CN1491955A - 一种提取细菌mRNA的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的提取细菌mRNA的方法,该方法是先设计针对5S、16S和23S rRNA的保守序列寡核苷酸探针,并进行生物素标记,标记的探针加入到包被链霉亲和素的顺磁颗粒中,再加入细菌总RNA提取液,5S、16S和23SrRNA与探针特异性杂交,形成的复合体被结合在固相上,使mRNA留在液相中,分离吸附复合体,收集上清,进行核酸沉淀,洗涤,即得富集的mRNA。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取细菌mRNA的方法,具体讲是从总RNA当中提取mRNA的方法。
背景技术
目前对真核生物mRNA的提取方法,一般使用亲和层析法或磁捕获杂交法,但由于大多数细菌mRNA无polyA尾,以上两种方法对细菌mRNA提取不能奏效。Affymetrix公司曾建立了一种大肠杆菌mRNA的富集方法,但这种方法不能除去5S rRNA,且步骤繁琐,成本较高,用时较长。本发明针对上述方法的缺陷,发明了一种新的提取mRNA的方法。
发明内容
本发明目的是提供一种提取细菌mRNA的新方法。
本发明提取细菌mRNA的技术方案如下:
首先设计针对5S、16S和23S rRNA的保守序列寡核苷酸探针,并在合成探针时进行生物素标记。将生物素标记的探针加入到包被链霉亲和素的顺磁颗粒(SA-PMPs)中,通过生物素(biotin)与链霉亲和素(streptavidin)的亲和性结合,这些探针和磁珠结合在一起。洗去未结合的探针后,再加入一定量的细菌的总RNA溶液。总RNA溶液中的5S、16S和23S rRNA就和与磁珠结合的生物素标记的寡核苷酸探针特异性杂交,形成rRNA-SA-PMP复合体,被顺磁颗粒捕获,结合在固相上。这样,mRNA就留在液相中。然后,用一个磁分离架吸附复合体,收集上清,然后再进行核酸沉淀,洗涤,即得富集的mRNA。
细菌mRNA提取方法技术路线流程图如图1所示。
由于16S和23S rRNA的保守性,本发明方法具有广谱性,设计16S和23S rRNA的保守序列的探针,就可从多种细菌总RNA中提取mRNA,对一些G+和G-菌均适用。产量较高、时间较短、完整mRNA回收率高。纯化所得mRNA可用于RT-PCR反应、cDNA合成及生物芯片上的基因表达谱分析。
下面以鼠疫耶尔森氏菌为例,对本发明的方法进行更为具体地说明。
实验例1:鼠疫耶尔森氏菌总RNA的提取
实验材料:
鼠疫耶尔森氏菌EV76株;离心管;高速冷冻离心机;BECKMANDU-600紫外分光光度计;试剂及其他耗材等。
实验步骤:
第一步,核酸提取
1.取15mL离心管,加入1.25mL冰预冷苯酚/乙醇阻断液,加入
10mL过夜培养物;
2.4℃下8000rpm离心5min集菌,去尽上清;
3.加入800μL溶菌酶液,重悬沉淀,加入80μL10%SDS,混匀,
64℃水浴2min;
4.加入88μL1mol/L乙酸钠(pH5.2),混匀;
5.加入1mL水饱和苯酚,混匀,64℃水浴中6min,每40s颠倒10
次;
6.冰浴上迅速冷却,4℃下12000rpm离心20min;
7.取2个1.5mL离心管中,水相均分至其中,加入与水相等体积
的氯仿,颠倒10次,4℃下12000rpm离心10min;
8.取上清,分别加入1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2)和1mmol/L
EDTA,加入2.5倍体积的预冷无水乙醇,-80℃下20min。4
℃下12000rpm离心30min,小心移去乙醇。
9.加入1mL预冷的80%乙醇洗涤沉淀,4℃下12000rpm离心
10min,小心移去乙醇,温箱中干燥沉淀。
10.加入100μL DEPC处理的水,重悬沉淀,两管样品收集于一起。
第二步,除DNA
1.200μL的样品中,依次加入0.5μL的RNA酶抑制剂(40U/μ
L)、25μL的10×DNA酶I缓冲液、2μL的无RNA酶的DNA
