CN1451038A - 可用作疫苗的减毒流感病毒 - Google Patents

可用作疫苗的减毒流感病毒 Download PDF

Info

Publication number
CN1451038A
CN1451038A CN00813421A CN00813421A CN1451038A CN 1451038 A CN1451038 A CN 1451038A CN 00813421 A CN00813421 A CN 00813421A CN 00813421 A CN00813421 A CN 00813421A CN 1451038 A CN1451038 A CN 1451038A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
cell
poly
influenza virus
type
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN00813421A
Other languages
English (en)
Inventor
G·G·布朗李
E·福多尔
L·波恩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oxford University Innovation Ltd
Original Assignee
Oxford University Innovation Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9917981.4A external-priority patent/GB9917981D0/en
Application filed by Oxford University Innovation Ltd filed Critical Oxford University Innovation Ltd
Publication of CN1451038A publication Critical patent/CN1451038A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

一种负义单链RNA病毒，该病毒已通过将基因组核酸中的多聚U段替换成可被复制并且由该核酸转录出的mRNA带有多聚U尾的多聚A段的方法而被减毒。该病毒通常为流感病毒。该病毒可掺入疫苗中使用，或可用作辅助病毒。

Description

可用作疫苗的减毒流感病毒
本发明涉及可在疫苗中使用的改良病毒。在特定情况下，这些病毒可以是流感病毒。本发明的改良病毒还包括适于作为病毒载体在靶细胞内表达异源序列的重组减毒病毒。
减毒病毒可用来获得对相应野生型病毒引起的疾病的免疫。由减毒病毒制备的疫苗通常优于那些包含死病毒或通过重组技术产生的病毒蛋白的疫苗。以流感为例，目前的灭活流感病毒疫苗只能提供有限的保护。为了获得一种安全的活体减毒流感疫苗，此前大多以冷适应性流感病毒为努力方向。所以，此前的减毒流感病毒是利用低温下大量传代流感病毒的方法来获得。适应在低温下生长的结果是，获得的病毒丧失了在较高温度下(约39℃)复制的能力。这些冷适应性(CA)病毒的复制在温度较低的上呼吸道只受到轻微的抑制，而在涉及疾病的主要病理部位，即温度较高的下呼吸道，却被高度抑制。
野生型流感病毒与CA流感病毒的序列比较结果显示，沉寂突变以及导致氨基酸改变的非沉寂突变都主要发生在基因区段的编码区。并且大多数氨基酸改变都是由点突变造成的。在将CA流感病毒作为疫苗而广泛应用方面，点突变的遗传不稳定性以及CA流感病毒的免疫原性强度仍是已知的潜在问题。
遗传工程技术可用来改造病毒以将其减毒。这种改造必须能够减弱病毒而又不使其丧失感染宿主细胞的能力。本发明人找到一种改造方法，该方法可影响宿主细胞内的mRNA加工方式，从而可应用于任何一种采用类似多腺苷酸化策略的负义单链RNA病毒，特别是流感病毒。本发明人发现，将病毒基因中的多聚U段替换成多聚A段时，仍可由该基因转录出功能性mRNA。并且带有这些修饰的病毒为减毒病毒。另外，由于多聚A段中的点突变可破坏基因的转录，所以这些修饰十分稳定。
Poon et al(1)发现，流感vRNA片段中的多聚A段可以被复制，从而由该片段转录出的mRNA带有多聚U尾。但该文章未说明这种mRNA的特性，也未提出将病毒基因组核酸中的多聚U段替换可产生一种功能性减毒病毒的建议。
本发明提供一种负义单链RNA病毒，该病毒已通过将基因组核酸中的多聚U段替换成一种可被复制并使该核酸转录出的mRNA带有多聚U尾的多聚A段的方法而被减毒。
该病毒通常为正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(如流感病毒(influenaz virus))、副粘病毒科(Paramyxoviridae)(如副流感病毒(parainfluenaz virus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、麻疹病毒(measles virus)或呼吸道合胞体病毒(respiratory syncytialvirus))、棒状病毒科(Rhabdoviridae)(如狂犬病病毒(rabies virus)或水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus))、丝状病毒科(Filoviridae)(如马堡病毒(Marburg virus)或埃博拉病毒(Ebolavirus))、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)或沙粒病毒科(Arenaviridae)。
该病毒可含有一种或多种基因组片段。带有数种基因组片段的负链RNA病毒的实例有流感病毒(1)。该流感病毒可以是A型、B型或C型流感。
在一项实施方案中，该病毒中的多聚A段复制可采用顺序反复机制。通常在该机制中，聚合酶在转录多聚A段时会反复“向后滑退”，从而可在mRNA内形成比多聚A段长的多聚U尾。采用该反复机制的优选病毒为流感病毒，其中特别优选的为A型流感病毒。
该病毒可被减毒，并在给药于宿主时(与野生型病毒相比)引起较轻的疾病症状。因此评价减毒作用的一种方法是测定在小鼠模型体内的致病性(例如，按实施例7所述)。一般而言，本发明的病毒在任何的一种、一些或所有可被其感染的天然宿主细胞或细胞系中的复制能力有所降低。可对其进行测定的一种方法是，当用该病毒感染这些细胞时，病毒的效价降低。病毒的效价通常会至少降低0.3log，例如至少降低0.5log、0.8log、1log、2log、5log、10log或更多。该病毒一般在宿主细胞内会具有一定程度的复制能力，即能够产生感染性子病毒。
当该病毒为流感病毒时，可利用Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞、Madin-Darby狗肾细胞或Vero细胞来测定其复制能力的降低情况。
一般而言，该核酸内可被复制并形成多聚A尾的多聚U段中的所有尿嘧啶核苷可被数量相同、减少或增加(如减少或增加1、2、3个或更多个)的腺嘌呤核苷所替代。以流感病毒为例，整个U6段一般可被A5、A6、A7、A8、A9、A10段或含有10个以上腺嘌呤核苷，如11-15个或更多腺嘌呤核苷，的区段所替代。
一般而言，该核酸由于具有4、5、6、7-10、10-20或更多处突变(可以是***，缺失或替换)而与相应的野生型核酸有所不同。这些突变通常位于5’和(或)3’末端。该核酸一般与相应的野生型基因组片段同源并且(或)能够与其杂交。在一项实施方案中，该核酸为来自不同病毒的片段的一种嵌合体。以流感病毒为例，该核酸可以是来自A型和(或)B型和(或)C型流感病毒的片段的一种嵌合体。
该核酸能够在宿主细胞中表达以产生至少一种带有多聚U尾的mRNA。由该核酸(和该mRNA)编码的蛋白通常在细胞内的表达水平较低(与相应的带有多聚尿嘧啶尾的mRNA相比)。这些蛋白中至少有一种能够在其表达水平低于被野生型病毒表达的水平的情况下引起减毒作用。
这些蛋白通常为野生型蛋白或至少具有野生型蛋白某些活性的功能等价物。这些蛋白一般为结构蛋白(如衣壳蛋白)、非结构蛋白或酶(如聚合酶)。
该病毒可含有1种、2种、3种、4种或更多种已由多聚A段替换其多聚U段的核酸。当该病毒为一种流感病毒时，其核酸通常是一种突变的天然流感病毒基因组片段。该片段可编码流感蛋白：PB1、PB2或PA聚合酶蛋白、核蛋白(NP)、基质蛋白M1或M2、血细胞凝集素(HA)、神经氨酸苷酶(NA)、NS1或NS2；或其中任何一种的功能等价物。优选地，该片段可编码NA。
本发明的病毒可另含有一种能够在宿主细胞内表达的异源编码序列。该异源编码序列可编码一种能够刺激针对病原体的免疫应答(或抗体应答或细胞介导的免疫应答)的抗原性肽或多肽。这些病原体的典型范例有病毒，如其它流感病毒或诸如HIV等非流感病毒，细菌、真菌、寄生虫，如疟原虫，以及致病细胞，如癌细胞。
当用于接种时，本发明的减毒病毒可含有一种编码病原体抗原或其免疫应答刺激性变体的异源编码序列。该异源编码序列可被***到病毒基因中，以产生一种仍具有原病毒蛋白功能的融合蛋白。以流感病毒为例，此前已发现HA的抗原性B位点是一个可接受外源抗原***序列(表位移植)的位点。该表面蛋白的抗原性B位点含有一个位于蛋白顶部的暴露的环状结构，并且具有很强的免疫原性。此前已有对流感病毒HA蛋白进行操作而将一种病毒表位***HA蛋白B位点的报道(亦参考文献2中Muster et al.及文献3中Li et al.的研究报道)。此前Rodrigues et al.也采用相同的策略来表达源于疟原虫的B细胞表位(4)。优选地，该抗原性多肽异源编码序列还可***到，例如，流感病毒的NA基因中。将表位移植到流感病毒蛋白中的策略也已有所描述，例如可参考WO 91/03552。
将外源序列的表位移植到流感病毒蛋白中可能会产生无功能性嵌合病毒蛋白，并可能无法获救存活的病毒转染体。另有一种利用重组流感病毒表达外源序列的不同策略可用于本发明的减毒病毒，该策略涉及对含有额外开放读码框的基因片段进行加工。可以构建一种能够为异源编码序列提供内部核糖体进入位点的重组基因组片段。此前，例如，Garcia-Sastre et al.已利用该方法获得一种可同时编码截尾形式的HIV gp41及NA的流感病毒vRNA片段(5)。作为选择，也可将异源编码序列按框架与一种病毒蛋白编码序列相融合，以编码一种能够自我酶解而产生病毒蛋白及所需的第二种多肽，如病毒抗原，的嵌合多蛋白。Percy et al.已证明该策略适用于长度多达200个氨基酸的非流感蛋白的表达。
应该了解的是，本发明的重组减毒病毒除用于接种外，还可出于多种治疗性目的而作为载体在靶细胞内表达异源编码序列。举例来说，该重组病毒可含有编码下列任一项的基因组片段：
-细胞因子，如干扰素或白细胞介素，
-毒素，
-能够直接或间接抑制病原体功能的姑息剂，如病毒蛋白酶抑制剂，
-能够将无细胞毒性或微细胞毒性的复合物转变成细胞毒性化合物的酶，例如单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶等能够将嘌呤类似物和嘧啶类似物磷酸化成具有毒性的活性形式的病毒酶，
-反义序列，
-核糖酶。
前文提到的能够使本发明所述减毒病毒表达外源表位的任一种技术都可用来将这些作用物的编码序列掺入到本发明的减毒病毒中。本发明的重组病毒可用于基因治疗。
本发明的其它方面还包括上文所述的已将多聚U段替换成多聚A段的核酸，以及可被转录而产生该核酸的DNAs。该DNA可在原核或真核细胞表达***或任一种可被病毒感染的细胞(如文中提到的此类细胞)中转录而产生本发明的核酸。该DNA可以是细胞或病毒基因组或其一部分。
该DNA可以是一种载体，通常是表达载体。该DNA可采用病毒载体或质粒的形式。以流感为例，可将天然流感病毒vRNA片段的cDNA***到两侧为适当启动子及适当限制性核酸内切酶位点的质粒中。然后通过，例如，用适当诱变引物进行PCR定向诱变的方法将cDNA定点诱变，使得用于转录的序列编码带有所需突变的vRNA片段。
当该病毒为流感病毒时，可在体外使本发明的核酸与流感病毒聚合酶蛋白及核蛋白复合，以形成含有转录及复制所需的所有成分的RNP复合物。该RNP复合物构成本发明的又一方面，其制备方法可采用此前将基因工程化流感病毒基因组片段RNA掺入RNA复合物继而在细胞中回收病毒的传统方式(7，8，9)。也可利用常规技术将本发明的RNP复合物转染到培养的细胞中，如MDBK细胞、MDCK细胞或Vero细胞。常用于此目的的方法包括DEAE-葡聚糖转染法和电穿孔法(10，11)。
本发明还提供被本发明的病毒来自体内感染的细胞。这些细胞包括被流感病毒正常感染的人类细胞和(或)动物细胞。这些细胞可以是单细胞类型或多细胞类型，如单类型或多类型的人类培养细胞或非人类动物培养细胞。也可以是体内细胞，如动物模型的细胞。这些细胞可以是下文所述的任一种与选择***相关的细胞类型。这些类型的细胞可在下文所述的病毒制备方法中使用。
本发明所述病毒的制备方法可包括，在能够将核酸组装到病毒颗粒中的条件下将本发明的核酸以及(病毒存活)必需的任何其它基因组核酸引入宿主细胞。其中的条件通常包括，存在病毒颗粒形成所需的蛋白。可通过质粒将基因组核酸引入宿主细胞。
