CN1494588A - 蛋白质组氨酸磷酸酶的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及来自哺乳动物的具有蛋白质组氨酸磷酸酶活性的多肽、此多肽的抗体和编码具有蛋白质组氨酸磷酸酶活性的多肽的mRNA的互补DNA或RNA序列的用途，用于调节ATP－柠檬酸裂合酶和治疗相关病理生理功能。

Description

蛋白质组氨酸磷酸酶的用途

本发明涉及来自哺乳动物的具有蛋白质组氨酸磷酸酶活性的多肽、此多肽的抗体和编码具有蛋白质组氨酸磷酸酶活性的多肽的mRNA的互补DNA或RNA序列的用途，用于调节ATP-柠檬酸裂合酶和治疗相关病理生理功能。

技术背景

翻译后修饰如蛋白质磷酸化提供了一个重要的机制，通过它可以控制蛋白质的功能活性，继而调节生物过程。蛋白质激酶和磷酸酶参与各种细胞功能的调节，这些细胞功能包括分化、生长控制、肿瘤启动、细胞周期和细胞死亡。新陈代谢或合成代谢途径中关键酶的特定残基的磷酸化/去磷酸化已显示出是上调或下调这些酶的主要机制。

ATP-柠檬酸裂合酶(ACL；EC 4.1.3.8)，提供胞质乙酰辅酶A的关键酶，是由四个明显一样的亚基组成的四聚体(Singh，M.等(1976)J.Biol.Chem.，251，5242-5250)，在肝脏、脑和肾中活性最高(Srere，P.A.(1959)J.Biol.Chem.234，2544-2547)。热量的摄入和胰岛素可引起ACL基因表达和蛋白含量在转录水平上提高，而饥饿和糖尿病却使其降低(Towle，H.C.等(1997)Annu.Rev.Nutr.17，405-433；Rosiers，S.D.等(1995)J.Biol.Chem.，270，10027-10033)。该酶有三个磷酸化调节位点，体内ACL的这些位点的磷酸化能改变它对营养物、激素环境和在分化期间的反应(Benjamin，W.B.等(1994)Biochem.J.，300，477-482)。

ACL在胞质中催化柠檬酸和辅酶A生成乙酰辅酶A和草酰乙酸，同时，ATP水解成ADP和磷酸。这一步是胞质乙酰辅酶A的主要来源，乙酰辅酶A用于碳水化合物、脂肪酸、胆固醇和乙酰胆碱的生物合成途径。该酶遵从的机制为形成磷酸化酶中间产物(Plowman，K.M.等，(1967)J.Biol.Chem.242，4239-4247；Wells，T.N.C.(1991)Eur.J.Biochem.199，163-168)，该中间产物在总反应的第一步时，由底物ATP对该酶的催化位点磷酸化得到。该磷酸化位点在His 760(Williams，S.P.等(1985)Biochem.，24，5527-5531)。

最近的发现表明ACL可能在糖原异生作用中也起重要的作用，因为它催化形成大部分的胞质草酰乙酸——主要的糖原异生前体(Rosiers，S.D.等(1995)J.Biol.Chem.，270，10027-10033)。此外，通过调节胞质中柠檬酸的浓度，使ACL的活性发生改变，不但能通过抑制磷酸果糖激酶的活性调节糖酵解(Comte，B.等(1997)J.Biol.Chem.，272，26117-26124)，而且能通过变构活化乙酰辅酶A羧化酶调节脂肪酸的生物合成(Reilly，D.I.等(1997)Prog.Lipid Res.，35，371-385)。

ACL催化的反应是用于脂肪生成和胆固醇生成的乙酰辅酶A的关键供给者。研究表明，抑制该酶导致胆固醇和脂肪酸的合成减少以及低密度脂蛋白受体的活性增加，这暗示ACL抑制剂具有作为低脂血症药物(Berkout，T.A.等(1990)Biochem.J.，272，181-186)、诱导体重降低的药物(WO 97/18806)或肥胖症治疗药物的潜力。

