CN1461345A - 用原卟啉原氧化酶基因增加农作物产量或单产的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过加强光合作用的效率，来增加农作物产量或单位面积内的数量的一种方法，其中包括用含有原卟啉原氧化酶(Protox)基因的载体转化一种宿主农作物。

Description

用原卟啉原氧化酶基因增加农作物产量或单产的方法
                      技术领域
本发明涉及应用原卟啉原氧化酶(在下文中，称之为“Protox”)基因增加农作物产量和单位面积数量的方法。更准确地说，本发明涉及到，通过增强农作物、重组载体和重组载体-宿主农作物***的光合作用能力和应用重组载体和重组载体-宿主农作物***，应用含有Protox基因的重组载体转化一种宿主农作物来增加农作物的产量和单位面积数量的方法。
                     背景技术
Protox催化原卟啉原IX氧化成原卟啉IX，是亚铁血红素和叶绿素生物合成过程中最常见的酶。叶绿素在光合作用中是光收获色素，是与光合作用的能力和最终产量有关的必需因素。迄今，已经做过很多努力来增加农作物的产量，如通过增加光合作用的效率，也就是为了增加光合作用的能力加大二氧化碳的浓度[Malano et al.，1994；Jilta et al.，1997]，卟啉途径前体δ-氨基乙酰丙酸的叶状喷溅增强了叶绿体生物合成，从而增加农作物产量[Hotta et al.，1997]，以及编码光敏色素的基因的操作，来增强光合作用的效率[Clough et al.，1995；Thile et al.，Plant Physiol.1999]。然而，由于这些尝试需要昂贵的费用和劳动力，以及可能存在未预料到的抑制农作物生长的副作用，而使得尚没有商业化。
到目前为止，自埃希氏大肠杆菌、酵母菌、人类和植物中，克隆和检定出的有12个Protox基因，其中每一种基因在不同的有机体中共享的氨基酸特性较低，但是，在相近的家簇之间却有很高的同源性[Dailey et al.，1996；Lermontova et al.，1997；Corrigall et al.，1998]。
尽管枯草杆菌(Bacillus subtilis)的Protox与具有一种黄素和利用分子氧作为一种电子受体的真核生物的酶有相似的动力学特性，但是它能够氧化多种底物，例如原卟啉原IX和粪卟啉原III。因为枯草杆菌Protox与真核生物Protox相比具有较少的底物特异性，所以当枯草杆菌Protox转化入植物时，能够应用底物催化植物的卟啉途径的反应[Dailey et al.，1994]。
通过强调对杂草控制和给农作物选择除草剂来研究Protox酶[Matringe et al.，1989；Choi et al.，1998；U.S.Patent No.5,767,373(June16，1998)；U.S.Patent No.5,939,602(August 17，1999)]。然而，并没有讨论与刺激植物生长有关的Protoxo。
                       发明内容
为确定是否植物细胞液或质体中存在枯草杆菌Protox基因的最佳表达，激发导致叶绿素和光敏色素生物合成增强的卟啉路径，并从而增加农作物的光合作用的能力，本发明的发明者通过农杆菌介导的转化，研制了表达枯草杆菌Protox基因的转基因稻米，并且在T0、T1和T2代检查了它们的生长特性。结果，发明者发现，转基因稻米的产量和单位面积内的数量由于载体-宿主植物***而大量增加，并且完成了本发明。
因此，本发明的一种目的就是提供一种通过增强农作物的光合作用的能力，用含Protox基因、最好是枯草杆菌Protox基因的一种重组载体，来转化一种宿主农作物，来增加农作物的产量和单位面积内的数量的方法。本发明也包括重组载体、重组载体宿主农作物***，和重组载体及其重组载体-宿主农作物***的应用。
首先，本发明提供了用一种含有Protox基因的重组载体转化一种宿主农作物，来增加农作物的产量和单位面积内的数量的方法。在此方法中，上述的基因最好是一种原核生物的基因，最好是一种来自杆菌或肠道细菌的基因。另外，最好的是，上述的重组载体具有泛素启动子并且靶到一种宿主植物的细胞液或质体。
第二，本发明提供了一种包含Protox基因、泛素启动子和潮霉素磷酸转移酶可选择标记物的重组载体。上述的Protox基因最好是从枯草杆菌中分离出来的。
第三，本发明提供了用上述重组载体转化的一种土壤杆菌属瘤(A.tumefaciens)，尤其是一种土壤杆菌属瘤LBA4404/pGAl611：C(KCTC0692BP)或一种土壤杆菌属瘤LBA4404/pGAl611：P(KCTC0693BP)。
