倍量，加1500ml热水混溶，30-45℃保温混合搅拌3-8min，通过胶体磨包合2-4次，冰箱放置8-14小时以上，抽滤，包合物30-45℃鼓风干燥4-8小时，过筛，加入糊精至800-1000重量份，加硬脂酸镁1-3重量份，阿斯巴甜1-3重量份，混匀，干压制粒，整粒，制成颗粒，包装即得。
2、如权利要求1所述的一种香薷挥发油颗粒制剂，其特征在于该制剂是由如下方法制成的：
取香薷挥发油33.3g，加等量95％乙醇稀释；β-环糊精500g，加1500ml热水混溶，40℃保温混合搅拌5min，通过胶体磨包合3次，冰箱放置12小时以上，抽滤，包合物40℃鼓风干燥6小时，过80目筛，加入糊精至996g，加硬脂酸镁2g，阿斯巴甜2g，混匀，干压制粒，20-80目整粒，制成1000g颗粒，包装即得。
3、如权利要求1或2所述制剂的质量控制方法，其特征在于该质量控制方法含有下述鉴别和/或含量测定：
含量测定：对照品溶液的制备，精密称取百里香酚对照品8mg和百里香酚对照品4mg，置100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取上述溶液2.5ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得，每ml中含百里香酚20μg，含香芹酚10μg；供试品溶液的制备，取装量差异项下的内容物，研细，取0.12g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；测定方法照高效液相色谱法测定；色谱条件与***适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；50-70∶50-30∶1-3甲醇-水-冰醋酸为流动相；检测波长为276nm；理论板数按百里香酚峰计算应不低于10000，按香芹酚峰计算应不低于15000；测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；每g颗粒含百里香酚和香芹酚的总量不得少于15mg；
鉴别：按莫拉颗粒含量测定方法，高效液相色谱图在与百里香酚和香芹酚对照品相同的保留时间，有相应的吸收峰。
4、如权利要求3所述的质量控制方法，其特征在于该方法中以60∶40∶2甲醇-水-冰醋酸为流动相。
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