此外，ACL参与的一个重要途径是神经递质乙酰胆碱的合成。由ACL转化柠檬酸生成的乙酰辅酶A受胞质中胆碱乙酰转移酶的作用而和胆碱结合。因为乙酰胆碱的缺乏是阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)的一个特征，且用乙酰胆碱酯酶抑制剂可改善临床症状(Bartus，R.T.等(1982)Science，217，408-414)，故ACL可能在阿尔茨海默氏病和其他类型痴呆症中起重要的作用。在不同器官的癌中，发现脂肪酸合酶的表达水平很高(Kuhajda，F.P.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，91，6379-6383；Rashid，A.等(1997)Am.J.Pathol.，150，201-208；Pizer，E.S.等(1998)Cancer 83，528-537)。因此假设可通过抑制脂肪酸合成而抑制高水平合成脂肪酸的肿瘤细胞的生长(Pizer，E.S.等(2000)Cancer Res.，60，213-218；Kuhajda，F.P.等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97，3450-3454)。在WO 94/02108中报道，抑制脂肪酸合成可抑制肿瘤细胞的生长，这意味着ACL抑制剂可作为潜在的抗肿瘤药物。在US 5,143,907中有相似的发现，在此亚磷酸盐-硼烷化合物的抗肿瘤和消炎作用被认为与抑制细胞质中脂肪酸和胆固醇的合成有关。而且，慢性代谢酸中毒的低柠檬酸尿症和肾皮质组织中ACL酶活性的升高有关，且通过抑制该酶活性可部分逆转(Melnick，J.Z.等(1996)J.Clin.Invest.，98，2381-2387)。这些结果表明，该酶在近端小管柠檬酸代谢中起重要作用，调节ACL酶活性可能是治疗低柠檬酸尿症的一个途径。

根据上述，很显然ACL是许多生物化学途径中的关键酶，调节ACL的活性对治疗各种疾病非常重要。

因此，本发明的目的就是提供ACL酶活性调节剂的用途、调节ACL酶活性的新方法和药物以及使用这些化合物生产治疗和ACL酶的活性提高或降低相关的病理生理功能的药物，这些病理生理功能如高脂血症、高胆固醇血症、心血管疾病、肥胖症、炎症、肿瘤、中枢神经***疾病和低柠檬酸尿症。

基于下面详细描述，本发明的其他目的对本领域技术人员是显而易见的。

这些目的可基于下面意外的发现而实现：ACL是最近报道的蛋白——人蛋白质组氨酸磷酸酶(hPHP)和它的同源变体的底物，而且hPHP通过使ACL磷酸化的组氨酸残基脱磷酸而调节ACL的活性。

因此，本发明提供了具有hPHP活性的多肽的用途，用于调节ACL酶活性。

此外，本发明提供了抑制hPHP活性的化合物，如hPHP或其片断的抗体或者编码具有hPHP活性的多肽的mRNA序列的互补DNA序列的用途，用于调节ACL的酶活性。

本发明还提供了具有hPHP活性或可抑制hPHP活性的化合物的用途，用于生产调节ACL酶活性的药物。

本发明也提供了具有hPHP活性的多肽或可抑制hPHP活性的化合物或包含这些化合物的药物的用途，用于治疗和ACL酶活性升高或降低相关的病理生理状况如高脂血症、高胆固醇血症、心血管疾病、肥胖症、炎症、肿瘤、中枢神经***疾病和低柠檬酸尿症。

本发明也提供治疗和ACL酶活性升高或降低相关的病理生理状况如高脂血症、高胆固醇血症、心血管疾病、肥胖症、微生物感染、炎症、肿瘤、中枢神经***疾病和低柠檬酸尿症的方法，包括给病人服用有效治疗量的有hPHP活性的多肽或者能抑制hPHP活性的化合物或者包含这些化合物的药物。

哺乳动物蛋白质组氨酸磷酸酶(hPHP)和其同源变体见WO00/52175(Seq.NO.2-8)。该蛋白表观分子量为14,000且N-末端封闭。

分离、纯化、鉴定(第7页第10行到第10页第10行)以及制备抗体(第7页第13-30行)的方法也在该申请中讲述。

由于ACL是hPHP的脱磷酸化活性的底物，该磷酸酶可用于调节ACL的活性，因此，hPHP或具有hPHP活性的多肽和含有该多肽的药物组合物可用于治疗和ACL酶活性升高或降低有关的病理生理功能，这些病理生理功能如高脂血症、高胆固醇血症、心血管疾病、肥胖症、炎症、肿瘤、中枢神经***疾病和低柠檬酸尿症。