第四，本发明提供了用上述土壤杆菌属瘤转化的一种植物细胞。这种植物细胞可能是一种单子叶植物，例如大麦、玉米、小麦、黑麦、燕麦、草皮草、甘蔗、小米、黑麦草、果园草，以及稻米或是一种双子叶植物，例如大豆、烟草、含油种子油菜、棉花和马铃薯。
第五，本发明提供了由上述植物细胞改建的一种植物。
第六，本发明提供了由上述植物收获的一种植物种子。
下文中将要描述T0、T1和T2代中表达一种枯草杆菌Protox基因的转基因植物的研制。然而，本发明并不限于特定的植物(例如，稻米、大麦、小麦、黑麦草、大豆和马铃薯)。该技术领域的专家将会欣赏，本发明不仅适用于其它的单子叶植物(例如，玉米、黑麦、燕麦、草皮草、甘蔗、小米、果园草等)，而且也适用于其它的双子叶植物(例如，烟草、含油种子油菜、棉花等)。因此，应该理解应用本发明的重组载体-宿主农作物***的任何转基因植物，都位于本发明的范围内。
在下文中，将更详细地描述本发明。
通过土壤杆菌介导的转化作用表达枯草杆菌Protox基因的转基因稻米植物，是由耐潮霉素的胼胝体改建的。
在转基因稻米的T0、T1和T2代中，应用DNA、RNA、Westem杂交及其它生物化学的分析，调查枯草杆菌Protox基因整合入植物基因组，以及其在细胞液或质体和遗传中的表达情况。
在本发明中，尽管可以应用来自肠道细菌如埃希氏大肠杆菌的Protox基因，但最好选用来自杆菌的Protox基因作为基因的来源。另外，最好选用具有泛素启动子的重组载体。因为枯草杆菌的Protox与真核生物的Protox有相似的底物特异性，并且据悉来自密码子用法与植物基因大不相同的微小动植物的基因表达很低[Cheng et al.，1998]，由于枯草杆菌Protox基因与植物基因的密码子用法不同，植物中枯草杆菌Protox基因的表达应该是低的，人们普遍相信，在稻米中转基因过度表达的泛素启动子、调节基因和枯草杆菌Protox基因的联合，有利于植物中枯草杆菌的Protox基因的最优表达。如果使用与本发明中相同的重组载体，在植物的质体中表达阿布属Protox基因，那么转基因表达与使用枯草杆菌Protox基因的情况相比可能会更高，或者由于Protox在阿布属和稻米之间的遗传同源而更低。无论如何，已经证实在转基因的稻米中使用含有枯草杆菌Protox基因的重组载体，可以导致极好的产量(见下表)。表.表达阿布属或枯草杆菌的Protox基因针对T1代中的质体的转基因稻米的生长特性
  特性     对照     阿布属Protox  枯草杆菌Protox
  植物高度(厘米)分蘖的数目谷物的产量(克)(对照的百分数)     871842.3(100)     751532(75.6)  86.535.569.8(165)
转基因稻米中枯草杆菌Protox基因的表达水平，极大地影响谷物的产量，与具有枯草杆菌Protox基因最优表达水平的C13-2的转基因系相比，发现具有枯草杆菌Protox基因较高表达水平的C13-1的转基因系的增产减少5-10％。因此，枯草杆菌Protox基因的最优表达水平，是增加农作物产量所必需的。枯草杆菌Protox基因的人工合成、适当的复制数导入植物基因组、和应用多种启动子[例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、稻米肌动蛋白启动子]的转基因的最优表达，可以极大地增加农作物的产量。表.依照T1代中的启动子，表达针对细胞液的枯草杆菌的Protox基因的、转基因稻米的生长特性
  特性     对照     泛素  CaMV35S  稻米肌动蛋白
  植物高度(厘米)分蘖的数目谷物的产量(克)(对照的百分数)     871842.3(100)     86.535.569.8(165)  873365(153)  843260(142)
如上表所示，泛素启动子是更适宜表达枯草杆菌Protox基因的。
然而，当一种基因的密码子用法与一种植物基因的密码子用法相似时(例如，从植物、藻类、酵母等中游离的Protox基因)，应该通过使用能够控制基因表达的一种调节基因，来获得这些基因的最优表达。
与导入的枯草杆菌Protox基因的复制数增加一样，它的表达水平也出现增加。因为转基因复制数的增加所致的枯草杆菌Protox mRNA的数量增加，可以降低产量增加效应。这些观察资料陈列于下表中。表.依据T1代中转基因的复制数，表达枯草杆菌Protox基因的转基因稻米的生长特性
  特性     对照    P9(1个复制)     P21(3个复制)
  植物高度(厘米)分蘖的数目谷物的产量(克)(对照的百分数)     82.51835(100)    86.535.569.8(199)     81.523.545.2(129)
另外，针对枯草杆菌Protox基因在转基因植物中表达的Protox酶的Western杂交分析显示，转基因表达在转基因植物中，针对质体的比针对细胞液的高。