当使用流感病毒时，为了使RNP复合物完整并能够筛选出所需的减毒病毒颗粒，可将上文所述的本发明的RNP复合物转染到已被流感辅助病毒感染的宿主细胞中。此前对多种用于特定流感病毒基因的基于辅助病毒的细胞拯救***已有所描述，其综述可参考Muster andGarcia-Sastre(12)。下文则对这些基因特异性拯救***加以简要描述。基于辅助病毒的流感基因拯救***
已报道的基于辅助病毒的拯救***能够对A型流感病毒vRNAs的NA和HA表面抗原、非结构蛋白、NP、PB2聚合酶蛋白以及M蛋白进行基因操作。NA基因特异性拯救***
最常用的基于辅助病毒的流感基因拯救***限于A/WSN/33型流感病毒的NA(7，8)。该方法的依据是，在缺乏胰蛋白酶的情况下，只有包含A/WSN/33型流感病毒NA基因的流感病毒才能在MDBK细胞中生长。该拯救***中的辅助病毒是一种重排列体(reassortant)，含有A/WSN/33型流感病毒的7种基因片段和非A/WSN/33型流感病毒的一种NA基因。辅助病毒通常为含有A/HK/8/68型流感病毒NA基因的A/WSN-HK。在该***中，可将A/WSN/33型流感病毒NA基因转染到已被辅助病毒感染的细胞中。然后在不含外源蛋白酶的情况下在MDBK细胞中生长以筛选病毒。
还可利用NA缺陷型突变病毒作为辅助病毒来拯救NA基因。该辅助病毒在组织培养物中生长时需要外源的神经氨酸苷酶。将NA基因转染到已被辅助病毒感染的细胞中。然后在不含神经氨酸苷酶的情况下在细胞中生长以筛选病毒(13)。NS基因特异性拯救***
NS基因特异性拯救***的辅助病毒是NS1蛋白带有缺陷的温度敏感型流感病毒。NS基因片段带有两个重叠基因，分别编码NS1和NS2蛋白。对编码在非允许温度下具有活性的NS1蛋白的NS基因片段可使用该拯救***来拯救。在该***中，可将待拯救的NS基因片段转染到已被温度敏感型病毒感染的细胞中。然后按Enami et al.(14)及Egorov et al.(26)所述，在非允许温度下培育病毒以筛选被NS基因片段转染的病毒。PB2基因特异性拯救***
含有一种A型鸟类流感病毒PB2基因的病毒可作为PB2基因特异性拯救***的辅助病毒。A型鸟类流感病毒PB2基因可限制辅助病毒在哺乳动物细胞中的复制。因此，该拯救***可拯救能够使流感病毒在哺乳动物细胞中复制的PB2基因。将待拯救的PB2基因转染到已被辅助病毒感染的细胞中。然后在哺乳动物细胞中培育病毒以筛选被PB2基因转染的病毒。Subbarao et al.(15)已将这种基于A型鸟类流感病毒PB2基因的拯救***用于野生型A/Ann Arbor/6/60型流感病毒PB2基因的拯救。M基因特异性拯救***
带有一种A/equine/Miami/1/63型流感病毒M基因的金刚胺敏感性流感病毒可作为M基因特异性拯救***的辅助病毒。该拯救***可拯救能够使病毒获得金刚胺抗性的M基因。在该***中，可将待拯救的M基因转染到已被辅助病毒感染的细胞中。然后在存在金刚胺的条件下培育病毒以筛选被M基因转染的病毒。Castrucci and Kawaoka(16)已将这种基于M基因的金刚胺敏感性***拯救用于A/PR/8/34型流感病毒M基因的拯救。基于抗体的拯救***
这些***依赖于病毒转染体与特定抗体的结合与否(8，17)。该抗体是一种可与流感病毒结合并阻碍其在组织培养物中生长的中和抗体。其辅助病毒可含有，例如，能够编码具有抗体表位的流感病毒表面蛋白的基因。因而该***可用来筛选不含该基因但可以存活的病毒转染体。所以，此类拯救***可拯救编码病毒表面蛋白的基因。可将待拯救基因转染到已被辅助病毒感染的细胞中。然后在存在抗体的情况下培育病毒以筛选含有转染基因的病毒。Enami and Palese(8)已将该***用于一种转染的HA合成片段的拯救。NP基因特异性拯救***
Li及其同事(11)对一种用于拯救A型流感病毒核蛋白基因的反向遗传***进行了报道。该***中的辅助病毒是一种温度敏感性(ts)ts56突变体。RNA复合物的体内重构可按前人所述(8)来进行，然后利用电穿孔方法将其引入已被ts56辅助病毒感染的细胞中。带有被拯救的NP编码vRNA片段的病毒转染体可通过非允许温度下的MDBK细胞噬斑方法来筛选。B型流感病毒拯救***
Barclay and Palese(18)还补充描述了B型流感病毒HA基因的拯救。
作为选择，也可使用Pleschka et al.(19)开发的基于表达载体的流感病毒基因拯救策略来制备本发明的减毒流感病毒。与上文提到的RNP转染***相比，该策略无需将病毒NP及聚合酶蛋白纯化，而这是RNP复合物体外重构所必需的。将能够产生NP和P蛋白(即PB1、PB2和PA)以及本发明所述核酸的表达载体共转染到宿主细胞中。此时，本发明的RNP复合物可在细胞内形成。然后可如前所述，用流感辅助病毒感染该细胞，以筛选所需的减毒流感病毒。
还可将宿主细胞中的本发明所述RNA复合物拯救到可存活的减毒病毒中，方法是将宿主细胞转染另外的补充RNA复合物(compl ementing RNA complexes)从而无需辅助病毒。按照Enami(20)最近叙述的用于流感病毒基因的常规拯救策略可实现这一目的。该策略包括，由适当的流感病毒纯化出RNPs，在能够与待拯救流感病毒基因杂交的cDNA存在的情况下用RNA酶H体外处理RNPs。由此可通过RNA酶H实现对该基因的特异性消化。然后将去除基因的RNPs与含有本发明所述核酸的RNP复合物共转染到细胞中。再用琼脂覆盖细胞，通过噬斑形成直接获得减毒的病毒转染体。与上述基于辅助病毒的基因拯救策略不同的是，该策略可用于来自任何流感病毒的任一种基因。因而可用其获得任一类流感的本发明所述减毒病毒或核酸。
也可使用非辅助病毒依赖性病毒拯救方法。此类方法的依据通常在于，细胞能够表达完整的流感病毒基因组vRNA片段或相应的cDNA。这些细胞通常能够提供核蛋白以及依赖于RNA的RNA聚合酶，因而可形成含有基因组vRNA片段的RNP复合物，并能够利用细胞组装病毒颗粒。适当的***在(27)和(28)中有所描述。
由上文对本发明所述病毒的性质的论述可以发现，本发明的病毒适用于免疫接种。因此，作为另一方面，本发明提供一种含有本发明所述病毒的疫苗。特别优选的是疫苗中的病毒可作为组合接种剂对抗一种以上的病原体，如本发明所述病毒的野生型和除此之外的第二种病原体。此类疫苗可按照用于此目的的已知方法来加以配制和给药。
因此，作为又一方面，本发明提供一种方法，用于刺激只针对一种病毒，如流感病毒，的免疫应答，或除此之外还同时刺激对一种或多种其它病原体的免疫应答，该方法包括以免疫方式将能够诱导所述免疫应答的本发明所述病毒给药。以流感为例，优选的是用本发明的病毒进行，例如，鼻内免疫。该免疫方法可按照Muster et al.(2)及Ferko et al.(21)利用表达HIV表位的重组流感病毒进行免疫的研究报道来设施。适当的免疫剂量为，例如，103-109pfu。在初次免疫后可利用功能特性相同但亚型或种类不同的病毒进行加强免疫。
此前，将异源编码序列掺入流感病毒的方法在，例如，PublishedInternational Publication WO91/03552(Palese et al.)中已有所描述，Muster and Garcia-Sastre在Textbook of Influenza 1998(12)中亦对该方法进行了综述。该异源编码序列可位于本发明的核酸上，也可位于不同的基因组片段上。它可以被同样含有可提供选择压力的一种流感病毒蛋白基因的额外核酸片段所携带。据前人报道，构建出的流感病毒可带有，例如，至少9种不同的vRNA片段。
用本发明的重组减毒流感病毒作为载体来表达用于接种的外源抗原的策略十分诱人，其原因在于：
1.针对不同亚型的抗体之间几乎不发生交叉反应。用病毒作为疫苗的一个缺点是会产生针对该病毒的免疫应答。在初次免疫后，通常要用相同的抗原进行一次或多次加强免疫。但对病毒的免疫应答会使利用相同病毒进行再次免疫的效果降低。由于针对不同亚型流感病毒的抗体之间几乎不存在交叉反应，因而用亚型不同但表达相同抗原的流感病毒来进行再次免疫即可克服这种影响。
2.已知流感病毒可诱导强烈的细胞应答和体液应答。
3.已知流感病毒可诱导强烈的粘膜反应。用流感病毒进行鼻内免疫可在生殖器粘膜和肠粘膜诱导持久的应答。
4.流感病毒具有非整合性及非致癌性。
5.如上文所述，本发明的流减毒感病毒可能具有减毒稳定性。
本发明的重组病毒可直接给药，也可用来来自体内感染细胞，然后将这些细胞向患者给药。
因此，作为另一方面，本发明提供一种用来向靶细胞递送异源编码序列的药用组合物，该组合物含有本发明的重组病毒和药学容许的载体或稀释剂。此外还提供被本发明所述病毒来自体内感染的细胞，以及经药学容许的载体或稀释剂配制以用于给药的带有本发明所述病毒的此类细胞。又一方面，本发明提供一种向细胞递送异源编码序列的方法，该方法包括用带有所述序列的本发明所述病毒感染所述细胞。
本发明的病毒还可作为辅助病毒来拯救受减毒突变影响的基因的替代基因，以获得在特定细胞类型中生长更快的病毒。为此，优选的是，所选减毒病毒与相应野生型病毒相比在一种或多种细胞中的生长至少减慢约3-4log，优选的则至少约5log。由此，另一方面，本发明提供本发明所述病毒在作为辅助病毒从细胞内拯救核酸方面的应用，其中产生的含有所述片段的病毒是根据相对于辅助病毒在特定类型细胞中的生长加速来进行筛选。举例来说，可利用已在NA编码vRNA内进行减毒多聚U段替换的本发明所述A型流感病毒来有效地拯救NA编码vRNA或其来源于另一种A型流感病毒的功能变异体。其典型方案的步骤包括：
1.用辅助病毒感染细胞，
2.将含有待拯救基因的RNP复合物转染到被辅助病毒感染的细胞中，以及
3.在辅助病毒的减毒作用增加的相同或不同类型的细胞中筛选拯救病毒。
在第3步选择细胞类型时应满足的条件是只有获得转染基因的病毒才有可能生长至高效价。可被证明能够有效筛选本发明所述减毒病毒的体外培养细胞包括MDBK细胞、Madin-Darby狗肾(MDCK)细胞和Vero(非洲绿猴肾)细胞中的一种或多种。
本发明的A/WSN/33型流感病毒特别适用于作为辅助病毒来拯救源于其它A型流感病毒的NA基因。此时，举例来说，可首先用这种辅助病毒感染MDBK细胞，然后优选的是用Vero细胞来筛选带有NA基因且该基因的vRNA不含减毒突变的病毒。
已知A/WSN/33型流感病毒可在小鼠体内显示出与表面抗原NA相关的神经毒性。因而认为该病毒的减毒变异体不适于直接作为疫苗使用。但是当如上所述作为辅助病毒使用时，可对NA vRNAs进行定点诱变，以构建出更适合治疗使用，如作为疫苗使用，的本发明所述减毒A型减毒流感病毒。
本发明通过附图做进一步的说明，其中：
图1显示带有野生型保守末端序列的vRNA模型。图中显示vRNA模板的假定RNA钩状模型。U6尾段(多腺苷酸化位点)以粗体表示。
图2显示U6段突变对CAT表达的影响。用4种蛋白表达质粒(pGT-h-PB1、pGT-h-PB2、pGT-h-PA和pGT-h-NP)以及带有野生型多腺苷酸化信号(1-4泳道)、U6→A6突变(A6；第5和6泳道)或U6→UCUACG突变(RS；第7和8泳道)的pPOL-I-CAT-RT转染人293肾细胞。按“材料与方法”中所述对细胞裂解物的CAT活性进行分析。图中指出了细胞裂解物的稀释系数。第9泳道，假转染(C)。
图3显示由A6转染体病毒合成的poly(U)尾NA mRNA。(A)RT-PCR分析。用RT-PCR反应对野生型病毒感染细胞(WT；第2、5和8泳道)或A6突变体感染细胞(A6；第3、5和9泳道)的总RNA进行vRNA(第2和3泳道)、poly(U)尾NA mRNA(第5和6泳道)以及poly(A)尾NA mRNA(第8和9泳道)测定。在8％的天然丙烯酰胺凝胶上对RT-PCR产物进行分析。靠近加样孔的高分子量条带为非特异性PCR产物。第1、4和7泳道为DNA标记(M)。(B)来源于poly(U)尾NA mRNA的cDNA克隆的poly(U)序列(n＝84)。图中给出流感病毒的mRNA序列。
图4显示由于NA表达降低而被减毒的A6突变体。(A)MDBK细胞中的病毒转染体生长曲线。在0.01MOI的条件下用野生型病毒(WT)或A6突变体(A6)对细胞进行感染。通过在MDBK细胞中的噬斑测定法测量在指定时间点释放到培养基中的感染性颗粒的效价。(B)野生型病毒(WT)与A6突变体(A6)的NA活性。NA活性表示为每微克病毒蛋白每分钟释放的4-甲基伞形酮的纳摩尔数。(C)转染细胞中的NA蛋白表达。测定被A6突变体(a和b图)、野生型病毒(c和d图)感染的细胞以及假感染细胞(e和f图)的NA蛋白表达。NA蛋白的表达是用FITC标记抗体经荧光显微镜来进行检测。在含有4’，6-二氨基-2-苯吲哚(DAPI)的抗漂白固定剂中对细胞进行DNA染色。第2列图像为NA蛋白表达与细胞核的融合图像。注意并非所有细胞都被病毒感染。
图5显示NA特异性vRNA的引物延伸测定。(A)被A6突变体(A6)和野生型病毒(WT)感染的细胞中NA特异性vRNA的水平。在指定时间点p.i.分离出感染细胞的总RNA。图中显示出NA(259nt)和NS(196nt)vRNA的预期产物。(C)用A6突变体(A6)或野生型病毒(WT)感染的细胞中NA vRNA与NS vRNA的比率。