本发明同样包括hPHP的片断、变体和突变体，这些片断、变体和突变体的抗体和所述片断、变体和突变体的mRNA序列的互补DNA或RNA序列在调节ACL酶活性中的用途。这些hPHP的片断、变体和突变体可通过在基本保持生物学活性的情况下，如随机或受控的替换，不同的剪切，删除或加入一个或多个核苷酸或氨基酸得到。

这样，本发明涉及使用具有hPHP活性的多肽以调节ACL酶活性，该多肽至少含有下列的氨基酸序列基元

DCECLGGGRISHQSQD

另外一个优选的调节ACL酶活性的具有hPHP活性的多肽至少含有下列氨基酸序列基元

DCECLGGGRISHQSQDX¹KIHVYGYSMX²YGX³AQH

其中，X¹＝K或R，X²＝A或G，X³＝P或R。

另外一个优选的调节ACL酶活性的具有hPHP活性的多肽至少含有下列氨基酸序列基元

YHADIYDKVSGDMQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSM.

所有这些部分序列在全酶氨基酸序列中都高度保守，而且认为它们参与了所述酶的活性位点或者在哺乳动物中具有其他生物的或药物的相关性。

一个特别优选的调节ACL酶活性的具有hPHP活性的多肽含有下列氨基酸序列

(M)AVADLALIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHSAPRSGAPAAESKEIVRGYKWAEYH

ADIYDKVSGDMQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSMAYGPAQHAISTE

KIKAKYPDYEVTWANDGY

序列N-末端的甲硫氨酸残基不是必需的。

本发明的另外一个目的是提供针对上述任何一个氨基酸序列的抗体，优选人源化单克隆抗体的用途，用于抑制hPHP磷酸酶活性，并因此间接调节ACL。这些抗体可以用本领域所熟知的技术制得。

针对hPHP的抗体，如针对具有氨基酸序列

CLGGGRISHQDK的hPHP活性位点的抗体(见WO 00/52175第13页18行，Seq.No.10)或针对上面提到的氨基酸序列之一的抗体可以用来抑制hPHP磷酸酶活性，从而间接调节ACL。

本发明的另外一个目的是提供编码hPHP的mRNA的互补DNA序列或化学修饰过的DNA序列的用途，用于抑制hPHP的翻译并因此间接调节ACL。这个DNA序列可容易的从WO 00/52175中所描述的hPHP DNA序列(Seq.No.1)得到，且可能具有下列序列之一

I)TACCGCCACC GCCTGGAGCG AGAGTAAGGA  CTACACCTGT AGCTGAGGCT

  GCCGCAGAAG TTCATACACG ACTAGGCTCA  GGTGAGCCGA GGGGCGAGGC

  CCCGAGGCCG ACGTCTCTCG TTCCTCTAGC  ACGCGCCGAT GTTCACCCGA

  CTCATGGTAC GCCTGTAGAT GCTGTTTCAC  AGCCCGCTGT ACGTCTTCGT

  TCCGACGCTG ACACTCACAG ACCCGCCGCC  CGCGTAGAGG GTGGTCTCAG

  TCCTGTTCTT CTAAGTGCAC ATGCCGATAA  GGTACCGGAT ACCAGGACGG

  GTCGTGCGGT AAAGTTGACT CTTTTAGTTTC GGTTCATGGG GCTGATGCTC

  CAGTGGACCC GATTGCTGCC GATG

II) CTGACACTCA CAGACCCGCC GCCCGCGTAG AGGGTGGTCT CAGTCCTG

III)CTGACACTCA CAGACCCGCC GCCCGCGTAG AGGGTGGTCT CAGTCCTGTT

    CTTCTAAGTG CACATGCCGA TAAGGTACCG GATACCAGGA CGGGTCGTG

IV)ATGGTACGCC TGTAGATGCT GTTTCACAGC CCGCTGTACG TCTTCGTTCC

   GACGCTGACA CTCACAGACC CGCCGCCCGC GTAGAGGGTG GTCTCAGTCC

   TGTTCTTCTA AGTGCACATG CCGATAAGGT AC

这些DNA序列可用本领域中所熟知的技术得到。

上面提到的天然的以及重组的多肽、抗体或DNA序列可以用于患有和ACL酶活性提高或降低相关的病理生理功能的病人，这些病理生理功能如高脂血症、高胆固醇血症、心血管疾病、肥胖症、微生物感染、炎症、肿瘤、中枢神经***疾病和低柠檬酸尿症，这些化合物可以直接使用，也可以在包含所述化合物和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物中使用。