                 附图的简要说明
图1阐明Protox转换肽(试验中所应用的烟草cv.Samsun和烟草cv.KY160的烟草Protox序列的比较)的核苷序列的比较(A)，和推导出的氨基酸序列(B)以及(C)二元载体中T-DNA区域的示意图。Ubi，玉米泛素；Tnos，胭脂碱合酶终止子；HPT，潮霉素磷酸转移酶；Bs，枯草杆菌；Ts，转换序列。
图2阐明转基因稻米中枯草杆菌Protox基因的Northern杂交分析。C，对照；Tc，转基因的对照；C8，C13，靶细胞液的转基因稻米系；P9，P21，靶质体的转基因稻米系。
图3阐明对照和转基因稻米的生长。
图4阐明转基因稻米中枯草杆菌Protox基因的DNA(A)和RNA(B)杂交分析。C，对照；Tc，转基因对照；C8，C13，靶细胞液的转基因稻米系；P9，P21，靶质体的转基因稻米系。
                 实现本发明的最好方式
下文解释适合本发明的具体方法。然而，发明中所用的方法和所引用的文献中的方法可能进行了适当的修改。
来自烟草Protox的转换序列的PCR克隆
PCR钓鱼转换序列(PCR-fished transit sequence)的序列资料表明，长度为具有63个氨基酸的189个核苷，比报道的烟草Protox长11个氨基酸[Lermontova et al.1997]。除了在PCR钓鱼的转换肽中有12个连续伸展的丝氨酸残基外，这两种Protox演绎的氨基酸序列几乎是完全相同的(图1)。然而，序列的变异似乎归因于作为模板的烟草植物的不同的培育植物。序列具有转换肽的共同特性，如富含丝氨酸/苏氨酸和缺乏天门冬氨酸/谷氨酸/酪氨酸[von Heijne et al.，1989]。
转化载体构建
有许多二元载体可以用来转化单子叶植物，尤其是稻米。几乎所有的二元载体都可以从国际组织处获得，例如CAMBIA(分子生物学应用于国际农业的中心，GPO Box 3200，Canberra ACT2601，澳大利亚)和大学学院。根据一种二元载体的基本骨架，能够广泛地修改Ti-质粒的左或右边界区侧面相接的转化体可选择的标记物、启动子和终止子基因。
尽管在本发明的例证中使用了pGA1611[Kang et al.，1998]作为一种二元载体，但是也可以使用能够有效表达Protox基因的其它载体，而不受任何特殊的限制。pCAMBIA1380 T-DNA和pCAMBIA1390T-DNA的二元载体可能适合例证，原因是它们与本发明中的pGA1611有密切的结构类似处，并且可以从CAMBIA处获得。
稻米的转化
应用传统的技术可以常规的实施转化。农杆菌介导的转化能够完成植物转化，并且可以使用以前的文献[Paszkowsky et al.，1984]中所描述的技术。例如，以前的文献中描述了经农杆菌介导的转化的稻米的转化技术[An et al.，1985]。应用PEG或电穿孔技术直接转基因入原生质体和粒子炮击入胼胝组织，可以完成单子叶植物的转化。单个DNA物种或多个DNA物种(也就是，共转化)能够承担转化。这些转化技术不仅能够适用于包括烟草、西红柿、向日葵、棉花、含油种子油菜、大豆、马铃薯等的双子叶植物，而且也适用于包括稻米、大麦、玉米、小麦、黑麦、燕麦、turfgrass、小米、甘蔗、黑麦草、果园草等的单子叶植物。应用传统技术把已经转化的细胞改建入标准植物。
应用已知的分子生物学技术，利用pGA1611、pGA1611：C和pGA1611的三基因构成物转化植物。把这些基因构成物亚克隆入一种二元载体pGA1611，而pGA1611隐藏一种构成的泛素启动子，认为这个泛素启动子在植物中适当地表达，并且具有可作为一种选择标记物的潮霉素磷酸转移酶，且把它转化为A.tumefaciens LBA4404。
自稻米(Oryza sativa cv.Nakdong)种子衍生的角质鳞片胼胝体与隐藏上述构成物的A.tumefaciens共培育。平均起来，有10-15％的胼胝体在含有50μg/mi潮霉素的选择性培养基中生存下来。挑选的胼胝体在改建性培养基上转移后，改建成嫩枝的比率为1-5％。由靶质体系(pGA1611：P)出现的一些嫩枝在改建过程期间，倾向于在正常的光强度下变得苍白。然而，通过先在暗光条件下生长1周，然后再转移到在正常光条件下生长就能够克服这种现象，这种嫩枝在正常光条件下就开始正常地生长而不在变得苍白。它能够解释为，由于在质体中枯草杆菌Protox基因可能过度表达的这些转基因系，正在把原卟啉原IX氧化成原卟啉IX，而下游的代谢过程又需要对植物细胞引起光毒性的原卟啉IX(资料没有显示)。总的来说，在细胞液或质体中表达具有pGA1611：C和pGA1611：P构成物的6种和58种不同的转基因稻米系分别生长到成熟。作为对照，表达pGA1611载体的一种转基因稻米也生长到成熟。大多数转基因系显然具有正常的表型，但是它们的种子产量依赖个体的转基因系，范围从4个到260个不等。