图6显示NA特异性cRNA和mRNA的引物延伸测定。(A)被A6突变体(A6)和野生型病毒(WT)感染的细胞中NA特异性cRNA和mRNA的水平。在指定时间点p.i.分离出感染细胞的总RNA。图中显示出NAcRNA(142nt)、NA mRNA(152-157nt)、HA cRNA(94nt)及HA mRNA(104-109nt)的预期产物。由于流感病毒mRNAs起始于大小不同的加帽引物，所以其引物延伸产物应产生一种比cDNA的产物长10-15nt的宽带。(B)用A6突变体(A6)或野生型病毒(WT)感染的细胞中NA cRNA与HA cRNA的比率。(C)用A6突变体(A6)或野生型病毒(WT)感染的细胞中NA mRNA与HA mRNA的比率。
图7显示poly(U)尾NA mRNA主要位于细胞核内。用NA mRNA特异性探针(A-I图)或poly(U)尾NA mRNA的特异性探针(J-R图)与A6突变体感染细胞(A-C图和J-L图)、野生型病毒感染细胞(D-F图和M-O图)以及假感染细胞(G-I图和P-R图)杂交。细胞核用DAPI染色(第1列)。相应探针的分布用荧光显微镜来进行观测(FITC；第2列)。第3列(Merge)为第1列与第2列的融合图像。注意并非所有细胞都被病毒感染。
以下实施例也可对本发明进行说明。实施例1 流感病毒多聚U段的替换对表达的影响
在流感病毒vRNA模板的模型中用多聚A段替换其多聚U段(图1)可使得体外与体内合成的mRNA都带有poly(U)尾。为检验poly(U)尾mRNA能否用于基因表达，我们采用了一种基于质粒的氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告***。将CAT vRNA表达质粒pPOLI-CAT-RT(19)转染到人293肾细胞中，以合成一种含有反向CAT基因且基因两侧为A/WSN/33型流感病毒第8片段5’及3’非编码区的vRNA样模板。并且将编码PB1、PB2、PA和NP病毒蛋白的四种蛋白表达质粒共转染到细胞内，以复制和转录CAT vRNA模板。为了合成poly(U)尾mRNA，将CAT vRNA模板5’非编码区内的多腺苷酸化位点(U6段)突变成A6段。在其它文献中(1)已严格证明了poly(U)存在于由该突变模板转录出的mRNA的3’端。
当用野生型CAT vRNA表达质粒转染细胞时可观测到强烈的CAT活性(图2，1-4泳道)。但是把U6→A6构建体(见上文)转染到细胞内后只观测到很低(野生型的3±1.5％)但很明显的CAT活性(图2，将第5和第6泳道与第1-4泳道相比)。相比之下，用含有U6→UCUACG“随机”突变的对照质粒转染的细胞未检测到CAT活性(图2，第7和第8泳道)。这些结果证明，聚合酶停止、聚合酶滑脱以及同聚核苷酸尾合成需要vRNA 5’端附近含有同聚核酸段。由于将U6段突变成“随机”序列时不能检测到基因表达(图2，第7和第8移动)，因而这些结果还说明同聚核酸段(U6或A6)是基因表达所必需的。实施例2 可编码带有poly(U)尾的NA特异性mRNA的流感病毒的拯救
由于转录自CAT vRNA的poly(U)尾mRNA可被翻译，所以尽管其效率很低，但对能否拯救可合成poly(U)尾mRNA的流感病毒转染体的问题进行检测仍很有意义。我们决定用一种A6序列替换NA片段vRNA上的多核苷酸化信号(U6)，这在一定程度上是由于可获得用于该基因片段的高效拯救***(7)，并且已知流感病毒可耐受NA蛋白水平的剧烈降低。为了构建一种在NA片段多腺苷酸化位点含有A段的病毒转染体(此后称为A6突变体)，首先将5’端非编码区内含有U6→A6突变的合成NA vRNA重构成核糖核蛋白(RNPs)。然后将重构的RNPs转染到已被A/WSN/HK辅助病毒感染的细胞中(8)。在3次独立的转染实验中均拯救到了野生型病毒和A6突变体病毒。但是把U段突变成一种随机序列(UCUACG)时不能拯救出病毒转染体。将病毒转染体噬斑纯化3次，取每种病毒的单噬斑用于进一步分析。
为了证实U6→A6突变存在于A6突变体的NA vRNA中，由纯化的病毒分离出vRNA，并利用RT-PCR进行扩增、克隆和测序。除了引入的U6→A6突变以及第195位残基的G→C突变(显示于图3B)外，在该片段的5’和3’非编码区内未检测到其它突变(数据未给出)。额外的G→C突变是在RNP’s重构前产生U6→A6突变体NA质粒的诱变方案中无意间引入的。此前的研究结果(见(29)的NA5D构建体)说明，位于NA片段5’非保守非编码区的该额外突变不应对U6→A6突变体的性质产生影响。
甚至将A6突变体在MDBK细胞上传代10次之后亦可检测到该U6→A6突变(数据未给出)，这说明U6→A6突变至少可在10次传代过程中保持稳定。实施例3 在被A 6 突变体感染的细胞中检测poly(U)尾NA mRNA
为了证实NA vRNA中的U6→A6突变可以使合成的NA mRNA含有poly(U)尾，我们从野生型病毒感染细胞或A6突变体感染细胞中分离出总RNA。然后通过专用来检测poly(A)尾mRNA或poly(U)尾mRNA的RT-PCR测定方法对总RNA进行检测(22)。在逆转录反应中分别用5’-GC-封端T20引物和5’-GC-封端A20引物检测poly(A)尾mRNA或poly(U)尾mRNA。其结果是呈现出如前人所述的特征性拖尾的阳性信号(22)。如图3A所示，在分离自A6突变体感染细胞(第6泳道)的总RNA中检测到了poly(U)尾NA mRNA，但在分离自野生型病毒感染细胞(第5泳道)的总RNA中未检测到。相比之下，poly(A)尾NA mRNA仅在分离自野生型病毒感染细胞(第8泳道)的总RNA中检测到，而在分离自A6突变体感染细胞(第9泳道)的RNA中未检测到。这些结果说明，poly(U)尾NA mRNA可在A6突变体感染细胞中特异性合成，并且不被多腺苷酸化。图3A的第2和第3泳道分别显示相当于由野生型感染细胞和A6突变体感染细胞分离的NA vRNA的5’端的RT-PCR产物。该强信号与134个核苷酸(nt)的DNA标记共迁移，说明用来分离RNA的细胞不出所料地被病毒所感染。然后将来自poly(U)尾NAmRNA的RT-PCR产物(第6泳道)克隆并测序(见“材料与方法”)。共发现9个含有poly(U)序列的独立克隆，序列长度为40-127个核苷酸不等。图3B显示的一个例子是84个残基的poly(U)尾。实施例4 通过隆低NA蛋白的表达来时A 6 突变体进行减毒
在Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞上生长的A6突变体可稳定产生小噬斑(数据未给出)，提示该突变体已被减毒。为了更详细地鉴定A6突变体的生长特性，在感染重数(moi)为0.01的条件下对铺满培养的MDBK细胞进行感染，并通过在MDBK细胞上的噬斑测定法来测量释放到培养基中的感染性病毒颗粒的数量。从菌斑的大小来看，A6突变体已被减毒。A6突变体最大的菌斑效价约比野生型的低1log(图4A)。另外还在Madin-Darby牛肾(MDCK)细胞上对A6突变体进行了测试，其最大的噬斑效价同样约比野生型病毒低1log(数据未给出)。
根据CAT报告基因的研究(见上文，图2)，A6突变体被减毒的原因很可能是NA蛋白的表达水平降低。为了验证这种可能性，我们用荧光光谱测定法(见“材料与方法”)来分析与纯化病毒有关的NA活性。A6突变体的NA活性约为野生型的8％(图4B)。然后我们使用了抗NA的单克隆抗体，其结果表明，被感染细胞内NA蛋白的低水平表达是病毒体内NA蛋白减少的原因。如图4C所示，NA在野生型病毒感染细胞的胞质内高水平表达(d图)。与此相反，A6突变体感染细胞的NA蛋白表达明显降低(b图)。尽管免疫荧光测定的结果不是定量的，但该结果与图4B的结果相符，显示出整合成病毒体的NA的量降低。此外，这些结果还表明，A6突变体被减毒的原因是被其感染的细胞内NA蛋白的表达水平降低。实施例5 特异性降低的有NA vRNA及mRNA的水平，但不包括cRNA的水平
以上结果表明，A6突变体感染细胞内的NA蛋白表达急剧减少。这种减少可能是由于被感染细胞内poly(U)尾mRNA的合成水平下降。为了验证这一假设，在不同时间点分离出被感染细胞的总RNA，并通过引物延伸测定法确定NA特异性vRNA、cRNA和mRNA的量。在对NA vRNA的引物延伸测定中，将NS vRNA作为一种内部对照。如图5A所示，在每个测试的时间点，A6突变体感染细胞内的NA vRNA水平都比野生型病毒感染细胞低。相比之下，A6突变体感染细胞与野生型病毒感染细胞内的NS vRNA水平相似。将感染细胞内的NA vRNA水平相对于NS vRNA水平校准，则A6突变体的稳态NA vRNA水平是野生型的40-53％(图5C)。我们还测定了病毒体的NA vRNA含量(图5B)。病毒转染体(A6突变体)的NA vRNA含量约为野生型的60％(图5B)。由于cRNA和mRNA都是有义链，所以使用相同的NA特异性引物对这两种RNA进行分析。在引物延伸反应中用血凝素(HA)特异性引物作为内部对照。如图6A所示，野生型病毒感染细胞内的NA mRNA多于NA cRNA。相比之下，A6突变体感染细胞内的NA mRNA信号比NA cRNA信号弱得多。这些结果表明，poly(U)尾mRNA的合成水平降低。将NA cRNA的水平相对于内部对照(即HA cRNA)校准，用斯氏检验法(3次独立实验)未发现A6突变体与野生型病毒的稳态NA cRNA水平有统计学上的差异(图6B)。相比之下，将NA mRNA相对于内部对照(即HA mRNA)校准，A6突变体感染细胞的稳态mRNA只有野生型感染细胞的约40-50％(图6C)。这些结果说明，合成水平降低的是A6突变体的NA mRNA，而不是NA cRNA。实施例6 poly(U)尾NA mRNA主要位于细胞核内
尽管A6突变体感染细胞的NA mRNA水平降低，但这不能充分解释A6突变体NA活性的急剧下降(野生型的8％；图4B)。由于流感病毒mRNAs的合成是在被感染细胞的核内进行，因而可能是poly(U)尾NAmRNA在向核外运输方面存在缺陷。为了回答这个问题，我们用荧光原位杂交方法来观察poly(U)尾NA mRNA在被感染细胞中的分布(图7)。首先使用有义NA RNAs特异性核糖探针(即mRNA和cRNA都可检测)(图7，A-I图)。由于在感染过程中，cRNA的合成量低于mRNA，并且在整个病毒感染过程中保持在核内，所以可假定胞质中的任何阳性信号都代表mRNAs，而核内的信号主要代表mRNA，尽管cRNA会在该信号中占有一部分。如图7所示(D-F图)，野生型病毒感染细胞在胞质内显示出强烈的信号。这些结果说明，poly(A)尾mRNA不出所料地从细胞核运输到细胞质。相比之下，A6突变体感染细胞只能在细胞核内检测到有义NA RNAs(图7，A-C图)，这说明poly(U)-mRNAs在核运输方面存在缺陷，从而主要保留在细胞核内。在假感染样品中未检测到信号(图7，G-I图)。
为了证实poly(U)尾mRNA在合成后主要保留在核内，原位杂交实验中使用的核糖探针对poly(U)尾NA mRNA有特异性，对NA cRNA则不具特异性。不出所料，在野生型病毒感染细胞(图7，M-O图)或假感染细胞(图7，P-R图)内未检测到poly(U)尾NA mRNA。相比之下，在A6突变体感染细胞(图7，J-L图)中则检测到poly(U)尾NA mRNA。更重要的是，检测到的poly(U)尾NA mRNA主要位于感染细胞的核内(图7，J-L图。总之，这些结果表明poly(U)尾NA mRNA在合成后主要保留在细胞核内，这强烈地说明poly(U)尾mRNA在核运输方面存在缺陷。实施例7 A 6 突变体的致病性和作用
利用Balb/C小鼠确定A6突变体的致病性及其产生的保护作用。为研究致病性，用不同效价的野生型或突变病毒诱发小鼠，然后观察肺炎症状。为研究突变病毒的保护作用，用突变流感病毒感染小鼠，再通过野生型流感病毒感染来诱发小鼠，并观察其病况。小鼠流感诱发模型是为研究流感感染而建立的***，长期用来检测抗流感疫苗或抗病毒复合物的作用。
此次研究使用随机分配的42只6-12周龄雌性Balb/C小鼠(Charles River UK Ltd)。将小鼠分成7组，每组6只，对所有小鼠进行电标记，以区分各组的每只小鼠。第0天，用氟烷/氧麻醉所有小鼠，并用50μl流感病毒进行鼻内感染，记录每只小鼠的体重。如表1所示用野生型或突变病毒向7组小鼠给药。每天观察各小鼠的临床症状并称重。显示出流感前期症状或体重降低20％或更多的小鼠均按照Home Office方案的1方法无痛处死。所有小鼠的综合健康评分标准为0分(完全健康)到8分。评分大于7分的小鼠均无痛处死，并在其余实验中记为8分。剩余实验还记录了被处死小鼠的最终体重组平均值。感染后的所有小鼠都进行21天的观察。A/WSN/33野生型组的所有存活小鼠都按照Home Office方案的1方法处死。在感染后第21天，用50μl A/WSN/33野生型病毒对所有剩余小鼠(包括未感染的对照组)进行第二次感染。每天观察所有小鼠的临床症状。处死的标准如前所述。在第2次感染第10天后处死剩余小鼠。表2显示该致病性研究的结果。根据观察，被野生型病毒感染的小鼠的健康在第2或第3天以前即受到严重影响，且大多数必须被处死。相比之下，被最大剂量突变病毒感染的一组小鼠中只有少数在第7或第8天显示出轻微的影响。而在较低剂量情况下未观测到有害影响。