此处的术语“药学上可接受的载体”是指惰性的、无毒的固体或液体填充剂，稀释剂或包囊材料，它们不和活性化合物或病人发生有害的反应。本领域中熟知适宜的，优选地液体载体，如无菌水、盐水、右旋糖水溶液、糖溶液、醇、二醇和油，包括来自石油、动物、植物或合成的油，如花生油、大豆油和矿物油。

根据本发明的制剂可以以单位剂量形式施用，其中含常规的、无毒的、药学上可接受的载体、稀释剂、辅料和典型用于胃肠外给药的赋形剂。

这里术语“胃肠外的”包括皮下的、静脉的、关节内的和气管内的注射和输液技术。同时，其他给药方式如口服给药和局部用药也是合适的。胃肠外组合物和组合最优选通过静脉给药，以快速浓注(bolus)的形式或者以恒定输注形式根据已知方式进行。

当本发明的化合物配制成片剂、胶囊或粉末时，可使用通常的载体和赋形剂如碳酸镁、碳酸钙、碳酸氢钠、硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石粉、乳糖、微晶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素淀粉钠和无水硅石；润滑剂如水化蓖麻油、硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和糖、果胶、糊精、黄蓍胶、低熔点蜡、可可油、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、季铵化合物等以及粘合剂如淀粉、葡萄糖、***树胶和甘露醇。可按照本领域熟知的方法给片剂或胶囊加包衣。

口服液体制剂可以呈水性或油性悬浮液、溶液、乳液、糖浆或酏剂形式，或者也可以是干药，用前用水或其他合适的载体重构。这种液体制剂可以含有常规添加剂如悬浮剂、乳化剂、非水性载体和防腐剂。

局部用药可以为水性或油性悬浮液、溶液、乳液、凝胶或优选为乳膏。

根据本发明，单位剂量可以包含每天所需量的本发明化合物，或含有其多个亚剂量以构成所需剂量。对于特定病人(哺乳动物，包括人)，最佳治疗可接受剂量和给药速度取决于多种因素，比如所用特定活性化合物的活力、病人年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间和途径、清除率、酶活性(单位/毫克蛋白)、治疗目的(即治疗或预防)以及待治疗疾病的性质，这些因素是本领域技术人员已知的。

因此，在用于(体内)治疗病人的组合物或组合中，本发明活性化合物的药物有效日剂量在约0.01和100毫克/千克体重之间，优选为0.1至10毫克/千克体重。根据本申请，形成的一个单剂量可以含有0.01到10毫克活性化合物。

本发明的ACL酶活性调节剂可以用于治疗癌症病人，所述癌的脂肪酸合成水平上升或者依赖于内源性脂肪酸。适于治疗的典型的癌包括膀胱、唾液腺、皮肤附件、胆管、子宫颈内膜、子宫颈***部和***、食道、鼻咽以及口咽的癌，或者来自生殖细胞的癌，以及间皮瘤。特别的，胃、子宫内膜、肾、肝和肺的癌或腺癌以及黑色素瘤可以根据本发明治疗。乳腺、结肠和直肠、***和卵巢的腺癌特别适用于该疗法。

这些细胞的内源性脂肪酸的合成速度优选为每分钟每200,000个细胞引入大于10f摩尔的乙酰辅酶A到酰基甘油中。可鉴定出优选的病人，因为他们的肿瘤含有的细胞表达ACL或别的脂肪酸合成途径酶，如乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的水平比周围正常(如非瘤的)组织中的水平要高。这些细胞是攻击性肿瘤细胞，可导致存活降低、转移增加、临床复发率升高和总的预后变坏。由于许多肿瘤细胞非常依赖内源性脂肪酸的合成，故对于降低脂肪酸合成的活性水平而言无需将特定肿瘤排除在本发明活性化合物的治疗候选对象外。ACL抑制剂将使脂肪酸的合成降低或停止。其结果是剥夺膜脂而导致细胞死亡。然而，正常细胞由于能够引入循环的脂肪而存活下来。

