CN1465704A - 抑癌基因pinx1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诊断髓母细胞瘤等癌症的方法，它包括检测个体的PINX1基因、转录本和/或蛋白与正常相比是否存在变异，存在变异就表明该个体患髓母细胞瘤等癌症的可能性大于正常人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒，以及治疗癌症尤其是髓母细胞瘤的方法和药物组合物。

Description

抑癌基因PINX1及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程和医学领域。更具体地，本发明涉及利用抑癌基因PINX1基因及其编码产物诊断和治疗髓母细胞瘤等癌症的方法，以及含有PINX1基因和/或蛋白的药物组合物。

背景技术

髓母细胞瘤是儿童期颅内最常见的恶性肿瘤，发病率占脑瘤总数的五分之一。它不仅恶性程度高且极具侵犯性，易发生脊髓转移，患者长期存活率低，是严重人类生存的重要疾病。

细胞原癌基因的过度表达、抑癌基因的失活和DNA错配修复基因的缺陷是各种肿瘤、癌症发生和发展的重要原因。有所不同的是，众多研究显示原癌基因的活化、扩增和过表达在髓母细胞瘤中并不常见，而是多表现为以等位基因杂合性缺失(LOH)为特征的抑癌基因失活。

然而，迄今为止，尚没有揭示髓母细胞瘤产生和发展的确切原因，也没有揭示髓母细胞瘤与某种抑癌基因及其编码蛋白存在直接的相关性。此外，本领域也缺乏早期诊断髓母细胞瘤的有效方法以及除手术和放疗以外的治疗髓母细胞瘤的有效手段。

PINX1又称为PIN2相互作用蛋白1，它是一种已知蛋白，基本信息如下：

英文：Homo sapiens PIN2-interacting protein 1 PINX1(hepatocellular carcinoma-

related putative tumor suppressor)

NCBI：Contig：NT_008010

mRNA：Homo sapiens PIN2-interacting protein 1(PINX1)，mRNA

gi|16975485|ref|NM_017884.1|[6975485]

PINX1的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，ORF位于第90-1073位，编码一个全长328个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：2)。PINX1的其他信息可以从Http：//www.ncbi.nlm.nih.gov获得。

曾有研究表明，8号染色体短臂是许多癌症和肿瘤组织中发生杂合性缺失的热点区域，强烈提示此处存在着在各类肿瘤及癌症中发挥重要作用的抑癌基因。同时有报道说，定位于8P23区域的PIN2蛋白相互作用蛋白1(PINX1)可能与细胞端粒酶活力和细胞凋亡有关。但人们对于PINX1的功能还了解甚少，不知其与髓母细胞瘤等癌症的相关性。

因此，本领域迫切需要开发新的诊断和治疗髓母细胞瘤的有效方法，以及相关的治疗药物，诊断技术和试剂。

发明内容

本发明的一个目的就是提供一种新的诊断(尤其是早期诊断)髓母细胞瘤等癌症的方法及检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种新的治疗癌症，尤其是髓母细胞瘤的方法。

本发明的再一目的是提供一种治疗癌症，尤其是髓母细胞瘤的药物组合物。

在本发明的第一方面，提供了一种对个体的癌症，尤其是髓母细胞瘤易感性进行诊断的方法，它包括步骤：

检测该个体的PINX1基因、转录本和/或蛋白，并与正常的PINX1基因、转录本和/或蛋白相比较，

存在差异就表明该个体患癌症，尤其是患髓母细胞瘤的可能性高于正常人群。

较佳地，被检测的是PINX1的基因或转录本，并与正常PINX1核苷酸序列比较差异。更佳地，所述的差异选自：SEQ ID NO：1中第162位G162变为A162；SEQ ID NO：1中第367位C367变为T367。

在本发明的第二方面，提供了一种治疗癌症，尤其是髓母细胞瘤的方法，它包括步骤：给需要所述治疗的病人施用安全有效量的正常PINX1蛋白。较佳地，PINX1蛋白被局部施用于肿瘤组织。

在本发明的第三方面，提供了一种PINX1蛋白在制备药物组合物方面的的用途以及相应的药物组合物，它含有安全有效量的人PINX1蛋白以及药学上可接受的载体。较佳地，它是靶向药物。

在本发明的第四方面，提供了一种检测癌症，尤其是髓母细胞瘤的试剂盒，它包括特异性扩增PINX1基因或转录本的引物。较佳地，它还含有与突变部位结合的探针。

在本发明的第五方面，提供了一种检测人PINX1基因的单核苷酸多态性的方法，它包括步骤：(a)确定在人PINX1基因的SEQ ID NO：1所示序列的第162和367位的核苷酸；和(b)检测在所述位置是否存在选自下组的单核苷酸多态性G162→A162和C367→T367。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了PINX1基因中的序列变化，其中第162位G162变为A162；第367位C367变为T367。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现和证明了PIN2相互作用蛋白1(PINX1)是一抑癌基因，与髓母细胞瘤等癌症密切相关，它的改变将促进髓母细胞瘤和其它癌症的产生和发展，是导致癌症的直接原因之一。在此基础上完成了本发明。