酶I(5U/μL),37℃作用30min。
2.加入等体积的水饱和苯酚,颠倒10次,4℃下12000rpm离心
5min。
3.取水相,分别加入等体积的水饱和苯酚:氯仿,颠倒10次,4
℃下12000rpm离心5min。
4.取水相,加入等体积的氯仿,颠倒10次,4℃下12000rpm离
心5min。重复该步骤。
5.取水相,加入1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体
积的预冷无水乙醇,-70℃下放置1h。4℃下12000rpm离心
30min,小心移去乙醇。
6.加入1mL预冷的80%乙醇洗涤沉淀,4℃下12000rpm离心
10min,小心移去乙醇,温箱中干燥沉淀。
7.加入50μL的DEPC处理的水,重悬沉淀。-70℃贮存。
第三步,RNA定量和纯度检测
1.取2μL的RNA样品,用10mmol/LTris-HCl(pH7.0)进行100
倍稀释,测定A260值,按下式计算RNA样品的浓度:
RNA浓度(μg/μL)=A260×100×40÷1000
2.取2μL的RNA样品,用10mmol/LTris-HCl(pH7.5)进行100
倍稀释,测定A260和A280值,计算A260/A280值。
结果如下:
1)提取的总RNA绝对量为223.465μg,浓度为4.4693μg/
μL。
2)A260/A280值为2.1。
第四步,总RNA提取物的电泳鉴定
提取的总RNA在65℃变性5分钟,冰浴上冷却,然后在含甲醛的1.2%琼脂糖凝胶上5-7V/cm下电泳。
结果如图3所示:
可见两条明亮的条带,分别代表16S rRNA和23S rRNA。
通过上述实验,从A260/A280值和电泳结果看,本实验得到了纯净完整的总RNA。
实验例2 从鼠疫耶尔森氏菌总RNA中富集mRNA
实验材料:链霉亲和素磁珠和磁分离架(New England BioLabs Inc.生产);总RNA(由实验例1提取);探针(上海生工合成)。
实验步骤:
1、合成生物素标记的寡核苷酸探针
用Primer Premier 5.0设计鼠疫耶尔森氏菌5S、16S和23S rRNA的探针,分别设计了1条(5S)、3条(16S)、5条(23S),它们分别是CP-1,CP-2,CP-3,CP-4,CP-5,CP-6,CP-7,CP-8,CP-9。由发明人提供探针序列,委托上海生工合成生物素标记的寡核苷酸探针。本发明设计的寡核苷酸探针具体序列参见本说明书所附的序列表,其中CP-1,核苷酸序列号为SEQ No.1;CP-2,核苷酸序列号为SEQ No.2;CP-3,核苷酸序列号为SEQ No.3;CP-4,核苷酸序列号为SEQ No.4;CP-5,核苷酸序列号为SEQ No.5;CP-6,核苷酸序列号为SEQ No.6;CP-7,核苷酸序列号为SEQ No.7;CP-8,核苷酸序列号为SEQ No.8;CP-9,核苷酸序列号为SEQ No.9。
2、准备磁珠
1)于1.5mL离心管中加入250μL(1mg)的亲和素磁珠,将离心管
置于磁分离架上30s~1min,弃上清。
2)再加入200μL洗涤/结合缓冲液,悬起磁珠。将离心管置于磁分
离架上30s~1min,弃上清。重复该步骤。
3、结合生物素标记的捕获探针
1)将约1.08nmol生物素标记的捕获探针溶解于200μL的结合缓冲
液(0.5×SSC)中,90℃下变性5min,迅速冰浴3min。其中探
针浓度为0.6nmol/10μL,每种探针取2μL,9条探针共1.08nmol,
相比于磁珠的探针结合能力,探针过量1倍。
2)加入到含有磁珠的离心管中,悬浮磁珠,室温作用15min,并不
时用手摇动。
3)供应磁场,弃上清。
4)加入200μL的洗涤缓冲液(0.5×SSC),悬浮磁珠,供应磁场,弃
上清。
4、磁捕获杂交与富集mRNA
1)将20μg总RNA溶解在200μL的杂交液中(6×SSC;10mmol/L
Tris-HCl,pH7.5;1mmol/LEDTA)。
2)加入到预先准备好的磁珠中,悬浮磁珠,68℃水浴30min,并不