癌细胞中ACL的存在可通过任何合适的方法检测，包括活性测定或染色，利用抗-ACL抗体的免疫分析、测定ACL mRNA的分析等等。

可以直接测定通过如活组织检查、切除术或针吸引术得到的肿瘤组织样品中ACL的表达，可用的测定法如免疫组织化学、细胞质酶免疫测定或放射免疫测定、具有ACL序列的靶mRNA与核酸探针的原位杂交，或者直接测定酶的活性。可用合适的测定方法在来自病人的液体生物样品中间接测定肿瘤的ACL表达，这些生物样品如血、尿、血清、淋巴、唾液、***、腹水或特别是血浆。

在癌，特别是最为恶性的癌中广泛存在需要内源性合成脂肪酸的细胞。尽管最好在治疗前测定ACL的存在，但熟练的临床医生将明了这种测定并不总是需要。用ACL抑制剂治疗癌症病人导致肿瘤负担的减少，说明肿瘤中存在ACL。这种癌症的经验性治疗也在本发明的期望之内。

将本发明的ACL酶活性的调节剂和其他化疗药物联合使用也是有用的。因为现今还没有可用的特别有效针对脂肪酸合酶途径的癌症化疗药，本发明的化合物可作为已有抗癌药物，特别是针对其他合成代谢或分解代谢途径的抗代谢药物的补充。

根据本发明，可以和本发明化合物一起使用的化疗药物包括具有抗瘤作用即，防止瘤细胞发展、成熟或扩散的药物，这些药物可以直接地如通过抑制细胞生长或细胞毒效应作用于肿瘤细胞，及间接地如通过生物应答修饰等机制起作用。根据本发明，化疗药物优选为天然或合成的化合物，但不排除生物分子，如蛋白质、抗体、趋化因子、细胞因子、多肽等。大量处于商业应用、临床评估和临床前开发状况的化疗药物也包含在本发明中。

化疗药物的例子包括，烷化剂，如氮芥、氮丙啶化合物、烷基磺酸酯和具有烷化作用的其他化合物，如亚硝基脲、顺铂、甲氮咪胺；抗代谢物，如叶酸、嘌呤或嘧啶拮抗剂；有丝***抑制剂，如，长春花生物碱和鬼臼毒素衍生物；细胞毒性抗生素和喜树碱衍生物。优选的化疗药物或化疗包括阿米斯丁(ethyol)、顺铂、甲氮咪胺(DTIC)、放线菌素、甲二氯三乙胺(氮芥)、链脲霉素、环磷酰胺、carrnustine(BCNU)、环己亚硝脲(CCNU)、阿霉素(adriamycin)、阿霉素脂(doxil)、吉西他滨(gemzar)、柔红霉素、柔红霉素脂(daunoxome)、甲基苄肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊甙、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、长春花碱、长春新碱、争光霉素、紫杉醇(taxol)、多烯紫杉醇(taxotere)、阿地流津、天冬酰胺酶、二甲磺酸丁酯、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、CPT-11，10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)、甲氮咪胺、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、伊达比星、美司钠、α-干扰素、β-干扰素、伊立替康、二羟基蒽酮、托泊替堪、亮丙瑞林、甲地孕酮、左旋苯丙氨酸氮芥、硫基嘌呤、光辉霉素、邻对二氯苯二氯乙烷、培加帕酶、喷司他丁、哌泊溴烷、光辉霉素、链脲霉素、他莫昔芬、替尼泊甙、睾内酯、硫鸟嘌呤、三胺硫磷、尿嘧啶氮芥、维诺利宾、苯丁酸氮芥和它们的组合物。

本发明的ACL酶活性调节剂还可能用于治疗高胆固醇脂血症和/或高脂血症病人，并防止病情进一步发展成如动脉粥样硬化和胰腺炎，还可用于治疗代谢性疾病如肥胖症。

甚至治疗中度II型高胆固醇脂血症也能够减少冠心病的死亡率和发病率，这已被广泛认可。

血浆中低密度脂蛋白浓度升高是II型高胆固醇脂血症的标志，该症由很多遗传和环境的因素引起，这些因素导致LDL合成增加、LDL代谢减少或者两者都有。现今对高胆固醇脂血症的疗法是刺激LDL的代谢(胆酸螯合剂和HMG-CoA还原酶抑制剂)和抑制LDL的合成(烟酸和maxepa鱼油)。