基因组DNA凝胶杂交分析
为评价自潮霉素选择性培养基改建的转基因系的稻米基因组中枯草杆菌Protox基因的稳定整合，分别自靶细胞液的5个转基因系(pGA1611：C)和靶质体的6个转基因系(pGA1611：P)提取DNA，用HindIII消化，以及用32P-标记的枯草杆菌Protox基因杂交。由于在探针的转基因内没有HindIII位点，杂交带的数目直接符合转基因系的基因组中的转基因的复制数。靶细胞液的转基因系(C2，C5，和C6)显示，在每条5kb以上的三条杂交带周围有多条带，提示在稻米基因组中的不同部位有多个***的转基因(资料未显示)。与此相反，C8和C13系在稻米基因组中有一种单一的复制***。至于靶质体的转基因系，6种中有5种具有一种单一的复制***，只有P21系显示有一种三复制***(资料未显示)。
在T1代的转基因稻米中耐潮霉素特性的分离
分别从T0代的自花授粉的个体转基因稻米植物中收集种子，以用来评价T1代中耐潮霉素特性的分离。在这项评价中，利用包括1个转基因对照(Tc)、2个靶细胞液系(C8和C13)和2个靶质体系(P9和P21)的5个转基因稻米系。在含有50μg/ml潮霉素的1/2浓度MS培养基中发育这些种子，并且记录这些种子自这种培养基中的存活率，以用来评价耐潮霉素特性的分离。结果列于下表1。表1.在T1代的转基因稻米中耐潮霉素特性的分离。
    转基因稻米     耐药的     敏感的     分离比率     x2
    TcC8C13P9P21     1819221316     7161374     3∶1-3∶13∶13∶1     0.12-2.751.070.27
在所检查的全部的转基因稻米系中除C8系外，潮霉素耐药的与敏感的分离比率接近3∶1，表明稻米基因组中的转基因是按照孟德尔氏遗传表达的。然而，在C8系中发现潮霉素敏感性的比率很高。
T1代中转基因稻米的RNA杂交分析
把从含有潮霉素的培养基中存活下来的转基因稻米系的个体(1个转基因对照，Tc；2个靶细胞液的转基因系，C8和C13；和2个靶质体的转基因系，P9和P21)移植入稻田。在从对照(C)系和转基因对照(Tc)系(图2)的叶子中提取的总RNA中，没有发现枯草杆菌Protox mRNA。在靶细胞液的转基因系，C8和C13中，枯草杆菌ProtoxmRNA的表达水平相对较高。靶质体的转基因系能够有效地转录枯草杆菌Protox基因，在P21系中展示出了最高水平的转基因表达。
根据转基因的复制数和相对的mRNA表达水平之间的一些相关性，枯草杆菌Protox mRNA的表达水平，看来好象与稻米基因组中转基因的复制数有关。随着导入的枯草杆菌Protox基因复制数的增加，它的表达水平也增加(图2：转基因的T1mRNA杂交测定)。随着由于转基因复制数的增加而增加的枯草杆菌Protox mRNA的数量，产量的增加作用下降(见叙述根据T1代中转基因的复制数的转基因稻米的生长特性的上表)。
检测枯草杆菌Protox多肽
使用针对枯草杆菌Protox的单克隆抗体(source，Rohm和HaasCo.)，应用免疫学方法检测T1代的转基因稻米中枯草杆菌Protox多肽的产生。从转基因稻米系(1个转基因对照，Tc；2个靶细胞液的转基因系，C8和C13；和2个靶质体的转基因系，P9和P21)的叶子中提取可溶性蛋白质，并且将其从凝胶电杂交到聚偏二氟乙烯膜。随后，依照标准过程，应用针对枯草杆菌Protox的抗体进行杂交膜上多肽的免疫检测。在所有检测的转基因稻米系中除转基因对照外，都发现了与枯草杆菌Protox大小相当的蛋白质。
有趣地是，靶质体的转基因系显示的条带强度比靶细胞液的高3-4倍。在转基因系中发现的两条小蛋白带，可能是枯草杆菌Protox的降解产物。与此相反，仅仅在靶质体的转基因系中，也发现了比枯草杆菌Protox约大4-5kDa的弱条带。这条带可能是枯草杆菌Protox的蛋白前体，具有不可消去的转换序列。在微粒体的蛋白质中没有发现抗体反应的蛋白(没有显示资料)。
总之，转基因系中枯草杆菌Protox的降解产物、靶质体的转基因系中的条带强度比靶细胞液转基因系中的高、以及存在枯草杆菌Protox蛋白前体的发现，间接给转基因系中枯草杆菌Protox的表达提供了强有力的证据。
T2代中转基因稻米DNA和RNA的印迹杂交分析
把从T1代的转基因稻米植物中收集的种子进行发育并常规移植入一块稻田。在稻田中，每种转基因系培育40棵植物。在移植后5周，依照叶子部分在含有100mg/l潮霉素的蒸馏水中的坏死反应，分别从单个转基因植物中收集叶子，以便检查转基因表达。分析耐潮霉素转基因系是否在T2代中稳定表达枯草杆菌Protox基因。与T1代中一样，在T2代的靶细胞液转基因系(C8和C13)和靶质体转基因系(P9和P21)中发现了枯草杆菌Protox的表达，但是在对照组和转基因对照组中则无表达[图4(A)]。RNA印迹杂交分析证实，导入的枯草杆菌Protox基因在T2代中稳定表达。枯草杆菌Protox mRNA表达的水平，在靶细胞液转基因系(C8、C13-1和C13-2)之间以及在靶质体转基因系(P9和P21)之间是不同的[图4(B)]。
另外发现，与具有枯草杆菌Protox基因最优表达水平的转基因系(图4，C13-2)相比，具有较高枯草杆菌Protox基因表达水平的转基因系(图4，C13-1)产量增加降低5-10％。
将提交下列的典型例证具体地解释本发明。然而，这些例证仅仅是说明本发明的，并不是以任何方式局限本发明。
                      例证
例证1：稻米转化载体的构建
有两种类型的枯草杆菌Protox基因构成物可以用来转化稻米。pGA1611载体作为一种启动的二元载体，按下列方法构建：把作为一种抗生素耐药基因的耐潮霉素基因[Gritz和Davies，1983；NCBIaccession No.，K01193]，调节耐潮霉素基因的CaMV35S启动子[Gardner等.，1981)；Odell等.，1985；NCBI accession No.，V00140]，和用于终止转录的、章鱼肉碱型TiA6质粒的第7转录产物中转录的终止区***一种装配型质粒载体pGA482[An等，1988]。把泛素基因导入[Christensen等.，1992；NCBI accession No.，S94464]BamHI/PstI位点，用于表达外源基因，并且把胭脂碱合成酶基因[Bevan等.，1983；NCBI accession No.，V00087]转录的终止区，放在具有唯一限制性酶切位点(HindIII，SacI，HpaI和KpnI)的克隆区。
构建细胞液中表达枯草杆菌Protox基因的一种质粒pGA1611：C。用SacI和KpnI消化多聚酶链式反应扩增的枯草杆菌Protox基因的全长，并且将其连接入用同样的限制性内切酶预先消化了的pGA1611二元载体，结果形成在玉米泛素启动子控制之下***的Protox基因。另一种构成物，pGA1611：P，是为了将枯草杆菌Protox基因靶入质粒所设计的(图1)。用下划线标出用于方便亚克隆所设计的SacI引物位点。自GenBank数据库(许可证号，Y13465)中获得烟草(Nicotianatabacum cv.Samsun NN)Protox序列。
使用依照烟草(N.tabacum cv.Samsun NN)Protox序列资料设计的特异性引物，应用PCR方法构建载体。使用包含一种HindIII位点(划线部分)的正向引物5’-d(TATC AAGCTTATGACAACAACTCCCATC)-3’、包含一种SacI位点(划线部分)的反向引物5’-d(ATTG GAGCTCGGAGCATCGTGTTCTCCA)-3’和烟草(N.tabacum cv.KY160)基因组的DNA作为模板来扩增转换肽。用HindIII和SacI消化PCR产物，经凝胶纯化后，在pBluescript(市场上可买得到)内连接到同样的限制性位点上。在鉴定了序列完整性后，把转换序列的HindIII和SacI片段连接到pGA1611：C的相同的限制性酶切位点中，结果构建成已经把转换肽***在枯草杆菌Protox基因前面的pGA1611：P。图1说明的是二元载体中T-DNA区域的模式图。图1中所应用的缩写如下所示：Ubi，玉米泛素；Tnos，胭脂碱合成酶3’-终止信号；P35S，CaMV35S启动子；HPT，潮霉素磷酸转移酶；Ts，转换序列。
例证2：稻米的转化和改建
隐含pGA1611、pGA1611：C和pGA1611：P的A.tumefaciensLBA4404在添加5μg/ml四环素和40μg/ml潮霉素的YEP培养基((1％Bacto-peptone，1％Bacto-yeast extract，0.5％NaCl)中，在28℃下过夜生长。将培养液离心，并且在相同体积的含有100μM乙酰丁香酮的AA培养基[Hiei等，1997]中悬浮沉淀物。在N6培养基[Rashid等，1996，Hiei等，1997]上从稻米(cv.Nakdong)种子的角质鳞片中诱导胼胝体。把3-4周大小的紧密胼胝体浸透在细菌悬浮液中3分钟，用消毒的过滤纸印干，去除多余的细菌。把胼胝体转移到一种共培养的培养基，然后在黑暗中25℃的情况下培养2-3天。用含有250mg/l头孢塞肟菌素的消毒蒸馏水洗涤共-培养的胼胝体，将其转移到含有250mg/l头孢塞肟菌素和50mg/l潮霉素的N6培养基。选择3-4周后，把胼胝体转移到一种再生性培养基，进行嫩枝和根部发育。根部充分发育后，把转基因植物转移到温室，生长到成熟。
根据布达佩斯条约，本发明中用pGA1611：C和pGA1611：P载体转化的A.tumafecians已经于1999年11月15日保藏在国际保藏单位(Korean Collection for type Cultures，Korea Research Institute ofBioscience和Biotechnology，52 Auheun-dong，Yusung-ku，Taejon305-333，Korea)，分别是KCTC0692BP和KCTC0693BP。
例证3：大豆的转化和改建
隐含pGA1611、pGA1611：C和pGA1611：P的A.tumefaciensLBA4404在添加5μg/ml四环素和40μg/ml潮霉素的YEP培养基((1％Bacto-peptone，1％Bacto-yeast extract，0.5％NaCl)中，在28℃下过夜生长。将培养液离心，并且在相同体积的含有100μM乙酰丁香酮的B5培养基[Gamborg等，1968]中悬浮沉淀物。纵向受伤的子叶组织与细菌悬液在24℃下共培养3天，然后将共-培养的胼胝体转移到B5复苏培养基和一种改建培养基中继续产生T0代大豆。
例证4：适合于大麦、小麦、黑麦草和马铃薯的转化载体的构建
自pGA1611：C和pGA1611：P二元载体，用BamHI/ClaI消化包括泛素启动子、枯草杆菌Protox基因和胭脂碱合成酶基因的3’终止区的基因，并将其连接入pBluscript II SK克隆载体(Strategene，USA)内同样的限制性酶切位点处，结果形成构建的pBSK-Protox载体。用ClaI/SalI自pGA1611：C消化章鱼肉碱型TiA6质粒中CaMV35S启动子区：耐潮霉素基因：转录终止区，并且将其连接入pBSK-Protox载体内，结果形成构建的pBSK-Protox/潮霉素载体，用作使用基因枪的转化载体。
例证5：大麦、小麦、黑麦草和马铃薯的转化和改建
使用角质鳞片衍生的胼胝体作为大麦、小麦和黑麦草转化的外植体[Spangenberg等，1995；Koprek等，1996；Takumi和Shimada，1997]，而马铃薯转化所用的是子叶组织。通过使用一种biolisticPDS-1000/He微粒传递***(Bio-Rad)，把用1.6-μm直径金制的微粒包裹的pBSK-Protox/潮霉素载体DNAs炮击入大麦、小麦、黑麦草和马铃薯的外植体中。在4℃情况下，在包括0.1M Tris缓冲液(pH7.0)，5mM β-巯基乙醇和1片/10ml的完全的蛋白酶抑制剂[CompleteMini；Boehringer Mannheim]的1ml的均质培养基中，从转化的植物中提取枯草杆菌Protox蛋白质。通过2层的微孔布(CalBiochem)过滤组织匀浆，然后以3000g的转速离心10分钟。以100,000g的转速离心由此形成的上清液60分钟，得到粗制的微粒体的沉淀。在100μl的均质缓冲液中再次悬浮沉淀，应用再次悬浮的20μg蛋白质沉淀进行针对微粒体片段的免疫印迹，而应用100,000g转速的15μg蛋白质的上清夜作为可溶解的蛋白质。应用10％的(w/v)acrylamide/bis凝胶，对可溶解的和微粒体的蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。在电泳之后，把蛋白质印迹到聚偏二氟乙烯膜，并且随后用针对枯草杆菌Protox的单克隆抗体进行免疫杂交。依照制造商的说明书(ECL Kit；Boehringer Mannheim)，应用增强的化学发光***进行第二抗体的使用和检测条带。
测试1：转基因稻米的生长结果
从例证2中改建的转基因稻米植物中收集种子，并且把耐潮霉素的秧苗移植入一块稻田。转基因稻米的生长结果显示在表2-5。表2显示T1代中转基因稻米在不同生长时期时的植物高度。表2.T1代中转基因稻米在不同生长时期时的植物高度
  移植后的周数             植物高度(cm)(至少是4棵植物的平均值)
  对照   TC   C8   C13   P9   P21
  12341016   26.043.246.753.082.382.5   28.341.746.352.379.079.0   28.240.345.349.786.386.5   25.545.348.551.389.590.5   25.343.043.348.385.886.5   26.641.447.655.879.681.5
如表2所示，靶细胞液转基因稻米显示出植物高度显著高于对照10厘米
表3、4和5分别显示了T1代中转基因稻米的分蘖数、数量特性和产量组分。表3.T1代中转基因稻米在不同生长时期时的分蘖数(圆括号中的数字是相对于对照的百分数)