通过对32例髓母细胞瘤标本和部分对照血样的研究，已发现多例体细胞PINX突变。进一步的研究表明，人PINX1与髓母细胞瘤密切相关，它的正常表达是抑制癌症特别是髓母细胞瘤发生和发展，维持正常生理状态的关键。根据蛋白同源性比较，人类PIN2相互作用蛋白1(PINX1)在物种间有较高保守性，作用重要。同时，表达研究显示，PINX1基因在人体许多重要组织中表达。因此人类PIN2相互作用蛋白1(PINX1)的突变是导致人类癌症特别是髓母细胞瘤的重要原因，根据此基因及其表达产物设计的药物和诊断治疗技术，可用于诊断和治疗人类髓母细胞瘤等癌症。

鉴于人类PINX1的变异是导致髓母细胞瘤的直接原因之一。因此，根据此基因及其表达产物设计的药物和诊断治疗技术，可用于诊断和治疗人类的癌症，尤其是髓母细胞瘤。

本发明的人PINX1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据PINX1的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

将PINX1编码序列***合适的表达载体，再转入宿主细胞，就可以分离出PINX1蛋白。

基于本发明的新发现，PINX1蛋白或多肽有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗PINX1蛋白功能低下或丧失所致的疾病(如各种肿瘤，尤其是髓母细胞瘤)，和用于筛选促进PINX1蛋白功能的物质，如抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人PINX1蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能刺激人PINX1蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对人PINX1 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人PINX1基因产物或片段。较佳地，指那些能与人PINX1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人PINX1蛋白的分子，也包括那些并不影响人PINX1蛋白功能的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人PINX1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人PINX1蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人PINX1蛋白功能的抗体以及不影响人PINX1蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人PINX1基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人PINX1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人PINX1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人PINX1蛋白。一种优选的抗PINX1抗体是不识别正常PINX1但识别突变PINX1(如SEQ ID NO：4)的抗体，或者识别正常PINX1但不识别突变PINX1的抗体。利用该抗体对正常和异常PINX1蛋白的特异性差异，可以方便地进行蛋白质水平的髓母细胞瘤易感性检测。

利用本发明PINX1蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与PINX1蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明PINX1蛋白可在施用(给药)给患者。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、皮下、或局部给药(包括瘤内给药)。较佳地是局部给药，例如瘤内给药。

正常的PINX1多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于髓母细胞瘤方面的治疗。在使用本发明PINX1蛋白时，还可同时使用其他***的药剂。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明PINX1蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如针剂、片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的PINX1蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人PINX1蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于PINX1蛋白的无表达或异常/无活性的PINX1蛋白的表达所致的细胞增殖异常。构建携带PINX1基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，etal.)。另外重组人PINX1基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织(如肿瘤组织)中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

本发明还涉及定量和定位检测人PINX1蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。

一种检测检测样品中是否存在PINX1蛋白的方法是利用PINX1蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与PINX1蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在PINX1蛋白。

PINX1蛋白的多聚核苷酸可用于PINX1蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，PINX1蛋白的多聚核苷酸可用于检测PINX1蛋白的表达与否或在疾病状态下PINX1蛋白的异常表达。如PINX1 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断PINX1蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达和基因诊断。用PINX1蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测PINX1蛋白的转录产物。

本发明还提供了一种检测人PINX1基因的单核苷酸多态性的方法，它包括步骤：(a)确定在人PINX1基因的SEQ ID NO：1所示序列的第162和367位的核苷酸；和(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性(SNP)。具体SNP例子包括G162→A162：C367→T367。

检测PINX1基因的突变也可用于诊断髓母细胞瘤。检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。PINX1蛋白突变的形式包括与正常野生型PINX1 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1确定PINX1突变是导致髓母细胞瘤的直接原因

1.1对象

收集32例髓母细胞瘤的石蜡包埋标本及部分患者外周血。

1.2病理检查

对患者病理组织石蜡切片进行苏木精-伊红染色，光镜下观察。所取组织片中80％以上为癌细胞。

1.3个体鉴定

利用6对微卫星多态标记对患者病理组织和外周血进行个体鉴定。患者病理组织和其外周血的基因分型完全一致。

1.4候选基因筛选及检测

经研究，将在8号染色体短臂上PIN2相互作用蛋白1(PINX1)定为一个重要的候选基因。该基因在脑等各种重要组织中表达。

用DNA抽提试剂盒(Qigen公司)从石蜡包埋的病理组织中抽提基因组DNA，将其作为模板。同时设计并合成了九对引物。这些引物覆盖了该基因所有外显子，内含子与外显子的边际，部分操作子的序列：