本发明的化合物通过调节ACL酶活性而抑制胆固醇的合成和脂肪酸的合成，从而降低血浆胆固醇和甘油三酯的水平。因此，本发明提供使用ACL酶活性抑制剂在治疗中的用途，特别是在治疗混合型高脂血症(IIb型)中用来降低血清甘油三酯和胆固醇的水平。而且，预期本发明化合物的使用可能在防止病情进一步发展成如动脉粥样硬化和胰腺炎以及治疗代谢性疾病如肥胖症中有好的效果。

此外，本发明的化合物可以用于通过刺激脂肪氧化而促进脂肪消耗，因为通过抑制ACL酶活性可使到达细胞质的乙酰辅酶A很少，这就限制了丙二酸单酰辅酶A的获得，丙二酸单酰辅酶A是肉碱酯酰转移酶——线粒体中脂肪燃烧的必需酶——的抑制剂。低水平的丙二酸单酰辅酶A促进了脂肪酸的降解，因此，本发明的化合物能促进脂肪消耗。该效果可由下面的事实支持：肝脏中脂肪酸氧化的活化也倾向于刺激糖原异生，糖原异生转而补充肝脏中贮存的肝糖原并向大脑中枢发送饱满感信息。因此，本发明提供了ACL酶活性抑制剂的用途，以促进脂肪消耗和作为食欲抑制剂。

而且，本发明提供了本发明化合物的用途，用于治疗神经退行性疾病。比如，阿尔茨海默氏病是一组遗传异质型渐进性致死神经疾病，其特征是在病理上表现为在大脑中积累淀粉状斑块，在临床上为近记忆受损而导致痴呆和死亡。除了和遗传相关的阿尔茨海默氏病，还有一些没有明显家族病史的散发病例。比如，头部创伤后或刺激细胞因子白细胞介素-1产生的炎症疾病后会发生典型阿尔茨海默氏病的病理变化。该疾病早期症状是近记忆的丧失，伴随着可解释此早期近记忆受损的海马细胞受损和死亡。利用磁共振成像技术测定海马体积表明，在临床记忆缺失发作之前海马萎缩就已经开始，且在两年(症状在此期间首次出现)里进行性发展，海马体积每年减少大约8％。临床上诊断阿尔茨海默氏病就是以近记忆的损伤和颞页中海马部分的病变为依据的。

尽管家族性或散发性阿尔茨海默氏病是老龄人群中主要的痴呆症，但是也发现了其他类型的痴呆症。这些包括但不限于：伴随着Pick病的额颞的退化，血管性痴呆症、路易斯小体老年性痴呆症、引起额萎缩的帕金森老年痴呆症、进行性核上麻痹和皮质基底变性和阿尔茨海默氏病相关的唐氏综合症。在海绵状脑病如CJD、瘙痒病和BSE中也有斑块的形成。

除了淀粉样斑块，脑中乙酰胆碱水平的降低是阿尔茨海默氏病的另一个病理特征。用乙酰胆碱酯酶抑制剂治疗对症状有一定的改善，推测该抑制剂可能增加了在大脑边缘***前面部分中起源于隔核并穿过布罗卡斜角带而进入海马的胆碱能传出。

通过刺激ACL酶活性可能达到相同效果，因为形成乙酰胆碱所必需的乙酰辅酶A来自柠檬酸向乙酰辅酶A和草酰乙酸的酶转化。

由于观察到亚磷酸盐-硼烷化合物的消炎效果可能是和抑制细胞质脂肪酸和胆固醇的合成有关(US 5,143,907)，本发明因此还提供了本发明的化合物在治疗炎症中的用途。

根据本发明，非限制性的炎症例子有：急性肾小球肾炎、急性滑膜炎、成人呼吸窘迫综合症、动脉粥样硬化、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性溶血性贫血、支气管炎、恶病体质、结膜炎、伴有急性炎性成分的皮肤病、痛风性关节炎、移植物抗宿主疾病、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、血液透析、炎性肠病如局限性回肠炎和溃疡性结肠炎、胰岛素依赖型糖尿病、白细胞去除术、多发性硬化、重症肌无力、坏死性小肠结肠炎、器官/组织移植排斥、骨关节炎、皮炎、银屑病关节炎、牛皮癣、赖特尔综合症、反应性关节炎、Raynaud综合症、风湿热、风湿性关节炎、鼻炎、风疹性关节炎、***性红斑狼疮、创伤性关节炎、血管炎和眼色素层炎。