时用手摇动。
3)供应磁场,收集上清。用200μL的洗涤缓冲液(0.5×SSC)洗涤
磁珠,收集所有上清于一起。
4)加入1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的预冷
无水乙醇,-70℃放置1h。4℃下12000rpm离心30min,小心移
去乙醇。
5)用预冷的80%乙醇洗涤沉淀两次,温箱中干燥沉淀。
6)加入20μL DEPC处理的水,充分溶解沉淀。-70℃保存备用。
5、磁珠的活化
1)于磁珠中加入200μL的新鲜0.1mol/L NaOH,悬浮磁珠,20-25
℃下4min(不得超时,否则引起DNA的脱嘌呤化),供应磁场,
弃上清。要求操作迅速,否则引起DNA的脱嘌呤化。
2)加入200μL的洗脱缓冲液(10mmol/L Tris-HCl,pH7.5;1mmol/L
EDTA),悬浮磁珠,供应磁场,弃上清。重复此步骤。
3)加入200μL的洗涤缓冲液(0.5×SSC),悬浮磁珠,供应磁场,弃
上清。
4)加入200μL的洗涤缓冲液(0.5×SSC),悬浮磁珠,4℃下贮存备
用。
6、RNA定量
取4μL富集的mRNA,溶于76μLDEPC处理的水中(即进行20倍稀释),混匀。用分光光度计测其OD260值。
计算含量:RNA浓度(μg/μL)=A260×40÷1000×稀释倍数
结果:浓度=0.11μg/μL;总量=2.22μg。
即每20μg总RNA能除去17.78μg rRNA。
7、RNA电泳鉴定
将1μg总RNA和1μg富集mRNA同时电泳,结果如图4所示。从定量结果和电泳结果看:磁捕获杂交法适于细菌mRNA的提取和纯化。
实验例3:对富集的mRNA进行RT-PCR
实验目的:检验mRNA提取过程中有无降解
实验材料:引物(军科院八所合成);mRNA(实验例2获得);Marker(DL2000);反转录试剂盒(SuperScriptTM First-Strand SynthesisSystem for RT-PCR(Life Technologies生产)。
实验步骤:
1、设计引物
选择鼠疫耶尔森氏菌染色体上的6个基因,代码分别为YPO0085、YPO0216、YPO2394、YPO3516、YPO3750和YPO4128;其ORF长度分别为768bp、699bp、635bp、237bp、939bp、705bp。基因选择的原则是:
(1)现有培养条件下表达的基因
(2)表达丰度不同的基因
(3)片段大小不同的基因
然后,用Array Designer 2.0软件进行引物设计,引物设计原则是尽量扩增全长。引物序列参见所附序列表。设计的引物分别是YPO0085F,序列号为SEQ No.10;YPO0085R,序列号为SEQ No.11,扩增片段682bp;YPO0216F,序列号为SEQNo.12;YPO0216R,序列号为SEQ No.13,扩增片段635bp;YPO2394F,序列号为SEQNo.14;YPO2394R,序列号为SEQNo.15,扩增片段206bp;YPO3516F,序列号为SEQ No.16;YPO3516R,序列号为SEQ No.17,扩增片段908bp;YPO3750F,序列号为SEQNo.18;YPO3750R,序列号为SEQ No.19,扩增片段691bp;YPO4128F,序列号为SEQNo.20;YPO4128R,序列号为SEQNo.21,扩增片段340bp。
2、对富集的mRNA进行RT-PCR
选用SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Life Technologies)试剂盒,用我们设计的6对引物,对富集的mRNA按试剂盒说明书进行反转录,即cDNA第一链合成。同时,做了Control RNA和No RT-Control的对照。在做PCR时,每一反应管都做了阴性对照。
3、对RT-PCR产物进行电泳鉴定
结果是除了阴性对照(No RT-Control及PCR的阴性对照)没有条带外,其它均见明亮的条带。可见,RNA提取和mRNA富集过程中没有发生降解。电泳图片如图5所示。