表3显示保护作用研究的结果。用poly(U)变体病毒初次感染后再用野生型病毒诱发的小鼠的健康及体重指标明显优于对照组。未受保护的对照组在诱发后2天内即显示出对健康的严重影响和体重下降。而在此前已被任意剂量的突变病毒感染的小鼠中，对健康的影响和体重下降都明显减轻，最高剂量组则几乎没有影响。因此，突变体病毒在对抗通常为致命剂量的野生型流感病毒方面具有明显的保护作用。讨论
流感病毒vRNA模板上的多腺苷酸化位点定位于vRNA 5’端附近的尿嘧啶残基段。在本发明中，我们设计了一种在NA vRNA片段5’端含有一个U6→A6突变的流感病毒。U6→A6突变的结果是，这种新病毒转化体合成了一种含有poly(U)尾而不是通常的poly(A)尾的NA mRNA。由于poly(U)尾NA mRNA缺乏多腺苷酸化病毒信号，所以在NA mRNA中未检测到任何poly(A)序列的结果并不出人意料。此外，该mRNA不包含用于真核细胞多腺苷酸化机制的信号。因而任何已知的宿主酶都不可能在poly(U)尾NA mRNA上添加poly(A)序列。有趣的是，在A6突变体感染细胞中可检测到低水平的NA表达，这表明poly(U)尾NA mRNA可以被翻译。令人吃惊的是，U6→A6突变在病毒传代过程中十分稳定；甚至在病毒传代10次后也未在A6段中发现逆转突变。相比之下，把U6段突变成随机序列(TCTACG)时不能拯救出病毒，这表明多腺苷酸化位点的同聚核酸段是mRNA合成所必需的。在CAT报告测定中，U6→TCATCG突变使CAT不能表达(图2)，这也证实了前面的结果。
A6突变体在细胞培养物中被减毒。我们测定的突变体病毒NA活性只相当于野生型病毒NA活性的约8％，这与A6突变体感染细胞的NA表达下降程度相符。已知NA可通过去除细胞表面及病毒糖蛋白上的唾液酸来促进病毒颗粒由细胞表面释放，并由此来促进病毒的扩散。因此，A6突变体被减毒的原因很可能是NA在细胞内表达的水平降低。
我们发现被感染细胞中poly(U)尾NA mRNA的水平降低，这表明NA低水平表达的原因可能是poly(U)尾NA mRNA的含量较低。由于含U6段或A6段的vRNA模板模型能够在体外合成数量相似的mRNA(1)，因而A6突变体的突变NA vRNA不会是一种在合成poly(U)尾mRNA方面效率较低的模板。NA vRNA水平的下降更可能是观测到Poly(U)尾NAmRNA水平降低的原因。我们测定感染细胞内稳态vRNA水平的结果是，NA vRNA的水平降低了50％。vRNA 3’及5’端的非保守核苷酸在复制过程中具有重要作用。U6→A6突变使cRNA和vRNA的非保守序列改变，它可能会以某种方式对复制过程进行减量调节。但该突变不会影响A6突变体的NA cRNA水平。在野生型病毒感染过程中，vRNA可被运送到细胞质以包装成子代病毒体，或可作为转录和复制的模板。以A6突变体感染过程为例，通常用于mRNA合成或被运送到细胞质的NA vRNAs可能会被NA cRNA合成过程所利用，以维持足够量的NA cRNA模板来合成NA vRNA。A6突变体病毒的NA活性(相当于野生型病毒NA活性的8％)急剧降低，这与A6突变体感染细胞中NA mRNA(相当于野生型病毒的50％)的下降程度并不相符。说明poly(U)尾mRNA的水平下降并不是影响NA表达的唯一因素。我们由原位杂交的结果(图7)发现，poly(U)尾NA mRNA和poly(A)尾NA mRNA的分布模式不同。poly(A)尾mRNA主要分布在细胞质。而poly(U)尾mRNA主要位于细胞核内。由于蛋白合成是在胞质内进行，所以poly(U)尾mRNA从细胞核向细胞质的运输过程出现缺陷会导致用于蛋白表达的mRNA的量减少。因此，被感染细胞内NA蛋白表达水平的急剧降低很可能是由poly(U)尾NAmRNA在细胞核内滞留造成的。我们在A6突变体感染细胞的胞质中未检测到NA mRNA(图7)，这说明胞质中的poly(U)尾NA mRNA水平低于我们的检测极限。另一方面，对被感染细胞(图4B)和A6突变体病毒(图4C)内NA蛋白的检测结果清楚地表明，有一定量的poly(U)尾NAmRNA可供翻译使用。因此，它必须要被运输(或扩散)到胞质中。
我们不知道是否把NA mRNA的poly(A)尾替换成poly(U)尾会影响翻译效率。但知道大部分poly(U)尾NA mRNA都停留在细胞核内，而A6突变体感染细胞内有明显的NA蛋白表达(相当于野生型的8％)，说明poly(U)尾NA mRNA足以充当翻译的模板。已知非多腺苷酸化的流感病毒mRNA可在体外条件下被翻译。目前的研究结果还表明，多腺苷酸化不是翻译所必需的。而我们的结果意味着病毒翻译的调控还涉及其它因素。已知病毒mRNA的5’非翻译区、NS1蛋白和一些细胞蛋白可促进病毒mRNA的翻译。因此，流感病毒mRNA的poly(A)尾并不是翻译所必需的，其最重要的功能可能是指导流感病毒mRNA从细胞核输出到细胞质。
已知与RNA运输有关的过程涉及几种流感病毒蛋白。举例来说，已知核蛋白和基质蛋白1能够与vRNA结合并促进其向核外运输。最近发现NS2(被称为NEP)在介导病毒RNP输出方面具有与HIV-1的Rev蛋白相似的功能。但这些蛋白似乎只限于介导vRNA向核外运输。NS1蛋白可能与细胞的3’端加工体系相互作用并抑制细胞中含有poly(A)的mRNAs向核外运输。但有新证据表明，NS1的这些功能在某些条件下并非病毒复制所必需的。由于流感病毒mRNAs具有与细胞mRNAs相似的结构〔如5’帽和poly(A)尾〕，所以流感病毒mRNAs利用细胞mRNA运输***向核外运输并不奇怪。
真核细胞中细胞前mRNAs的成熟是向核外运输的先决条件，支持这一观点的证据越来越多。添加poly(A)尾可刺激mRNA输出的发现也符合此观点。另外还发现，非多腺苷酸化的组蛋白mRNAs向核外运输前需要产生成熟的3’末端。此时在缺乏成熟mRNA的特征性信号〔如poly(A)尾〕的情况下，细胞的核输出因子可能会把A6突变体的poly(U)尾NA mRNA当作前mRNA，并将poly(U)尾mRNA保留在核内。由于通过流感病毒RNA聚合酶合成poly(A)尾无需使用细胞的切割/多腺苷酸化体系，所以我们的结果意味着poly(A)序列本身是mRNA高效输出所必需的。
另一方面，poly(U)尾本身可能是一种核滞留信号。真核细胞中与核内mRNA结合的几种细胞蛋白可在mRNA向核外输出前被选择性去除，说明这些细胞蛋白中可能有一些与核滞留有关。有趣的是，参与mRNA核滞留的hnRNP C蛋白显示出与poly(U)序列结合的倾向性。我们推测hnRNP C蛋白或其它核滞留因子(细胞的和病毒的)能够与poly(U)尾mRNA的poly(U)序列特异性结合，并阻碍poly(U)尾mRNA从细胞核向细胞质运输。材料与方法
病毒A/WSN/HK型流感病毒是一种重排列体病毒，含有来自A/HK/8/86型流感病毒的一种NA片段，所有其它片段则来自A/WSN/33型流感病毒，它可在鸡胚卵中生长。X-31型流感病毒是A/HK/8/86型流感病毒与A/PR/8/34型流感病毒的重排列体。
质粒转染和CAT测定分别表达流感PB1、PB2、PA和NP蛋白的pGT-h-PB1、pGT-h-PB2、pGT-h-PA和pGT-h-NP质粒以及pPOLI-CAT-RT质粒由P.Palese(1，19)慷慨提供。用25μl DOTAP转染试剂(Boehringer Mannheim)按厂商说明将1μg的每种质粒转染到293细胞中。突变形式的pPOLI-CAT-RT质粒是根据反向PCR技术用Pfu DNA聚合酶来加以制备，并通过DNA测序来验证突变序列。在转染后约60小时，收集细胞提取物并按前人所述(23)测定CAT活性。将50μl未稀释的或稀释的细胞提取物保温在含有0.08μCi[14C]氯霉素、1mM已酰辅酶A和250mM Tris-HCl(PH7.5)的75μl反应混合物中。37℃保温2小时后，用乙酸乙酯抽提反应产物，然后由薄层层析将反应产物分离。用放射自显影技术检测乙酰化产物，并用磷光成像仪进行分析。
A型流感病毒RNP的制备和RNP转染如前人所述(25)从A型流感病毒X-31毒株中分离出RNA聚合酶及核蛋白。简单地说，用Triton X-100、NP-40和溶血卵磷脂将病毒裂解。用甘油分步梯度离心法将RNP分离。将富含RNP的组分进行细球菌核酸酶处理，再添加EGTA，然后用于RNP转染。编码A/WSN/33型流感病毒野生型NA vRNA全长片段的pT3NAM1质粒(5)由P.Palese慷慨提供。突变形式的质粒是根据逆转录PCR技术用Pfu DNA聚合酶来加以制备，并通过DNA测序来验证突变序列。RNP的转染是按前人所述(8)进行。简单地说，在37℃和存在经细球菌核酸酶处理的RNP的条件下，用T3 RNA聚合酶将BpuAI-线性化的pT3NAM1转录30分钟。用DEAE-葡聚糖将重构的RNP复合物转染到已被A/WSN/HK型流感辅助病毒感染的MDBK细胞中。保温1天后，用噬斑测定法在MDBK细胞上检测被转染细胞的培养基中是否存在病毒转染体。
病毒纯化在覆盖有琼脂培养基的MDBK细胞中将病毒转染体噬斑纯化3次。然后使纯化病毒在MDBK细胞中生长，并经30％蔗糖垫纯化，然后在30-60％的蔗糖梯度上纯化。
NA基因的5’及3’端测序利用5’DNA末端快速扩增法(5’RACE)获得病毒转染体NA片段的5’端cDNA克隆。利用引物5’-GGGTGTCCTTCGACCAAAAC-3’(与NA vRNA的第879-898位核苷酸互补)和SuperScriptII逆转录酶(Gibco BRL)将纯化病毒转染体的NA vRNA逆转录。利用末端脱氧核苷酸转移酶在逆转录产物的3’端添加poly(C)尾。利用引物5’-TGGACTAGTGGGAGCATCAT-3’(与NA vRNA的第1280-1299位核苷酸互补)和5’RACE简化锚定引物按厂商说明(GibolBRL)对poly(C)尾cDNAs进行PCR扩增。然后将PCR产物克隆到pGEM-T载体中(Promega)并测序。在合成NA片段的3’端序列cDNA时，首先利用poly(A)聚合酶(Gibco BRL)将纯化病毒的vRNAs多腺苷酸化。再利用引物5’-GCGCTCTAGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTAGC-3’将多腺苷酸化的vRNA逆转录。利用该逆转录引物以及相当于NA vRNA第1197-1220位核苷酸的引物5’-GTTGAGTCCTGCCC AGCAACAACT-3’对cDNA进行PCR扩增。然后将PCR产物克隆到pGEm-T中并测序。
NA活性测定NA活性的测定按前人所述(25)进行。简单的说，在100μl含有1mM CaCl2和50nmol 2’-(4-甲基-伞形酮基)-α-D-N-乙酰神经胺酸(MU-NANA)(Sigma)的150mM磷酸缓冲液中将纯化病毒(～3μg)37℃保温10分钟。然后加入2ml 0.5M甘氨酸-NaOH(pH10.4)以终止反应，并利用荧光仪(Shimadzu，RF-540)测定释放出的4-甲基伞形酮。标准对照为0.1mM的4-甲基伞形酮(Sigma)溶液。
免疫荧光显微术用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗生长在盖玻片上的MDBK细胞，然后在约0.5moi的条件下用病毒进行感染。感染后10小时收集感染细胞，用PBS清洗两次，再用含4％多聚甲醛的PBS固定。用含有0.5％Triton-X-100的PBS将固定细胞透析15分钟，再用PBS清洗两次。然后用稀释100倍的鼠抗NA单克隆抗体(H17-L17-5；由Walter Gerhard慷慨捐赠)将细胞4℃保温过夜。用含有0.01％Triton-X-100的PBS将细胞清洗两次，然后用荧光素偶联马抗鼠抗体(Vector；1∶200稀释)室温保温1小时。用含有0.01％Triton-X-100的PBS将样品清洗两次，然后在含有4’，6’-二氨基-2-苯吲哚(DAPI)的抗漂白固定剂中进行DNA染色。用Zeiss Axiophot显微镜对样品进行镜检。
对感染细胞的mRNA和vRNA进行RT-PCR测定在2moi条件下用病毒感染MDBK细胞，感染后12小时收集细胞。用Trizol(GibolBRL)按厂商说明分离总RNA。检测NA vRNA时，首先在42℃用NA vRNA特异性引物5’-GGGTGTCCTTCGACCAAAAC-3’(与NA vRNA的第879-898位核苷酸互补)以25U的Moloney鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV RT，Promega)将约1.5μg总RNA逆转录30分钟。再用5’-TGGACTAGTGGGAGCATCAT-3’(与NA vRNA的第1280-1299位核苷酸互补)和5’-ggactagtagt AGTAGAAACAAGG-3’(加下画线的核苷酸相当于NA vRNA的5’端前13个核苷酸)引物以Taq聚合酶将逆转录产物扩增。
检测NA mRNA同聚核苷酸尾的RT-PCR是按前人所述进行(22)。首先在42℃条件下用5’GC-封端T20引物〔5’-GCCCCGGGATCCT20-3’，对poly(A)尾mRNA有特异性〕或5’GC-封端A20引物〔5’-GCCCCGGGATCCA20-3’，对poly(U)尾mRNA有特异性〕以25U的M-MLV RT(Promega)将约1.5μg总RNA逆转录30分钟。然后用5’-TGGACTAGTGGGAGCATCAT-3’(与NA基因的第1280-1299位核苷酸互补)和对同聚核苷酸尾具有特异性的相应引物Taq聚合酶将逆转录产物扩增。再把所有的PCR产物克隆到pGEM-T中并测序。