  移植后的周数                 分蘖数(至少是4棵植物的平均值)
    对照     TC     C8     C13     P9     P21
  12341016     3.66.38.815.715.718.0(100)     3.76.09.315.716.218.2(101)     3.36.010.318.719.323.0(128)     2.87.516.024.326.528.0(156)     2.38.014.326.326.335.5(197)     4.26.813.618.719.523.5(131)
表4.T1代中转基因稻米的数量特性
    特性     对照   TC   C8   C13   P9   P21
    嫩枝鲜重(克)根部鲜重(克)嫩枝/根部鲜重比圆锥花序长度(厘米)有效的分蘖比率     131891.520.282.1   138921.518.776.9   2461401.7517.389.1   2521112.2719.193.9   188932.0219.680.9   171682.5118.377.9
表5.T1代中转基因稻米的产量组分
  产量组分     对照   TC   C8   C13   P9   P21
  谷物产量(克)(对照的％)1,000个谷粒重量(克)圆锥花序的数目每个圆锥花序谷粒的数目灌浆比率(％)     35.0(100)28.315.094.488.1   35.2(101)30.014.094.085.5   36.3(104)27.720.599.485.9   58.6(167)31.426.310884.8   69.8(199)29.228.710486.0   45.2(129)28.218.310186.7
如表3、4和5所示，本发明明显地改善了转基因稻米中的数量特性，也就是有效的分蘖比率，并且它们的谷物产量和分蘖也增加了2倍。
测试2：转基因的大麦、小麦、大豆、意大利黑麦草和马铃薯的生长结果
检查与例证2中同样改建的所有的转基因单子叶植物(大麦、小麦)、双子叶植物(大豆、马铃薯)和草料农作物(意大利黑麦草)的生长特性。在转基因的大麦中发现谷物产量增加了18-27％(表6)。在转基因的小麦(表7)和大豆(表8)中，发现谷物产量分别增加了14-25％和23-28％。在转基因的意大利黑麦草中，嫩枝鲜重增加了51％(表9)。表10显示转基因的马铃薯的产量特性。嫩枝和块茎鲜重都增加13-18％。这些结果证明，枯草杆菌Protox基因的产量增加效应，不仅广泛地适用于包括稻米的单子叶的植物，而且也适用于草料农作物和双子叶的植物。表6.转基因大麦的产量特性
  特性     对照     TC     C112     P115
  谷物产量(克)(对照的％)1,000个谷粒重量(克)圆锥花序的数目每个圆锥花序谷粒的数目灌浆比率(％)圆锥花序长度(厘米)植物高度(厘米)     177(100)34.94.342.082.73.969.5     180(100)33.84.044.282.03.867.4     228(127)33.16.351.480.14.069.0     211(118)31.45.547.084.54.270.8
表7.转基因小麦的产量特性
 特性     对照     TC     C204     P207
 谷物产量(克)(对照的％)1,000个谷粒重量(克)圆锥花序的数目每个圆锥花序谷粒的数目灌浆比率(％)圆锥花序长度(厘米)植物高度(厘米)     247(100)45.35.634.280.67.867.4     242(97)44.05.336.079.27.169.0     310(125)46.17.240.177.17.676.4     282(114)45.08.337.081.07.772.0
表8.转基因大豆的产量特性
 特性     对照     TC     C303     P310
 谷物产量(克)(对照的％)1,000个谷粒重量(克)植物高度(厘米)灌浆比率(％)     39.2(100)19.671.480.2     36.5(94)21.068.481.0     48.5(123)20.078.090.4     50.3(128)22.576.387.4
表9.转基因的意大利黑麦草的产量特性
    特性     对照     TC     P407
    嫩枝鲜重(克)(对照的％)分蘖的数目叶子的数目     117(100)8.536.0     105(89)8.041.2     178(151)12.350.0
表10.转基因马铃薯的产量特性
    特性     对照     TC     C401     P421
    嫩枝鲜重(克)(对照的％)植物高度(厘米)块茎鲜重(克)     55(100)85135     52(95)82130     62(113)80155     65(118)78160
                      工业实用性
因为根据本发明已经证实的、通过应用含有Protox基因的重组载体，转化一种宿主农作物，可使农作物的产量和单位面积内的数量明显增加，那么就有可能解决食物短缺问题，以及应用本发明，有可能获得增强利用包括草料农作物在内的植物资源。
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                       序列表<110>白镜焕(BACK，Kyoung Whan)
 李熙载(LEE，Hee Jae)
 具滋(GUM，Ja Ock)<120>用原卟啉原氧化酶基因增加农作物产量或单产的方法<130>PC00018-BKH<150>KR10-1999-0043860<151>1999-10-11<150>KR10-1999-0052478<151>1999-11-24<150>KR10-1999-0052492<151>1999-11-24<160>3<170>KOPATIN 1.55<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1TATCAAGCTT ATGACAACAA CTCCCATC                                     28<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2ATTGGAGCTC GGAGCATCGT GTTCTCCA                                     28<210>3<211>189<212>DNA<213>Nicotiana烟草(Nicotiana tabacum)<220><221>基因<222>(1)..(189)<223>Protox转换序列<400>3ATGACAACAA CTCCCATCGC CAATCATCCT AATATTTTCA CTCACCGGTC ACCGCCGTCC    60TCCTCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCTCCTCG TCTCCATCGG CATTCTTAAC TCGTACGAGT    120TTCCTCCCTT TCTCTTCCAT CTCGAAGCGC AATAGTGTCA ATTCGAATGG CTGGAGAACA    180CGATGCTCC                                   189

Claims (16)

1.一种通过应用含有原卟啉原氧化酶(Protox)基因的重组载体转化一种宿主植株，增加农作物产量或单位面积数量的方法。
2.根据权利要求1中所述的方法，其中所述的基因是一种原核细胞基因。
3.根据权利要求2中所述的方法，其中所述的原核细胞基因来源自一种杆菌或者一种肠道细菌。
4.根据权利要求1中所述的方法，所述的重组载体有一种泛素启动子。
5.根据权利要求1中所述的方法，所述的重组载体以宿主植株的细胞胞质或者质粒为目标。
6.一种重组载体，包含有原卟啉原氧化酶(Protox)基因、泛素启动子和潮霉素磷酸转移酶选择性标记物。
7.根据权利要求6所述的重组载体，所述的原卟啉原氧化酶(Protox)来源自枯草杆菌(Bacillus subtilis)。
8.应用根据权利要求6提及的重组载体转化的一种土壤杆菌属瘤(Agrobacterium tumefaciens)。
9.根据权利要求8中所述的土壤杆菌属瘤是一种土壤杆菌属瘤的LBA4404/pGAl611：C(KCTC0692BP)或者一种土壤杆菌属瘤的LBA4404/pGA1611：P(KCTC0693BP)。
10.一种植物细胞，应用根据权利要求8或者根据权利要求9中的土壤杆菌属瘤转化。
11.根据权利要求10中所述的植物细胞是一种单子叶植物。
12.根据权利要求11中所述的单子叶植物中植物细胞，是从大麦、玉米、小麦、黑麦、燕麦、草皮草、甘蔗、小米、黑麦草、果园草和稻米群体中挑选出来的。
13.根据权利要求10中所述的植物细胞是一种双子叶植物。
14.根据权利要求13中所述的植物细胞，上述的双子叶植物中是从大豆、烟草、含油种子油菜、棉花和马铃薯群体中挑选出来的。
15.一种植株源自对权利要求10中的植物细胞的重建。
16.一种植物的种子是从权利要求15中提及的植株中收获的。
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