名称	序列(5′→3′)	SEQ ID NO：
			PINX1-1  正向引物	5′-CCTCTAGCCAATGAGCGAAT-3′	5
PINX1-1  反向引物	5′-CGAGCAGGACAATCAGAGC-3′	6
			PINX1-2  正向引物	5′-TGCCACATTATGAGGGAACA-3′	7
PINX1-2  反向引物	5′-AACAATTTTTGATTTGGGATCA-3′	8
			PINX1-3  正向引物	5′-TGAGTGCTAATTGATGCAGAGG-3′	9
PINX1-3  反向引物	5′-ACAGTGCCATGCATTCAAAG-3′	10
			PINX1-4  正向引物	5′-CCAGGAAGCCCCTTTTTAAT-3′	11
PINX1-4  反向引物	5′-TTTTAAATGCTCCCAACACAAA-3′	12
			PINX1-5  正向引物	5′-GCCTGGCCTGATCCATAGTA-3′	13
PINX1-5  反向引物	5′-CAGTCAATGCGAAGACTCCA-3′	14
			PINX1-6  正向引物	5′-TGAAAAAGTGGGTAGAAAGTCAG-3′	15
PINX1-6  反向引物	5′-CAAAAGCCAAACACCAGAAAA-3′	16
			PINX1-7A 正向引物	5′-CCGACCAGAAGGGAGAGAG-3′	17
PINX1-7A 反向引物	5′-GCTCTTCTTCTTGGCCACTC-3′	18

PINX1-7B 正向引物	5′-TCTGAGAGCCACGATTGAGA-3′	19
			PINX1-7B 反向引物	5′GCCACAGGTAAAGATGTGGAA-3′	20
PINX1-7C 正向引物	5′-TGAATCCAAGCTATTGCCTCT-3′	21
			PINX1-7C 反向引物	5′-AGGGAAGAAAAAGCTGCAAA-3′	22

利用这九对引物采用PCR扩增、直接测序的方法，对髓母细胞瘤病理标本进行PINX1基因突变检测。

经过对32例髓母细胞瘤病理组织和部分外周血DNA的PINX1基因测序，发现其中PINX1-2，PINX1-4两对引物检测到病理组织中PINX1基因与正常不同。全自动测序仪检测突变结果如下：

cgcacgtcct gattctcctg gagtctccag cccgcccagt ggccgcagtc acccaggtcc  60

agaggcggcg gtatcacagg ctctccgaca tgtctatgct ggctgaacgt cggcggaagc  120

agaagtgggc tgtggatcct cagaacactg cctggagtaa t Gacgattcc aagtttggcc  180

agcggatgct agagaagatg gggtggtcta aaggaaaggg tttaggggct caggagcacg  240

gagccacaga tcatattaaa gttcaagtga aaaataacca cctgggactc ggagctacca  300

tcaataatga agacaactgg attgcccatc aggatgattt taaccagctt ctggccgaac  360

tgaaca Cttg ccatgggcag gaaaccacag attcctcgga caagaaggaa aagaaatctt  420

ttagccttga ggaaaagtcc aaaatctcca aaaaccgtgt tcactatatg aaattcacaa  480

aagggaagga tctgtcatct cggagcaaaa cagatcttga ctgcattttt gggaaaagac  540

agagtaagaa gactcccgag ggcgatgcca gtccctccac tccagaggag aacgaaacca  600

cgacaaccag cgccttcacc atccaggagt actttgccaa gcggatggca gcactgaaga  660

acaagcccca ggttccagtt ccagggtctg acatttctga gacgcaggtg gaacgtaaaa  720

gggggaagaa aataaataaa gaggccacag gtaaagatgt ggaaagttac ctccagccta  780

aggccaagag gcacacggag ggaaagcccg agagggccga ggcccaggag cgagtggcca  840

agaagaagag cgcgccagca gaagagcagc tcagaggccc ctgctgggac cagagttcca  900

aggcctctgc tcaggatgca ggggaccatg tgcagccgcc tgagggccgg gacttcaccc  960

tgaagcccaa aaagaggaga gggaagaaaa agctgcaaaa accagtagag atagcagagg  1020

acgctacact agaagaaacg ctagtgaaaa agaagaagaa gaaagattcc aaatgaatcc  1080

ttcccagccg gggccttccg accactcagc tgtcagggca ctgcgggggc agacacctct  1140

ggcctgaagt cacagcagag ttcaccccag agcgcctggg cgcatcttgt ggcatgccca  1200

tgggctgccg agtcctgccc tctcgccaca tttcccccaa gttacattcc caggaggacc  1260

tttttaatgt tctcaatcgt ggctctcaga cacaaataaa tttttttgta aactctgaaa  1320

aaaaaaaaaa aa                                                      1332

(SEQ ID NO：1)