引物延伸测定在指定时间点用Trizol(Gibco BRL)分离出在2moi条件下被病毒感染的细胞的总RNA。引物延伸测定是按前人所述进行(25)。在42℃条件下用32P标记的相应引物以200U的SuperScript(Gibco BRL)将约0.2μg病毒RNA或5μg总RNA逆转录45分钟。加入等体积的甲酰胺加样染料以终止反应。然后将产物于99℃加热2分钟，并在5％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶上进行分析。将凝胶干燥并用磷光成像仪进行分析，以确定逆转录产物的产量。
用NA vRNA特异性引物(5’-GTGGCAATAACTAATCGGTCA-3’，与NAvRNA的第1151-1171位核苷酸互补)和NS vRNA特异性引物(5’-GGGAACAATTAGGTCAGAAGT-3’，与NS vRNA的第695-715位核苷酸互补)进行引物延伸测定，以确定NA vRNA及NS vRNA的水平。NA与HA的mRNA和cRNA水平则分别利用NA cRNA/mRNA特异性引物(5’-GTTGAGTCCTGCCCAGCAACAACT-3’，与NA vRNA的第142-122位核苷酸互补)和HA cRNA/mRNA特异性引物(5’-CATATTGTGTCTGCATCTGTAGCT-3’，相当于HA vRNA的第94-71位核苷酸)来加以测定。
原位杂交用PBS清洗生长在盖玻片上的MDBK细胞，然后在0.5moi的条件下用病毒进行感染。感染后8小时收集感染细胞，用PBS清洗两次，再用含4％多聚甲醛的PBS固定。然后在室温下用含有0.5％Triton X-100的PBS将固定细胞透析15分钟。PBS清洗两次，再用2×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)清洗两次。用20μl含有约100ng核糖探针的杂交缓冲液(50％甲酰胺，2×SSC，10％硫酸葡聚糖，1mg/ml大肠杆菌tRNA)与样品37℃杂交过夜。用37℃的杂交缓冲液将杂交后的细胞清洗两次，然后在室温下依次用2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC各清洗细胞15分钟。再用含有1μg/ml抗地高辛-荧光素抗体(Boehringer Mannheim)的4×SSC将样品室温下保温1小时。用含有0.01％Triton X-100的4×SSC将保温后的样品清洗3次，然后在含有DAPI的抗漂白固定剂中进行DNA染色(Vector)。用Zeiss Axiophot显微镜对样品进行镜检。
NA cRNA和NA mRNA的检测是利用T3 RNA聚合酶将BamH1-线性化pT3NAM1转录，以制备出一种核糖探针(相当于NA vRNA的第1-299位核苷酸)。poly(U)尾mRNA的检测是构建一种含有poly(A)序列和NA基因3’端部分序列的质粒。该质粒的转录产物含有一段由86个A残基〔对poly(U)尾有特异性〕和NA mRNA最后21个NA特异性残基构成的序列。在体外转录过程中，这两种核糖探针都用地高辛-UTP(Boehringer Mannheim)标记。
                  参考文献
1.Poon，L.L.M.，D.C.Pritlove，E.Fodor，and G.G.Brownlee.1999.通过vRNA模板中U段的顺序重复拷贝可合成A型流感病毒mRNA的poly(A)尾的直接证据。J.Virol.73：3473-3476.
2.Muster T.，Ferko B.，Klima，A.et al.1995.用嵌合流感病毒对1型人类免疫缺陷病毒进行免疫的粘膜模型。J.Virol.69，6678-86.
3.Li.S.，Polords，V.，Isobe，H.et al.1993.嵌合流感病毒可诱导抗1型人类免疫缺陷病毒的中和抗体及细胞毒性T细胞。J.Virol.67，6659-66.
4.Rodrigues，M.，Li，S.，Murata，K，Rodrigues D.1994.表达疟疾CD8+T细胞及B细胞表位的流感病毒和牛痘病毒。J.Immunol.153，4636-48.
5.Garcia-Sastre，A.，T.Muster，W.S.Barclay，N.Percy，and P.Palese.1994.利用哺乳动物内部核糖体进入位点元件由流感病毒转染体表达一种外源蛋白。J.Virol.68：6254-6261.
6.Percy，N.，Barclay，W.S.，Garcia-Sastre，A.and Palese，P.1994.利用A型流感病毒表达一种外源蛋白质。J.Virol 68，4486-92.
7.Enami，M.，W.Luytjes，M.Krystal，and P.Palese.1990.在流感病毒基因组中引入定点突变。Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：3802-3805.
8.Enami，M.，and P.Palese.1991.高效组建流感病毒转染体。V.Virol.65：2711-2713.
9.Garcia-Sastre，A.and Palese，P.1993.负链RNA病毒基因组的遗传操作。Ann.Rev.Microbiol.47，765-90.
10.Luytjes，W.，M.Krystal，M.Enami，J.D.Parvin，andP.Palese.1989.利用流感病毒对一种外源蛋白进行扩增、表达和组装。Cell.59：1107-1113.
11.Li，S.，Xu，M.and Coelingh，K.1995.用来拯救核蛋白和基质基因的核糖核蛋白复合物电穿孔法。Virus Res.37，153-161.
12.Muster，T.and Garcia-Sastre，M.June 1998.流感教程，Blackwe11 Science Ch.9，p.93-106，流感病毒的遗传操作。
13.Liu，C.and Air，G.M.1993.流感病毒神经氨酸苷酶负链突变体的筛选方法和性质及其利用神经氨酸苷酶克隆基因的拯救方法。Virology 194，403-7.
14.Enami，M.，Sharma，G.，Benham，G.and Palese，P.1991.含有9种不同RNA片段的流感病毒。Virology，185，291-8.
15.Subbarao，E.K.，Park，E.J.，Lawson，C.M.，Chen，A.Y.and Murphy，B.R.1995.在A型流感病毒转染体PB2基因中顺序添加温度敏感性错义突变可导致温度敏感性及减毒作用加强并可用于基因工程A型流感病毒活体疫苗的合理设计。J.Virol.69，5969-77.
16.Castrucci M.R.and Kawaoka，Y.1995.利用反向遗传学***产生含有C端残基缺失的M2蛋白的A型流感病毒突变体。J.Virol.69，2725-8.
17.Horimoto，T.and Kawaoka，Y.1994.利用反向遗传学为血凝素可裂解性与A型鸟类流感病毒毒性相互关系提供直接证据。J.Virol.68，3120-3128.
18.Barclay，W.S.and Palese，P.1995.含有被引入定点突变的NA基因的B型流感病毒。J.Virol.76.3211-5.
19.Pleschka，S.，Jaskunas，R.，Engelhardt，O.G.，Zurcher，T.，Palese，P.and Garcia-Sastre，A.1996.可用于A型流感病毒的一种基于质粒的反向遗传学***。J.Virol.70，4188-92.
20.Enami，M.1997.流感病毒遗传操作技术进展。RNA病毒研究前沿p.19，The Oji International Seminar in Natural Science，Kyoto，Japan 1997.
21.Ferko，B.，Egorov，A.et al.1997.用流感病毒作为粘膜免疫的载体。RNA病毒研究前沿p.18，The Oji InternationalSeminar in Natural Science，Kyoto，Japan.
22.Pritlove，D.C.，L.L.M.Poon，E.Fodor，J.Sharps，and G.G.Brownlee.1998.由病毒体RNA模板模型体外转录的mRNA的多腺苷酸化需要5’保守序列。J.Virol.72：1280-1286.
23.Gorman，M.，L.F.Moffat，and B.H.Howard.1997.在哺乳动物细胞中表达氯霉素乙酰转移酶的重组基因组。Mol.Cell.Biol.2：1044-1051.
24.Seong，B.L.，and G.G.Brownlee.1992.将流感病毒聚合酶与RNA体外重构的一种新方法：对用于cRNA和vRNA体外合成及体内拯救的启动子元件的研究。Virology 186：247-260.
25.Fodor，E.，P.Palese，G.G.Brownlee，and A.Garcia-Sastre.1998.启动子突变使A型流感病毒的mRNA水平降低。J.Virol.72：6283-6290.
26.Egorov，A.et al.1998.NS1蛋白大段缺失的A型流感病毒转染体可在Vero细胞中有效生长。J.Virol.72：6437-6441.
27.Fodor et al.1999.由重组DNA拯救A型流感病毒。J.Virol.73：9679-9682.
28.Neumann et al.1999.完全用克隆cDNA产生A型流感病毒。Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96：9345-9350.
29.Zeng et al.1996.A型流感病毒RNA 3’及5’端的非保守核苷酸在病毒复制过程中具有重要作用。Virology 217：242-251.
表1.免疫方案
组别     抗原第0天 病毒诱发后第21天
    1     A/WSN/33 wild type1×106pfu     N.A.
    2     A/WSN/33 wild type3×104pfu     N.A.
    3     A/WSN/33 wild type1×103pfu     N.A
    4     A/WSN/33 A6 mutant1×106pfu     A/WSN/33 wild type1×106pfu
    5     A/WSN/33 A6 mutant3×104pfu     A/WSN/33 wild type1×106pfu
    6     A/WSN/33 A6 mutant1×103pfu     A/WSN/33 wild type1×106pfu
    7     (PBS)     A/WSN/33 wild type1×106pfu
表2.突变病毒的毒性重量-初重的平均百分率(各组均以第0天为100)Day                            1      2      3      4      5      6      7      8      9      10     11     12     13     14     15     16     17     18     19     20     21Group 1 wild type 1×10^6pfu   103.9  96.5   92.1   89.8   89.4   89.6   89.5   88.7   88.6   88.5   88.7   88.8   88.7   88.5   88.9   89.6   88.6   89.6   89.8   89.7   90.5Group 2 wild type 3×10^4pfu   103.9  93.9   86.3   80.8   78.5   78.5   78.5   78.5   78.5   78.5   78.5   78.5   78.5   78.5   78.5   78.5   78.5   78.5   78.5   78.5   78.5Group 3 wild type 1×10^3pfu   103.6  101.0  92.7   88.3   84.1   82.3   79.9   79.7   80.5   80.6   81.9   82.2   82.7   82.3   82.7   83.2   83.0   83.2   84.0   83.8   84.4Group 4 mutant 1×10^6pfu      103.0  99.7   103.0  103.9  103.0  103.8  103.0  102.7  103.0  104.1  102.5  103.2  102.3  102.4  103.0  103.4  