而且，本发明的化合物还可用于治疗低柠檬酸尿症，因为已证实慢性代谢酸中毒可提高肾皮质ACL的活性和蛋白丰度，且该酶的上调在低柠檬酸尿症的形成中起重要的作用。因此，本发明的化合物可用于治疗低柠檬酸尿症。

附图简述

图1：对底物ACL的hPHP依赖型去磷酸化；无和有hPHP的去磷酸化；道1：对照(无hPHP)，2：280纳克hPHP，3：210纳克hPHP，4：140纳克hPHP，5：70纳克hPHP，6：28纳克hPHP。该蛋白表观分子量为约120kDa，以hPHP浓度依赖型方式去磷酸化。

图2：鉴定ACL；左边：放射自显影(灰色斑点)后和考马斯亮蓝染色的凝胶电泳后的重叠图；1：分子标记，2：大鼠肝脏可溶提取物，3：部分纯化的ACL；右边：考马斯亮蓝染色的凝胶电泳；1：分子标记，2：大鼠肝脏可溶提取物。ACL用箭头指示。

实施例

实例1

hPHP底物的鉴定

为了鉴定脊椎动物hPHP1的底物，筛选了³²P标记的兔肝脏提取物。兔肝脏提取物根据出版的操作方案标记，以选择性的得到组氨酸残基磷酸化的蛋白质(FEBS Lett 1995；364，63-3)。这可通过用酸和碱处理印迹在PVDF膜上的蛋白质后放射自显影来证实。加入hPHP选择性导致蛋白质去磷酸化，该蛋白质在SDS胶上迁移到110K处。将hPHP底物蛋白分离后鉴定为ATP-柠檬酸裂合酶(ACL)。已知ACL在催化过程中在组氨酸764处自磷酸化。

实例2

PHP分析

制备磷酸化的磷酸酶底物cheA。用Sephadex G-50柱除去未掺入的[γ-³²P]ATP。将hPHP在含有0.6纳克[³²P]cheA(0.21皮摩尔[³²P]/毫升)，25毫摩尔/升pH7.5的TEA，10毫摩尔/升MgCl₂和0.1％β-巯基乙醇的40微升反应混合物中37℃孵育30分钟。加入10微升0.5摩尔/升EDTA和150微升甲醇/丙酮(1∶1)中止反应，于15,000g离心5分钟，上清液用于分析[³²P]含量。将PHP稀释以使磷酸的释放保持在线性范围(＜25％)。

包括110K的磷酸酶底物的兔肝脏可溶性提取物用上述方法磷酸化。15微升去磷酸化反应包括5-50纳克PHP，25毫摩尔/升pH7.5的TEA，0.1％β-巯基乙醇和60微克磷酸化的提取物。37℃，30分钟后通过加入样品缓冲液终止反应。反应产物通过10％SDS-PAGE后放射自显影分析。

实例3

hPHP的纯化及其底物

兔肝脏可溶性提取物用作起始物质。缓冲液A由20毫摩尔/升TEA，1毫摩尔/升EDTA，0.1％β-巯基乙醇，0.02％pH7.5的NaN₃(其中补充有NaCl或Mg²⁺)组成。缓冲液A用于除Blue Sepharose 6 Fast Flow过程(此时含有0.1毫摩尔/升EDTA(缓冲液B))外的所有纯化步骤中。

将提取物加到SOURCE 30Q上，用缓冲液A加0.2摩尔/升NaCl洗脱。含有hPHP活性的部分用90％(NH₄)₂SO₄浓缩后用HiLoad 26/60Superdex 75层析，所用缓冲液为缓冲液A。将11-21K的洗脱体积合并，调节到10毫摩尔/升Mg²⁺，加到用含10毫摩尔/升Mg²⁺的缓冲液B平衡过的Blue Sepharose上。用补加0.2M NaCl的缓冲液B洗脱hPHP。

按照已描述的方法(Hoffmann，G.E.等(1979)Hoppe-Seyler’sZ.Physiol.Chem.360，1445-51)用Source 30Q、Hiload 26/60 Superdex 200和MonoQ将ACL部分纯化。