如上所示，正常人序列“…aatGacg…”在1例髓母细胞瘤病理组织中纯合变化为“…aatAacg…”，这一变化直接导致了其编码产物SEQ ID NO：2中第25位由天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)(外显子2，mRNA编码序列中第162位的G162→A162，见图1A)。

正常人序列“…acaCttg…”在1例髓母细胞瘤病理组织中纯合改变为“…acaTttg…”，这一变化直接导致了其编码产物SEQ ID NO：2中第93位由苏氨酸(T)变为异亮氨酸(I)(外显子4，mRNA编码序列中第367位的C367→T367，见图1B)。

含有G162→A162和C367→T367突变(SNP)的PINX1序列示于SEQ IDNO：3，其编码的突变蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：4。应指出，这些序列代表了含有G162→A162和/或C367→T367突变，以及含有Asp25→Asn25和/或Thr93→Ile93突变的序列。

此外，为了验证突变位点对髓母细胞瘤发生的特异性，随机检查了300个没有亲源关系的人在所述位点的情况，没有发现有任何突变。这说明所述位点的突变并非人群中的多态性所致，而是髓母细胞瘤的特异性突变位点。因此表明了PINX1与人类的髓母细胞瘤的发生密切相关，此基因及其编码产物可对人类的髓母细胞瘤起重要作用。

1.5 PINX1基因的等位基因杂合性缺失(LOH)

利用位于8P22位点的微卫星多态标记D8S1130对发生G162→A162突变的患者病理组织和外周血进行基因分型，发现等位基因杂合性缺失现象。此外，该患者病理标本PINX1基因外显子3的测序结果进一步证明了LOH的存在(见图1C)。

讨论

G162→A162的体细胞纯合性突变，使得PINX1蛋白在25位由天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)。在对三百个正常人的该序列比较中，均未发现此变化。结构预测表明该区域是PINX1蛋白的磷酸化位点，天冬氨酸到天冬酰胺的变化可能影响蛋白二级结构的正常形成。此外，经过与其它物种同源比较，该突变处的氨基酸有高度保守性，且位于关键的G-PATH边缘区域，提示25位的天冬氨酸是维持蛋白功能的基础。此外，该对样本8P22位点处微卫星多态标记D8S1130的基因分型显示在病理组织中存在等位基因的杂合性缺失(LOH)。病理样品PINX1基因外显子3的测序结果也进一步证实了LOH的出现。

PINX1 mRNA上C367→T367的纯合突变，直接导致了其编码产物93位点由苏氨酸(T)变为异亮氨酸(I)。该位点在小鼠中呈现保守性，在三百个正常人PINX1序列比较中也未出现相同变化，提示93位的苏氨酸对维持蛋白的功能起重要的作用。

总之，本发明首次公开了PIN2相互作用蛋白1(PINX1)与人类癌症特别是髓母细胞瘤的发生和发展密切相关，此基因及其编码产物对人类的癌症特别是髓母细胞瘤起重要作用。

此外，8号染色体短臂是许多癌症和肿瘤组织中发生杂合性缺失(LOH)的热点区域。这强烈提示此处存在着在各类肿瘤及癌症中发挥重要作用的抑癌基因。PINX1正是定位于该区域内。已有的研究表明，该基因与细胞端粒酶活力和细胞凋亡有关，暗示了其与癌症、肿瘤发生和发展的相关性。

本发明首次揭示了PINX1与髓母细胞瘤密切相关，它的改变将促进髓母细胞瘤的产生和发展。由于PINX1基因在心脏、脑、肾、肺、胃、肝、胰腺、***、卵巢、皮肤、子宫、食道、肌肉等众多人体重要组织中均有较高表达，广泛的表达范围从另一个侧面证实了该基因的重要性，并暗示PINX1的功能缺失是导致除髓母细胞瘤以外的多种癌症、肿瘤的直接原因之一。这些癌症包括(但并不限于)：胃癌、肺癌、肝癌、***癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌等。

实施例3

髓母细胞瘤诊断检测试剂盒的制备

制备一试剂盒，它含有：

名称	序列(5′→3′)	编号	浓度
				PINX1-2  正向引物	tgccacattatgagggaaca	SEQ ID NO：7	干粉20D
PINX1-2  反向引物	aacaatttttgatttgggatca	SEQ ID NO：8	干粉20D
				扩增片段长度：504bp，检测突变G162→A162
PINX1-4  正向引物	ccaggaagcccctttttaat	SEQ ID NO：11	干粉20D
				PINX1-4  反向引物	ttttaaatgctcccaacacaaa	SEQ ID NO：12	干粉20D
扩增片段长度：520bp，检测C367→T367突变
				PCR反应液	含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液
PCR产物纯化盒	含小量PCR产物纯化的溶液，DNA吸附柱
				测序反应液	含Big Dye

抽取待检测病人的血液3ml或肿瘤组织20-30mg，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液或组织中提取DNA。将髓母细胞瘤检测试剂盒中的PCR引物稀释到1μmol/μl，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。使用检测试剂盒所提供的PRC产物纯化盒对PCR产物进行纯化。将纯化的产物进行测序反应后直接进行测序。观测所得到的扩增序列是否存在点突变G162→A162和/或C367→T367。

实施例4

药物组合物的制备

将PINX1所编码的正常蛋白与常规的医用缓冲液溶液一起配制成针剂，其中PINX1蛋白含量为0.5％。该针剂可补充病灶处的PINX1编码蛋白，使病人的生理状况得到改善，从而达到治疗的目的。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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                   序列表<110>中国科学院上海生物工程研究中心<120>抑癌基因PINX1及其应用<130>023583<160>22<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1332<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(90)..(1073)<223><400>1cgcacgtcct gattctcctg gagtctccag cccgcccagt ggccgcagtc acccaggtcc      60agaggcggcg gtatcacagg ctctccgac atg tct atg ctg gct gaa cgt cgg       113

                            Met Ser Met Leu Ala Glu Arg Arg

                            1               5cgg aag cag aag tgg gct gtg gat cct cag aac act gcc tgg agt aat       161Arg Lys Gln Lys Trp Ala Val Asp Pro Gln Asn Thr Ala Trp Ser Asn

10                  15                  20gac gat tcc aag ttt ggc cag cgg atg cta gag aag atg ggg tgg tct       209Asp Asp Ser Lys Phe Gly Gln Arg Met Leu Glu Lys Met Gly Trp Ser25                  30                  35                  40aaa gga aag ggt tta ggg gct cag gag cac gga gcc aca gat cat att       257Lys Gly Lys Gly Leu Gly Ala Gln Glu His Gly Ala Thr Asp His Ile

            45                  50                  55aaa gtt caa gtg aaa aat aac cac ctg gga ctc gga gct acc atc aat       305Lys Val Gln Val Lys Asn Asn His Leu Gly Leu Gly Ala Thr Ile Asn

        60                  65                  70aat gaa gac aac tgg att gcc cat cag gat gat ttt aac cag ctt ctg       353Asn Glu Asp Asn Trp Ile Ala His Gln Asp Asp Phe Asn Gln Leu Leu

    75                  80                  85gcc gaa ctg aac act tgc cat ggg cag gaa acc aca gat tcc tcg gac       401Ala Glu Leu Asn Thr Cys His Gly Gln Glu Thr Thr Asp Ser Ser Asp

90                  95                  100aag aag gaa aag aaa tct ttt agc ctt gag gaa aag tcc aaa atc tcc      449Lys Lys Glu Lys Lys Ser Phe Ser Leu Glu Glu Lys Ser Lys Ile Ser105                 110                 115                 120aaa aac cgt gtt cac tat atg aaa ttc aca aaa ggg aag gat ctg tca      497Lys Asn Arg Val His Tyr Met Lys Phe Thr Lys Gly Lys Asp Leu Ser

            125                 130                 135tct cgg agc aaa aca gat ctt gac tgc att ttt ggg aaa aga cag agt      545Ser Arg Ser Lys Thr Asp Leu Asp Cys Ile Phe Gly Lys Arg Gln Ser

        140                 145                 150aag aag act ccc gag ggc gat gcc agt ccc tcc act cca gag gag aac      593Lys Lys Thr Pro Glu Gly Asp Ala Ser Pro Ser Thr Pro Glu Glu Asn

    155                 160                 165gaa acc acg aca acc agc gcc ttc acc atc cag gag tac ttt gcc aag      641Glu Thr Thr Thr Thr Ser Ala Phe Thr Ile Gln Glu Tyr Phe Ala Lys

170                 175                 180cgg atg gca gca ctg aag aac aag ccc cag gtt cca gtt cca ggg tct      689Arg Met Ala Ala Leu Lys Asn Lys Pro Gln Val Pro Val Pro Gly Ser185                 190                 195                 200gac att tct gag acg cag gtg gaa cgt aaa agg ggg aag aaa ata aat      737Asp Ile Ser Glu Thr Gln Val Glu Arg Lys Arg Gly Lys Lys Ile Asn

            205                 210                 215aaa gag gcc aca ggt aaa gat gtg gaa agt tac ctc cag cct aag gcc      785Lys Glu Ala Thr Gly Lys Asp Val Glu Ser Tyr Leu Gln Pro Lys Ala

        220                 225                 230aag agg cac acg gag gga aag ccc gag agg gcc gag gcc cag gag cga      833Lys Arg His Thr Glu Gly Lys Pro Glu Arg Ala Glu Ala Gln Glu Arg

    235                 240                 245gtg gcc aag aag aag agc gcg cca gca gaa gag cag ctc aga ggc ccc      881Val Ala Lys Lys Lys Ser Ala Pro Ala Glu Glu Gln Leu Arg Gly Pro

250                 255                 260tgc tgg gac cag agt tcc aag gcc tct gct cag gat gca ggg gac cat      929Cys Trp Asp Gln Ser Ser Lys Ala Ser Ala Gln Asp Ala Gly Asp His265                 270                 275                 280gtg cag ccg cct gag ggc cgg gac ttc acc ctg aag ccc aaa aag agg      977Val Gln Pro Pro Glu Gly Arg Asp Phe Thr Leu Lys Pro Lys Lys Arg

            285                 290                 295aga ggg aag aaa aag ctg caa aaa cca gta gag ata gca gag gac gct     1025Arg Gly Lys Lys Lys Leu Gln Lys Pro Val Glu Ile Ala Glu Asp Ala

        300                 305                 310aca cta gaa gaa acg cta gtg aaa aag aag aag aag aaa gat tcc aaa     1073Thr Leu Glu Glu Thr Leu Val Lys Lys Lys Lys Lys Lys Asp Ser Lys

    315                 320                 325tgaatccttc ccagccgggg ccttccgacc actcagctgt cagggcactg cgggggcaga   1133cacctctggc ctgaagtcac agcagagttc accccagagc gcctgggcgc atcttgtggc   1193atgcccatgg gctgccgagt cctgccctct cgccacattt cccccaagtt acattcccag   1253gaggaccttt ttaatgttct caatcgtggc tctcagacac aaataaattt ttttgtaaac   1313tctgaaaaaa aaaaaaaaa                                                1332<210>2<21l>328<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Ser Met Leu Ala Glu Arg Arg Arg Lys Gln Lys Trp Ala Val Asp1               5                   10                  15Pro Gln Asn Thr Ala Trp Ser Asn Asp Asp Ser Lys Phe Gly Gln Arg

        20                  25                  30Met Leu Glu Lys Met Gly Trp Ser Lys Gly Lys Gly Leu Gly Ala Gln

    35                  40                  45Glu His Gly Ala Thr Asp His Ile Lys Val Gln Val Lys Asn Asn His

50                  55                  60Leu Gly Leu Gly Ala Thr Ile Asn Asn Glu Asp Asn Trp Ile Ala His65                  70                  75                  80Gln Asp Asp Phe Asn Gln Leu Leu Ala Glu Leu Asn Thr Cys His Gly

            85                  90                  95Gln Glu Thr Thr Asp Ser Ser Asp Lys Lys Glu Lys Lys Ser Phe Ser

        100                 105                 110Leu Glu Glu Lys Ser Lys Ile Ser Lys Asn Arg Val His Tyr Met Lys

    115                 120                 125Phe Thr Lys Gly Lys Asp Leu Ser Ser Arg Ser Lys Thr Asp Leu Asp

130                 135                 140Cys Ile Phe Gly Lys Arg Gln Ser Lys Lys Thr Pro Glu Gly Asp Ala145                 150                 155                 160Ser Pro Ser Thr Pro Glu Glu Asn Glu Thr Thr Thr Thr Ser Ala Phe

            165                 170                 175Thr Ile Gln Glu Tyr Phe Ala Lys Arg Met Ala Ala Leu Lys Asn Lys

        180                 185                 190Pro Gln Val Pro Val Pro Gly Ser Asp Ile Ser Glu Thr Gln Val Glu

    195                 200                 205Arg Lys Arg Gly Lys Lys Ile Asn Lys Glu Ala Thr Gly Lys Asp Val

210                 215                 220Glu Ser Tyr Leu Gln Pro Lys Ala Lys Arg His Thr Glu Gly Lys Pro225                 230                 235                 240Glu Arg Ala Glu Ala Gln Glu Arg Val Ala Lys Lys Lys Ser Ala Pro

            245                 250                 255Ala Glu Glu Gln Leu Arg Gly Pro Cys Trp Asp Gln Ser Ser Lys Ala

        260                 265                 270Ser Ala Gln Asp Ala Gly Asp His Val Gln Pro Pro Glu Gly Arg Asp

    275                 280                 285Phe Thr Leu Lys Pro Lys Lys Arg Arg Gly Lys Lys Lys Leu Gln Lys

290                 295                 300Pro Val Glu Ile Ala Glu Asp Ala Thr Leu Glu Glu Thr Leu Val Lys305                 310                 315                 320Lys Lys Lys Lys Lys Asp Ser Lys

            325<210>3<211>1332<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(90)..(1073)<223><400>3cgcacgtcct gattctcctg gagtctccag cccgcccagt ggccgcagtc acccaggtcc     60agaggcggcg gtatcacagg ctctccgac atg tct atg ctg gct gaa cgt cgg      113

                            Met Ser Met Leu Ala Glu Arg Arg

                            1               5cgg aag cag aag tgg gct gtg gat cct cag aac act gcc tgg agt aat      161Arg Lys Gln Lys Trp Ala Val Asp Pro Gln Asn Thr Ala Trp Set Asn

10                  15                  20aac gat tcc aag ttt ggc cag cgg atg cta gag aag atg ggg tgg tct      209Asn Asp Ser Lys Phe Gly Gln Arg Met Leu Glu Lys Met Gly Trp Ser25                  30                  35                  40aaa gga aag ggt tta ggg gct cag gag cac gga gcc aca gat cat att      257Lys Gly Lys Gly Leu Gly Ala Gln Glu His Gly Ala Thr Asp His Ile

            45                  50                  55aaa gtt caa gtg aaa aat aac cac ctg gga crc gga gct acc atc aat      305Lys Val Gln Val Lys Asn Ash His Leu Gly Leu Gly Ala Thr Ile Asn

        60                  65                  70aat gaa gac aac tgg att gcc cat cag gat gat ttt aac cag ctt ctg      353Asn Glu Asp Asn Trp Ile Ala His Gln Asp Asp Phe Asn Gln Leu Leu

    75                  80                  85gcc gaa ctg aac att tgc cat ggg cag gaa acc aca gat tcc tcg gac      401Ala Glu Leu Asn Ile Cys His Gly Gln Glu Thr Thr Asp Set Ser Asp

90                  95                  100aag aag gaa aag aaa tct ttt agc ctt gag gaa aag tcc aaa arc tcc      449Lys Lys Glu Lys Lys Ser Phe Ser Leu Glu Glu Lys Ser Lys Ile Ser105                 110                 115                 120aaa aac cgt gtt cac tat atg aaa ttc aca aaa ggg aag gat ctg tca      497Lys Asn Arg Val His Tyr Met Lys Phe Thr Lys Gly Lys Asp Leu Ser

            125                 130                 135tct cgg agc aaa aca gat ctt gac tgc att ttt ggg aaa aga cag agt      545Ser Arg Ser Lys Thr Asp Leu Asp Cys Ile Phe Gly Lys Arg Gln Ser

        140                 145                 150aag aag act ccc gag ggc gat gcc agt ccc tcc act cca gag gag aac      593Lys Lys Thr Pro Glu Gly Asp Ala Ser Pro Ser Thr Pro Glu Glu Asn

    155                 160                 165gaa acc acg aca acc agc gcc ttc acc atc cag gag tac ttt gcc aag      641Glu Thr Thr Thr Thr Ser Ala Phe Thr Ile Gln Glu Tyr Phe Ala Lys

170                 175                 180cgg atg gca gca ctg aag aac aag ccc cag gtt cca gtt cca ggg tct      689Arg Met Ala Ala Leu Lys Asn Lys Pro Gln Val Pro Val Pro Gly Ser185                 190                 195                 200gac att tct gag acg cag gtg gaa cgt aaa agg ggg aag aaa ata aat      737Asp Ile Ser Glu Thr Gln Val Glu Arg Lys Arg Gly Lys Lys Ile Asn

            205                 210                 215aaa gag gcc aca ggt aaa gat gtg gaa agt tac ctc cag cct aag gcc      785Lys Glu Ala Thr Gly Lys Asp Val Glu Ser Tyr Leu Gln Pro Lys Ala

        220                 225                 230aag agg cac acg gag gga aag ccc gag agg gcc gag gcc cag gag cga      833Lys Arg His Thr Glu Gly Lys Pro Glu Arg Ala Glu Ala Gln Glu Arg

    235                 240                 245gtg gcc aag aag aag agc gcg cca gca gaa gag cag ctc aga ggc ccc      881Val Ala Lys Lys Lys Ser Ala Pro Ala Glu Glu Gln Leu Arg Gly Pro

250                 255                 260tgc tgg gac cag agt tcc aag gcc tct gct cag gat gca ggg gac cat      929Cys Trp Asp Gln Ser Ser Lys Ala Ser Ala Gln Asp Ala Gly Asp His265                 270                 275                 280gtg cag ccg cct gag ggc cgg gac ttc acc ctg aag ccc aaa aag agg      977Val Gln Pro Pro Glu Gly Arg Asp Phe Thr Leu Lys Pro Lys Lys Arg

            285                 290                 295aga ggg aag aaa aag ctg caa aaa cca gta gag ata gca gag gac gct     1025Arg Gly Lys Lys Lys Leu Gln Lys Pro Val Glu Ile Ala Glu Asp Ala

        300                 305                 310aca cta gaa gaa acg cta gtg aaa aag aag aag aag aaa gat tcc aaa     1073Thr Leu Glu Glu Thr Leu Val Lys Lys Lys Lys Lys Lys Asp Ser Lys

    315                 320                 325tgaatccttc ccagccgggg ccttccgacc actcagctgt cagggcactg cgggggcaga   1133cacctctggc ctgaagtcac agcagagttc accccagagc gcctgggcgc atcttgtggc   1193atgcccatgg gctgccgagt cctgccctct cgccacattt cccccaagtt acattcccag   1253gaggaccttt ttaatgttct caatcgtggc tctcagacac aaataaattt ttttgtaaac   1313tctgaaaaaa aaaaaaaaa                                                1332<210>4<211>328<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Met Ser Met Leu Ala Glu Arg Arg Arg Lys Gln Lys Trp Ala Val Asp1               5                   10                  15Pro Gln Asn Thr Ala Trp Ser Asn Asn Asp Ser Lys Phe Gly Gln Arg

        20                  25                  30Met Leu Glu Lys Met Gly Trp Ser Lys Gly Lys Gly Leu Gly Ala Gln

    35                  40                  45Glu His Gly Ala Thr Asp His Ile Lys Val Gln Val Lys Asn Asn His

50                  55                  60Leu Gly Leu Gly Ala Thr Ile Asn Asn Glu Asp Asn Trp Ile Ala His65                  70                  75                  80Gln Asp Asp Phe Asn Gln Leu Leu Ala Glu Leu Asn Ile Cys His Gly

            85                  90                  95Gln Glu Thr Thr Asp Ser Ser Asp Lys Lys Glu Lys Lys Ser Phe Ser

        100                 105                 110Leu Glu Glu Lys Ser Lys Ile Ser Lys Asn Arg Val His Tyr Met Lys

    115                 120                 125Phe Thr Lys Gly Lys Asp Leu Ser Ser Arg Ser Lys Thr Asp Leu Asp

130                 135                 140Cys Ile Phe Gly Lys Arg Gln Ser Lys Lys Thr Pro Glu Gly Asp Ala145                 150                 155                 160Ser Pro Ser Thr Pro Glu Glu Asn Glu Thr Thr Thr Thr Ser Ala Phe

            165                 170                 175Thr Ile Gln Glu Tyr Phe Ala Lys Arg Met Ala Ala Leu Lys Asn Lys

        180                 185                 190Pro Gln Val Pro Val Pro Gly Ser Asp Ile Ser Glu Thr Gln Val Glu

    195                 200                 205Arg Lys Arg Gly Lys Lys Ile Asn Lys Glu Ala Thr Gly Lys Asp Val

210                 215                 220Glu Ser Tyr Leu Gln Pro Lys Ala Lys Arg His Thr Glu Gly Lys Pro225                 230                 235                 240Glu Arg Ala Glu Ala Gln Glu Arg Val Ala Lys Lys Lys Ser Ala Pro

            245                 250                 255Ala Glu Glu Gln Leu Arg Gly Pro Cys Trp Asp Gln Ser Ser Lys Ala

        260                 265                 270Ser Ala Gln Asp Ala Gly Asp His Val Gln Pro Pro Glu Gly Arg Asp

    275                 280                 285Phe Thr Leu Lys Pro Lys Lys Arg Arg Gly Lys Lys Lys Leu Gln Lys

290                 295                 300Pro Val Glu Ile Ala Glu Asp Ala Thr Leu Glu Glu Thr Leu Val Lys305                 310                 315                 320Lys Lys Lys Lys Lys Asp Ser Lys

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Claims (10)

1.一种对个体的癌症易感性进行诊断的方法，其特征在于，它包括步骤：

检测该个体的PINX1基因、转录本和/或蛋白，并与正常的PINX1基因、转录本和/或蛋白相比较，

存在差异就表明该个体患癌症的可能性高于正常人群。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的癌症是髓母细胞瘤，且检测的是PINX1的基因或转录本，并与正常PINX1核苷酸序列比较差异。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的差异选自下组：

    SEQ ID NO：1中第162位G162变为A162；和

    SEQ ID NO：1中第367位C367变为T367。

4.一种治疗癌症的方法，其特征在于，包括步骤：给需要所述治疗的病人施用安全有效量的正常PINX1蛋白，或者将正常的PINX1基因靶向导入肿瘤组织，使其在肿瘤细胞中表达。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的癌症是髓母细胞瘤，且所述的PINX1蛋白被施用于肿瘤组织。

6.一种药物组合物，其特征在于，它含有有效量的PINX1蛋白和药学上可接受的载体。

7.一种检测癌症的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增PINX1基因或转录本的引物。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的癌症是髓母细胞瘤，且所述试剂盒还含有与突变部位结合的探针。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的突变选自：

    SEQ ID NO：1中第162位G162变为A162；

    SEQ ID NO：1中第367位C367变为T367。

10.一种检测人PINX1基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，它包括步骤：

(a)确定在人PINX1基因的SEQ ID NO：1所示序列的第162和367位的核苷酸；和

(b)检测在所述位置是否存在选自下组的单核苷酸多态性G162→A162和C367→T367。

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