102.3  104.1  105.8  104.4  105.8Group 5 mutant 3×10^4pfu      102.6  104.9  104.4  105.9  105.1  104.5  103.6  103.7  106.2  105.1  106.2  107.9  107.7  108.2  109.3  108.8  107.6  110.4  112.1  109.5  110.3Group 6 mutant 1×10^3pfu      100.5  101.6  102.9  103.7  103.0  103.9  103.9  103.5  103.1  104.0  102.6  103.4  104.3  104.9  102.8  104.8  103.9  105.7  107.7  105.1  106.3Group 7 PBS                    104.9  106.0  106.2  107.3  106.4  106.5  105.6  104.9  105.5  105.6  104.7  107.8  106.9  106.6  106.8  108.2  107.5  107.6  108.6  106.9  107.8健康评分-每组平均值(各组均以第0天为0.00)Day                             1     2      3      4      5      6      7      8      9      10     11     12     13     14     15     16     17     18     19     20     21Group 1 wild type 1×10^6pfu    0.00  2.83   4.83   6.17   5.50   5.33   5.67   5.67   5.33   5.33   5.33   5.33   5.33   5.33   5.33   5.33   5.33   5.33   5.33   5.33   5.33Group 2 wild type 3×10^4pfu    0.00  3.17   4.83   6.50   8.00   8.00   8.00   8.00   8.00   8.00   8.00   8.00   8.00   8.00   8.00   8.00   8.00   8.00   8.00   8.00   8.00Group 3 wild type 1×10^3pfu    0.00  0.00   4.17   4.50   6.00   6.50   7.00   7.50   7.00   7.00   6.67   6.67   6.67   6.67   6.67   6.67   6.67   6.67   6.67   6.67   6.67Group 4 mutant 1×10^6pfu       0.00  0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   1.00   0.67   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00Group 5 mutant 3×10^4pfu       0.00  0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00Group 6 mutant 1×10^3pfu       0.00  0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00Group 7 PBS                     0.00  0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00表3.保护性研究重量-初重的平均百分率challenge    21   22   23   24   25   26    27   28   29   30    31    32    33    34    35Group 4  mutant     wild type 1×10^6 100  97.6 98.6 98.2 99.6 100.2 99.6 99.1 99.7 102.8 101.6 102.4 101.5 102.1 102.21×10^6 pfu         pfuGroup 5  mutant     wild type 1×10^6 100  96.6 94.8 96.0 98.9 99.2  99.9 99.5 98.8 101.8 102.6 102.2 100.2 101.6 102.13×10^4 pfu         pfuGroup 6  mutant     wild type 1×10^6 100  97.5 96.2 95.1 94.7 94.4  95.6 97.5 96.8 99.1  98.5  98.6  97.8  98.2  99.91×10^3 pfu         pfuGroup 7         PBS wild type 1×10^6 100  97.2 92.0 88.9 87.3 87.0  86.3 86.8 86.0 87.0  86.9  87.0  86.1  86.6  87.0pfu健康评分-每组平均值challenge     21   22   23   24   25   26    27   28   29   30    31    32    33    34    35Group 4  mutant     wild type 1×10^6 0.00 0.00 0.50 0.17 0.00 0.00  0.00 0.00 0.00 0.00  0.00  0.00  0.00  0.00  0.001×10^6 pfu        pfuGroup 5  mutant     wild type 1×10^6 0.00 0.00 1.33 0.83 0.83 0.00  0.00 0.33 0.00 0.00  0.00  0.00  0.00  0.00  0.003×10^4 pfu        pfuGroup 6  mutant     wild type 1×10^6 0.00 0.00 2.17 2.00 1.83 2.00  2.17 1.67 1.33 1.33  1.33  1.33  1.33  1.33  1.331×10^3 pfu        pfuGroup 7         PBS wild typ 1×10^6  0.00 0.00 4.00 4.33 5.50 5.67  5.83 5.33 5.33 5.33  5.33  5.33  5.33  5.33  5.33pfu
序列表<110>ISIS INNOVATION LIMITED<120>病毒疫苗<130>N77192A<140>PCT/GB00/02933<141>2000-07-28<150>GB 9917981.4<151>1999-07-30<150>US 60/146,145<151>1999-07-30<160>18<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>6<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：随机序列<400>1ucuacg                                                       6<210>2<211>6<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：随机序列<400>2tctacg                                                       6<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>3gggtgtcctt cgaccaaaac                                             20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>4tggactagtg ggagcatcat                                             20<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>5gcgctctaga attctttttt tttttttttt agc                              33<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>6gttgagtcct gcccagcaac aact                                        24<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>7gggtgtcctt cgaccaaaac                                             20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>8tggactagtg ggagcatcat                                             20<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>9ggactagtag tagtagaaac aagg                                        24<210>10<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>10gccccgggat cctttttttt tttttttttt tt                               32<210>11<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>11gccccgggat ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa                               32<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>12tggactagtg ggagcatcat                                             20<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>13gtggcaataa ctaatcggtc a                                           21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>14gggaacaatt aggtcagaag t                                           21<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>15gttgagtcct gcccagcaac aact                                        24<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>16catattgtgt ctgcatctgt agct                                        24<210>17<211>37<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：vRNA模板<400>17aguagaaaca aggnnnuuuu uunnnccugc uuuugcu                          37<210>18<211>198<212>DNA<213>流感病毒(Influenza virus)<400>18tgtggtgtga atggtgatac tgtagattgg tctaggccag gcggtgctga gttgccgttc 60accattgaca agtagtttct tctttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttnga ncccngggca 180annantnnng nggccccc                                               198