实例4

抗组氨酸磷酸酶抗体

制备针对蛋白质不同区域的抗组氨酸磷酸酶抗体。用标准FMOC-化学合成肽。将每种肽注射(4次注射)到两只兔体内以进行免疫然后取四个血样。最后一次取血是大约3个月后。所制备的抗体对组氨酸磷酸酶的检测和定位很有用。

此外，可单独分析分子中不同区域。特别是对于组氨酸磷酸酶中含有下列氨基酸序列的高度保守的中间部分：

DCECLGGGRISHQSQD该保守区域被认为含有负责体内蛋白质功能的活性位点。针对这个区域的抗肽抗体有抑制或中和的作用。

Claims (9)

1.对磷酸组氨酸高度专一的具有蛋白质组氨酸磷酸酶(PHP)生物活性的多肽或同源变体的用途，用于调节ATP-柠檬酸裂合酶(EC 4.1.3.8)的活性。

2.根据权利要求1的多肽的用途，该多肽分子量为13,000-15,000。

3.根据权利要求1的多肽的用途，该多肽至少含有选自下面的氨基酸序列基元：

I)DCECLGGGRISHQSQDX¹KIHVYGYSMX²YGX³AQH

其中，X¹＝K或R，X²＝A或G，X³＝P或R或者

II)DCECLGGGRISHQSQD或

III)(M)AVADLALIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHSAPRSGAPAAESKEIVRGYKWA

    EYHADIYDKVSGDMQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSMAYGPAQH

    AISTEKIKAKYPDYEVTWANDGY

4.抗根据权利要求1到3任一项的具有蛋白质组氨酸磷酸酶活性的多肽的抗体或其片断的用途，用于调节ATP-柠檬酸裂合酶(EC 4.1.3.8)的活性。

5.和蛋白质组氨酸磷酸酶的mRNA互补的DNA序列，其至少具有下列序列之一

I)TACCGCCACC GCCTGGAGCG AGAGTAAGGA CTACACCTGT AGCTGAGGCT

  GCCGCAGAAG TTCATACACG ACTAGGCTCA GGTGAGCCGA GGGGCGAGGC

  CCCGAGGCCG ACGTCTCTCG TTCCTCTAGC ACGCGCCGAT GTTCACCCGA

  CTCATGGTAC GCCTGTAGAT GCTGTTTCAC AGCCCGCTGT ACGTCTTCGT

  TCCGACGCTG ACACTCACAG ACCCGCCGCC CGCGTAGAGG GTGGTCTCAG

   TCCTGTTCTT CTAAGTGCAC ATGCCGATAA  GGTACCGGAT ACCAGGACGG

   GTCGTGCGGT AAAGTTGACT CTTTTAGTTTC GGTTCATGGG GCTGATGCTC

   CAGTGGACCC GATTGCTGCC GATG

II) CTGACACTCA CAGACCCGCC GCCCGCGTAG AGGGTGGTCT CAGTCCTG

III)CTGACACTCA CAGACCCGCC GCCCGCGTAG AGGGTGGTCT CAGTCCTGTT

    CTTCTAAGTG CACATGCCGA TAAGGTACCG GATACCAGGA CGGGTCGTG

IV) ATGGTACGCC TGTAGATGCT GTTTCACAGC CCGCTGTACG TCTTCGTTCC

    GACGCTGACA CTCACAGACC CGCCGCCCGC GTAGAGGGTG GTCTCAGTCC

    TGTTCTTCTA AGTGCACATG CCGATAAGGT AC

6.根据权利要求5的DNA序列的用途，用于抑制蛋白质组氨酸磷酸酶的翻译，以及调节ATP-柠檬酸裂合酶(EC 4.1.3.8)的活性。

7.根据权利要求1到5之任一项的化合物的用途，用于生产治疗易受ATP-柠檬酸裂合酶(EC 4.1.3.8)活性调节影响的病理生理状况的药物。

8.根据权利要求7的化合物的用途，其中病理生理状况选自：高脂血症、高胆固醇血症、心血管疾病、肥胖症、炎症、肿瘤、中枢神经***疾病和低柠檬酸尿症。

9.根据权利要求1到5任何之一的化合物的用途，用于生产控制体重、促进脂肪消耗和抑制食欲的药物。

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