实验例4:磁珠的重复利用实验
将富集过mRNA的磁珠活化后(活化方法见本发明实验例2)再用来富集mRNA,同时用一份新磁珠做对照。由于活化过程就是用0.1MNaOH将探针和rRNA之间的键打开,去除rRNA。这样,探针还留在亲和素标记的磁珠上。所以,用活化之后的磁珠不必再结合探针。实验材料:实验例2中用过并活化的磁珠(标记为旧磁珠)以及NewEngland BioLabs Inc.生产的新磁珠各一份;磁分离架;总RNA各用20μg。
实验方法:同前。
实验结果:旧磁珠富集总量为7.2315μg;新磁珠富集总量为6.5765μg。电泳结果如图6所示。其中1代表新磁珠富集的1μg mRNA;2代表旧磁珠富集的1μg mRNA;3代表1μg总RNA。
从上述实验的定量和电泳结果看,旧磁珠不如新磁珠效果好,但也能除去大部分rRNA。所以,旧磁珠能重复利用,尤其在大量提取mRNA时。
本发明的方法与现有技术相比,具有操作快速、简单、产量高、完整mRNA回收率高的优点。而且,不需要一些酶的反应,反应条件易于控制,成本较低。
现有技术当中用于真核生物mRNA提取的方法一般是亲和层析法和磁捕获杂交法。但由于细菌mRNA的自身的特点,大多数细菌mRNA无polyA尾,使得以上两种方法对细菌mRNA提取不能奏效。
Affymetrix公司建立的大肠杆菌mRNA的富集方法,为一系列酶的反应,这种方法不能除去5S rRNA,且步骤繁琐,成本较高,用时较长。
本发明设计的磁捕获杂交法提取mRNA的方法,结合了真核生物的mRNA的磁捕获杂交法快速、简单的优点以及从总RNA中去除rRNA从而获得mRNA的思路,由于16S和23S rRNA的保守性,这种方法具有广谱性,设计16S和23S rRNA的保守序列的探针,就可从多种细菌总RNA中提取mRNA,对一些G+和G-菌均适用。纯化所得mRNA可用于RT-PCR反应、cDNA合成及生物芯片上的基因表达谱分析。这将极大的促进原核生物的功能基因组学的研究。
附图说明
图1是细菌mRNA提取方法技术路线流程图;
图2是磁捕获杂交示意图,其中1代表磁珠,2代表亲和素,3代表生物素,4代表5′端生物素标记的探针;
图3是总RNA提取物的电泳图谱;
图4是将1μg总RNA和1μg富集mRNA同时电泳的图谱;
图5是对富集的mRNA进行RT-PCR,所得产物进行电泳鉴定的电泳图谱。
图6是对新磁珠富集的mRNA、旧磁珠富集的mRNA和总RNA进行电泳的图谱。
具体实施方式
实施例1大肠杆菌JM109株mRNA的提取
第一步,提取大肠杆菌JM109株总RNA。
取15mL离心管,加入1.25mL冰预冷苯酚/乙醇阻断液,加入10mL过夜培养物;4℃下8000rpm离心5分钟集菌,去尽上清;加入800μL溶菌酶液,重悬沉淀,加入80μL 10%SDS,混匀,64℃水浴2分钟;加入88μL 1mol/L乙酸钠(pH5.2),混匀;加入1mL水饱和苯酚,混匀,64℃水浴中6分钟,每40s颠倒10次;冰浴上迅速冷却,4℃下12000rpm离心20min;取2个1.5mL离心管中,水相均分至其中,加入与水相等体积的氯仿,颠倒10次,4℃下12000rpm离心10min;取上清,分别加入1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2)和1mmol/L EDTA,加入2.5倍体积的预冷无水乙醇,-80℃下20min。4℃下12000rpm离心30min,小心移去乙醇。加入1mL预冷的80%乙醇洗涤沉淀,4℃下12000rpm离心10min,小心移去乙醇,温箱中干燥沉淀。加入100μLDEPC处理的水,重悬沉淀,两管样品收集于一起。
200μL的样品中,依次加入0.5μL的RNA酶抑制剂(40U/μL)、25μL的10×DNA酶I缓冲液、2μL的无RNA酶的DNA酶I(5U/μL),37℃作用30分钟。加入等体积的水饱和苯酚,颠倒10次,4℃下12000rpm离心5分钟。取水相,分别加入等体积的水饱和苯酚:氯仿,颠倒10次,4℃下12000rpm离心5分钟。取水相,加入等体积的氯仿,颠倒10次,4℃下12000rpm离心5分钟。重复该步骤。取水相,加入1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的预冷无水乙醇,-70℃下放置1h。4℃下12000rpm离心30min,小心移去乙醇。加入1mL预冷的80%乙醇洗涤沉淀,4℃下12000rpm离心10min,小心移去乙醇,温箱中干燥沉淀。加入50μL的DEPC处理的水,重悬沉淀。-70℃贮存。
第二步,从大肠杆菌JM109株总RNA中富集mRNA
本实施例所用上述探针,仍然是委托上海生工合成。但是,通过BLAST发现,本发明设计的9条探针中,只有6条与大肠杆菌的rRNA同源。所以,本实施例只使用同源的6条探针。它们的代号和用量分别为:
16SrRNA探针:CP-2 2μL;CP-3 4μL;CP-6 4μL;
23SrRNA探针:CP-7 2μL;CP-8 4μL;CP-9 2μL。
共18μL,即1.08nmol。
这些探针的具体序列同前,即:CP-2,核苷酸序列号为SEQ No.2;CP-3,核苷酸序列号为SEQ No.3;CP-6,核苷酸序列号为SEQ No.6;CP-7,核苷酸序列号为SEQ No.7;CP-8,核苷酸序列号为SEQ No.8;CP-9,核苷酸序列号为SEQ No.9。
于1.5mL离心管中加入250μL(1mg)的亲和素磁珠,将离心管置于磁分离架(New England BioLabs Inc.生产)上30s~1min,弃上清。再加入200μL洗涤/结合缓冲液,悬起磁珠。将离心管置于磁分离架上30s~1min,弃上清。重复该步骤。
将约1.08nmol生物素标记的捕获探针溶解于200μL的结合缓冲液(0.5×SSC)中,90℃下变性5min,迅速冰浴3min。其中探针浓度为0.6nmol/10μL,每种探针取2μL,6条探针共1.08nmol,相比于磁珠的探针结合能力,探针过量1倍。加入到含有磁珠的离心管中,悬浮磁珠,室温作用15min,并不时用手摇动。供应磁场,弃上清。加入200μL的洗涤缓冲液(0.5×SSC),悬浮磁珠,供应磁场,弃上清。
将25μg总RNA溶解在200μL的杂交液中(6×SSC;10mmol/LTris-HCl,pH7.5;1mmol/LEDTA)。加入到预先准备好的磁珠中,悬浮磁珠,68℃水浴30min,并不时用手摇动。供应磁场,收集上清。用200μL的洗涤缓冲液(0.5×SSC)洗涤磁珠,收集所有上清于一起。加入1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的预冷无水乙醇,-70℃放置1h。4℃下12000rpm离心30min,小心移去乙醇。
用预冷的80%乙醇洗涤沉淀两次,温箱中干燥沉淀。加入20μL DEPC处理的水,充分溶解沉淀。-70℃保存备用,即得。富集mRNA的总量为6.5147μg。
序列表:
SEQ No.1:
5′-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTCGTTTCACTTCTGAGTTCGGCATGGGAT-3′
SEQ No.2:
5′-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGC-3′
SEQ No.3:
5′-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTCACATCTGACTTAACAAACCGCCTGCGT-3′
SEQ No.4:
5′-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTCCCACCATTACGTGCTGGCAACAAAG-3′
SEQ No.5:
5′-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTGCGACTTTCCAGACGCTTCCACTAACA-3′
SEQ No.6:
5′-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTCATTAGTCGGTTCGGTCCTCCAGTTAGTGT-3′
SEQ No.7:
5′-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTCAACATTAGTCGGTTCGGTCCTCCAGT-3′
SEQ No.8:
5′-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTCATTCGCACTTCTGATACCTCCAGCAAC-3′
SEQ No.9:
5′-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTATTCGCACTTCTGATACCTCCAGCAACCC-3′
SEQ No.10:
5′-ATGCGACATCCATTAGTTATG-3′
SEQ No.11:
5′-CAATATCTGGCTGAGTGAAC-3′
SEQ No.12:
5′-AAGTACATCCTAATGGTATTC-3′
SEQ No.13:
5′-GTTCAACAGCAGCCATAC-3′
SEQ No.14:
5′-TAATTCTGGCTTCTACAATGC-3
SEQ No.1 5:
5′-TTACTTCTTGTAAGCTTGAGC-3′
SEQ No.16:
5′-CCGCTGGTGGGATTGG-3′
SEQ No.17:
5′-AACGAACTTCTCACCTAACTC-3′
SEQ No.18:
5′-ATGGCTAAGCTGACCAAG-3′
SEQ No.19:
5′-CAGTCAGGCCGCTTTG-3′
SEQ No.20:
5′-ATGCCTGTATCCCTTTAC-3′
SEQ No.21:
5′-CAATCAGCACCGATAAATAG-3′
Claims (10)
1.一种提取细菌mRNA的方法,其特征在于该方法包括如下步骤:
首先,分别设计针对5S、16S和23S rRNA的保守序列寡核苷酸探针,并在合成探针时进行生物素标记;
然后,将生物素标记的探针加入到包裹着链霉亲和素的顺磁颗粒中,将探针和磁珠结合在一起;
再加入细菌总RNA溶液,其中的5S、16S和23S rRNA与磁珠结合的生物素标记的寡核苷酸探针特异性杂交,形成的复合体被顺磁颗粒捕获,结合在固定相上,使mRNA就留在液相中;
用一个磁分离架吸附复合体,收集上清,然后再进行核酸沉淀,洗涤,即得富集的mRNA。
2.根据权利要求1的方法,其特征在于将富集过mRNA的磁珠活化后,再用于以后富集mRNA的过程,不必再结合探针。
3.根据权利要求2的方法,其特征在于所说的磁珠活化过程是于磁珠中加入0.1mol/L NaOH,悬浮磁珠,供应磁场,弃上清。
4.根据权利要求1所说的方法,其特征在于所述的针对5S rRNA的探针是CP-1,核苷酸序列号为SEQ No.1。
5.根据权利要求1所说的方法,其特征在于所述的针对16S rRNA的探针是CP-2,CP-3,CP-4,核苷酸序列号分别为SEQ No.2、SEQNo.3和SEQ No.4。
6.根据权利要求1所说的方法,其特征在于所述的针对23S rRNA的探针是CP-5,CP-6,CP-7,CP-8,CP-9,核苷酸序列号分别为SEQ No.5、SEQ No.6、SEQ No.7、SEQ No.8和SEQ No.9。
7.根据权利要求1所说的方法,其特征在于所使用的探针是只针对16S和23S rRNA的保守序列寡核苷酸探针。
8.根据权利要求1所说的方法,其特征在于所说的细菌总RNA是从多种细菌中提取获得的。
9.根据权利要求1所说的方法,其特征在于所说的细菌总RNA是从鼠疫耶尔森氏菌中提取获得的。
10.根据权利要求1所说的方法,其特征在于所说的细菌总RNA是从大肠杆菌中提取获得的。
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