Claims (23)

1.一种负义单链RNA病毒，该病毒已通过将基因组核酸中的多聚U段替换成可被复制并且由该核酸转录出的mRNA带有多聚U尾的多聚A段的方法而被减毒。
2.权利要求1的一种病毒，其中的多聚A段以顺序反复机制复制。
3.权利要求1或2的一种病毒，其中该病毒为流感病毒。
4.权利要求3的一种病毒，其中该病毒为A型、B型或C型流感病毒。
5.权利要求3或4的一种病毒，其中的核酸可编码一种神经氨酸酶。
6.权利要求3、4或5的一种病毒，其中的核酸是天然流感病毒基因组RNA片段的一种突变体。
7.权利要求3-6之一的一种病毒，其中该病毒在MDCK细胞上的噬斑效价与亲本野生型病毒相比至少降低约0.5log。
8.以上权利要求之一的一种病毒，其中该病毒额外含有一种可在靶细胞内表达的异源编码序列。
9.权利要求8的一种病毒，其中所述异源编码序列可编码一种能够刺激对病原体的免疫应答的抗原性肽或多肽。
10.权利要求1、5或6所定义的一种核酸。
11.一种DNA，该DNA可被转录而产生权利要求10的核酸。
12.一种质粒，该质粒含有权利要求11所定义的DNA。
13.一种核糖核蛋白(RNP)复合物，其中，权利要求10所定义的一种核酸是与一种流感病毒的聚合酶蛋白及核蛋白相复合，用来制备权利要求3-9之一的减毒病毒。
14.一种来自体内的细胞，该细胞已被权利要求1-9之一所定义的一种病毒方式感染。
15.一种疫苗，该疫苗含有权利要求1-9之一的一种病毒。
16.权利要求15的一种疫苗，该疫苗含有权利要求9的一种病毒，并且能够刺激对一种流感病毒以及除该流感病毒之外的第二种病原体的免疫应答。
17.一种药用组合物，该组合物含有权利要求8或9所定义的一种病毒以及药学容许的载体或稀释剂，用于将所述异源编码序列递送至靶细胞。
18.一种药用组合物，该组合物含有已被权利要求8或9的病毒感染的细胞以及药学容许的载体或稀释剂。
19.一种方法，用来制备权利要求1-9之一的病毒，该方法包括在能够将所述病毒的基因组核酸片段组装到病毒颗粒中的条件下将该片段引入宿主细胞。
20.权利要求1-9之一的一种病毒在作为辅助病毒从细胞内拯救流感病毒基因组核酸片段方面的应用，其中产生的含有所述片段的病毒是根据相对于辅助病毒在特定类型细胞中的生长提高来进行筛选。
21.一种方法，用来刺激对流感病毒的免疫应答，或选择性地同时刺激对另外一种或多种病原体的免疫应答，该方法包括以免疫方式将权利要求1-9之一的一种减毒流感病毒给药。
22.一种方法，用于将异源编码序列递送至细胞，该方法包括用带有该序列的权利要求8或9的病毒感染所述细胞。
23.多聚A段内的突变在将病毒减毒方面的应用。
CN00813421A 1999-07-30 2000-07-28 可用作疫苗的减毒流感病毒 Pending CN1451038A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14614599P 1999-07-30 1999-07-30
US60/146,145 1999-07-30
GB9917981.4 1999-07-30
GBGB9917981.4A GB9917981D0 (en) 1999-07-30 1999-07-30 Viral vaccine

