CN1495252A - 一种外切菊粉酶的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用本发明人采用基因重组方法，获得一株高效表达外切菊粉酶的巴斯德毕赤酵母重组Pichia pastoris EXI 2086菌株(CGMCC No.0763)作为生产菌株，采用高密度发酵生产方法生产外切菊粉酶(发酵液中最高外切菊粉酶活性达到577.14U/ml)。利用本发明可提高菊粉酶的产量并缩短产酶发酵高峰期，克服生产实践菊粉酶产量低、成本高的问题，适合工业化生产。

Description

一种外切菊粉酶的生产方法

本发明涉及一种外切菊粉酶的生产方法，属于制糖工业领域。

蔗糖作为甜味剂的统治地位，因其营养弊端正受到其它更优越产品的挑战。长期大量食用蔗糖引起了一系列营养与健康问题——肥胖症、糖尿病、龋齿、高血压和心血管疾病等，随着经济发展这一问题越发突出。因此：蔗糖替代品研发工作倍受重视。

目前国际上，在众多的蔗糖替代品或者甜味剂品种中果糖产量一直上升紧追蔗糖，位居第二。这是因为果糖独具优势。其低热值性成为甜味剂和低热值食品原料新宠。目前国内外果糖生产途径之一是：以淀粉为原料经过三种酶催化的多步化学反应生产果糖即多步法途径。以菊粉为原料依靠菊粉酶一步催化反应生产高纯度果糖即一步酶法生产途径的产业化，处于起步阶段。

多采用多步法工艺生产高果糖浆(HFS)，即以玉米或水稻淀粉为原料，经过3种酶(淀粉酶，糖化酶和葡萄糖异构酶)催化反应和4～5个反应步骤，反应初产物为含果糖42％的果葡糖浆(第1代产品，F-42)，原料利用率和产物得率均很低。通过膜分离和循环反应可以制备含果糖55％(第2代产品，F-55)和90％(第3代产品，F-90)的高果葡糖浆，但成本增加高。一步法工艺具有与多步法工艺不同的特点或者优势：一步法工艺只有一步菊粉酶催化反应，生产工序大为简化，生产成本降低，糖化初产物为高纯度(＞90％)果糖HFS，产物得率＞100％；多步法工艺需要3种不同酶催化反应和多步产物分离反应，初产物果糖得率＜50％。显然，菊粉酶是一步酶法生产菊粉高果糖浆的唯一重要酶种。

一般采用液态发酵生产菊粉酶。据报道一种产菊粉酶的黑曲霉在摇床水平下，在30℃140r/min，至120h酶活达到27U/ml，168h酶活达到高峰为48.4U/ml，生物量达到28.8g/L(OhtaK.，Akimoto H.，Matsuda.，et al.，Molecular cloning and sequence analysis of two endo-inulinasegenes from Aspergillus niger.Biosci.Biotechnol.Biochem.，1998，62：1731-1738.)。最近报道(Ongen-Baysal G.and Sukan S.S.Production of inulinase mixed culture of Aspergillius nigerand Kluyveromyces marxianus.Biotechnol.Lett.1996，18：1431-1434.)一种产菊粉酶的黑曲霉在摇瓶水平下，28℃ 200r/min，菊粉酶至168h达到50U/ml的高峰值。一株K.marxianus最适生长与产酶温度为40～45℃，在1L发酵罐中采用无机培养基进行连续培养，培养基碳源限制为0.25％蔗糖，发酵参数为pO₂控制在50％～70％，由1M KOH和0.5M H₂SO₄控制pH4.5，在0.1/h稀释速率下，最高胞外酶活32U/ml，I/S＝1/15，胞外酶与胞内酶比例依培养时间大致为：50％～65％/50％～35％，培养基中残余蔗糖浓度与酶产量呈负相关(Rouwenhorst R.J.，Hensing M.，Verbakel J.，et al.Structure and properties of the extracellular inulinase of Kluyveromycesmarxianus CBS6556，Appl.Environ.Microbiol.，1988，54：1311-1137；1990，56：3337-3345.)。另一株K.marxianus NCYC 587在28℃ 200r/min，120h菊粉酶活性达34.5U/ml(Ongen-BaysalG.and Sukan S.S.Production of inulinase mixed culture of Aspergillius niger andKluyveromyces marxianus.Biotechnology Lett.1996，18：1431-1434.)。又一株Kluyveromyces菌株在由牛肉膏、玉米浆、尿素和菊芋汁组成的有机培养基上经摇瓶产酶正交试验结果：最高菊粉酶胞外酶活性为15U/ml，在15L和1000L发酵罐上试验所得最高胞外酶产量分别为17.63和18.7U/ml(魏文铃等，克鲁维酵母Y-85合成菊粉酶最适条件的研究.微生物学报，1998，38：208-212)。最新报道Bacillus sphaericus产菊粉酶的最佳碳源为0.75％菊粉，产菊粉酶178.4U/ml；最佳氮源为牛肉膏，产菊粉酶196.1U/ml(Kwon S.J，Yoo，J.Y.，Lee J.S.Isolation ofintracellular inulinase-producing bacterirum and culture condition for inulinase production.FoodSci.Biotechnol.，1999，8：24-29)。王建华等采用酵母高密度细胞发酵方法，当选天然菌株Kluyveromyces(CGMCC 0360)在120h(35～40℃，500～800r/min)最高菊粉酶产量达289U/ml，为20世纪90年代国际最高产量酶水平(王建华等。一种产生菊粉酶的酵母菌株及其在高果糖浆中的应用，1998，中国专利，专利申请号No.98120697.2；王建华等。菊粉酶高产酵母高密度培养及酶学性质研究。生物工程学报，2000；16(1)：60-64)。

菊粉酶(Inulinase)是能够水解β-2，1-D-果聚糖果糖苷键的一类水解酶，学名β-2，1-D-果聚糖酶，又叫β-果糖苷酶，或β-果聚糖水解酶，或2，1-D-果聚糖果聚糖水解酶，酶学编号为EC 3.2.1。根据菊粉酶酶切果聚糖链的方式分为内切酶(EC 3.2.1.7)和外切酶(EC3.2.1.80)；20世纪30年代初从微生物细胞中提取出菊粉酶，深入研究菊粉酶始于20世纪80年代中期，这是因为外切菊粉酶水解菊粉可得高纯度果糖，内切菊粉酶水解菊粉可得高纯度低聚果糖。果糖和低聚果糖是比蔗糖更为优秀的甜味剂、功能性食品原料和添加剂。

本发明的目的是为选择一株菊粉酶的高产菌株并将该菌株用于菊粉酶的工业化生产的方法，以提高菊粉酶产量和缩短产酶发酵高峰期，解决生产实践中菊粉酶产量低、成本高的问题。

本发明人采用基因重组方法，获得一株高效表达外切菊粉酶的重组酵母菌株，命名为：巴斯德毕赤酵母重组Pichia pastoris EXI2086菌株，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国北京中关村北一条13号，100080)进行保藏，保藏号为：CGMCCNo.0763，保藏日期为2002年7月10日。

本发明的另一个目的是提供一种由本发明所获得的重组酵母菌株高密度发酵生产外切菊粉酶的方法。将以上方法生产出的发酵产物利用本发明人1999年1月29日提交的98120697.2专利申请的方法生产的菊粉酶降解菊粉生产高果糖浆的方法。

本发明的技术路线见附图1。

本发明的具体描述如下：

首先筛选出一株外切菊粉酶产生菌株，即外切菊粉酶基因供体菌株为克鲁维酵母菌Kluyveromyces IW9801菌株(CGMCC0360)；并对起所产菊粉酶的性质进行研究(见本发明人1999年1月29日提交的98120697.2专利申请)，扩增和保存质粒用大肠杆菌为E.coliTOP10F’；设计相应的引物并对外切菊粉酶基因进行克隆，再经重组载体构建、受体酵母转化(受体菌株：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris GS115(His^-Mut^-))及重组子筛选和重组子功能性测定等一整套基因重组和表达优化操作获得高效表达外切菊粉酶的工程酵母菌Pichia pastoris EXI2086株。

本发明以上的工作获得：

1.克隆的外切菊粉酶基因全长1599bp(不含信号肽)，编码533氨基酸，同源性比较分析发现：与国外最早报道的克鲁维外切菊粉酶基因序列同源性＞99％，认定为同一起源基因。从氨基酸推断理论分子量为59.2KD。在编码的氨基酸序列上发现了10个潜在N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr，X为任意氨基酸)。外切菊粉酶基因中G+C含量达到47.3％。

2.成功构建外切菊粉酶重组酵母Pichia pastoris EXI2086，在96h达最高产酶水平577U/ml；产酶水平显著高于我们已知的国内外文献报道的各菌株最高产酶水平。

由本发明所获得的重组酵母菌株高密度发酵生产菊粉酶的方法描述如下(除非特别说明，本发明所用的百分比均为重量百分比)：

在pH、溶解氧(DO)、温度自动控制的6.6L发酵罐中培养本发明研制的工程菌株Pichiapastoris EXI2086生产菊粉酶。在发酵罐的起始培养基装料容积是罐容量的30％：基础培养基：2.67％磷酸，0.093％硫酸钙，1.82％硫酸钾，1.49％硫酸镁，0.413％氢氧化钾，4.0％葡萄糖，0.437％PTM1，补水至1L。其中PTM1成分和配制浓度为：0.6％硫酸铜，0.008％碘化钠，0.3％硫酸锰，0.002％钼酸钠，0.02％硼酸，0.05％氯化钴，2.0％氯化锌，6.5％硫酸亚铁，0.025％生物素，0.5％硫酸，补水至1L。工程菌株接种量5％～7.5％(工程菌株摇瓶种子培养基：1.0％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，加水至1L)，发酵温度控制在28～32℃，搅拌速度为800～1,200r/min，pO₂均控制在30％以上，入口气流速度大于9L/min，发酵液的pH用2Mol/l氨水始终控制在pH5.6水平上(所补加氨水同时在培养基中起氮源作用)；产菊粉酶工程菌株具有不同的调控方式，主要由两部分组成(1)通过基础培养基和生长阶段补料液(生长阶段补料液：25％葡萄糖，1.2％PTM1，补水至1L。当培养基中残糖低于0.5％或生物量低于200g/L时进行补料)提供足够营养物质以加速酵母细胞繁殖获得最大生物量200g/L以上；(2)采用混合诱导培养基(混合诱导培养基(补料液)：25％葡萄糖，10％甲醇，1.2％PTM1，补水至1L)进行补料，其目的是在进一步提高生物量的同时，使酵母菌适应甲醇碳源，并由此进入诱导外源蛋白质表达的起始阶段；(3)其后采用纯粹诱导培养基(纯粹诱导培养基(补料液)：纯甲醇，1.2％PTM1，补水至1L)进行补料，在此其间，只有补加流量的变化，其他条件不变；补料流量变化的依据是：保持DO值在一个合适的水平上，如果太低(＜30％)，说明生长快、氧消耗多，表明培养基中营养不足，此时需要提高补料流量；如果太高(＞40％)，说明生长慢、氧消耗少，表明培养基中营养充足，此时需要减低补料流量。诱导表达的条件与优化原则与Jayne Stratton et al.方法(High Cell-DensityFermentaion.In：David RH.，James MC.ed.Methods in Molecular Biology-ProtocolsPichia，1998，vol.103 Humana Press Inc.，New York：107-120)基本一致，只是将培养基中使用的碳源甘油改由葡萄糖代替，这样既降低产酶发酵成本又不影响营养生长和外源蛋白质表达效果。总培养时间达90～144h时可以获得最大量的菊粉酶总产量和最好的产酶经济效益。

本发明利用以上获得的培养液，经菌体与酶液分离后，将菊粉酶液与含糖8～17％的菊粉溶液按照1∶8～17的体积比混合，在45～55℃下酶解糖化30～40小时，得到高果糖浆。生产菌株的构建包括以下以下实验：

实验一

外切菊粉酶基因的克隆  外切菊粉酶基因供体菌株为Kluyveromyces IW9801(CGMCC0360)

(1)供体菌株基因组DNA提取(采用中性裂解法)收集菌体，用蒸馏水洗涤一次；菌体悬浮于0.2ml破壁体系中(1.0M山梨醇，0.1M醋酸钠pH7.0，60mM EDTA，1％Zymolyase5000达终浓度1mg/ml，1％巯基乙醇)于37℃下处理30min加入如下物质：0.5％SDS，100mM Tris-HClpH7.0，50mM EDTA pH8.5，混匀，放于-70℃冰箱中，再加入0.2ml 5M醋酸钾，置0℃，45min，再于4℃离心10,000r/min，10min，留上清分成两份。用等体积Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，15,000r/min，离心5min，收集上清，再用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，加入2倍体积预冷无水乙醇，于室温下静止30min。4℃，10,000r/min，离心20min，弃上清液留沉淀。用1ml预冷70％乙醇连续洗两次，4℃10,000r/min，离心20min，留沉淀。沉淀即DNA，溶于50μlTE于-20℃下保存备用。

(2)外切菊粉酶基因扩增引物设计与合成  按照已经报道的克鲁维酵母菊粉酶全基因序列为依据，在exoinu基因的5’端有一个编码23个氨基酸的信号肽编码序列，通过PCR的方法，以信号肽编码序列之后的碱基序列(长35个的碱基)和基因3’端序列(长29个的碱基)为引物，以分段或者一次性钓取目的基因为目的，设计特异性引物若干对，并且交由上海Genecore Inc合成，能够一次性成功钓取全目的基因的一对引物：

P1：5’CAAAGCTTGATTGCGGCCGATGGATGGTGACAGCA 3’

P2：5’CAGAATTCTCAATTTCACCAATAACGTTG 3’

(3)PCR扩增目的基因  设置PCR反应参数为：94℃变性5min，后在反应体系中加入Taq酶，6000r/min，离心20秒，然后进行循环30--35次，每次循环94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环结束后72℃保温10min。PCR产物进行低熔点琼脂糖电泳。

目标基因克隆和核苷酸结构分析

扩增产物低熔点琼脂糖电泳。判断扩增片段大小1.6kb左右，试剂盒回收纯化PCR产物，送上海Genecore生物技术公司进行测序克隆得到的目标基因，经测定得到该基因核苷酸序列，结果如下：

5’GATGGTGACA GCAAGGCCAT CACTAACACC ACTTTTAGTT TGAACAGACC TTCTGTGCAT     60

   TTCACTCCAT CCCATGGTTG GATGAACGAT CCAAATGGTT TGTGGTACGA TGCCAAGGAA    120

   GAAGACTGGC ATTTGTACTA CCAGTACAAC CCAGCAGCCA CGATCTGGGG TACTCCATTG    180

   TACTGGGGTC ACGCTGTTTC CAAGGATTTG ACTTCCTGGA CAGATTACGG TGCTTCTTTG    240

   GGCCCAGGTT CCGACGACGC TGGTGCGTTC AGTGGTAGTA TGGTTATCGA TTATAACAAT    300

   ACTTCTGGTT TCTTCAACAG CTCTGTGGAC CCAAGACAAA GAGCAGTTGC AGTCTGGACT    360

   TTGTCTAAGG GCCCAAGCCA AGCCCAACAC ATCAGTTACT CATTGGACGG TGGTTACACC    420

   TTCGAGCACT ACACCGACAA CGCCGTGTTG GACATCAACA GCTCCAACTT CAGAGACCCT    480

   AAGGTGTTCT GGCACGAGGG CGAGAACGGC GAAGATGGTC GTTGGATCAT GGCCGTTGCT    540

   GAATCGCAAG TGTTCTCTTG TTTGTTCTAC TCTTCTCCAA ACTTGAAAAA CTGGACCTTG    600

   GAATCCAACT TCACCCACCA CGGCTGGACT GGTACCCAAT ACGAATGTCC AGGTCTAGTT    660

AAGGTTCCAT ACGACAGTGT TGTTGACTCT TCGAACTCCT CCGACTCCAA GCCAGACTCC     720

GCATGGGTCT TGTTTGTCTC TATCAACCCT GGTGGTCCAT TGGGTGGTTC CGTTACCCAA     780

TACTTTGTTG GTGACTTCAA CGGTACTCAC TTCACTCCAA TCGACGGCCA AACCAGATTC     840

CTAGACATGG GTAAGGACTA CTACGCACTA CAAACTTTCT TCAACACTCC AAACGAGAAG     900

GACGTCTACG GTATCGCATG GGCTTCTAAC TGGCAATACG CCCAACAAGC CCCAACTGAC     960

CCATGGCGTT CATCTATGAG TTTGGTTAGA CAATTCACAT TGAAAGACTT CAGCACAAAC    1020

CCTAACTCCG CTGATGTCGT CTTGAACAGT CAACCAGTCT TGAACTATGA TGCATTGAGA    1080

AAGAACGGTA CCACTTACAG TATCACAAAC TACACCGTCA CCTCCGAAAA CGGCAAGAAG    1140

ATCAAGCTAG ACAACCCATC CGGTTCTCTT GAATTCCATC TTGAATACGT GTTTAACGGC    1200

TCCCCAGATA TCAAGAGCAA CGTGTTCGCT GATCTTTCCT TGTACTTCAA GGGTAACAAC    1260

GACGACAACG AATACTTGAG ATTGGGTTAC GAAACCAACG GTGGTGCCTT CTTCTTGGAC    1320

CGTGGCCACA CCAAGATTCC TTTCGTGAAG GAGAACTTGT TCTTCACCCA CCAATTGGCA    1380

GTTACCAACC CAGTTTCCAA CTACACCACA AACGTCTTCG ACGTTTACGG TGTCATTGAC    1440

AAGAACATCA TCGAATTGTA CTTCGATAAC GGTAACGTCG TCTCCACCAA CACTTTCTTC    1500

TTCTCTACCA ACAACGTTAT TGGTGAAATT GACATCAAGT CGCCATACGA CAACCCTTAC    1560

ACCATTAACT CATTTAACGT TACCCAATTT AACGTTTGA 3’                                                 1599

由核苷酸密码翻译的氨基酸序列如下：

GAT GGT GAC AGC AAG GCC ATC ACT AAC ACC ACT TTT AGT TTG AAC AGA CCT TCT      54

 D   G   D   S   K   A   I   T   N   T   T   F   S   L   N   R   P   S       18

GTG CAT TTC ACT CCA TCC CAT GGT TGG ATG AAC GAT CCA AAT GGT TTG TGG TAC     108

 V   H   F   T   P   S   H   G   W   M   N   D   P   N   G   L   W   Y       36

GAT GCC AAG GAA GAA GAC TGG CAT TTG TAC TAC CAG TAC AAC CCA GCA GCC ACG     162

 D   A   K   E   E   D   W   H   L   Y   Y   Q   Y   N   P   A   A   T       54

ATC TGG GGT ACT CCA TTG TAC TGG GGT CAC GCT GTT TCC AAG GAT TTG ACT TCC     216

 I   W   G   T   P   L   Y   W   G   H   A   V   S   K   D   L   T   S       72

TGG ACA GAT TAC GGT GCT TCT TTG GGC CCA GGT TCC GAC GAC GCT GGT GCG TTC     270

 W   T   D   Y   G   A   S   L   G   P   G   S   D   D   A   G   A   F       90

AGT GGT AGT ATG GTT ATC GAT TAT AAC AAT ACT TCT GGT TTC TTC AAC AGC TCT     324

 S   G   S   M   V   I   D   Y   N   N   T   S   G   F   F   N   S   S      108

GTG GAC CCA AGA CAA AGA GCA GTT GCA GTC TGG ACT TTG TCT AAG GGC CCA AGC     378

 V   D   P   R   Q   R   A   V   A   V   W   T   L   S   K   G   P   S      126

CAA GCC CAA CAC ATC AGT TAC TCA TTG GAC GGT GGT TAC ACC TTC GAG CAC TAC     432

 Q   A   Q   H   I   S   Y   S   L   D   G   G   Y   T   F   E   H   Y      144

ACC GAC AAC GCC GTG TTG GAC ATC AAC AGC TCC AAC TTC AGA GAC CCT AAG GTG     486

 T   D   N   A   V   L   D   I   N   S   S   N   F   R   D   P   K   V      162

TTC TGG CAC GAG GGC GAG AAC GGC GAA GAT GGT CGT TGG ATC ATG GCC GTT GCT     540

 F   W   H   E   G   E   N   G   E   D   G   R   W   I   M   A   V   A      180

GAA TCG CAA GTG TTC TCT TGT TTG TTC TAC TCT TCT CCA AAC TTG AAA AAC TGG     594

 E   S   Q   V   F   S   C   L   F   Y   S   S   P   N   L   K   N   W      198

ACC TTG GAA TCC AAC TTC ACC CAC CAC GGC TGG ACT GGT ACC CAA TAC GAA TGT     648

 T   L   E   S   N   F   T   H   H   G   W   T   G   T   Q   Y   E   C      216

CCA GGT CTA GTT AAG GTT CCA TAC GAC AGT GTT GTT GAC TCT TCG AAC TCC TCC     702

 P   G   L   V   K   V   P   Y   D   S   V   V   D   S   S   N   S   S      234

GAC TCC AAG CCA GAC TCC GCA TGG GTC TTG TTT GTC TCT ATC AAC CCT GGT GGT     756

 D   S   K   P   D   S   A   W   V   L   F   V   S   I   N   P   G   G      252

CCA TTG GGT GGT TCC GTT ACC CAA TAC TTT GTT GGT GAC TTC AAC GGT ACT CAC     810

 P   L   G   G   S   V   T   Q   Y   F   V   G   D   F   N   G   T   H      270

TTC ACT CCA ATC GAC GGC CAA ACC AGA TTC CTA GAC ATG GGT AAG GAC TAC TAC     864

 F   T   P   I   D   G   Q   T   R   F   L   D   M   G   K   D   Y   Y      288

GCA CTA CAA ACT TTC TTC AAC ACT CCA AAC GAG AAG GAC GTC TAC GGT ATC GCA     918

 A   L   Q   T   F   F   N   T   P   N   E   K   D   V   Y   G   I   A      306

TGG GCT TCT AAC TGG CAA TAC GCC CAA CAA GCC CCA ACT GAC CCA TGG CGT TCA     972

 W   A   S   N   W   Q   Y   A   Q   Q   A   P   T   D   P   W   R   S      324

TCT ATG AGT TTG GTT AGA CAA TTC ACA TTG AAA GAC TTC AGC ACA AAC CCT AAC    1026

 S   M   S   L   V   R   Q   F   T   L   K   D   F   S   T   N   P   N      342

TCC GCT GAT GTC GTC TTG AAC AGT CAA CCA GTC TTG AAC TAT GAT GCA TTG AGA    1080

 S   A   D   V   V   L   N   S   Q   P   V   L   N   Y   D   A   L   R      360

AAG AAC GGT ACC ACT TAC AGT ATC ACA AAC TAC ACC GTC ACC TCC GAA AAC GGC    1134

 K   N   G   T   T   Y   S   I   T   N   Y   T   V   T   S   E   N   G      378

AAG AAG ATC AAG CTA GAC AAC CCA TCC GGT TCT CTT GAA TTC CAT CTT GAA TAC    1188

 K   K   I   K   L   D   N   P   S   G   S   L   E   F   H   L   E   Y      396

GTG TTT AAC GGC TCC CCA GAT ATC AAG AGC AAC GTG TTC GCT GAT CTT TCC TTG    1242

 V   F   N   G   S   P   D   I   K   S   N   V   F   A   D   L   S   L      414

TAC TTC AAG GGT AAC AAC GAC GAC AAC GAA TAC TTG AGA TTG GGT TAC GAA ACC    1296

 V   F   N   G   S   P   D   I   K   S   N   V   F   A   D   L   S   L      432

AAC GGT GGT GCC TTC TTC TTG GAC CGT GGC CAC ACC AAG ATT CCT TTC GTG AAG    1350

 N   G   G   A   F   F   L   D   R   G   H   T   K   I   P   F   V   K      450

GAG AAC TTG TTC TTC ACC CAC CAA TTG GCA GTT ACC AAC CCA GTT TCC AAC TAC    1404

 E   N   L   F   F   T   H   Q   L   A   V   T   N   P   V   S   N   Y      468

ACC ACA AAC GTC TTC GAC GTT TAC GGT GTC ATT GAC AAG AAC ATC ATC GAA TTG    1458

 T   T   N   V   F   D   V   Y   G   V   I   D   K   N   I   I   E   L      486

TAC TTC GAT AAC GGT AAC GTC GTC TCC ACC AAC ACT TTC TTC TTC TCT ACC AAC    1512

 V   F   D   N   G   N   V   V   S   T   N   T   F   F   F   S   T   N      504

AAC GTT ATT GGT GAA ATT GAC ATC AAG TCG CCA TAC GAC AAC CCT TAC ACC ATT    1566

 N   V   I   G   E   I   D   I   K   S   P   Y   D   N   P   Y   T   T      522

AAC TCA TTT AAC GTT ACC CAA TTT AAC GTT TGA                                1599

 N   S   F   N   V   T   Q   F   N   V   Z                                  533

分析外切菊粉酶基因的核苷酸序列及编码的氨基酸序列，具有如下特征：

(1)克隆的外切菊粉酶基因(不含信号肽)全长1599个核苷酸，编码533个氨基酸，同源性比较分析发现：与国外最早报道的克鲁维外切菊粉酶基因序列同源性＞99％(Laloux O.，J-P.Cassart，J.Delcour，et al.，1991)，认定二者具有同一起源基因。

(2)从氨基酸推断理论分子量为59.2KDa。

(3)在编码的氨基酸序列上发现了10个潜在的N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr，X为任意氨基酸)，成熟酶蛋白的分子量为78KDa。

(4)该基因G+C含量47.3％。

实验二

以Pichia pastoris GS115为受体菌的重组载体构建

用EcoRI和HindIII分别酶切exoinu基因和pUC18，酶切后进行低熔点琼脂糖电泳进行回收纯化所需片段，exoinu与pUC18以3∶1比例(摩尔比例)混合后，在T4DNA连接酶作用下，于16℃过夜。取连接反应物转化感受态E.coli JM103，在37℃过夜培养的LB固体培养基(含Amp 50～100μg/ml)上筛选重组子pUC18A，提取质粒，酶切鉴定。从已经验证的pUC18A上用EcoRI和SnaBI酶切下包含exoinu的片段，同样用EcoRI和SnaBI酶切pPIC9，酶切后进行低熔点琼脂糖电泳进行回收纯化所需片段，exoinu与pPIC9以3～5∶1(摩尔比例)混合后，在T4DNA连接酶作用下，于16℃过夜。然后取连接反应物转化感受态E.coli TOP10F’，在LB培养基(含Amp50～100μg/ml)上涂平板，37℃过夜培养，挑选阳性重组子。PCR验证重组质粒，提取质粒，以提取的质粒为Template DNA，以5’AOX1 sequencing primer：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’和3’AOX1 sequencingprimer：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’为引物，进行PCR反应钓取特征性DNA片段(见附图2)。

用PCR验证重组载体，测序结果表明经改造的exoinu基因通过EcoRI和SnaBI位点以正确的阅读框架与酵母表达载体pPIC9(pPIC9长度为8023bp，带有Amp抗性标记，具有酒精氧化酶启动子序列3’AOX1(1-948bp)和alpha--分泌因子信号肽序列(948-1218bp)，具有多克隆位点XhoI，SnaBI，EcoRI，NotI等，位于1192-1241bp之间。)上的alpha-factor信号肽编码序列3’端融合，得到重组载体pPIC9A。这样重组载体上的外源基因exoinu基因受AOX1(酒精氧化酶1)启动子控制。

实验三

酵母转化及阳性重组子筛选

受体菌株为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris GS115(His^-Mut^-)，在500ml YPD(1.0％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中30℃培养至A₆₀₀＝1.3～1.8时离心收集菌体；依次用500ml和250ml预冷的无菌水洗菌体，离心去上清，收集菌体；用20ml预冷的1mol/L山梨醇悬浮菌体；离心后再用0.5ml预冷的山梨醇悬浮菌体；取40μl，加入1～5μg线性化重组质粒，冰浴5min，用LN-101电击仪电击转化，参数：0.8kV，11.5μF。电击结束后立即加入0.5ml预冷的1mol/L山梨醇，取200μl于固体YSDB上涂板，30℃培养直至转化子出现。用无菌牙签挑取YSDB上的转化子对应点种到MM和MD平板上，30℃下培养2d，在MD上生长正常而在MM上生长不正常或不生长的克隆子(his⁺Mut^-)为阳性克隆子。

转化子可以在培养基YSDB(不含His)上生长，而非转化子不能生长，这是因为受体菌为组氨酸缺陷型(his^-)，而载体上虽然有His4基因，但是没有酵母复制子，所以载体上的His4基因必须整合进酵母基因组中才能表达。另外，由于重组的酵母细胞中AOX1基因受到破坏，所以它不能再利用甲醇作为碳源，这样在以甲醇作为唯一碳源的培养基上转化子就不能够生长或者生长很慢，表现为甲醇利用缺陷型(Mut^-)。

实验四

重组酵母的分子鉴定

重组酵母于10ml BMGY中30℃剧烈振摇，使细胞生长至饱和状态，离心收集菌体，加入10ml诱导培养基BMMY，30℃下继续诱导培养5～7天，重组酵母于BMGY中培养后，提取基因组DNA。进行PCR反应，以重组酵母基因组DNA作为DNA模板，以5’AOX1sequencing primer 5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’和3’AOX1 sequencing primer：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’为引物进行PCR扩增，以证明外切菊粉酶基因是否正确***表达载体。将PCR产物外送上海Genecore生物技术公司测序，证明外切菊粉酶基因正确***基因组DNA中。

实验五

重组酵母表达产物菊粉外切酶SDS-PAGE分析

重组酵母30℃诱导培养36h后离心去菌体，取3μl上清液进行SDS-PAGE分析，(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺为29∶1)分离胶浓度为8％，浓缩胶浓度为5％，电泳结束后，凝胶用考马斯亮兰染色30min，接着用10％冰乙酸脱色。

蛋白质SDS-PAGE电泳结果表明表达的外切菊粉酶分子量大小约为78KDa，在用Endo H(Endo-β-N-acetylglyco-saminidase H)脱糖基化处理后，分子量降为60KDa左右，从蛋白质水平证明了重组子能够正常表达和分泌外源外切菊粉酶蛋白质，表达产物能够进行蛋白翻译后的糖基化修饰。

实验一至实验五使用以下实验材料

1 菌株与质粒  外切菊粉酶基因供体菌株为Kluyveromyces IW9801(CGMCC0360)、扩增和保存质粒用大肠杆菌为E.coli DH5α，E.coli TOP10F’、受体菌株Pichia pastorisGS115(His^-Mut^-)、质粒pUC18和pPIC9均为中国农业科学院饲料研究所饲料生物技术研究室王建华课题组和姚斌课题组保存和提供材料。5’AOX1 sequencing primer：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’和3’AOX1 sequencing primer：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’引物为Invitrogen产品；其他材料均为普通研究用商品材料。

2 酶与试剂盒  从北京欣经科试剂公司和Promega公司购买。包括：限制性内切酶EcoRI，HindIII，SnaBI，TaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶，RNase，通用PCR反应试剂盒，基因组DNA提取与纯化试剂盒，DNA片段回收与纯化试剂盒。

3 培养基

(1)大肠杆菌培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0。

(2)完全培养基YPD：1.0％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。

(3)转化培养基YSDB：1.34％YNB，18.6％山梨醇，2％葡萄糖，0.00004％Biotin，0.005％谷氨酸，0.005％甲硫氨酸，0.005％赖氨酸，0.005％亮氨酸，0.005％异亮氨酸，2％琼脂。

(4)选择培养基MM：1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇，2.0％琼脂。

(5)选择(对照)培养基MD：1.34％YNB，0.00004％Biotin，2％葡萄糖，2.0％琼脂。

(6)诱导(适应)培养基BMGY：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油，由0.1Mol/l磷酸钠缓冲液调节培养基pH6.0。

(7)诱导培养基BMMY：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇，由0.1Mol/l磷酸钠缓冲液调节培养基pH6.0。

实验六

重组酵母Pichia pastoris EXI2086表达外切菊粉酶研究

从200个阳性转化子中随机挑选120个，接种于装有BMGY培养基的指形试管和15毫升离心管，在250r/min，30℃下培养24h，然后离心转换BMMY培养基，3d后直接检测诱导的发酵液的菊粉酶活性，依据活性大小，选定若干株继代10代以上，选1高产重组子(定名为EXI2086)上6.6升Braun实验发酵罐(Biostat)研究产酶条件和曲线。主要发酵方法与Jayne Stratton et al.方法(In：David RH.，James MC.ed.，Methods in MolecularBiology-Protocols Pichia，1998，vol.103 Humana Press Inc.，New York：107-120.)基本相同，装料系数0.30，为后期产酶诱导补料予留足够空间。

1 培养基

(1)工程菌株摇瓶种子培养基：1.0％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，加水至1L。

(2)发酵罐基础培养基成分：2.67％磷酸，0.093％硫酸钙，1.82％硫酸钾，1.49％硫酸镁，0.413％氢氧化钾，(前5种成分可以配制成为，5～10倍浓缩母液)，4％葡萄糖，0.437％PTM1溶液，消泡剂GP 0.2ml，GPE 0.8ml，补水到1升。

(3)微量元素PTM1成分：0.6％硫酸铜，0.08％碘化钠，0.3％硫酸猛，0.02％钼酸钠，0.02％硼酸，0.05％氯化钴，2％氯化锌，6.5％硫酸亚铁，0.025％生物素，0.5％浓硫酸，补水到1升。

(4)生长阶段补料液成分：25％葡萄糖，含PTM1成分12ml/l(补料液)。

(5)混合诱导补料液成分：25％葡萄糖，10％甲醇，含PTM1成分12ml/l(补料液)；

(6)纯粹诱导培养基：纯甲醇，含PTM1成分12ml/l(补料液)。

2 发酵条件  在pH、DO、温度自动控制的6.6L Braun发酵罐(Biostat，德国产)中培养工程菌株Pichia pastoris EXI2086生产外切菊粉酶，工程菌株在发酵罐的起始装料容积是2.0L，接种量5％～7.5％，发酵温度分别控制在30℃，搅拌速度为1,200r/min，pO₂均控制在30％以上，入口气流速度大于9L/min，发酵液的pH用2Mol/l氨水分别控制在pH5.6(所补加氨水同时在培养基中起氮源作用)；产外切菊粉酶工程菌株具有不同的调控方式，主要由三个部分组成(1)通过初始培养基和补料培养基提供足够营养物质以加速酵母细胞繁殖获得最大生物量，(2)补饲目标蛋白质表达诱导物质和营养物质混合培养在进一步提高生物量的同时，开始诱导目标蛋白质的表达，诱导表达的条件与Jayne Stratton et al.方法(High Cell-Density Fermentation，In：David RH.，James MC.ed.Methods in MolecularBiology-Protocols Pichia，1998，vol.103 Humana Press Inc.，New York：107-120)基本一致，只是将培养基中使用的碳源甘油改由葡萄糖代替，这样既降低成本又不影响营养生长效果。其他的变化还包括生长培养基补充料和表达诱导补充料流速的调控，具体参数见后面的实施例1中的详细叙述。

         表1.重组酵母Pichia pastoris EXI2086产外切菊粉酶时间进程

 时间(h)         生物量(g/l，FW，经5000g，10min离心)      酶活性单位(U/ml)

   0                             10                             --

   24                            98                             --

   30                            165                            --

   36                            180                            60.34

   48                            198                            104.16

   56                            210                            141.19

   60                            230                            300.95

    72                       230                        314.76

    84                       250                        393.80

    96                       254                        577.14

表1可见：Pichia pastoris EXI2086最高产菊粉酶水平在96h达到577.14U/ml，比原始供体出发菌株Kluyveromyces marxianus IW9801(CGMCC0360)最高水平(289U/ml)高1倍，且时间缩短24h，根据该酵母表达***表达其他异源蛋白质的特点，还有足够的优化余地，预期能够达到更理想产酶水平。

实验七

外切菊粉酶活性的测定方法

本研究菊粉酶反应条件为：经过适当稀释的酶液0.50ml和2.5％～3.0％菊糖(上海化学试剂二厂)0.50ml在55℃反应10min，反应体系为1ml，反应体系pH值为4.5，由0.02mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液提供。由斐林试剂法测定反应体系中还原糖含量。菊粉酶活性单位定义为--反应体系中每毫升每分钟产生1μmol己糖所需酶量为1个酶活性单位。

附图说明：

图1本发明的技术路线

图2.重组载体pPIC9A和高表达外切菊粉酶重组酵母Pichia pastoris EXI2086构建

本发明有以下特点：(1)工程菌株Pichia pastoris EXI2086产酶水平577.14U/ml，高于发明人查到的同类研究或专利报道的最高值，2002年3月4日经过国家一级科技查新站检索表明(200101c1400033)：这是迄今为止唯一具有生产意义的成功构建的外切菊粉酶工程菌株；(2)达到最高产酶水平时间从出发菌株的120h缩短到96h，提前24h；(3)获得相同酶水平所需要的生物量比出发菌株更低；(4)工程菌株发酵温度30℃比出发菌株低8℃；(5)用葡萄糖替换该表达***的指定碳源甘油，前5点都意味着发酵能源和成本的大幅度降低；(6)在产外切菊粉酶诱导培养期间葡萄糖和甲醇的适当比例以及培养基pH控制是优化产酶条件的2个重要因子之一；(7)是目前报道中唯一只产外切菊粉酶的高产菌株，节省酶的纯化成本。

实施例1

种子液制备：斜面种子(1环)接入装有培养基(摇瓶种子培养基(YPD)：1％酵母培养物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，H₂O 1000ml)的250ml摇瓶中经30℃ 24h，300r/min成种子液，再转入装有同样培养基的500ml摇瓶中经30℃ 24h，300r/min成二级种子液。

生长阶段：将2.0L培养基基础料配制(含2.67％磷酸，0.093％硫酸钙，1.82％硫酸钾，1.49％硫酸镁，0.413％氢氧化钾，4.0％葡萄糖，0.437％PTM1(PTM1成分：0.6％硫酸铜，0.08％碘化钠，0.3％硫酸锰，0.02％钼酸钠，0.02％硼酸，0.05％氯化钴，2.0％氯化锌，6.5％硫酸亚铁，0.025％生物素，0.5％浓硫酸)消泡剂GP 0.2ml/L，GPE 0.8ml/L，装入6.6L发酵罐经121℃蒸汽灭菌30min，冷却至30℃接入种子液，30℃培养，1,200r/min搅拌，发酵液的pH用2Mol/L氨水始终控制在pH5.6水平上(所补加氨水同时在培养基中起氮源作用)，pO₂≥30％。培养24h后，按36ml/h/L的速度补料(补料液成分：25％葡萄糖，含PTM1成分12ml/L)30℃，pO₂≥40％，5h后，以9L/min通气；1,200r/min搅拌，pH5.6(自动补充氨水调控)。

诱导阶段：至48h后用混合诱导培养基(25％葡萄糖，10％甲醇，含PTM1成分12ml/L)进行补料，其流量为：第1h为36ml/h/L，第2至4h为19.2ml/h/l，其他条件同上。再后以3ml/h/L的速度用纯粹诱导补料液进行补料(补料液成分：10％纯甲醇，含PTM1成分12ml/L)，pO₂＞＝50％，其他条件同上。补料12h后又以6ml/h/L的速度用混合诱导培养基(25％葡萄糖，10％甲醇，含PTM1成分12ml/L)再补料6h，pO₂为50％～55％，其他条件同上。再后以12～10ml/h/L的速度用纯粹诱导补料液进行补料，其他条件同上至96h结束培养。此时发酵液中的产酶水平达到577.14U/ml。

Claims (9)

1.一株外切菊粉酶产生菌株，其特征为该菌株是本发明人采用分子生物学的方法，获得的一株工程菌株，命名为：Pichia pastoris EXI2086，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为：CGMCC No.0763，保藏日期为：2002年7月10日。

2.按照权利要求1所述的外切菊粉酶产生菌株，其特征为该菌株是通过以下方法获得的，即：首先筛选出一株外切菊粉酶产生菌株，即外切菊粉酶基因供体菌株为KluyveromycesIW9801，CGMCC No.0360)；经过扩增、设计相应的引物，并对外切菊粉酶基因进行克隆，再经重组载体构建、转化到受体菌株毕赤酵母菌Pichia pastoris GS115(His^-Mut^-)中，再对获得的重组子经过鉴定、筛选获得高效表达外切菊粉酶的酵母工程菌株。

3.一种外切菊粉酶的生产方法，其特征在于在pH、溶解氧、温度自动控制的6.6L发酵罐中培养本发明研制的工程菌株Pichia pastoris EXI2086生产菊粉酶。在发酵罐的起始的基础培养基装料容积是罐容量的30％：工程菌株接种量5％～7.5％，发酵温度控制在28～32℃，搅拌速度为800～1,200r/min，pO₂均控制在30％以上，入口气流速度大于9L/min，发酵液的pH用2Mol/l氨水始终控制在pH5.6水平上，所补加氨水同时在培养基中起氮源作用；产外切菊粉酶工程菌株具有不同的调控方式，主要由两部分组成(1)通过基础培养基和生长阶段补料液提供足够营养物质以加速酵母细胞繁殖获得最大生物量至少达到200g/L，当培养基中残糖低于0.5％或生物量低于200g/L时进行补料；(2)采用混合诱导培养基进行补料，其目的是在进一步提高生物量的同时，使重组酵母菌适应甲醇碳源，并由此进入诱导外源蛋白质表达的起始阶段；(3)其后采用纯粹诱导培养基进行补料，在此其间，只有补加流量的变化，其他条件不变；补料流量变化的依据是：保持溶解氧在一个合适的水平上，如果＜30％，说明生长快、氧消耗多，表明培养基中营养不足，此时需要提高补料流量；如果＞40％，说明生长慢、氧消耗少，表明培养基中营养充足，此时需要减低补料流量。诱导表达的条件与优化原则与Jayne Stratton et al.方法基本一致，只是将培养基中使用的碳源甘油改由葡萄糖代替，这样既降低产酶发酵成本又不影响营养生长和外源蛋白质表达效果。总培养时间达90～144h时可以获得最大量的菊粉酶总产量和最好的产酶经济效益。

本发明利用以上获得的培养液，经菌体与酶液分离后，将菊粉酶液与含糖8～17％的菊粉溶液按照1∶8～17的体积比混合，在45～55℃下酶解糖化30～40小时，得到高果糖浆。

4.权利要求3所述的外切菊粉酶的生产方法，其特征在于所用的基础培养基为：2.67％磷酸，0.093％硫酸钙，1.82％硫酸钾，1.49％硫酸镁，0.413％氢氧化钾，4.0％葡萄糖，0.437％PTM1，补水至1L。其中PTM1成分和配制浓度为：0.6％硫酸铜，0.008％碘化钠，0.3％硫酸锰，0.002％钼酸钠，0.02％硼酸，0.05％氯化钴，2.0％氯化锌，6.5％硫酸亚铁，0.025％生物素，0.5％硫酸，补水至1L。

5.按照权利要求3所述的外切菊粉酶的生产方法，其特征在于所用的工程菌株摇瓶种子培养基：1.0％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，加水至1L。

6.按照权利要求3所述的外切菊粉酶的生产方法，其特征在于所用的生长阶段补料液为：25％葡萄糖，1.2％PTM1，补水至1L。

7.按照权利要求3所述的外切菊粉酶的生产方法，其特征在于所用的混合诱导培养基为：25％葡萄糖，10％甲醇，1.2％PTM1，补水至1L。

8.按照权利要求3所述的外切菊粉酶的生产方法，其特征在于所用的纯粹诱导培养基为：纯甲醇，1.2％PTM1，补水至1L。

9.按照权利要求3所述的外切菊粉酶的生产方法，其特征在于发酵液中最高外切菊粉酶活性达到577.14U/ml。

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