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1451038A true CN1451038A (zh) 2003-10-22

Family

ID=26315811

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN00813421A Pending CN1451038A (zh) 1999-07-30 2000-07-28 可用作疫苗的减毒流感病毒

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP1200563B1 (zh)
JP (1) JP2003508086A (zh)
CN (1) CN1451038A (zh)
AT (1) ATE308612T1 (zh)
AU (1) AU6454700A (zh)
CA (1) CA2380514A1 (zh)
DE (1) DE60023708D1 (zh)
MX (1) MXPA02001009A (zh)
WO (1) WO2001009291A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101454023B (zh) * 2006-05-24 2013-06-26 沃里克大学 干扰缺损病毒

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080292658A1 (en) * 2004-11-11 2008-11-27 Emmie De Wit Defective Influenza Virus Particles
US7959929B2 (en) 2005-04-21 2011-06-14 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for respiratory disease control in canines
US11865172B2 (en) 2005-04-21 2024-01-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for respiratory disease control in canines
CN117587038A (zh) * 2005-10-19 2024-02-23 佛罗里达大学研究基金公司 能够感染犬科动物的流感病毒及其用途
WO2010144797A2 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Vaccine Technologies, Incorporated Influenza vaccines with enhanced immunogenicity and uses thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5166057A (en) * 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101454023B (zh) * 2006-05-24 2013-06-26 沃里克大学 干扰缺损病毒

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001009291A1 (en) 2001-02-08
JP2003508086A (ja) 2003-03-04
MXPA02001009A (es) 2002-10-31
CA2380514A1 (en) 2001-02-08
AU6454700A (en) 2001-02-19
DE60023708D1 (de) 2005-12-08
ATE308612T1 (de) 2005-11-15
EP1200563B1 (en) 2005-11-02
EP1200563A1 (en) 2002-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. Advances in development and application of influenza vaccines
JP6352974B2 (ja) ワクチンのための高力価組み換えインフルエンザ・ウィルス
EP1631663B1 (en) High titer recombinant influenza viruses for vaccines and gene therapy
Kumar et al. Evaluation of the Newcastle disease virus F and HN proteins in protective immunity by using a recombinant avian paramyxovirus type 3 vector in chickens
JP4583602B2 (ja) 低温適応性ウマインフルエンザウィルス
JP3545418B2 (ja) インフルエンザの新規組換え温度感受性変異体
CN1912112A (zh) 重组的感染性不分节段的负链rna病毒
KR20080024212A (ko) 개의 세포에서 네거티브 센스 바이러스 ｒｎａ를발현시키기 위한 방법 및 조성물
US11180737B2 (en) Generation of infectious influenza viruses from virus-like particles
CN1065912C (zh) 用遗传工程方法生产减毒病毒
US6824784B2 (en) Cold-adapted equine influenza viruses
EP2049662A1 (en) Methods and compositions for increasing replication capacity of an influenza virus
CN1451038A (zh) 可用作疫苗的减毒流感病毒
US20130156733A1 (en) Influenza virus populations, methods of use and methods of making thereof
WO1999057284A2 (en) Attenuated influenza viruses
US6723559B2 (en) Recombinant segmented negative strand virus containing bicistronic vrna segment with a duplication of its 3′ noncoding flanking sequence, and vaccines and therapeutic compositions containing the same
KR101582490B1 (ko) 인플루엔자 바이러스의 다중 아형에 대한 교차 면역반응을 형성하는 신규한 재조합 바이러스 백신
CN1644686A (zh) 流感病毒哺乳动物细胞高产毒株、其重组毒株及其制备方法和应用
US20200291397A1 (en) Influenza Virus Mutants and Uses Therefor
CN101243189A (zh) 用于在犬细胞内表达反义病毒rna的方法和组合物
Kibenge et al. Amnoonviruses and non-influenza orthomyxoviruses of fish

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication