CN101243189A - 用于在犬细胞内表达反义病毒rna的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于在犬细胞如MDCK细胞内表达核酸序列的新型犬pol I调节核酸序列。本发明还提供了包含这种核酸的表达载体和细胞以及使用这种核酸制备流感病毒，其中包括感染性流感病毒的方法。
Description
1.发明领域
在一方面，本发明提供了包含犬RNA聚合酶I调节序列的分离核酸。在另一方面，本发明提供了包含这种核酸的表达载体和细胞以及利用这种核酸制备流感病毒，其中包括感染性流感病毒，的方法。
2.发明背景
流感大流行的定义是因流感疾病而导致的全球性发病率和死亡率迅猛增加。有几种因素影响疾病流行的严重程度和范围，其中包括人群的免疫程度低以及病毒在人群中的传染效率。通常来说，后者不仅受病毒本身的影响，而且受人群的密度和进出该地区的难易的影响。导致大流行的病毒通常都是最近出现的抗原性突变株，人群中的大多数以前未接触过这种突变株，因而未产生或很少产生对该突变株的免疫。另外，人与人之间的有效传播是快速流行的先决条件，在动物性病毒向人群传播的情况下，病毒必须适应在人体内复制，并且能够有效传播。
流行性感冒传播速度很快，会造成破坏性的影响。二十世纪最严重的大流行是1918年的大流行，在美国有500,000公民死亡，而全球范围内的死亡人数在2到4千万之间。大流行流感相对快速地启动和传播为应对这种程度的全球性发作提出了几个问题，给急性应答者和健康工作者施加了极大的负担。快速鉴定并对出现的大流行作出反应很明显是解决问题的必要条件；目前在全球范围内已经建立了几套程序用于监测正在出现的流感病毒，其中包括很少导致人患病的禽流感病毒。这些监测数据结合预先定义的大流行预警水平可以确定威胁的可能性并为有效应对提供指导。
免疫接种是预防流感年度流行所引起的疾病的最重要公共卫生措施。潜在大流行的确定与患病水平开始明显升高之间短暂的间隔对于制备有效疫苗以保护大部分人群来说是一个大的挑战。在下一次大流行出现之前储备疫苗制备技术和生产基础设施对于减少大量疾病和死亡的出现是十分关键的。制备“大流行疫苗”所需要的较短的反应时间将不允许有过长的研究或处理开发时间以提供有效的反应。
到目前为止，在美国针对非大流行株的所有商用流感疫苗都是在含胚鸡蛋内繁殖的。虽然流感病毒可在鸡蛋内良好生长，但是疫苗的生产要依赖鸡蛋的可用性。鸡蛋供应必须是有组织的，用于疫苗生产的病毒株要在下一次流感季节到来前几个月筛选出来，这会限制这种方法的灵活性，因此常常会导致疫苗生产和分配的延迟和短缺。不幸的是，某些流感疫苗病毒株，如2003-04季流行的A/Fujian/411/02原型株，在含胚鸡蛋内不能很好地复制，因此不得不利用细胞培养分离该病毒株，这种方法不仅昂贵而且生产过程耗时很长。
最近几年已经开发出了在细胞培养物内生产流感病毒的***(参见，如，弗明哥(Furminger)，Vaccine Production(疫苗制备)，选自尼科尔森(Nicholson)等编的Textbook of Influenza(流感教科书)324-332页；莫坦(Merten)等(1996)，Production of influenzavirus in cell cultures for vaccine preparation(在细胞培养物内生产流感病毒用于疫苗制备)，选自科恩(Cohen)和萨弗曼(Shafferman)编的Novel Strategies in Design and Production of Vaccines(疫苗设计与生产新策略)，第141-151页)。一般来说，这些方法都包括用筛选出的病毒株感染合适的永生宿主细胞。虽然相对于在鸡蛋内生产疫苗来说可以克服许多困难，但是并不是所有的流感病毒致病株都可以按照已有的组织培养方法良好生长和制备。另外，许多具有理想特征，例如，减毒特性、温度敏感性和冷适应性，的适于制备减毒活疫苗的病毒株利用已有的方法不能在组织培养物内生长。
除了依赖用活病毒感染细胞培养物的细胞培养方法以外，利用重组DNA技术可以在细胞培养物内生产全感染性的流感病毒。利用重组DNA生产流感病毒可明显提高生产流感疫苗的组织培养方法的灵活性和效用。最近报道了利用重组质粒制备甲型和乙型流感病毒的***，该质粒包含编码病毒基因组的cDNA，参见，例如，纽曼(Neumann)等，(1999)，Generation of influenza A virus entirely from cloned cDNAs(从克隆的cDNA制备完整的甲型流感病毒)。Proc Natl Acad Sci USA 96：9345-9350；弗多(Fodor)等，(1999)，Rescue of influenza A virus from recombinant DNA(从重组DNA拯救甲型流感病毒)。J.Virol 73：9679-9682；霍夫曼(Hoffmann)等，(2000)，A DNAtransfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids(从8个质粒制备甲型流感病毒的DNA转染***)，Proc Natl Acad Sci USA 97：6108-6113；WO01/83794；霍夫曼(Hoffmann)和韦伯斯特(Webster)(2000)，Unidirectional RNApolymerase I-polymerase II transcription system for the generation of influenza A virusfrom eight plasmids(从8个质粒制备甲型流感病毒的单向RNA聚合酶I-聚合酶II转录***)，81：2843-2847；霍夫曼(Hoffmann)等，(2002)，Rescue of influenza B viruses from8 plasmids(从8个质粒拯救乙型流感病毒)，99(17)：11411-11416；美国专利号6,649,372和6,951,754；美国专利公开号20050003349和20050037487，本文已纳入作为参考。这些***通常被称为“质粒拯救”，提供了制备表达来自于任何所选病毒株的免疫原性HA和NA蛋白的重组病毒的可能性。
但是，这些重组方法依赖于表达载体的使用，其中表达载体包含驱动病毒基因组rRNA转录的RNA聚合酶I(RNA pol I)调节元件。这种调节元件是产生特定的流感病毒基因组RNA 5’和3’端以制备出完整的感染性流感病毒所必须的。目前的重组***，如上面所描述的那些，使用了人RNA pol I调节***来表达病毒RNA。由于RNA polI启动子的物种特异性，这些调节元件只在人或灵长类动物细胞内有活性。因此，流感病毒的质粒拯救到目前为止只有通过用合适的质粒转染人或灵长类动物细胞才可能实现。
另外，这种人或灵长类动物细胞通常不能产生疫苗制备所需要的足够效价的流感病毒。作为替代，Madin-Darby犬肾细胞(MDCK细胞)可用于将疫苗病毒株复制到足够的效价以制备商用疫苗。因此，目前利用质粒拯救方法制备流感疫苗需要使用至少两种不同的细胞培养物。犬RNA pol I调节序列的鉴定和克隆可使质粒拯救在与病毒复制相同的细胞培养物上实现，这样就不需要各自的拯救培养物了。因此，还需要鉴定和克隆犬RNA pol I调节元件，这种调节元件可用于构建合适的载体以便于在MDCK和其他犬细胞内完成质粒拯救。本发明提供了这些及其他未满足的要求。
本文所引用或讨论的参考文献并不等于承认这些是本发明的在先领域。另外，专利的引用也不等于承认其真实性。
3.发明概述
本文公开了包含能用于，例如，在犬细胞内表达流感病毒基因组RNA的调节元件的核酸。组合物如包含本发明的犬调节序列的分离核酸、载体和细胞以及使用这些组合物的方法是本发明的实施方式。
相应的，在某些方面，本发明的分离核酸包含犬RNA聚合酶I(pol I)调节序列。在某些实施方式中，调节序列包含启动子。在某些实施方式中，调节序列包含增强子。在某些实施方式中，调节序列既包含启动子又包含增强子。在一个实施方式中，调节序列包含相应的天然启动子或其功能衍生物的-250到-1位核苷酸(相对于转录自启动子的第一个核苷酸，也被称为+1位核苷酸)。在一个实施方式中，调节序列与病毒DNA，例如，克隆的病毒cDNA，操作性地连接在一起。在一个实施方式中，克隆的病毒cDNA编码负链或正链病毒的病毒RNA或相应的cRNA。在某些实施方式中，克隆的病毒cDNA编码流感病毒的基因组病毒RNA(或相应的cRNA)。
在一个实施方式中，本发明的分离核酸包含犬RNA聚合酶I调节序列和转录终止序列。在某些实施方式中，转录终止序列是RNA聚合酶I终止序列。在一个具体实施方式中，转录终止序列是人、猴或犬pol I终止序列。
在某些方面，本发明提供了包含犬RNA pol I启动子的分离核酸。优选的是，犬RNA pol I启动子与被转录的核酸如流感病毒基因组RNA操作性连接。在一个实施方式中，核酸引入到犬细胞内会导致流感病毒基因组RNA的转录，以及在存在合适的流感病毒蛋白的情况下，RNA转录子可被包装进感染性的流感病毒。在一个实施方式中，提供了包含本发明的犬RNA调节序列(例如，犬RNA pol I启动子)的分离核酸，其中调节序列与被转录的核酸操作性连接，以及在体外或体内存在合适蛋白(如，编码流感病毒vRNA节段的核酸的例子中的RNP复合物)的情况下分离核酸可被转录。在一个实施方式中，与所述调节序列操作性连接的核酸是流感病毒vRNA节段。
在某些实施方式中，本发明的核酸包含能结合人、灵长类动物、鼠或犬pol I多肽的多核苷酸序列或其功能活性片段，例如，犬RNA pol I调节序列，该序列与选自SEQ ID Nos：1-19的一个或多个核苷酸序列有至少100％或约99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％或65％的相同性。在一个实施方式中，如果存在合适的多肽(如人、灵长类动物、鼠或犬pol I多肽)以及与核苷酸序列操作性连接的第二多核苷酸序列，多核苷酸序列或其功能活性片段还可以保留启动转录的能力。在一个实施方式中，SEQ ID Nos：1-19中所列核酸的“功能活性片段”保留了本文所述的SEQ ID Nos：1-19全长序列的一种或多种功能活性。例如，提供了如SEQ ID Nos：1所述的调节序列的功能活性片段，其中调节序列片段与被转录的核酸操作性连接，如果体外或体内存在合适的蛋白就会被转录。
在某些实施方式中，本发明的核酸包含能结合人、灵长类动物、鼠或犬pol I多肽的多核苷酸序列或其片段，例如，犬RNA pol I调节序列，和/或与选自SEQ IDNos：1-19的一个或多个核苷酸序列有100％或至少或约99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％或65％的相同性。在一个实施方式中，如果存在合适的多肽(如人、灵长类动物、鼠或犬pol I多肽)以及与核苷酸序列操作性连接的第二多核苷酸序列，多核苷酸序列或其片段还可保留启动转录的能力。
在其他实施方式中，本发明的分离核酸包含犬RNA聚合酶I调节序列和核酶序列。这可以是，例如，肝炎δ病毒基因组核酶序列或其功能衍生物。
在一个实施方式中，本发明的核酸编码本领域技术人员已知的任何负链RNA病毒来源的基因组病毒RNA，但并不局限于这些病毒。在某些实施方式中，病毒RNA编码单分子负链RNA病毒目来源的基因组病毒RNA。在某些实施方式中，病毒RNA编码来自于副粘病毒科、肺病毒亚科、弹状病毒科、纤丝病毒科、博尔纳病毒科、正粘病毒科、本扬病毒科或沙粒病毒科家族的病毒的基因组病毒RNA。在某些实施方式中，病毒RNA编码来自于呼吸道病毒属、麻疹病毒属、腮腺炎病毒属、亨德拉病毒属、禽腮腺炎病毒属、肺病毒属、间质肺炎病毒属、水泡性病毒属、狂犬病病毒属、短暂热病毒属、质型弹状病毒属、核型弹状病毒属、粒弹状病毒属、马尔堡病毒属、埃博拉病毒属、博尔纳病毒属、流感病毒A、流感病毒B、流感病毒C、索戈托病毒属、鲑鱼贫血病毒属、正本雅病毒属、汉坦病毒属、内罗病毒属、白蛉病毒属、番茄斑萎病毒属、沙粒病毒属、柑橘鳞皮病毒属、水稻条纹叶枯病毒属或δ-病毒属的病毒的基因组病毒RNA。在某些实施方式中，病毒RNA编码病毒的基因组病毒RNA，其中的病毒选自下组：副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、尼帕病毒、新城疫病毒、人呼吸道合胞病毒、禽肺病毒、水泡性口炎印第安纳病毒、狂犬病病毒、牛三日热病毒、莴苣坏死黄化病毒、马铃薯黄矮病毒、传染性造血组织坏死病毒、维多利亚湖马尔堡病毒、萨伊埃博拉病毒、博尔纳病病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、索哥托病毒、传染性鲑鱼贫血病毒、布尼亚病毒、汉坦病毒、达革毕病毒、立谷热病毒、番茄斑萎病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、柑橘鳞皮病毒、水稻条纹枯病毒以及肝炎δ病毒。
在另一方面，本发明提供了包含本发明的核酸的载体。在某些实施方式中，载体是表达载体。在某些实施方式中，载体包含细菌的复制起点。在某些实施方式中，载体包含真核细胞的复制起点。在某些实施方式中，载体包含能在真核细胞内筛选的可选标记。在某些实施方式中，载体包含多克隆位点。在某些实施方式中，多克隆位点相对于犬RNA聚合酶I调节序列定向以使引入到多克隆位点内的多核苷酸序列受调节序列的控制而转录。在某些实施方式中，载体包含能在犬细胞如MDCK细胞内表达的多核苷酸序列。
在一个实施方式中，本发明提供了用于从细胞培养物如MDCK细胞培养物重组拯救病毒的表达载体。一般来说，载体用于拯救本领域技术人员已知的任何病毒以在其生命周期中制备带特定末端的RNA。这些病毒包括而不限于负链RNA病毒，如上面所描述的那些病毒。优选的是，病毒是流感病毒，如甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。
在某些实施方式中，本发明的一种或多种载体还包含RNA转录终止序列。在某些实施方式中，转录终止序列选自RNA聚合酶I转录终止序列、RNA聚合酶II转录终止序列、RNA聚合酶III转录终止序列以及核酶。
在某些实施方式中，表达载体是单向表达载体。在其他实施方式中，表达载体是双向表达载体。在某些实施方式中，本发明的双向表达载体包含***到第二启动子和多聚腺苷酸位点如SV40多聚腺苷酸位点之间的第一启动子。在某些实施方式中，第一启动子是犬RNA pol I启动子。在某些实施方式中，第二启动子是犬RNA pol I启动子。在一个实施方式中，第一和第二启动子位于至少一个克隆位点两侧，方向相对。
在某些实施方式中，表达载体包含核酶序列或转录终止序列，该序列的位置相对于犬RNA pol I启动子来说位于至少一个克隆位点的3’端。在某些实施方式中，表达载体包含核酶序列或转录终止序列，该序列的位置相对于犬RNA pol I启动子来说位于至少一个克隆位点的3’端，这样在胞内合成的vRNA就具有正确的5’和3’末端。
在一个实施方式中，本发明的双向表达载体内的基因或cDNA位于本发明的上游pol II启动子和下游犬pol I调节序列(例如，pol I启动子)之间。受pol II启动子控制的基因或cDNA的转录可产生带帽的正链病毒mRNA，受犬pol I调节序列控制的基因或cDNA的转录可产生负链未带帽的vRNA。另外，在本发明的单向载体***内，基因或cDNA位于pol I和pol II启动子的下游。Pol II启动子可产生带帽的正链病毒mRNA，pol I启动子可产生未带帽的正链病毒cDNA。
在另一方面，本发明提供了包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个载体的组合物，其中载体包含本发明的与病毒cDNA如流感病毒cDNA操作性连接的一种或多种核酸(例如，本发明的犬pol I调节序列)。
在某些实施方式中，本发明的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或12个以上的载***于一个质粒内。在某些实施方式中，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个载***于不同的质粒内。在某些实施方式中，每个载体都位于一个独立的质粒内。
在某些实施方式中，本发明的载体是双向表达载体。本发明的双向表达载体通常包含第一启动子和第二启动子，其中第一和第二启动子与同一双链cDNA的两条链中的一条链分别操作性连接，双链cDNA编码包含流感病毒基因组节段的病毒核酸。一般来说，这些启动子中至少有一个是犬RNA pol I启动子。另外，双向表达载体可包含聚酰苷酸化信号和/或终止序列。例如，聚酰苷酸化信号和/或终止序列可位于两个启动子之间的流感病毒基因组节段的两侧。一种优选的聚酰苷酸化信号是SV40聚酰苷酸化信号。
在一个实施方式中，本发明包含以双向质粒为基础的表达***和以单向质粒为基础的表达***，其中病毒cDNA被***到本发明的犬RNA pol I调节序列(例如，pol I启动子)和终止序列(内部转录单位)之间。这个内部转录单位两侧分别是RNA聚合酶II(pol II)启动子和聚酰苷酸化位点(外部转录单位)。在单向***中，pol I和pol II启动子位于cDNA的上游，可产生出正链未带帽cRNA(来自pol I启动子)和正链带帽mRNA(来自pol II启动子)。单向***内的pol I启动子、pol I终止序列、pol II启动子和聚酰苷酸化信号可被称为包含“上游到下游的方向”。在双向***内，pol I和polII启动子位于cDNA相对的两侧，其中上游的pol II启动子可产生出正链带帽的mRNA，下游的pol I启动子可产生出负链未带帽的病毒RNA(vRNA)。这些pol I-polII***分别从其自身的启动子开始转录两种细胞RNA聚合酶，据推测这些聚合酶可能位于细胞核的不同区域内。双向***内的pol I启动子和pol I终止序列被称为包含“下游到上游的方向”，而双向***内的pol II启动子和聚酰苷酸化信号被称为包含“上游到下游的方向”。
在其他方面，本文公开的本发明包括包含表达载体的组合物，其中表达载体包含可被犬RNA聚合酶I转录的多核苷酸序列。在某些实施方式中，多核苷酸产生流感病毒vRNA或cRNA。在某些实施方式中，组合物包含一组表达载体，其中每一个表达载体都包含一个可被犬RNA聚合酶I转录的多核苷酸序列。在某些实施方式中，多核苷酸产生一组流感病毒vRNA或cRNA。在某些实施方式中，多核苷酸产生所有8种流感病毒vRNA或cRNA。
在其他方面，本文公开的本发明包括包含本发明的一组表达载体的组合物，当这一组表达载体被引入到犬细胞内时，在缺少/存在辅助病毒的情况下可导致流感病毒基因组的合成。
在某些实施方式中，本发明的组合物包含一组表达载体，当这一组表达载体被引入到犬细胞内时，在缺少/存在辅助病毒的情况下可导致感染性流感病毒的产生。在某些实施方式中，感染性流感病毒是对冷敏感的流感病毒。在某些实施方式中，感染性流感病毒是减毒的流感病毒。在某些实施方式中，感染性流感病毒是温度敏感的流感病毒。在某些实施方式中，感染性流感病毒是冷适应性的流感病毒。在某些实施方式中，感染性流感病毒是减毒的、温度敏感的、冷适应性的流感病毒。
在某些实施方式中，本发明的组合物包含载体，其中载体包含，从5’到3’，与5’非编码流感病毒序列操作性连接的启动子、cDNA、3’非编码流感病毒序列以及转录终止序列，这些节段彼此相连。在某些实施方式中，载体内的一个或多个cDNA处于正义方向。在某些实施方式中，载体内的一个或多个cDNA处于反义方向。
在某些实施方式中，本发明提供了包含多个载体的组合物，其中多个载体包括含有犬调节序列的载体，犬调节序列与流感病毒聚合酶酸性蛋白(PA)cDNA操作性相连，后者与转录终止序列相连；含有犬调节序列的载体，犬调节序列与流感病毒聚合酶碱性蛋白1(PB1)cDNA操作性相连，后者与转录终止序列相连；含有犬调节序列的载体，犬调节序列与流感病毒聚合酶碱性蛋白2(PB2)cDNA操作性相连，后者与转录终止序列相连；含有犬调节序列的载体，犬调节序列与流感病毒血凝素(HA)cDNA操作性相连，后者与转录终止序列相连；含有犬调节序列的载体，犬调节序列与流感病毒核蛋白(NP)cDNA操作性相连，后者与转录终止序列相连；含有犬调节序列的载体，犬调节序列与流感病毒神经氨酸酶(NA)cDNA操作性相连，后者与转录终止序列相连；含有犬调节序列的载体，犬调节序列与流感病毒基质蛋白cDNA操作性相连，后者与转录终止序列相连；以及含有犬调节序列的载体，犬调节序列与流感病毒NS cDNA操作性相连，后者与转录终止序列相连。在某些实施方式中，组合物还包含一种或多种表达mRNA的表达载体，其中的mRNA编码选自如下一组的一种或多种流感病毒多肽：PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、基质蛋白1(M1)、基质蛋白2(M2)和非结构蛋白1和2(NS1和NS2)。在一个实施方式中，当组合物被引入到犬细胞内时会产生感染性的流感病毒。在某些实施方式中，感染性流感病毒是对冷敏感的流感病毒。在某些实施方式中，感染性流感病毒是减毒的流感病毒。在某些实施方式中，感染性流感病毒是温度敏感的流感病毒。在某些实施方式中，感染性流感病毒是冷适应性的流感病毒。在某些实施方式中，感染性流感病毒是减毒的、温度敏感的、冷适应性的流感病毒。
在某些实施方式中，本发明提供了可从克隆的病毒cDNA制备感染性流感病毒的组合物，该组合物包含一套质粒，其中每个质粒都包含编码至少一个病毒基因组节段的cDNA，以及其中病毒基因组节段相应的病毒cDNA被***到本发明的犬RNA聚合酶I调节序列与调节元件(例如，犬pol I终止序列)之间用于合成带有正确3’末端的vRNA或cRNA，这样就可导致vRNA或cRNA的表达。
在某些实施方式中，本发明提供了可从克隆的病毒cDNA制备感染性流感病毒的组合物，该组合物包含一套质粒，其中每个质粒都包含编码至少一个病毒基因组节段的cDNA，以及其中病毒基因组节段相应的病毒cDNA被***到本发明的犬RNA聚合酶I调节序列与调节元件(例如，犬pol I终止序列)之间用于合成带有正确3’末端的vRNA或cRNA，这样就可导致vRNA或cRNA的表达，其中用于合成带正确3’末端的vRNA或cRNA的犬RNA聚合酶I调节序列、病毒cDNA和调节元件被依次***到RNA聚合酶II(pol II)启动子和聚酰苷酸化信号之间，这样可导致病毒mRNA及其相应的病毒蛋白的表达，其中全套vRNA或cRNA以及病毒蛋白的表达可导致感染性流感病毒的装配。
在某些实施方式中，用于合成带正确3’末端的vRNA或cRNA的调节元件是RNA聚合酶I(pol I)终止序列。正如本领域技术人员所熟知的，流感病毒vRNA的有效复制和转录需要在vRNA的5’和3’末端具有十分特异的序列。技术人员可利用RNA聚合酶I(pol I)终止序列来确保所合成的RNA转录子3’末端的序列被认定是可用于这个基因组RNA有效复制和/或转录的理想的正确末端。在某些实施方式中，用于合成带正确3’末端的vRNA或cRNA的调节元件是核酶序列。在某些实施方式中，pol I启动子靠近聚酰苷酸化信号，pol I终止序列靠近pol II启动子。在某些实施方式中，polI启动子靠近pol II启动子，pol I终止序列靠近聚酰苷酸化信号。在某些实施方式中，流感病毒是甲型流感病毒。在某些实施方式中，流感病毒是乙型流感病毒。
在另一方面，本发明提供了用于制备流感病毒基因组RNA的方法，该方法包括转录本发明的核酸从而制备流感病毒基因组。在某些实施方式中，流感病毒基因组RNA是在无细胞***内转录的。在某些实施方式中，流感病毒基因组RNA是在犬细胞如MDCK细胞内转录的。
在一个实施方式中，方法包括转录一组本发明的核酸从而合成出一组RNA分子，例如，一组流感病毒基因组RNA。在某些实施方式中，1、2、3、4、5、6、7或8个流感病毒基因组RNA被转录。在某些实施方式中，一套完整的流感病毒基因组RNA被转录。在某些实施方式中，当流感病毒基因组RNA在犬细胞如MDCK细胞内转录时，如果存在PA、PB1、PB2和NP，则表达流感病毒蛋白。在某些实施方式中，流感病毒蛋白选自如下一组：PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1和NS2。在某些实施方式中，当一套完整的流感病毒基因组RNA在犬细胞如MDCK细胞内转录时，如果存在PA、PB1、PB2和NP，则表达感染性的流感病毒。在某些实施方式中，方法包括与流感病毒基因组RNA一起引入PA、PB1、PB2和NP。在某些实施方式中，PA、PB1、PB2和NP由辅助病毒提供。在某些实施方式中，一套完整的流感病毒基因组RNA来自于冷适应性的、温度敏感的、减毒的流感病毒。
在一个实施方式中，提供了转录流感病毒vRNA节段的方法，所述方法包括步骤1)使包含选自SEQ ID Nos1-19的核酸(或其活性片段)的多核苷酸与流感病毒蛋白PB1、PB2、NP和PA中的一种或多种接触，其中所述的核酸与编码所述vRNA节段的cDNA分子操作性连接；以及2)分离转录的vRNA节段。在一个具体实施方式中，辅助病毒用于该方法。
在一个方面，本发明提供了制备包含RNA基因组节段的重组感染性重组病毒(例如，感染性的流感病毒)的方法，该方法包括培养犬宿主细胞如MDCK细胞的步骤，其中的宿主细胞包含本发明的一种或多种含病毒基因组上每个基因相应的病毒cDNA的表达载体和表达编码一种或多种病毒多肽的病毒mRNA的表达载体；以及分离感染性病毒群。在一个实施方式中，感染性病毒群是流感病毒群。在一个实施方式中，该方法还包括在所述的培养步骤前将一种或多种表达载体引入到犬宿主细胞内的步骤。在一个实施方式中，该方法还包括在所述的引入步骤前制备一种或多种表达载体的步骤。
在一个实施方式中，提供了制备包含RNA基因组节段的重组感染性重组病毒(例如，感染性流感病毒)的方法，其中该方法包括步骤：a)将病毒基因组上每个基因相应的病毒cDNA***到本发明的一种或多种表达载体内；(b)将所述的表达载体和一种或多种表达一种或多种病毒多肽编码病毒mRNA的表达载体引入(例如，通过电穿孔)到宿主细胞(例如，犬细胞)或宿主细胞群内；(c)孵育所述的宿主细胞；以及d)分离感染性的病毒群。在一个实施方式中，感染性重组病毒是流感病毒。在某些实施方式中，流感病毒是冷适应性的、温度敏感的、减毒的流感病毒。
在一个实施方式中，提供了制备包含RNA基因组节段的感染性重组病毒(例如，感染性流感病毒)的方法，其中该方法包括步骤：a)将病毒基因组上每个基因相应的病毒cDNA***到本发明的一种或多种表达载体内；(b)将所述的表达载体引入(例如，通过电穿孔)到宿主细胞(例如，犬细胞)或宿主细胞群内；(c)孵育所述的宿主细胞；以及d)分离感染性的病毒群。在一个实施方式中，感染性重组病毒是流感病毒。在某些实施方式中，流感病毒是冷适应性的、温度敏感的、减毒的流感病毒。
在一个实施方式中，本发明提供了利用本发明的表达vRNA节段或相应的cRNA以及流感病毒蛋白，特别是PB1、PB2、PA和NA，的表达载体在宿主细胞内制备感染性重组流感病毒的方法。根据这个实施方式，可以利用也可以不用辅助病毒来制备感染性的重组流感病毒。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于制备重组流感病毒的方法，该方法包括培养包含一组核酸的犬细胞，其中的一组核酸包含与一种或多种编码每个流感病毒基因组RNA的cDNA操作性连接的犬RNA聚合酶I调节序列和表达一种或多种流感病毒多肽：PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1和NS2编码病毒mRNA的表达载体；以及从细胞内分离所述的重组流感病毒。
在某些实施方式中，方法包括将表达载体引入到犬细胞内，其中的表达载体可指导基因组或反基因组病毒RNA节段、核蛋白和RNA依赖的聚合酶在细胞内表达，因此在没有辅助病毒的情况下也可以形成核糖核蛋白复合物，可以装配病毒颗粒；以及(b)培养细胞，其中病毒颗粒可被包装和拯救。在某些实施方式中，重组的负链病毒是非节段化的病毒。在某些实施方式中，重组负链RNA病毒是节段化的病毒。在某些实施方式中，负链RNA病毒是流感病毒。
在某些实施方式中，方法包括将表达载体引入到培养的犬细胞内，其中的表达载体可指导节段化的负链RNA病毒的基因组或反基因组病毒RNA节段、核蛋白和RNA依赖的聚合酶在允许包含病毒基因组RNA节段的RNP复合物形成以及病毒颗粒在无辅助病毒时仍可装配的条件下表达，以及培养细胞，其中病毒颗粒可被制备出来。在某些实施方式中，表达载体指导病毒基因组RNA节段的表达。
在某些实施方式中，用于本发明方法中的犬细胞包含一种或多种表达一种或多种蛋白的表达载体，其中的蛋白选自核蛋白和RNA依赖的RNA聚合酶的亚单位。在某些实施方式中，表达载体指导一种或多种核蛋白和所述RNA依赖的RNA聚合酶的亚单位的表达。在某些实施方式中，从表达载体表达一种或多种病毒蛋白受调节序列的控制，其中的调节序列选自与人腺病毒2型的剪接的三链前导序列操作性连接的腺病毒2主要晚期启动子或人巨细胞病毒立即早期启动子、或调节序列的功能衍生物。
在某些实施方式中，病毒是A、B或丙型流感病毒。在某些实施方式中，病毒是含有衍生自多个亲本病毒的vRNA节段的重配病毒。
在某些实施方式中，本发明的方法包括引入本发明的多个载体，其中每个载体都将一部分流感病毒引入到能支持病毒复制的宿主细胞群内。宿主细胞可在允许病毒生长的条件下培养，流感病毒可以回收。在某些实施方式中，流感病毒是减毒的病毒、冷适应性的病毒和/或温度敏感的病毒。例如，在某些实施方式中，载体衍生的重组流感病毒可以是减毒的、冷适应性的、温度敏感的病毒，这样适于作为减毒活疫苗给药，例如鼻内疫苗制剂中的减毒活疫苗。在一个典型的实施方式中，病毒通过引入一组掺入全部或部分流感病毒B/Ann Arbor/1/66基因组例如ca B/AnnArbor/1/66病毒基因组的载体来制备。
在某些实施方式中，包含编码一个流感病毒株的至少6个内部基因组节段(例如，编码除HA和NA之外的所有流感病毒蛋白的基因组节段)的cDNA和编码另一种流感病毒株的一个或多个基因组节段(例如，HA和NA vRNA节段)的cDNA的一组载体可被引入到宿主细胞群内。例如，所选择的减毒的、冷适应性的和/或温度敏感的流感病毒A或B株如B/Ann Arbor/1/66的ca、att、ts株或人工改造的ca、att、ts流感病毒A或B株的至少6个内部基因组节段(“骨架”)可与编码来自于另一病毒株的免疫原性抗原的一个或多个节段一起引入到宿主细胞群内。一般来说，免疫原性表面抗原包括血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)抗原中的一种或两种。在引入编码免疫原性表面抗原的单一节段的实施方式中，所选择病毒的7个互补节段也被引入到宿主细胞内。
在某些实施方式中，表达载体通过电穿孔被转染到细胞内。在某些实施方式中，通过在存在脂质体转染剂的条件下转染到细胞内或通过磷酸钙沉淀的方式将表达载体转染到细胞内。在某些实施方式中，表达载体是质粒。在某些实施方式中，表达载体包含用于表达所述病毒的基因组RNA节段或相应的编码RNA的不同表达载体。在某些实施方式中，每个基因组RNA节段或编码RNA的表达都受来自于上述犬PolI启动子的启动子序列的控制。
在某些实施方式中，包含流感病毒基因组节段的一组质粒载体被引入到宿主细胞群内。例如，在某些实施方式中，8个质粒，每个质粒都含有不同的基因组节段，可用于将完整的流感病毒基因组引入到宿主细胞内。另外，包含更小基因组亚序列的更多数目的质粒也可以使用。
在另一方面，本发明提供了在培养细胞内制备节段化的负链RNA病毒的感染性病毒颗粒的方法，其中的负链RNA病毒具有3个以上的基因组vRNA节段，例如流感病毒如甲型流感病毒，所述方法包括：(a)将能够在所述细胞内表达基因组vRNA节段以提供所述病毒的完整基因组vRNA节段的第一套表达载体引入到能支持所述病毒生长的细胞群内；(b)将能够表达编码所述病毒的一种或多种多肽的mRNA的第二套表达载体引入到所述细胞内；以及(c)培养所述细胞从而制备所述的病毒颗粒。在某些实施方式中，细胞是犬细胞。在某些实施方式中，细胞是MDCK细胞。在某些实施方式中，病毒是乙型流感病毒。在某些实施方式中，第一套表达载体包含在1-8个质粒内。在某些实施方式中，第一套表达载体包含在1个质粒内。在某些实施方式中，第二套表达载体包含在1-8个质粒内。在某些实施方式中，第二套表达载体包含在1个质粒内。在某些实施方式中，第一套、第二套或两套表达载体通过电穿孔引入。在某些实施方式中，第一套表达载体编码流感病毒的各个vRNA节段。在某些实施方式中，第二套表达载体编码一种或多种流感病毒多肽的mRNA。在某些实施方式中，第一套或第二套表达载体(或两套)包含本发明的核酸，例如，本发明的犬调节序列(例如，犬pol I)。在某些实施方式中，第一套或第二套表达载体(或两套)编码第二病毒的vRNA或mRNA。例如，一套载体包含编码第二流感病毒的HA和/或NA mRNA和/或vRNA的一种或多种载体。
本发明还提供了在培养细胞内制备节段化的负链RNA病毒的感染性病毒颗粒的方法，其中的负链RNA病毒具有3个以上的基因组vRNA节段，例如流感病毒如甲型流感病毒，所述方法包括：(a)将既能够在所述细胞内表达基因组vRNA节段以提供所述病毒的完整基因组vRNA节段又能够表达编码所述病毒的一种或多种多肽的mRNA的一套表达载体引入到能支持所述病毒生长的细胞群内；(b)培养所述细胞从而制备所述的病毒颗粒。在某些实施方式中，细胞是犬细胞。在某些实施方式中，细胞是MDCK细胞。在某些实施方式中，病毒是乙型流感病毒。在某些实施方式中，这一套表达载体包含在1-17个质粒内。在某些实施方式中，这一套表达载体包含在1-8个质粒内。在某些实施方式中，这一套表达载体包含在1-3个质粒内。在某些实施方式中，这一套表达载体通过电穿孔引入。在某些实施方式中，这一套表达载体编码流感病毒的各个vRNA节段。在某些实施方式中，这一套表达载体编码一种或多种流感病毒多肽的mRNA。在某些实施方式中，这一套表达载体编码流感病毒的每一个vRNA节段和一种或多种流感病毒多肽的mRNA。在某些实施方式中，这一套表达载体包含本发明的核酸，例如，本发明的犬调节序列(例如，犬pol I)。在某些实施方式中，这一套表达载体编码第二病毒的vRNA或mRNA。例如，这一套载体包含编码第二流感病毒的HA和/或NA mRNA和/或vRNA的一种或多种载体。在某些实施方式中，第一套或第二套表达载体(或两套)编码第二病毒的vRNA或mRNA。例如，一套载体包含编码第二流感病毒的HA和/或NA mRNA和/或vRNA的一种或多种载体。
在某些实施方式中，方法还包括利用与犬细胞相同或不同的细胞进行其他一个或多个细胞感染步骤扩增犬细胞所产生的病毒颗粒。在某些实施方式中，方法还包括分离感染性的病毒颗粒。在某些实施方式中，方法还包括病毒减毒或灭活步骤。在某些实施方式中，方法还包括在疫苗组合物内掺入减毒的或灭活的病毒颗粒。
在一个实施方式中，本发明的生产病毒的方法所产生的病毒效价(本发明的载体引入到宿主细胞后24、36或48小时)为至少0.1×103 PFU/ml、或至少0.5×103 PFU/ml、或至少1.0×103 PFU/ml、或至少2×103 PFU/ml、或至少3×103 PFU/ml、或至少4×103PFU/ml，或者在0.1-1×103 PFU/ml范围内、或在1×103-5×103 PFU/ml范围内，或者超过5×103 PFU/ml。
在某些实施方式中，流感病毒是乙型流感病毒。在某些实施方式中，流感病毒是甲型流感病毒。在某些实施方式中，方法包括回收能在给予，例如鼻内给予，受体时激发免疫反应的重组和/或重配流感病毒。在某些实施方式中，病毒在给予前被灭活，在其他实施方式中，给予减毒活病毒。根据本发明的方法制备的重组和重配甲型和乙型流感病毒也是本发明的特征。在某些实施方式中，病毒包括减毒的流感病毒、冷适应性的流感病毒、温度敏感的流感病毒、或者具有这些理想特性的任意组合的病毒。在一个实施方式中，流感病毒包含流感病毒B/Ann Arbor/1/66株，例如，B/Ann Arbor/1/66的冷适应性温度敏感减毒株。在另一个实施方式中，流感病毒包含流感病毒B/Ann Arbor/6/60株，例如，B/Ann Arbor/6/60的冷适应性温度敏感减毒株。
另外，重配病毒可通过引入编码病毒株的6个内部vRNA的载体结合编码表面抗原(HA和NA)的vRNA节段的载体来制备，其中前一种病毒株根据其与疫苗制备有关的优良特性来筛选，表面抗原来自于所选择的病毒株，例如致病株。例如，优选的是，HA节段选自致病相关株H1、H3或B，这在疫苗制备中是常规实行的。同样，HA节段可选自正出现的致病株如H2株(例如，H2N2)、H5株(例如，H5N1)或H7株(例如，H7N7)。另外，第一病毒株的7个互补基因节段可与HA或NA编码节段之一一同引入。在某些实施方式中，内部基因节段来自于流感病毒株B/AnnArbor/1/66或A/AnnArbor/6/60。另外，可以制备包含经修饰的HA基因的流感病毒(例如，H5N1、H9N2、H7N7或HxNy(其中x＝1-9，y＝1-15))。例如，HA基因可通过去除多碱基裂解位点来加以修饰。
在另一方面，本发明提供了包含本发明的核酸或表达载体的宿主细胞。在某些实施方式中，细胞是犬细胞。在某些实施方式中，细胞是肾细胞。在某些实施方式中，犬肾细胞是MDCK细胞。在其他实施方式中，细胞选自下组：Vero细胞、Per.C6细胞，BHK细胞、PCK细胞、MDCK细胞、MDBK细胞、293细胞(例如，293T细胞)和COS细胞。在某些实施方式中，这些细胞系中至少两种细胞系的混合物的共培养物，例如，COS和MDCK细胞的组合或293T和MDCK细胞的组合，组成宿主细胞群。
包含本发明的流感病毒载体的宿主细胞可在允许病毒复制和装配的条件下在培养物内生长。一般来说，含有流感病毒质粒的宿主细胞在37℃以下培养，优选的温度是等于或低于35℃。在某些实施方式中，细胞在32℃到35℃之间培养。在某些实施方式中，细胞在约32℃到34℃之间，例如，约33℃，培养。在经过一段合适的时间培养以使病毒复制到特定效价以后，可回收重组病毒。另外，回收的病毒可被灭活。
在另一方面，本发明提供了改造流感病毒以使其只限于在特定类型的细胞内生长的方法，其中的细胞包括而不限于MRC-5、WI-38、FRhL-2、PerC6、293、NIH 3T3、CEF、CEK、DF-1、Vero、MDCK、Mv1Lu、人上皮细胞和SF9细胞。在一个实施方式中，生长是受限的，这样流感病毒就不能在人原代细胞(例如，PerC6)内生长。在另一个实施方式中，生长是受限的，这样流感病毒就不能在人上皮细胞内生长。本领域的技术人员将会认识到生长受限表型可以和一种或多种其他表型如冷适应性、温度敏感性、减毒等组合。还可以认识到导致生长受限表型的突变也可以导致和/或负责其他表型，如上面所列的那些。
在另一方面，本发明提供了从MDCK细胞培养物中拯救重组或重配甲型或乙型流感病毒(即，甲型流感病毒和/或流感病毒的野生型和突变株)的新方法。在某些实施方式中，含有流感病毒基因组的一组载体可通过电穿孔引入到MDCK细胞群内，其中流感病毒基因组的转录受本发明的犬调节序列的控制。细胞可在允许病毒复制的条件下生长，例如，如果是冷适应性的、减毒的、温度敏感的病毒株，MDCK细胞可在37℃以下生长，优选的是等于或低于35℃。一般来说，细胞的培养温度在32℃到35℃之间。在某些实施方式中，细胞的培养温度在约32℃到34℃之间，例如，约33℃。另外(例如，用于疫苗制备时)，MDCK细胞可在不含任何动物源性产品的无血清培养基内生长。
在上述方法的某些实施方式中，可在培养含流感病毒基因组质粒的宿主细胞后回收流感病毒。在某些实施方式中，回收的病毒是重组病毒。在某些实施方式中，病毒是具有不止一个亲本病毒株遗传起源的重配流感病毒。另外，回收的重组或重配病毒还可以通过在培养的细胞或鸡蛋内传代来进一步扩增。
另外，回收的病毒可以被灭活。在某些实施方式中，回收的病毒包含流感病毒疫苗。例如，回收的流感病毒疫苗可以是具有甲型或乙型流感病毒的所选病毒株来源的HA和/或NA抗原的重配流感病毒(例如，6:2或7:1重配病毒)。在一个实施方式中，HA或NA抗原是经过修饰的。在某些优选实施方式中，重配流感病毒具有减毒表型。另外，重配病毒可以是冷适应性的和/或温度敏感的，例如，减毒的、冷适应性的或温度敏感的甲型或乙型流感病毒。这种流感病毒可作为，例如，减毒活疫苗，用于预防接种以产生所选病毒株，例如，致病性流感病毒株，特异性的免疫反应。根据本发明的方法所制备的流感病毒，例如，减毒的重配病毒，也是本发明的特征。
在另一方面，本发明涉及制备重组流感病毒疫苗的方法，该方法包括将一组包含流感病毒基因组的载体引入到能支持流感病毒复制的宿主细胞群内，其中流感病毒基因组的转录受本发明的犬调节序列(例如，犬RNA pol I启动子)的控制，在低于或等于35℃的温度下培养宿主细胞，以及回收能在给予受体时激发免疫反应的流感病毒。疫苗包含甲型或乙型流感病毒株。
在某些实施方式中，流感病毒疫苗包括减毒流感病毒、冷适应性流感病毒或温度敏感性流感病毒。在某些实施方式中，病毒具有这些理想特性的组合。在一个实施方式中，流感病毒包含流感病毒株A/Ann Arbor/6/60。在另一个实施方式中，流感病毒包含流感病毒株B/Ann Arbor/1/66。另外，疫苗还包括人工改造的甲型或乙型流感病毒，其中包含至少一个可影响caA/Ann Arbor/6/60或ca/B/Ann Arbor/1/66特征性生物特性的取代氨基酸，如这些株的独特氨基酸。
在一个实施方式中，提供了根据本发明的方法制备的包含一组重组病毒(或其衍生的病毒)的疫苗。在一个具体实施方式中，疫苗包含根据本发明的方法制备的活病毒。在另一个具体实施方式中，疫苗包含根据本发明的方法制备的死亡或灭活病毒。在另一个具体实施方式中，疫苗包含根据本发明的方法制备的活病毒、死病毒或灭活病毒制备出的免疫原性组合物。在另一个具体实施方式中，疫苗包含根据本发明的方法制备的冷适应性温度敏感减毒活流感病毒制备出的免疫原性组合物。在另一个具体实施方式中，疫苗包含根据本发明的方法制备的冷适应性温度敏感减毒活流感病毒或其衍生的病毒。
4.附图简述
图1代表wt和ca B株(B/Beijing/243/97)在PerC6和MDCK细胞内的生长曲线；每个时间点的病毒效价通过TCID50分析确定。
图2代表wt和ca A株(A/Sydney/05/97和B/Beijing/262/95)在PerC6和MDCK细胞内的生长曲线；每个时间点的病毒效价通过TCID50分析确定。
图3代表wt和caA株(A/AnnArbor/6/60)在PerC6和MDCK细胞内的生长曲线；每个时间点的病毒效价通过TCID50分析确定。
图4代表PerC6和MDCK细胞内A/Sydney的病毒RNA的实时分析结果，所用仪器为Taqman
(加利福尼亚州帕罗阿托罗氏分子***公司(Roche MolecularSystems；Palo Alto，CA))，探针是病毒RNA的M节段特异性的。
图5代表caA/Vietnam/1203/2004(H5N1)在MDCK细胞内的生长曲线；每个时间点的病毒效价通过TCID50分析确定。
图6是一个直方图，描述了利用8-质粒拯救技术将每一个流感病毒基因节段拯救成7:1重配病毒。
图7代表每一个7:1重配病毒在PerC6细胞内的生长曲线；每个时间点的病毒效价通过TCID50分析确定。
图8代表包含犬RNApol I调节序列的Eco RI片段的限制性酶切图谱。
图9A、9B和9C代表克隆自犬基因组DNA的约3.5kB核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，该序列编码至少一部分18s rRNA基因，起始于所显示序列的1804位核苷酸。
图10代表质粒pAD3000的图谱，该质粒很适于制备本发明的表达载体。
图11代表用于微小基因组分析的MDCK pol I启动子构建体的示意图。
图12代表微小基因组分析的结果。产自-1、+1和+2MDCK pol I启动子构建体的EGFP信号分别显示在上排左侧、中间和右侧。负启动子对照只显示了背景荧光(下排左侧)。用CMV-EGFP构建体转染的细胞作为阳性对照(下排右侧)。
5.发明详述
流感病毒的质粒拯救通常包括引入表达病毒蛋白的表达载体和在合适的细胞内转录病毒基因组RNA。一般来说，病毒基因组RNA的转录用RNA聚合酶I完成，因为这些酶可产生带有末端的适合作为病毒基因组的转录子。因此，RNA pol I启动子和其他调节元件在质粒拯救期间可用于启动基因组RNA的转录。不幸的是，RNApol I启动子是物种高度特异性的。这就是说，来源于一个物种的RNA pol I可能能够与不相关物种来源的RNA pol I启动子有效结合，也可能不能结合。相应的，RNA polI启动子的可用性限制了能够完成质粒拯救的细胞。在本发明之前，质粒拯救在犬细胞内是不可能的。根据本发明下面的公开内容，在犬细胞内进行质粒拯救首次成为可能。
相应的，在第一方面，提供了本发明的包含犬RNA聚合酶I调节序列的分离核酸。在某些实施方式中，调节序列是启动子。在一个实施方式中，调节序列是犬polI启动子序列。在另一个实施方式中，调节序列与克隆的病毒cDNA操作性连接。在另一个实施方式中，克隆的病毒cDNA编码负链或正链病毒的病毒RNA或相应的cRNA。在一个具体实施方式中，克隆的cDNA编码流感病毒的基因组病毒RNA(或相应的cRNA)。
在一个具体实施方式中，本发明的分离核酸包含犬RNA聚合酶I调节序列和转录终止序列。在某些实施方式中，转录终止序列是pol I终止序列。在某些实施方式中，转录终止序列是人、猴或犬pol I终止序列。
在某些实施方式中，本发明的核酸包含能结合人、灵长类动物、鼠或犬pol I多肽的多核苷酸序列或其功能活性片段，例如，犬RNA pol I调节序列，该序列与选自SEQ ID Nos：1-19的一个或多个核苷酸序列有至少100％或约99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％或65％的相同性。在一个实施方式中，如果存在合适的多肽(如人、灵长类动物、鼠或犬pol I多肽)以及与核苷酸序列操作性连接的第二多核苷酸序列，多核苷酸序列或其功能活性片段还可保留启动转录的能力。在一个实施方式中，SEQ ID Nos：1-19中所列核酸的“功能活性片段”保留了本文所述的SEQ ID Nos：1-19全长序列的一种或多种功能活性。例如，提供了如SEQ ID Nos：1所述的调节序列的功能活性片段，其中调节序列片段与被转录的核酸操作性连接，如果体外或体内存在合适的蛋白就会被转录。
在某些实施方式中，本发明的核酸包含能结合人、灵长类动物、鼠或犬pol I多肽的多核苷酸序列或其片段，例如，犬RNA pol I调节序列，和/或与选自SEQ IDNos：1-19的一个或多个核苷酸序列有100％或至少或约99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％或65％的相同性。在一个实施方式中，如果存在合适的多肽(如人、灵长类动物、鼠或犬pol I多肽)以及与核苷酸序列操作性连接的第二多核苷酸序列，多核苷酸序列或其片段还可保留启动转录的能力。
在某些方面，本发明提供了包含犬RNA pol I启动子的分离核酸。优选的是，犬RNA pol I启动子与被转录的核酸如流感病毒基因组RNA操作性连接。核酸引入到犬细胞内会导致流感病毒基因组RNA的转录，以及在存在合适的流感病毒蛋白的情况下，RNA转录子可被包装进感染性的流感病毒。在一个实施方式中，提供了包含本发明的犬RNA调节序列(例如，犬RNA pol I启动子)的分离核酸，其中调节序列与被转录的核酸操作性连接，以及在体外或体内存在合适蛋白的情况下分离核酸可被转录。在一个实施方式中，与所述调节序列操作性连接的核酸是流感病毒vRNA节段。
在另一方面，本发明提供了用于在犬细胞培养物中从克隆的病毒DNA制备完整的重组流感病毒的载体和方法。例如，流感病毒可通过如下过程制备：将一组包含克隆的cDNA的载体引入到犬宿主细胞内，其中的cDNA编码各个病毒基因组节段，位于本发明的犬RNA调节序列(例如，犬pol I启动子)的控制之下，培养犬细胞以及从细胞培养物中分离制备的重组流感病毒。当编码流感病毒的载体被引入(例如，通过电穿孔)到犬细胞内时，通过标准纯化方法可以回收适于作疫苗的重组病毒。利用本发明的载体***和方法，可在组织培养物中快速而有效地生产包含6个内部基因节段及免疫源性HA和NA节段的重配病毒，其中6个内部基因节段的来源病毒株是根据其与疫苗制备有关的理想特性进行筛选的，HA和NA节段来源于所选择的病毒株，例如，致病株。因此，本文所描述的***和方法可用于在犬细胞培养物内快速生产重组的和重配的甲型和乙型流感病毒，其中包括适于作为疫苗的病毒，包括减毒活疫苗。根据本发明的方法制备的疫苗可通过鼻内给药或肌肉注射转移。
一般来说，每一个A和B亚型都要筛选一个主供体病毒(MDV)株。如果是减毒活疫苗，主供体病毒株一般根据其与疫苗制备有关的良好特性来筛选，例如，温度敏感性、冷适应性和/或减毒特性。例如，典型的主供体病毒株包括A/AnnArbor/6/60和B/Ann Arbor/1/66各自的这种温度敏感株、减毒株和冷适应株。
例如，所选择的主供体型病毒A(MDV-A)或主供体型病毒B(MDV-B)可从包含病毒基因组的一组克隆的病毒cDNA中制备。在一个典型的实施方式中，重组病毒是从8个克隆的病毒cDNA制备的。代表PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M和NS的被选MDV-A或MDV-B的8个病毒cDNA被克隆到表达载体内，例如，双向表达载体如质粒(例如，pAD3000)，这样病毒基因组RNA可被犬RNA聚合酶I(pol I)启动子驱动从一个链上转录出来，病毒mRNA受RNA聚合酶II(pol II)启动子驱动从另一条链上合成出来。任选地，任何基因节段都可被修饰，其中包括HA节段(例如，去除多碱基裂解位点)。
将包含8个病毒cDNA的质粒转染到合适的宿主细胞，例如，MDCK细胞，内以后，回收感染性的重组MDV-A或MDV-B病毒。利用本文所描述的质粒和方法，本发明可用于，例如，通过共转染被选病毒(例如，MDV-A、MDV-B、PR8)的6个内部基因(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)和其他相应型(A或B)的流感病毒来源的HA和NA来制备6:2重配流感病毒疫苗。例如，HA节段优选自致病相关株H1、H3或B，这在疫苗制备中都是常规实行的。同样，HA节段可选自即将流行为致病株如H2株(例如，H2N2)、H5株(例如，H5N1)或H7株(例如，H7N7)的病毒株。也可以制备包含MDB的7个基因组节段和被选病毒株的HA或NA基因的重配病毒株(7:1重配体)。另外，这个***可用于确定与疫苗生产有关的表型特征的分子基础，例如，减毒(att)、冷适应性(ca)和温度敏感(ts)表型。
5.1定义
除非另外定义，所有科学和技术术语的含义都与其相关领域所通常使用的含义相同。为了本发明的目的，将下列术语定义如下。
术语“核酸”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核酸序列”是指单链或双链脱氧核糖核酸或核糖核酸聚合物或其嵌合物或类似物。在本文中，术语还可以包括具有天然核苷酸基本特性的天然核苷酸类似物的聚合物，其中它们可以与天然核苷酸相似的方式与单链核酸杂交(例如，肽核酸)。除非另外说明，本发明特定核酸序列除了包括明确描述的序列以外还包括互补序列。
术语“基因”的应用范围很广，是指与生物功能有关的任何核酸。因此，基因包括编码序列和/或其表达所需要的调节序列。术语“基因”适用于特殊的基因组序列以及该基因组序列所编码的cDNA和mRNA。
基因还包括非表达的核酸节段，例如，形成其他蛋白的识别序列的核酸节段。非表达的调节序列包括“启动子”和“增强子”，调节蛋白如转录因子与之结合可导致临近的或附近的序列转录。“组织特异性的”启动子或增强子是指只能在一种或多种特定组织类型或细胞类型内调节转录的启动子或增强子。
“启动子”或“增强子序列”是指当存在合适的转录相关酶，例如，RNA聚合酶时，在某种条件下，例如，培养或生理条件，能够启动与其操作性连接的核酸序列转录的DNA调节区，其中酶是有功能的。启动子可位于其所启动转录的核酸序列的上游或下游。位于cDNA上游的启动子序列在其3’末端与转录起始位点连接并向上游(5’方向)延伸，包括很少几个在背景之上的可检测水平上启动转录所必须的碱基或元件。位于cDNA下游的启动子序列(表达(-)RNA)在其5’末端与转录起始位点连接并向下游(3’方向)延伸，包括很少几个在背景之上的可检测水平上启动转录所必须的碱基或元件。本发明的双向***即包含上游启动子，又包含下游启动子；单向***只包含上游启动子。在启动子序列内或其附近可发现转录起始位点(常规上可通过，例如，用核酶S1绘图来定义)，其中可能还包含能驱动、调节、增强RNA聚合酶，或者负责RNA聚合酶结合的蛋白结合区(共有序列)。
在本文中，“犬RNA聚合酶I调节序列”或“犬RNA聚合酶I调节元件”(或其功能活性片段)是指当存在犬RNA聚合酶I以及可选的相关转录因子时，在某种条件下，例如，培养或生理条件，能够增强与其操作性连接的核酸序列转录的核酸序列，其中酶是有功能的。犬RNA聚合酶I调节序列的例子包括犬RNA聚合酶I启动子，它可以使与其操作性连接的核酸转录水平达到背景水平以上，以及犬RNA聚合酶I增强子，它可以增强与犬RNA聚合酶I启动子操作性连接的核酸的转录，使其转录水平超过无犬RNA聚合酶I增强子时所观察到的水平。一种鉴定犬RNA聚合酶I调节元件的试验是将与目的核酸操作性连接的假定的犬RNA聚合酶I调节元件引入到合适的犬细胞内，例如，MDCK细胞，并利用常规的分析方法，例如，Northern印迹，检测目的核酸的转录水平。比较存在和不存在假定的犬RNA聚合酶I调节元件的条件下的核酸转录水平就使技术人员能够确定核酸元件是否是犬RNA聚合酶I调节元件。
术语“载体”是指核酸，例如，可用于将异源核酸序列引入到细胞内的质粒、病毒载体、重组核酸或cDNA。本发明的载体通常包含本发明的调节序列。载体可能能够自主复制，也可能不能自主复制。载体还可以是不能自主复制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、由同一条链内的DNA和RNA组成的多核苷酸、多聚赖氨酸结合的DNA或RNA、肽结合的DNA或RNA、脂质体结合的DNA等。最常见的是，本发明的载体是质粒。
“表达载体”是能够驱动其所包含的核酸表达，例如，转录，的载体，如，质粒。本发明的表达载体一般都包含本发明调节序列。表达载体可能是自主复制的，也可能不是自主复制的。一般来说，被表达的核酸与启动子和/或增强子“操作性”连接，受启动子和/或增强子的转录调节控制。
“双向表达载体”的特征通常是含有两个启动子，二者相对于两个启动子之间核酸方向相反，这样在两个方向上都能启动表达，导致，例如，正(+)或正义链和负(-)或反义链RNA的转录。另外，双向表达载体可以是双义载体，其中病毒mRNA和病毒基因组RNA(cRNA)从同一条链上表达。
在本发明的上下文中，术语“分离的”是指基本不包含在其天然环境中与其结合或相互作用的组分的生物材料，如核酸或蛋白质。分离材料还可以包含在其他天然环境，例如，细胞，中未发现的材料。例如，如果材料处于其天然环境中，例如细胞内，那么材料在细胞内所处的位置(例如，基因组或遗传元件)对于该环境中的材料来说是非天然的。例如，天然核酸(例如，编码序列、启动子、增强子等)如果通过非天然方式被引入到对该核酸来说是非天然的基因组位点(例如，载体如质粒或病毒载体，或扩增子)中，那么这种天然核酸就变成分离的了。这种核酸也被称为“异源”核酸。
术语“重组体”是指通过人为干涉发生人工改变或合成改变(非天然的)的材料(例如，核酸或蛋白质)。改变可在其天然环境或状态内的材料上完成，也可以在从其天然环境或状态中分离出来的材料上完成。特别地，如果指的是病毒，例如，流感病毒，当病毒是通过表达重组核酸来制备的时候，病毒是重组体。
术语“重配体”用于病毒时是指病毒包含来源于多个亲本病毒株或资源的基因和/或多肽组分。例如，7:1重配体包括来源于第一亲本病毒的7个病毒基因组节段(或基因节段)和来源于第二亲本病毒的一个互补病毒基因组节段，例如，编码血凝素或神经氨酸酶。6:2重配体包含来源于第一亲本病毒的6个基因组节段，最常见的6个内部基因，以及来源于不同亲本病毒的两个互补节段，例如，血凝素和神经氨酸酶。
术语“引入”用于指异源核酸或分离核酸时是指核酸被***到真核或原核细胞内，其中核酸可以被***到细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)、转化成自主复制子、或者瞬时表达(例如，转染的mRNA)。该术语包括这些方法如“感染”、“转染”、“转化”和“转导”。在本发明的上下文中，各种方法都可用于将核酸引入到原核细胞内，其中包括电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质介导的转染(脂质转染法)等。
术语“宿主细胞”是指能够或者已经摄取核酸如载体并支持核酸复制和/或表达的细胞，任选地，该细胞还可以支持一种或多种编码产物的合成，其中包括多肽和/或病毒。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物、鸟类或哺乳动物细胞，其中包括人细胞。在本发明的上下文中，典型的宿主细胞包括Vero(非洲绿猴肾)细胞、Per.C6细胞(人胚胎视网膜细胞)、BHK(幼仓鼠肾)细胞、原代鸡肾(PCK)细胞、马-达氏犬肾(MDCK)细胞、马-达氏牛肾(MDBK)细胞、293细胞(例如，293T细胞)和COS细胞(例如，COS1、COS7细胞)。术语宿主细胞包括细胞的组合或混合物，其中包括，例如，不同细胞类型或细胞系(例如，Vero和CEK细胞)的混合培养物。电穿孔的SF Vero细胞的共培养在，例如，PCT/US04/42669中有描述，申请日为2004年12月22日，本文已完整纳入作为参考。
术语“人工改造的”用于本文中是指病毒、病毒核酸或病毒编码产物，例如，多肽、疫苗，包含至少一个通过重组方法引入的突变，例如，定向诱变、PCR诱变等。术语“人工改造的”用于指包含一个或多个核苷酸突变和/或氨基酸取代的病毒(或病毒组分或产物)时是指编码病毒(或病毒组分或产物)的病毒基因组或基因组节段不是来源于天然资源，例如通过非重组方法(例如在25℃累进传代)制备的天然病毒株或以前就存在的实验室病毒株，例如，野生型或冷适应性的A/Ann Arbor/6/60或B/AnnArbor/1/66株。
术语“％序列相同性”在本文中可与术语“％相同性”交互使用，是指利用序列比对程序进行比对时，两个或多个肽序列之间的氨基酸序列相同性的水平，或者两个或多个核苷酸序列之间的核苷酸序列相同性的水平。例如，在本文中，80％的相同性是指通过确定的算法所确定的与80％序列相同性同样的事情，是指一个给定的序列与另一长度的另一序列至少有80％是一致的。典型的序列相同性水平包括而不限于与给定序列有60、70、80、85、90、95、98％或更高的序列相同性。
术语“％序列同源性”在本文中可与术语“％同源性”交互使用，是指利用序列比对程序进行比对时，两个或多个肽序列之间的氨基酸序列同源性的水平，或者两个或多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同源性的水平。例如，在本文中，80％的同源性是指通过确定的算法所确定的与80％序列同源性同样的事情，相应的给定序列的同源物在给定序列的长度上有超过80％的序列同源性。典型的序列同源性水平包括而不限于与给定序列有60、70、80、85、90、95、98％或更高的序列同源性。
可用于确定两个序列之间相同性的典型计算机程度包括而不限于一套BLAST程序，例如，BLASTN、BLASTX、和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN，在NCBI网站上已经公开，可以在互联网上找到。还可参见艾滋库尔(Altschul)等，1990，J.Mol.Biol.215：403-10(可特别参考公开的默认设置，即，参数w＝4，t＝17)和艾滋库尔(Altschul)等，1997，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402。如果要评价一个给定的氨基酸序列相对于GenBank蛋白序列数据库和其他公共数据库中的氨基酸序列的相同性时，一般利用BLASTP程序进行序列检索。BLASTX程序优选用于检索已将所有阅读框架翻译成GenBank蛋白序列数据库和其他公共数据库中的氨基酸序列的核酸序列。BLASTP和BLASTX都可采用默认参数运行，即开放缺口罚分为11.0，延伸缺口罚分为1.0，并利用BLOSUM-62矩阵。同上。
为了确定两个或多个序列之间的“％相同性”所进行的所选择序列的优选比对可利用MacVector 6.5版本的CLUSTAL-W程序完成，其中包括10.0的开放缺口罚分，0.1的延伸缺口罚分，和BLOSUM 30相似性矩阵。
“特异地杂交”或“特异性杂交”或“选择性地杂交”是指复杂混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中存在特定核苷酸序列时，在严格条件下核酸分子优先与该核苷酸序列结合、形成双链或杂交。
术语“严格条件”是指探针与其靶序列优先杂交、与其他序列杂交程度低或根本不杂交的条件。“严格杂交”和“严格杂交洗涤条件”用于核酸杂交试验如Southern和Northern杂交时是序列依赖性的，在不同的环境参数下是有区别的。对核酸杂交的较广泛的指导见于提杰森(Tijssen)，1993，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes(生物化学和分子生物学实验室技术-用核酸探针杂交)，第I部分，第2章，“Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid probe assays(杂交原则和核酸探针分析策略概述)”，纽约艾斯维尔(Elsevier，NY)；森布鲁克(Sambrook)等，2001，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory)，第三版，NY；以及欧舒贝尔(Ausubel)等编辑，最新版本，Current Protocolsin Molecular Biology(当代分子生物学操作手册)，纽约格里恩出版合作和威利国际科学出版社(Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NY)。
一般来说，高严格杂交和洗涤条件所选择的温度比特异性序列在特定离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在特定的离子强度和pH下)。十分严格的条件是指等于特定探针的Tm。
对于Southern或Northern印迹中含有约100个以上互补残基的互补核酸在滤膜上的杂交来说，严格杂交条件的一个例子是在42℃、含1mg肝素的50％甲醛，杂交过夜。高严格洗涤条件的一个例子是在72℃、0.15M NaCl中杂交约15分钟。严格洗涤条件的一个例子是在65℃、0.2×SSC中洗涤15分钟。参见森布鲁克(Sambrook)等对SSC缓冲液的描述。在高严格洗涤之前可先进行低严格洗涤以去除背景探针信号。对于，例如约100个以上核苷酸的双链核酸来说，一种典型的中等严格洗涤条件是在45℃、1×SSC中洗涤15分钟。对于，例如约100个以上核苷酸的双链核酸来说，一种典型的低严格洗涤条件是在40℃、4-6×SSC中洗涤15分钟。一般来说，在特定杂交试验中信-噪比高于不相关探针所具有的信-噪比的2倍(或更高)说明检测到的是特异性杂交。
在本文中，除非特别指明，术语“约”是指一个数值不大于或小于该术语所修饰的数值的10％。例如，术语“约5μg/kg”是指从4.5μg/kg到5.5μg/kg的范围。另一个例子，“约1小时”是指从48分钟到72分钟的范围。
在本文中，术语“编码”是指核酸，例如，脱氧核糖核酸，转录互补核酸的特性，其中包括能被翻译成多肽的核酸。例如，脱氧核糖核酸可编码转录自脱氧核糖核酸的RNA。同样，脱氧核糖核酸可编码翻译自脱氧核糖核酸所转录的RNA的多肽。5.2包含犬RNA Pol I调节元件的核酸
在一个实施方式中，提供了包含本发明的犬RNA调节序列(例如，犬RNA pol I启动子)的分离核酸。调节序列可以，例如，与被转录的核酸操作性连接，在体外或体内存在合适蛋白的情况下分离核酸可被转录。在一个实施方式中，与所述调节序列操作性连接的核酸是流感病毒vRNA节段。
在某些方面，本发明提供了包含犬RNA pol I启动子的分离核酸。优选的是，犬RNA pol I启动子与被转录的核酸如流感病毒基因组RNA操作性连接。核酸引入到犬细胞内会导致流感病毒基因组RNA的转录，以及在存在合适的流感病毒蛋白的情况下，RNA转录子可被包装进流感病毒，例如，感染性的流感病毒。
在某些实施方式中，本发明的核酸包含能结合人、灵长类动物、鼠或犬pol I多肽的犬RNA pol I调节序列或其片段，以及与选自SEQ ID Nos：1-19的一个或多个核苷酸序列有至少或约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、或60％的相同性。在一个实施方式中，RNA pol I调节序列或其片段还保留了启动与核苷酸序列操作性连接的基因转录的能力。
另外，本发明的核酸还包括含有犬RNA pol I启动子的核酸的衍生物。这种衍生物可通过本领域技术人员所熟知的任何方法，但是并不限于这些方法，从下文所鉴定的犬RNA polI调节序列制备。例如，衍生物可通过定点诱变来制备，其中包括核酸的1、2、3、5、10或更多个核苷酸的取代、***或缺失。另外，衍生物可通过随机诱变来制备。随机诱变核酸的一种方法包括在存在0.1mM MnCl2和不平衡的核苷酸浓度的条件下在PCR反应中扩增核酸。这些条件增加了PCR反应中聚合酶错误掺入的几率，导致被扩增的核酸发生随机诱变。优选的是，衍生的核酸还保留有启动与核酸序列操作性连接的基因转录的能力。
在某些实施方式中，本发明的核酸包含一个或多个核苷酸序列的至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、或1000个连续核苷酸，其中的核苷酸序列选自SEQ ID Nos 1-19。优选的是，核酸包含在犬细胞内能启动与核苷酸序列操作性连接的基因转录的序列，因此是功能衍生物。在一个实施方式中，核酸包含能在犬细胞内结合犬pol I多肽并启动(体外或体内)流感病毒vRNA的转录。
在某些实施方式中，本发明的核酸序列包含如SEQ ID NO：1所示序列的-250到-1位核苷酸，或者说由这些核苷酸组成(相对于转录自启动子的第一个核苷酸，也被称为+1位核苷酸)，或者其功能衍生物。SEQ ID NO：1上所发现的表达自犬RNA pol I调节序列的18S核糖体RNA的+1位核苷酸位于SEQ ID NO：1的1804位。
在某些实施方式中，本发明的犬RNA pol I调节序列包含分离的核酸(或其互补序列)，或者说由其组成，其中分离的核酸在严格杂交条件下可与包含选自SEQ IDNos 1-19所组成的一组的核酸杂交，并能在犬细胞内启动与调节序列操作性连接的基因转录。
在一个实施方式中，本发明的犬RNA pol I调节序列包含能与犬RNA pol I多肽结合的核酸序列，以及，在一个实施方式中，在犬细胞内启动与调节序列操作性连接的基因转录。在一个实施方式中，核酸包含能结合真核细胞pol I多肽并能启动(体外或体内)流感病毒vRNA转录的序列。在某些实施方式中，犬RNA pol I多肽与犬RNA pol I调节序列的结合可通过核酶保护试验来分析。在某些实施方式中，犬RNApol I多肽与犬RNA pol I调节序列的结合可通过用于分析蛋白相互作用的BIACORE***(瑞典乌普萨拉百阔国际公司(Biacore International AG，Uppsala，Sweden))来分析。
在某些实施方式中，核酸包含能结合犬RNA pol I的序列。在某些实施方式中，序列和犬RNA pol I结合的亲和力高于和选自如下一组的RNA聚合酶结合的亲和力：灵长类RNA pol I、人pol I和鼠pol I。在某些实施方式中，序列和犬RNA pol I结合的亲和力高于和犬RNA pol II结合的亲和力。在某些实施方式中，序列和犬RNA polI结合的亲和力高于和犬RNA pol III结合的亲和力。在某些实施方式中，与犬RNA polI调节序列的结合可通过用于分析蛋白相互作用的BIACORE***(瑞典乌普萨拉百阔国际公司)来分析。
在某些实施方式中，犬RNA pol I启动子包含下列核苷酸序列，或者说由下列核苷酸序列组成：
TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA(SEQ ID NO：2)。
在某些实施方式中，犬RNA pol I启动子包含下列核苷酸序列，或者说由下列核苷酸序列组成：
GGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA(SEQ ID NO：3)。
在某些实施方式中，犬RNA pol I启动子包含下列核苷酸序列，或者说由下列核苷酸序列组成：
GCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA(SEQ ID NO：4)。
在某些实施方式中，犬RNA pol I启动子包含下列核苷酸序列，或者说由下列核苷酸序列组成：
TGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA(SEQ ID NO：5)。
在某些实施方式中，犬RNA pol I启动子包含下列核苷酸序列，或者说由下列核苷酸序列组成：
GTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA(SEQ ID NO：6)。
在某些实施方式中，犬RNA pol I启动子包含下列核苷酸序列，或者说由下列核苷酸序列组成：
AGGCGCGGTTTTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA(SEQ ID NO：7)。
在某些实施方式中，犬RNA pol I启动子包含下列核苷酸序列，或者说由下列核苷酸序列组成：
TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTG(SEQ ID NO：8)。
在某些实施方式中，犬RNA pol I启动子包含下列核苷酸序列，或者说由下列核苷酸序列组成：
TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCC(SEQ ID NO：9)。
在某些实施方式中，犬RNA pol I启动子包含下列核苷酸序列，或者说由下列核苷酸序列组成：
TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATC(SEQ ID NO：10)。
在某些实施方式中，犬RNA pol I启动子包含下列核苷酸序列，或者说由下列核苷酸序列组成：
TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGT(SEQ ID NO：11)。
在某些实施方式中，犬RNA pol I启动子包含下列核苷酸序列，或者说由下列核苷酸序列组成：
TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG(SEQ ID NO：12)。
在某些实施方式中，犬RNA pol I启动子包含下列核苷酸序列，或者说由下列核苷酸序列组成：
GGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG(SEQ ID NO：13)。
在某些实施方式中，犬RNA pol I启动子包含下列核苷酸序列，或者说由下列核苷酸序列组成：
GCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG(SEQ ID NO：14)。
在某些实施方式中，犬RNA pol I启动子包含下列核苷酸序列，或者说由下列核苷酸序列组成：
GGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG(SEQ ID NO：15)。
在某些实施方式中，犬RNA pol I启动子包含下列核苷酸序列，或者说由下列核苷酸序列组成：
GCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG(SEQ ID NO：16)。
在某些实施方式中，犬RNA pol I启动子包含下列核苷酸序列，或者说由下列核苷酸序列组成：
TGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG(SEQ ID NO：17)。
在某些实施方式中，犬RNA pol I启动子包含下列核苷酸序列，或者说由下列核苷酸序列组成：
GGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG(SEQ ID NO：18)。
在某些实施方式中，犬RNA pol I启动子包含下列核苷酸序列，或者说由下列核苷酸序列组成：
TCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG(SEQ ID NO：19)。
5.3载体和表达载体
在另一方面，本发明提供了包含本发明的核酸的载体，其中包括用于从细胞培养物重组拯救病毒的表达载体。一般来说，表达载体可用于拯救本领域技术人员已知的任何病毒以便于在其生命周期中合成带确定末端的RNA。例如，如上面所讨论的，流感病毒基因组RNA应该含有确定的5’和3’末端以便于在重组***内有效复制和包装。也可参见，纽曼(Neumann)等，(2002)，83：2635-2662中的综述，本文已纳入作为参考。下面的讨论集中在适用于流感病毒的表达载体；但是应当注意的是，其他病毒也可以利用本发明的载体拯救。
根据本发明，在一个实施方式中，编码流感病毒8个基因组节段(节段可来自不同的流感病毒，例如，6个来自于X株，2个来自于Y株)的每一个节段所对应的病毒基因组RNA的cDNA可被***到表达载体内以便于流感病毒的操作和制备。各种载体，其中包括病毒载体、质粒、粘粒、噬菌体和人工染色体，可用于本发明中。一般来说，为了便于操作，cDNA被***到质粒载体内，这种载体含有一个或多个在细菌和真核细胞内能发挥功能的复制起点，以及，可选的便于筛选或选择包含质粒序列的细胞的标记。参见，例如，纽曼(Neumann)等，1999，PNAS.USA 96：9345-9350。
在一个实施方式中，本发明的载体是能在任何一个方向上从***的cDNA启动转录病毒基因组节段的双向表达载体，这就是说，产生(+)链和(-)链RNA分子。为了有效地进行双向转录，每一个病毒基因组节段都***到至少含有两个独立启动子的表达载体内，这样病毒基因组RNA的拷贝可由第一RNA聚合酶启动子(例如犬RNA polI启动子)从一条链上转录出来，病毒mRNA从第二RNA聚合酶启动子(例如，在犬细胞内能启动RNA pol II所介导的转录的犬RNA Pol II启动子或其他启动子)合成。相应的，两个启动子可相对排列，位于至少一个克隆位点(即，限制性内切酶识别序列)的两侧，优选的是适于***病毒基因组RNA节段的独特克隆位点。另外，也可使用“双义(ambisense)”表达载体，其中(+)链mRNA和(-)链病毒RNA(cRNA)从同一个载体链转录。如上所述，用于转录病毒基因组RNA的pol I启动子优选犬pol I启动子。
为了确保每一个表达的vRNA或cRNA都具有正确的3’末端，每个vRNA或cRNA表达载体都可以在RNA编码序列下游***核酶序列或合适的终止子序列(例如，人、鼠、灵长类动物或犬RNA聚合酶I终止序列)。这种序列可以是，例如，肝炎δ病毒基因组核酶序列或其功能衍生物，或者鼠rDNA终止子序列(Genbank登录号M12074)。另外，例如，可以使用Pol I终止子序列(纽曼(Neumann)等，1994，Virology202：477-479)。RNA表达载体可以利用与下列文献所描述的vRNA表达载体相同的方式构建：Pleschka等，1996，J.Virol.70：4188-4192；霍夫曼(Hoffmann)和韦伯斯特(Webster)，2000，J.Gen Virol.81：2843-2847；霍夫曼(Hoffmann)等，2002，Vaccine 20：3165-3170；弗多(Fodor)等，1999，J.Virol.73：9679-9682；纽曼(Neumann)等，1999，RN.A.S.USA 96：9345-9350；以及霍夫曼(Hoffmann)等，2000，Virology 267：310-317，本文都已完整纳入作为参考。
在其他***中，pol I和pol II启动子所转录的病毒序列可以转录自不同的表达载体。在这些实施方式中，可以使用编码在本发明的犬调节序列，例如犬polI启动子(“vRNA表达载体”)，控制之下的每个病毒基因组节段的载体和编码在pol II启动子控制之下的一种或多种病毒多肽，例如流感病毒PA、PB1、PB2和NP多肽(“蛋白表达载体”)，的载体。
在与pol II启动子有关的每一种情况下，要表达的流感病毒基因组节段可操作性连接于合适的转录控制序列(启动子)以指导mRNA的合成。许多启动子都适用于表达载体内以调节流感病毒基因组节段的转录。在某些实施方式中，利用的是巨细胞病毒(CMV)DNA依赖的RNA聚合酶II(Pol II)启动子。如果需要，例如，为了调节条件表达，可以替换其他的启动子以诱导在特殊条件下的，或者在特殊组织或细胞内的，RNA转录。现在已经有无数病毒和哺乳动物，例如，可得到人启动子，或者可根据所关注的特殊用途分离人启动子。例如，得自动物和人病毒的其他启动子包括这样的启动子，如腺病毒(如腺病毒2)、***状瘤病毒、乙型肝炎病毒和多瘤病毒，以及各种逆转录病毒启动子。哺乳动物启动子包括而不限于肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子等。在一个具体实施方式中，调节序列包括与人腺病毒2的剪接的三联前导序列相连的腺病毒2主要晚期启动子，如伯格(Berg)等，BioTechniques 14：972-978所述。另外，噬菌体启动子也可以和同源的RNA聚合酶联合使用，例如，T7启动子。
用于表达病毒蛋白，特别是形成RNP复合物的病毒蛋白的表达载体优选表达与目的病毒同源的病毒蛋白。这些表达载体所表达的病毒蛋白可被本领域技术人员已知的任何调节序列调节。调节序列可以是组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子。蛋白表达载体内可用于控制病毒蛋白表达的启动子的其他例子包括而不限于：SV40早期启动子区(伯诺斯特(Bernoist)和享本(Chambon)，1981，Nature290：304-310)、Rous肉瘤病毒的3’长末端重复序列所包含的启动子(山本(Yamamoto)等，1980，Cell 22：787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(瓦格纳(Wagner)等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列(布林斯特(Brinster)等，1982，Nature 296：39-42)；原核表达载体如β-内酰胺酶启动子(维拉卡玛罗夫(Villa-Kamaroff)等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：3727-3731)，或tac启动子(德波尔(DeBoer)等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25)；也可参见ScientificAmerican(科学美国人)中的“Useful proteins from recombinant bacteria(重组细菌来源的有用蛋白)”，1980，242：74-94；包含胆脂碱合成酶启动子区(海热拉-埃斯图拉(Herrera-Estrella)等，Nature 303：209-213)或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(加德纳(Gardner)等，1981，Nucl.Acids Res.9：2871)的植物表达载体，以及光合酶核酮糖磷酸氢盐羧化酶的启动子(海热拉-埃斯图拉(Herrera-Estrella)等，1984，Nature310：115-120)；来自于酵母或其他真菌的启动子元件如Gal 4启动子、ADC(乙醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子以及下列动物转录控制区，这些转录控制区都具有组织特异性，已被用于转基因动物中：在胰腺腺泡细胞内有活性的弹性硬蛋白酶I基因控制区(斯维弗特(Swift)等，1984，Cell 38：639-646；Omitz等，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409；麦克唐纳(MacDonald)，1987，Hepatology 7：425-515)；在胰腺β细胞内有活性的胰岛素基因控制区(哈纳罕(Hanahan)，1985，Nature 315：115-122)，在淋巴样细胞内有活性的免疫球蛋白基因控制区(格罗斯希德(Grosschedl)等，1984，Cell 38：647-658；艾达莫斯(Adames)等，1985，Nature 318：533-538；亚历山大(Alexander)等，1987，Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)，在睾丸细胞、乳腺细胞、淋巴样细胞以及肥大细胞内有活性的鼠***瘤病毒控制区(莱德(Leder)等，1986，Cell 45：485-495)，在肝脏内有活性的白蛋白基因控制区(品科特(Pinkert)等，1987，Genes and Devel.1：268-276)，在肝脏内有活性的甲胎蛋白基因控制区(科鲁劳夫(Krumlauf)等，1985，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；海默(Hammer)等，1987，Science 235：53-58)，在肝脏内有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(科尔赛(Kelsey)等，1987，Genes and Devel.1：161-171)，在髓样细胞内有活性的β球蛋白基因控制区(莫格莱姆(Mogram)等，1985，Nature 315：338-340；科莱斯(KoIlias)等，1986，Cell 46：89-94)；在脑的少突胶质细胞内有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(瑞德海德(Readhead)等，1987，Cell 48：703-712)，在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链2基因控制区(赛尼(Sani)，1985，Nature 314：283-286)，以及在下丘脑内有活性的***释放激素基因控制区(梅森(Mason)等，1986，Science 234：1372-1378)。
在一个具体实施方式中，本发明的蛋白表达载体包含与核酸序列操作性连接的启动子、一个或多个复制起点、以及，任选地，一个或多个可选标记(例如，抗生素抗性基因)。在另一个实施方式中，本发明的蛋白表达载体能够产生双顺反子mRNA，这种载体可通过***双顺反子mRNA序列来制备。可以利用某些内部核糖体进入位点(IRES)序列)。优选的IRES元件包括而不限于哺乳动物BiP IRES和丙型肝炎病毒IRES。
在一个实施方式中，本发明的核酸被***到质粒pAD3000和其衍生物内。参见美国专利申请公开20050266026和图10。因此，在某些实施方式中，表达载体是双向表达载体。在某些实施方式中，表达载体包含SV40聚酰苷酸化信号，临近两个启动子之间的流感病毒基因组节段。在某些实施方式中，表达载体包含巨细胞病毒(CMV)DNA依赖的RNA Pol II启动子。
可以通过，例如，三种通用方法，鉴定包含基因***片段的载体：(a)核酸杂交；(b)存在和不存在“标记”基因功能；以及，如果是表达载体，(c)***序列的表达。在第一种方法中，可以通过核酸杂交检测载体内是否存在***的病毒基因，所用探针包含与***基因同源的序列。在第二种方法中，可以根据是否存在由于基因***到载体内而导致的某些“标记”基因功能(例如，对抗生素耐药和转化表型)来鉴定和筛选重组载体/宿主***。在第三种方法中，可以通过分析表达的基因产物来鉴定表达载体。这种分析可基于，例如，病毒蛋白在体外分析***中的物理特性或功能特性，例如，病毒蛋白与抗体的结合。
在一个具体实施方式中，一种或多种蛋白表达载体编码和表达RNP复合物形成所必需的病毒蛋白。在另一实施方式中，一种或多种蛋白表达载体编码和表达形成病毒颗粒所必需的病毒蛋白。在另一实施方式中，一种或多种蛋白表达载体编码和表达特定负链RNA病毒的所有病毒蛋白。
任选地，可以通过***增强子序列来增强表达载体的转录。一般来说，增强子是一种较短的，例如，10-500bp，能与启动子协同作用增强转录的顺式作用DNA元件。已经从哺乳动物基因(血红蛋白、弹性酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)和真核细胞病毒中分离出许多增强子序列。增强子可以被剪接到载体内异源编码序列的5’或3’位置，但是通常被***到启动子的5’位置。一般来说，所选择的启动子，以及如果需要，还有其他转录增强序列可以优化宿主细胞内的表达，其中异源DNA被引入到该细胞内(沙夫(Scharf)等(1994)，“Heat stress promoters and transcription factors(热应激启动子和转录因子)”Results Probl Cell Differ 20：125-62；Kriegler等(1990)，Assemblyof enhancers，promoters，and splice signals to control expression of transferred genes(装配增强子、启动子和剪接信号以控制被转移基因的表达)Methods in Enzymol 185：512-27)。任选地，扩增子还可以包含用于翻译起始的核糖体结合位点或内部核糖体进入位点(IRES)。
本发明的表达载体还可以包含用于转录终止的序列以及用于稳定mRNA的序列，如聚酰苷酸化位点或终止序列(例如，人、鼠、灵长类动物或犬RNA聚合酶I终止序列)。这种序列通常存在于真核细胞或病毒DNA或cDNA的5’以及，偶尔为3’，非翻译区。在某些实施方式中，SV40聚酰苷酸化序列提供了聚酰苷酸化信号。
另外，如上所述，载体还可以包含一个或多个可选标记基因以提供用于筛选转化的宿主细胞的表型特征，除了上面所列的基因以外，标记如二氢叶酸还原酶或新霉素耐药性也适用于真核细胞培养物内的筛选。
包含上述合适DNA序列以及合适启动子或控制序列的表达载体可用于转化允许蛋白表达的宿主细胞。虽然本发明的表达载体可以在细菌细胞内复制，但是为了表达的目的，最常见的是将其引入到哺乳动物细胞内，例如，Vero细胞、BHK细胞、MDCK细胞、293细胞、COS细胞，更优选的是MDCK细胞，这也是比较理想的。
本发明的表达载体可用于指导包含一个或多个突变的基因组vRNA或相应的cRNA的表达(例如，去除或灭活特定流感病毒大流行株如H5N1的HA基因上的多碱基裂解位点)。这些突变可导致病毒的减毒。例如，vRNA节段极大可以是锅柄样双链启动子区上含有减毒碱基对取代的甲型流感病毒的vRNA节段，特别是，例如，NA特异性vRNA的双链区上11-12’位的C到A和G到U的已知减毒碱基对取代(弗多(Fodor)等，1998，J.Virol.6923-6290)。通过利用本发明的制备重组负链RNA病毒的方法，可以鉴定出新的减毒突变。
另外，美国专利号6,951,754、6,887,699、6,649,372、6,544,785、6,001,634、5,854,037、5,824,536、5,840,520、5,820,871、5,786,199和5,166,057以及美国专利申请公开号20060019350、20050158342、20050037487、20050266026、20050186563、20050221489、20050032043、20040142003、20030035814和20020164770所描述的任何表达载体都可用于本发明。一般来说，通过将本文所描述的本发明的核酸(例如，本发明的犬调节序列如犬pol I启动子序列)引入到表达载体内以指导病毒vRNA或cRNA的合成，这些公开所描述的载体可用于本发明中。
5.3.1其他表达元件
最常见的是，编码流感病毒蛋白的基因组节段包含其表达所需要的任何其他序列，其中包括翻译成功能性的病毒蛋白。在其他情形中，可以使用编码病毒蛋白，例如，HA或NA蛋白，的微小基因或其他人工构建体。在这种情况下，包含有助于异源编码序列有效翻译的特异性起始信号通常是比较理想的。这些信号包括，例如，ATG起始密码子及其相邻序列。为了确保完整***片段能够翻译，起始密码子要被***到病毒蛋白相应的正确阅读框架内。外源转录元件和起始密码子可以是各种来源的，既可以是天然的，也可以是合成的。通过将合适的增强子***到所用的细胞***内可以提高表达的效率。
如果需要，编码其他表达元件，如信号序列、分泌或定位序列等，的多核苷酸序列可以被***到载体内，这些序列通常与目的基因位于同一框架内，例如，以使表达的多肽靶向到所期望的细胞区域、细胞膜或细胞器，或者进入细胞培养介质中。这种序列是本领域技术人员所熟知的，其中包括分泌前导肽、细胞器靶向序列(例如，细胞核定位序列，ER停滞信号，线粒体转运序列)、膜定位/锚定序列(例如，终止转运序列，GPI锚定序列)等。
5.4用于制备嵌合病毒的表达载体
本发明的表达载体还可用于制备能够表达对于病毒基因组来说是异源的序列的嵌合病毒。指导vRNA或相应的cRNA的表达载体与指导病毒蛋白的表达载体一起被引入到宿主细胞内以制备新型感染性重组负链RNA病毒或嵌合病毒。参见，例如，美国转录申请公开号US20040002061。可以被***到这些病毒内的异源序列包括反义核酸和核酸如核酶。另外，表达肽或多肽的异源序列也可以被***到这些病毒内。编码下列肽或多肽的异源序列可以被***到这些病毒中：1)病原体特征性抗原；2)自身免疫病特征性抗原；3)***反应原特征性抗原；以及4)肿瘤特征性抗原。例如，可以被***到本发明的嵌合病毒内的异源基因序列包括而不限于人免疫缺陷病毒(HIV)的表位如gp160；乙型肝炎病毒表面抗原(HbsAg)；疱疹病毒的糖蛋白(例如，gD，gE)；脊髓灰质炎病毒的VP1；以及非病毒病原体的抗原决定簇如细菌和诸虫。
自身免疫病的特征性抗原通常来源于哺乳动物组织的细胞表面、细胞浆、细胞核、线粒体等，其中包括糖尿病、多发性硬化症、***红斑狼疮、类风湿性关节炎、恶性贫血、阿狄森氏病、硬皮病、自身免疫性萎缩性胃炎、青少年糖尿病以及盘状红斑狼疮的特征性抗原。
变体反应原性抗原通常是蛋白或糖蛋白，其中包括花粉、粉尘、霉、孢子、皮屑、昆虫和食物来源的抗原。
肿瘤抗原特征性抗原通常来源于肿瘤组织细胞的细胞表面、细胞浆、细胞核、细胞器等。例子包括肿瘤蛋白特征性抗原，其中包括突变的癌基因编码的蛋白；肿瘤相关的病毒蛋白；以及糖蛋白。肿瘤包括而不限于下列类型的癌来源的那些肿瘤：唇癌、鼻咽癌、咽和口腔癌、食道癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、喉癌、肺和支气管癌、皮肤黑色素瘤、乳腺癌、***、子宫癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌、子宫癌、脑和神经***其他部位的癌、甲状腺癌、***癌、睾丸癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。
在本发明的一个具体实施方式中，异源序列来源于人免疫缺陷病毒(HIV)的基因组，优选人免疫缺陷病毒-1或人免疫缺陷病毒-2。在本发明的另一个实施方式中，异源编码序列可以被***到负链RNA病毒基因编码序列内，这样可以表达嵌合基因产物，其中异源肽序列包含在病毒蛋白内。在本发明的这个实施方式中，异源序列还可以来源于人免疫缺陷病毒的基因组，优选人免疫缺陷病毒-1或人免疫缺陷病毒-2。
在异源序列是HIV来源的例子中，这种序列包括而不限于env基因(即，编码全长或部分gp160、gp120和/或gp41的序列)、pol基因(即，编码全长或部分反转录酶、核酸内切酶、蛋白酶和/或整合酶的序列)、gag基因(即，编码全长或部分p7、p6、p55、p17/18、p24/25的序列)、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr和/或vpx来源的序列。
构建这些杂合分子的一种方法是将异源编码序列***到负链RNA病毒基因的DNA互补链内，这样异源序列的两侧分别是病毒聚合酶活性所需的病毒序列；例如，犬RNA pol I启动子，和聚酰苷酸化位点。在另一种方法中，编码犬RNA pol I启动子的寡核苷酸，例如，病毒基因组节段3’端或两端的互补链可以连接上异源编码序列以构建杂合分子。从前，在靶序列内放置外源基因或外源基因节段受靶序列内是否存在合适的限制性酶切位点的限制。但是最近在分子生物学上的研究进展已经基本解决了这个问题。通过定向诱变可以很容易地将限制性酶切位点***到靶序列的任何位置上(例如，参见，例如卡恩科尔(Kunkel)，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：488所描述的技术)。所描述的经过改变的聚合酶链式反应(PCR)技术也可用于特异地***序列(即，限制性酶切位点)和灵活地构建杂合分子。另外，PCR反应可用于制备重组模板而无需克隆。例如，PCR反应可用于制备包含DNA指导的RNA聚合酶启动子(例如，噬菌体T3、T7或SP6)的双链DNA分子和包含异源基因和犬RNA polI启动子的杂合序列。因此，RNA模板可以从这个重组DNA上直接转录出来。在另一个实施方式中，重组vRNA或相应的cRNA可通过利用RNA连接酶将指定异源基因负极性的RNA与犬RNA pol I启动子连接起来而制备。
可以构建双顺反子mRNA以便于内部启动病毒序列的翻译以及从规则的末端起始位点表达外源蛋白编码序列。另外，可以构建双顺反子mRNA序列，其中病毒序列从规则的末端开放阅读框架翻译，而外源序列从内部位点起始。某些内部核糖体进入位点(IRES)序列可以被利用。所选择的IRES序列应该足够短以使其不会干扰病毒包装限制。因此，优选的是，这种双顺反子方法所选择的IRES长度不应该超过500个核苷酸，少于250个核苷酸是优选的。另外，优选的是，所利用的IRES与小核糖核酸病毒元件不共享序列或者没有结构同源性。优选的IRES元件包括而不限于哺乳动物的BiP FRES和丙型肝炎病毒IRES。
另外，外源蛋白可以从内部转录单位表达，其中转录单位含有起始位点和聚酰苷酸化位点。在另一个实施方式中，外源基因被***到负链RNA病毒基因内，这样所得到的表达蛋白是融合蛋白。
5.5制备重组病毒的方法
本发明提供了在无辅助病毒的情况下通过将本发明的蛋白表达载体和vRNA或相应的cRNA表达载体引入到宿主细胞内来制备感染性的重组负链RNA病毒的方法。优选的是，宿主细胞是犬细胞，例如，MDCK细胞。本发明还提供了在有辅助病毒的情况下通过将本发明的蛋白表达载体和vRNA或相应的cRNA表达载体引入到宿主细胞内来制备感染性的重组负链RNA病毒的方法。优选的是，宿主细胞是犬细胞，例如，MDCK细胞。
可以利用本领域技术人员熟知的任何技术，但是并不局限于这些技术，将蛋白表达载体和指导vRNA或相应的cRNA表达的表达载体引入到宿主细胞内。例如，本发明的表达载体可以利用电穿孔、二乙胺基乙基葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质体、微注射以及微粒轰击引入到宿主细胞内(参见，例如，森布鲁克(Sambrook)等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，第二版，1989，纽约冷泉港冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.))。本发明的表达载体可以同时或先后引入到宿主细胞内。
在一个实施方式中，在引入指导病毒蛋白表达的表达载体前将指导vRNA或相应的cRNA表达的一个或多个表达载体引入到宿主细胞内。在另一个实施方式中，在引入指导vRNA或相应的cRNA表达的一个或多个表达载体前将指导病毒蛋白表达的一个或多个表达载体引入到宿主细胞内。根据这些实施方式，指导vRNA或相应的cRNA表达的表达载体可在不同的转染中一起引入或分别引入。另外，根据这些实施方式，指导病毒蛋白表达的表达载体可在不同的转染中一起引入或分别引入。
在另一个实施方式中，指导vRNA或相应的cRNA表达的一个或多个表达载体和指导病毒蛋白表达的一个或多个表达载体可以被同时引入到宿主细胞内。在某些实施方式中，所有表达载体都利用脂质体引入到宿主细胞内。
利用常规的试验可以确定用于执行本发明的方法所需要的表达载体的合适数量和比例。作为指导，在用脂质体转染或磷酸钙沉淀将质粒引入到宿主细胞内的例子中，优选的是每个质粒的用量为几个微克，例如，1到10μg，例如，常规方法中在用转染剂混合前将总DNA的终浓度稀释到约0.1μg/ml。优选的是，表达NP和/或RNA依赖的RNA聚合酶亚单位的载体所使用的浓度高于表达vRNA节段的那些载体。本领域的技术人员很容易理解，表达载体的数量和比例可以根据宿主细胞的不同而改变。
在一个实施方式中，至少0.5μg，优选至少1μg、至少2.5μg、至少5μg、至少8μg、至少10μg、至少15μg、至少20μg、至少25μg、或至少50μg本发明的一种或多种蛋白表达载体被引入到宿主细胞内以制备感染性的重组负链RNA病毒。在另一个实施方式中，至少0.5μg，优选至少1μg、至少2.5μg、至少5μg、至少8μg、至少10μg、至少15μg、至少20μg、至少25μg、或至少50μg本发明的一种或多种指导vRNA或相应的cRNA表达的载体被引入到宿主细胞内以制备感染性的重组负链RNA病毒。
用于制备本发明的负链RNA病毒的宿主细胞包括原代细胞、培养的或传代的细胞以及转化的或永生化的细胞(例如，293细胞、293T细胞、CHO细胞、Vero细胞、PK细胞、MDBK细胞、OMK细胞和MDCK细胞)。宿主细胞优选动物细胞，更优选的是哺乳动物细胞，最优选的是犬细胞。在一个优选实施方式中，本发明的感染性重组负链RNA病毒在MDCK细胞内制备。
本发明提供了在稳定转导的宿主细胞系内制备感染性重组负链RNA病毒的方法。本发明的稳定转导的宿主细胞系可通过将合适表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止序列、聚酰苷酸化位点等)控制的cDNA和可选标记引入到宿主细胞内来制备。引入外源DNA以后，转导的细胞可在丰富培养基内培养1-2天，然后转移到选择培养基内。可选标记赋予细胞耐受性，允许细胞将DNA稳定整合到其染色体内。稳定整合DNA的转导宿主细胞可以被克隆并扩增成细胞系。
许多筛选***都可以使用，其中包括而不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(韦格勒(Wigler)等，1977，Cell 11：223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(斯滋巴尔斯卡(Szybalska)和斯滋巴尔斯科(Szybalski)，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：2026)以及腺嘌呤核酸核糖转移酶(罗威(Lowy)等，1980，Cell 22：817)基因，这些基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞中。另外，抗代谢物耐受性也可用作筛选下列基因的基础：dhfr基因，赋予细胞对氨甲碟呤的耐受性(韦格勒(Wigler)等，1980，Natl.Acad.Sci.USA 77：3567；欧海尔(O′Hare)等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527)；gpt基因，赋予细胞对霉酚酸的耐受性(谬里干(Mulligan)和伯格(Berg)，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072)；neo基因，赋予细胞对氨基糖甙G-418的耐受性(蔻伯瑞-咖瑞平(Colberre-Garapin)等，1981，J.Mol.Biol.150：1)；以及hygro基因，赋予细胞对潮霉素的耐受性(森特瑞(Santerre)等，1984，Gene 30：147)。
根据本发明的方法制备的非减毒的感染性重组负链RNA病毒可通过，例如，经典方法，减毒或灭活。例如，可通过热处理或甲醛处理灭活本发明的重组负链RNA病毒，这样病毒就不能复制了。本发明的非减毒的重组负链RNA病毒可通过，例如，在非天然宿主内传代以产生免疫原性而非致病性的子代病毒减毒。
根据本发明制备的减毒活病毒或死病毒可在随后以常规的方式掺入到疫苗组合物内，或者用于制备其他病毒，例如，在鸡蛋内。如果这种病毒含有如上所述的编码外源抗原的嵌合vRNA节段，就可以被制成制剂以达到同时产生抗多种病原体的免疫的目的。根据本发明制备的含有嵌合vRNA节段的减毒重组病毒还可以被加以设计以使其具有其他治疗用途，例如，抗肿瘤药物或基因治疗工具，在这种情况下，制备病毒以后可以将其与药用载体或稀释剂一起掺入到合适的药用组合物中。
根据本发明实施的无辅助病毒拯救特别适用于制备重配病毒，尤其是用于疫苗的重配流感病毒，因为筛选方法无需去除辅助病毒培养物。
本发明的方法可加以修饰以加入本领域技术人员熟知的方法的方面，从而提高拯救感染性病毒颗粒的效率。例如，反求遗传技术可用于制备包含负链病毒RNA非编码区的合成重组病毒RNA，这种非编码区是病毒聚合酶识别以及制备成熟病毒元所需要的包装信号所必须的。重组RNA可以从重组DNA模板合成并在体外用纯化的病毒聚合酶复合物重新构建以形成可用于转染细胞的重组核糖核蛋白(RNP)。如果合成的RNA在体外或体内转录期间存在病毒聚合酶蛋白，那么就可以达到更有效率的转染。合成的重组RNP可被拯救到感染性病毒颗粒内。在先技术在下列文献中有描述：美国专利号5,166,057，1992年11月24日公开；美国专利号5,854,037，1998年12月29日公开；美国专利号5,789,229，1998年8月4日公开；欧洲专利公开EP0702085A1，1996年2月20日公开；美国专利申请序列号09/152,845；国际专利公开PCR WO97/12032，1997年4月3日；WO96/34625，1996年11月7日；欧洲专利公开EP-A780475；WO99/02657，1999年1月21日公开；WO98/53078，1998年11月26日公开；WO98/02530，1998年1月22日公开；WO99/15672，1999年4月1日公开；WO98/13501，1998年4月2日公开；WO97/06720，1997年2月20日公开；以及EPO 78047SA1，1997年6月25日公开，本文都已完整纳入作为参考。
5.5.1节段化的负链RNA病毒的具体实施方式
本发明提供了在培养细胞中制备包含3个以上基因组vRNA节段的节段化负链RNA病毒的感染性重组病毒颗粒的方法，例如，流感病毒如甲型流感病毒，所述方法包括：(a)将能够在所述细胞内表达基因组vRNA节段以提供所述病毒的完整基因组vRNA节段的第一套表达载体引入到能支持所述病毒生长的细胞群内；(b)将能够表达编码所述病毒的一种或多种多肽的mRNA的第二套表达载体引入到所述细胞内；以及(c)培养所述细胞从而制备所述的病毒颗粒。在某些实施方式中，细胞是犬细胞。在某些实施方式中，细胞是MDCK细胞。在某些实施方式中，重组病毒是甲型或乙型流感病毒。在某些实施方式中，第一套表达载体包含在1-8个质粒内。在某些实施方式中，第一套表达载体包含在1个质粒内。在某些实施方式中，第二套表达载体包含在1-8个质粒内。在某些实施方式中，第二套表达载体包含在1个质粒内。在某些实施方式中，第一套、第二套或两套表达载体通过电穿孔引入。在某些实施方式中，第一套表达载体编码流感病毒的各个vRNA节段。在某些实施方式中，第二套表达载体编码一种或多种或所有流感病毒多肽的mRNA。在某些实施方式中，第一套或第二套表达载体(或两套)包含本发明的核酸，例如，本发明的犬RNA pol I调节序列(例如，犬RNA pol I启动子)。在某些实施方式中，第一套或第二套表达载体(或两套)编码第二病毒的vRNA或mRNA。例如，一套载体包含编码第二流感病毒的HA和/或NA mRNA和/或vRNA的一种或多种载体。在一个实施方式中，辅助病毒用于该方法中。在一个实施方式中，用于该方法的培养细胞是犬细胞。
本发明提供了在培养细胞内制备节段化的负链RNA病毒的感染性重组病毒颗粒的方法，其中的负链RNA病毒具有3个以上的基因组vRNA节段，例如流感病毒如甲型流感病毒，所述方法包括：(a)将既能够在所述细胞内表达基因组vRNA节段以提供所述病毒的完整基因组vRNA节段又能够表达编码所述病毒的一种或多种多肽的mRNA的一套表达载体引入到能支持所述病毒生长的细胞群内；(b)培养所述细胞从而制备所述的病毒颗粒。在某些实施方式中，细胞是犬细胞。在某些实施方式中，细胞是MDCK细胞。在某些实施方式中，病毒是甲型或乙型流感病毒。在某些实施方式中，这一套表达载体包含在1-17个质粒内。在某些实施方式中，这一套表达载体包含在1-8个质粒内。在某些实施方式中，这一套表达载体包含在1-3个质粒内。在某些实施方式中，这一套表达载体通过电穿孔引入。在某些实施方式中，这一套表达载体编码流感病毒的各个vRNA节段。在某些实施方式中，这一套表达载体编码一种或多种流感病毒多肽的mRNA。在某些实施方式中，这一套表达载体编码流感病毒的每一个vRNA节段和一种或多种流感病毒多肽的mRNA。在某些实施方式中，这一套表达载体包含本发明的核酸，例如，本发明的犬RNA pol I调节序列(例如，犬RNA pol I启动子)。在某些实施方式中，这一套表达载体编码第二病毒的vRNA或mRNA。例如，这一套载体包含编码第二流感病毒的HA和/或NA mRNA和/或vRNA的一种或多种载体。在某些实施方式中，第一套或第二套表达载体(或两套)编码第二病毒的vRNA或mRNA。例如，一套载体包含编码第二流感病毒的HA和/或NA mRNA和/或vRNA的一种或多种载体。在一个实施方式中，辅助病毒用于该方法中。在一个实施方式中，用于该方法的培养细胞是犬细胞。
本发明提供了在培养细胞中制备负链RNA病毒的感染性重组病毒颗粒的方法，所述方法包括：(a)将能够在所述细胞内表达基因组vRNA节段以提供所述病毒的完整基因组vRNA节段的第一套表达载体引入到能支持所述病毒生长的细胞群内；(b)将能够表达编码所述病毒的一种或多种多肽的mRNA的第二套表达载体引入到所述细胞内；以及(c)培养所述细胞从而制备所述的病毒颗粒。在某些实施方式中，细胞是犬细胞。在某些实施方式中，细胞是MDCK细胞。在某些实施方式中，病毒是乙型流感病毒。在某些实施方式中，第一套表达载体包含在1-8个质粒内。在某些实施方式中，第一套表达载体包含在1个质粒内。在某些实施方式中，第二套表达载体包含在1-8个质粒内。在某些实施方式中，第二套表达载体包含在1个质粒内。在某些实施方式中，第一套、第二套或两套表达载体通过电穿孔引入。在某些实施方式中，第一套表达载体编码流感病毒的各个vRNA节段。在某些实施方式中，第二套表达载体编码一种或多种或所有流感病毒多肽的mRNA。在某些实施方式中，第一套或第二套表达载体(或两套)包含本发明的核酸，例如，本发明的犬RNA pol I调节序列(例如，犬RNA pol I启动子)。在一个实施方式中，辅助病毒用于该方法中。在一个实施方式中，用于该方法的培养细胞是犬细胞。
本发明提供了在培养细胞内制备负链RNA病毒的感染性重组病毒颗粒的方法，所述方法包括：(a)将既能够在所述细胞内表达基因组vRNA节段以提供所述病毒的完整基因组vRNA节段又能够表达编码所述病毒的一种或多种多肽的mRNA的一套表达载体引入到能支持所述病毒生长的细胞群内；(b)培养所述细胞从而制备所述的病毒颗粒。在某些实施方式中，细胞是犬细胞。在某些实施方式中，细胞是MDCK细胞。在某些实施方式中，病毒是乙型流感病毒。在某些实施方式中，这一套表达载体包含在1-17个质粒内。在某些实施方式中，这一套表达载体包含在1-8个质粒内。在某些实施方式中，这一套表达载体包含在1-3个质粒内。在某些实施方式中，这一套表达载体通过电穿孔引入。在某些实施方式中，这一套表达载体编码流感病毒的各个vRNA节段。在某些实施方式中，这一套表达载体编码一种或多种流感病毒多肽的mRNA。在某些实施方式中，这一套表达载体编码流感病毒的每一个vRNA节段和一种或多种流感病毒多肽的mRNA。在某些实施方式中，这一套表达载体包含本发明的核酸，例如，本发明的犬RNA pol I调节序列(例如，犬RNA pol I启动子)。在某些实施方式中，这一套表达载体编码第二病毒的vRNA或mRNA。例如，这一套载体包含编码第二流感病毒的HA和/或NA mRNA和/或vRNA的一种或多种载体。在一个实施方式中，辅助病毒用于该方法中。在一个实施方式中，用于该方法的培养细胞是犬细胞。
本发明提供了在培养的犬细胞中制备包含3个以上基因组vRNA节段的节段化负链RNA病毒的感染性病毒颗粒的方法，例如，流感病毒如甲型流感病毒，所述方法包括：(a)提供第一犬细胞群，该细胞群能支持所述病毒生长并且包含第一套表达载体，该套表达载体在缺少辅助病毒的情况下能够指导基因组vRNA节段在所述犬细胞内表达以提供所述病毒的完整基因组vRNA节段或相应的cRNA，从而提供任何这种RNA节段，所述的犬细胞还能够提供核蛋白和RNA依赖的RNA聚合酶，从而可以形成包含所述病毒基因组vRNA节段的RNP复合物以及在所述犬细胞内装配所述的病毒颗粒；(b)培养所述的犬细胞从而制备所述的病毒颗粒。在某些实施方式中，犬细胞是MDCK细胞。
本发明还提供了在培养的犬细胞中制备节段化负链RNA病毒的感染性病毒颗粒的方法，所述方法包括：(i)提供第一犬细胞群，该细胞群能支持所述病毒生长并且可以被修饰以使其能够(a)在无辅助病毒的情况下提供所述病毒的基因组vRNA以及(b)提供核蛋白和RNA依赖的RNA聚合酶，从而可以形成包含所述基因组vRNA的RNA复合物以及装配所述的病毒颗粒，所述的基因组vRNA或其功能性衍生物可在犬RNA pol I调节序列的控制下在所述细胞内表达；以及(ii)培养所述的犬细胞从而制备所述的病毒颗粒。
本发明提供了在培养的细胞中制备节段化负链RNA病毒的感染性病毒颗粒的方法，所述方法包括：(i)提供一群犬细胞，该细胞群能支持所述病毒生长并且可以被修饰以使其能够(a)在无辅助病毒的情况下提供所述病毒的基因组vRNA以及(b)提供核蛋白和RNA依赖的RNA聚合酶，从而可以形成RNP复合物或包含所述基因组vRNA的复合物以及装配所述的病毒颗粒，所述的基因组vRNA或其功能性衍生物可在犬RNA pol I调节序列的控制下在所述犬细胞内表达；以及(ii)培养所述的犬细胞从而制备所述的病毒颗粒。
在一个具体实施方式中，可以利用本文描述的方法在犬宿主细胞内制备包含至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个基因组vRNA节段的感染性重组负链RNA病毒。
在一个具体实施方式中，本发明提供了利用表达vRNA节段或相应的cRNA以及流感病毒蛋白，特别是PB1、PB2、PA和NA，的表达载体在宿主细胞内制备感染性重组流感病毒的方法。根据这个实施方式，制备感染性重组流感病毒可以使用辅助病毒，也可以不使用。
本发明的感染性重组流感病毒可以能够或不能够复制和产生子代。优选的是，本发明的感染性重组流感病毒是减毒的。减毒的感染性重组流感病毒可以，例如，包含NS1基因的突变。
在某些实施方式中，本发明的感染性重组病毒可用于制备其他病毒，这些其他病毒可用于制备本发明的疫苗组合物。在一个实施方式中，根据本发明的方法制备的重组或重配病毒可用于制备适于用作疫苗的其他病毒。例如，根据本发明的方法制备的包含本发明的犬RNA pol I调节序列(例如，犬RNA pol I启动子)的重组或重配病毒群。随后在鸡蛋或其他培养物中扩增病毒群从而生产用于制备疫苗或免疫原性组合物的其他病毒。
在某些实施方式中，本发明的感染性重组流感病毒表达异源(即，非流感病毒的)序列。在另一个实施方式中，本发明的感染性重组流感病毒表达来自于不同流感病毒株的流感病毒蛋白。在另一个优选实施方式中，本发明的感染性重组流感病毒表达融合蛋白。
5.5.2将载体引入宿主细胞
可根据本领域熟知的方法(参见，例如，美国专利申请公开号US20050266026和20050158342)将包含流感病毒基因组节段的载体引入到宿主细胞内以便于将异源核酸引入到真核细胞内，引入方法包括，例如，磷酸钙共沉淀、电穿孔、微注射、脂质转染以及利用多胺转染剂的转染。例如，根据厂家的说明书利用多胺转染剂TransIT-LT1(Mirus)可将载体如质粒转染到宿主细胞内，如，MDCK细胞、COS细胞、293T细胞或其组合。将大约1μg要引入宿主细胞群的各载体与大约2μl TransIT-LT1混合，用160μl培养基稀释，优选无血清培养基，总体积为200μl。DNA：转染剂混合物在室温下孵育45分钟，然后加入800μl培养基。再将转染混合物加到宿主细胞中，按照上面描述的方法培养细胞。相应的，为了在细胞培养物中生产重组或重配病毒，包含8个基因组节段(PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HA和NA)的各个节段的载体与约20μl TransIT-LT1混合并转染到宿主细胞内。任选地，在转染之前可用无血清培养基如Opti-MEM I代替含有血清的培养基，并培养4-6小时。
另外，电穿孔可用于将包含流感病毒基因组节段的载体引入到宿主细胞内。参见，例如，美国专利申请公开US20050266026和20050158342，本文已纳入作为参考。例如，按照下面的过程通过电穿孔可将包含甲型或乙型流感病毒的质粒载体引入到MDCK细胞内。简言之，将例如生长在添加10％胎牛血清(FBS)的改进的Eagle培养基(MEM)中的5×106个MDCK细胞悬浮于0.4ml OptiMEM，然后加到电穿孔槽内。溶解在最多25μl体积中的20μg DNA被加到电穿孔槽内的细胞中，通过敲击温和混合。按照厂家的说明书(例如，连有Capacitance Extender Plus的BioRad Gene Pulser II)进行电穿孔，参数为300伏特、950微法拉、时间常数在28-33毫秒之间。通过温和敲打混合细胞，电穿孔后约1-2分钟将含10％FBS的0.7ml MEM直接加到电穿孔槽内。然后将细胞转移到标准6孔组织培养平皿的两个孔中，每孔含2ml MEM、10％FBS或无血清的OPTI-MEM。洗涤电穿孔槽以回收所有剩余的细胞，洗涤悬液分到两个孔中。终体积约为3.5ml。然后细胞在允许病毒生长的条件下孵育，例如，对于冷适应性病毒株来说约为33℃。
对载体引入宿主细胞内的进一步指导可见于，例如，美国专利号6,951,754、6,887,699、6,649,372、6,544,785、6,001,634、5,854,037、5,824,536、5,840,520、5,820,871、5,786,199和5,166,057以及美国专利申请公开号20060019350、20050158342、20050037487、20050266026、20050186563、20050221489、20050032043、20040142003、20030035814和20020164770。
5.6细胞培养
一般来说，病毒的繁殖可在培养宿主细胞常用的培养基组合物中完成。用于流感病毒复制的合适宿主细胞包括，例如，Vero细胞、Per.C6细胞、BHK细胞、MDCK细胞、293细胞和COS细胞，其中包括293T细胞、COS细胞。在本发明中MDCK细胞是优选的。使用非致瘤性MDCK细胞作为宿主细胞也是本发明的实施方式。包含两种上述细胞系，例如，MDCK细胞和293T细胞或COS细胞，的共培养物也可用于提高复制效率，例如以1∶1的比例。参见，例如，20050158342。一般来说，细胞在标准的商用培养基中培养，例如添加血清(例如，10％胎牛血清)的DMEM，或者在无血清培养基中培养，培养条件为适于维持中性缓冲pH(例如，pH在7.0到7.2之间)的可控湿度和CO2浓度。任选地，培养基可以包含抗生素以防止细菌生长，例如，青霉素、链霉素等，和/或其他营养物，例如L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸、促使产生良好生长特性的其他添加物，例如，胰蛋白酶、β-巯基乙醇等。
在培养物中培养哺乳动物细胞的方法已有很多报道，也是本领域技术人员所熟知的。下列书籍提供了通用方法，例如，氟莱希尼(Freshney)(1983)《动物细胞的培养：基本技术手册》(Culture of Animal Cells：Manual of Basic Technique)，纽约艾伦阿利斯(Alan R.Liss，New York)；波尔(Paul)(1975)《细胞和组织培养》(Cell and Tissue Culture)，第5版，爱丁堡里维斯顿(Livingston，Edinburgh)；亚当斯(Adams)(1980)《生物化学和分子生物学实验室技术-生化学家使用的细胞培养》(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists)，沃克(Work)和伯顿(Burdon)(编)，阿姆斯特丹艾斯维尔(Elsevier，Amsterdam)。在流感病毒的体外制备过程中，与为了特定目的的组织培养方法有关的其他细节包括，例如，莫坦(Merten)等，(1996)，在细胞培养物中制备流感病毒用于疫苗生产(Production ofinfluenza virus in cell cultures for vaccine preparation)，选自科恩(Cohen)和萨弗曼(Shafferman)编的《设计和制备疫苗的新策略》(Novel Strategies in Design and Production of Vaccines)，本文已完整纳入作为参考。另外，通过常规试验可以很容易地确定适合本发明的这种方法的变化。
用于制备流感病毒的细胞可以在含血清或无血清培养基中培养。在某些情况下，例如，用于制备纯化的病毒时，在无血清条件下培养宿主细胞是比较理想的。细胞可以在小规模，例如，少于25ml的培养基、培养管或培养瓶中培养，或者在振荡的大培养瓶、旋转瓶，或者在培养瓶、培养罐或反应器中的微载体珠(例如，二乙胺基乙基葡聚糖微载体珠，如PL公司(Pfeifer & Langen)的Dormacell；流体实验室(FlowLaboratories)的Superbead；苯乙烯共聚物-三-甲胺珠，如Hillex，SoloHill，Ann Arbor)上培养。微载体珠是小球(直径在100-200微米之间)，可在单位体积的细胞培养物中提供巨大的表面积以便于粘附细胞生长。例如，1升培养基可包含超过2千万个微载体珠，提供超过8000平方厘米的生长表面。对于病毒的商业生产来说，例如，用于疫苗生产，在生物反应器或发酵罐中培养细胞通常是比较理想的。现有的生物反应器的体积从1升以下到100升以上不等，例如，Cyto3生物反应器(明尼苏达州明尼汤卡的奥斯莫尼克公司(Osmonics，Minnetonka，MN)；NBS生物反应器(纽约麦迪逊的新布朗斯韦克科技公司(New Brunswick Scientific，Edison，N.J.))；布劳恩生物技术国际公司的实验室规模和商业规模的生物反应器(德国麦逊根的布劳恩生物技术国际公司(B.Braun Biotech，Melsungen，Germany))
无论培养体积多大，在本发明中培养物可在低于或等于35℃的温度下培养以确保重组和/或重配流感病毒的有效回收，特别是冷适应性的、温度敏感的、减毒重组和/或重配流感病毒。例如，细胞在约32℃到35℃之间培养，温度一般在约32℃到约34℃之间，通常在约33℃。
一般来说，要使用能感知和维持细胞培养***温度的调节器，例如，恒温器，或其他装置来确保温度在病毒复制过程中不会超过35℃。5.7病毒的回收
病毒通常从已经生长有感染的(转染的)细胞的培养基中回收。通常在浓缩流感病毒前要澄清粗培养基。常用的方法包括过滤、超滤、在硫酸钡上吸附以及洗脱和离心。例如，来自于感染培养物的粗培养基首先通过离心澄清，例如，1000-2000×g离心足够的时间以去除细胞碎片和其他大颗粒物质，例如离心10到30分钟。另外，将培养基通过0.8μm醋酸纤维素滤器过滤去除完整的细胞和其他大颗粒物质。任选地，随后离心澄清的培养基上清以使流感病毒成团，例如，15,000×g离心约3到5小时。用合适的缓冲液如STE(0.01M Tris-HCl；0.15M NaCl；0.0001M EDTA)或pH7.4的磷酸缓冲盐水(PBS)将病毒团重悬以后，通过蔗糖(60％-12％)或酒石酸钾(50％-10％)密度梯度离心将病毒浓缩。连续或分步梯度都是合适的，分步梯度如以4个12％步进的12％到60％的蔗糖梯度。梯度要以足够的速度和时间离心以使病毒浓缩成可见的带以便于回收。另外，为了大规模的商业应用，需要利用区带离心转子以连续模式操作以便于从密度梯度中淘洗病毒。下列文献提供的其他细节足以指导技术人员完成从组织培养物中制备流感病毒的工作，例如，弗明哥(Furminger)的VaccineProduction(疫苗制备)，见于Nicholson等(编)的Textbook of Influenza(流感病毒教科 书)，第324-332页；莫坦(Merten)等(1996)，Production of influenza virus in cell culturesfor vaccine preparation(在细胞培养物中制备用于疫苗生产的流感病毒)，见于科恩(Cohen)和萨弗曼(Shafferman)编的Novel Strategies in Design and Production of Vaccines(疫苗设计和生产新策略)，第141-151页，以及美国专利号5,690,937、美国公开申请号20040265987、20050266026和20050158342，本文已纳入作为参考。如果需要，回收的病毒可储存在-80℃，加入蔗糖-磷酸-谷氨酸(SPG)作为稳定剂。5.8流感病毒
流感病毒的基因组由线性(-)链核糖核酸(RNA)的8个节段组成，编码免疫原性的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白以及6个内部核心多肽：核壳核蛋白(NP)；基质蛋白(M)；非结构蛋白(NS)；以及3个RNA聚合酶(PA、PB1、PB2)蛋白。在复制期间，基因组病毒RNA在宿主细胞核内转录成(+)链信使RNA和(-)链基因组cRNA。8个基因组节段都被包装进核糖核蛋白复合物中，该复合物除了含有RNA以外还含有NP和聚合酶复合物(PB1、PB2和PA)。
根据本发明的方法可在本发明的MDCK细胞内制备的流感病毒包括而不限于包含血凝素和/或神经氨酸酶抗原的重配病毒，其中的抗原选自被批准的减毒温度敏感主病毒株。例如，病毒可包括具有，例如，温度敏感性(ts)、冷适应性(ca)或减毒特性(att)中一种或多种特性的主病毒株(例如，A/AnnArbor/6/60、B/AnnArbor/1/66、PR8、B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55、B/England/2608/76、A/Puerto Rico/8/34(即，PR8)等，或其抗原性突变株或衍生物)。5.9流感病毒疫苗
从历史上看，流感病毒疫苗是在含胚鸡蛋内制备的，所用病毒株是根据经验预测即将流行的相关病毒株而确定的。最近制备出了包含血凝素和/或神经氨酸酶抗原的重配病毒，其中的抗原选自被批准的减毒温度敏感主病毒株。通过在鸡蛋内多次传代培养病毒以后，回收流感病毒，任选地，回收的流感病毒可以被灭活，例如，利用甲醛和/或β-丙酸内酯。但是，以这种方式制备流感疫苗有几个明显的缺点。来自于鸡蛋的剩余污染物是高抗原性、高致热的，在使用时常常会导致明显的副作用。更重要的是，为生产而设计的病毒株通常必须在下一个流行季节到来前几个月筛选和分配，以便于有时间生产和灭活流感疫苗。在细胞培养物内制备重组和重配疫苗的企图因无法得到被批准的病毒株而受到阻碍，其中的病毒株可在标准细胞培养条件下有效生长从而能够用于疫苗生产。
本发明提供了用于在培养物中制备重组和重配病毒的载体***、组合物和方法，该方法使快速生产一种或多种被选的抗原性病毒株相应的疫苗成为可能。特别的是，本发明提供的条件和病毒株可用于在细胞培养物中从多质粒***有效制备病毒。任选地，如果需要，病毒还可以在鸡蛋或与拯救病毒所用的培养物不同的细胞培养物中进一步扩增。
例如，在标准细胞培养条件下，例如，在37℃，培养乙型流感病毒主病毒株B/AnnArbor/1/66是不可能的。在本发明的方法中，多个质粒，每一个质粒包含一个流感病毒基因组节段，被引入到合适的细胞内，在低于或等于35℃的条件下在培养物中培养。一般来说，培养温度在约32℃到35℃之间，优选在约32℃到约34℃之间，例如，约33℃。
一般来说培养物在***中培养，例如细胞培养孵箱，控制湿度和CO2，利用温度调节器保持恒温，如恒温器确保温度不超过35℃。
通过引入一套载体可以很容易地获得重配流感病毒，其中载体包含编码主流感病毒基因组节段以及目的病毒株(例如，抗原性目的病毒株)来源的互补节段的cDNA。一般来说，根据与疫苗注射相关的期望特性来筛选主病毒株。例如，为了制备疫苗，例如，为了制备减毒活疫苗，可选择具有减毒表型、冷适应性和/或温度敏感性的主供体病毒株。在这种情况下，甲型流感病毒株caA/Ann Arbor/6/60；乙型流感病毒株ca B/Ann Arbor/1/66；或根据其理想表型特性筛选的其他病毒株，例如，减毒的、冷适应性的和/或温度敏感的病毒株，优选作为主供体病毒株。
在一个实施方式中，包含cDNA的质粒被转染到合适的宿主细胞内，其中一部分cDNA编码流感病毒主病毒株的6个内部vRNA节段(即，PB1、PB2、PA、NP、NB、M1、BM2、NS1和NS2)，与这些cDNA组合的是编码抗原性理想病毒株来源的血凝素和神经氨酸苷霉vRNA节段的cDNA，例如，经预测可引起明显的局部或全球流感病毒感染的病毒株。在适于有效回收的合适温度下，例如，等于或低于35℃，如约32℃到35℃之间，例如约32℃到约34℃之间，或约33℃，在细胞培养物中复制重配病毒以后，回收重配病毒。任选地，回收的病毒可用变性剂如甲醛或β-丙酸内酯灭活。
5.10用于疫苗预防性给药的方法和组合物
本发明的重组和重配病毒可以混合到合适载体或赋形剂中预防性给药以刺激针对一种或多种流感病毒株的特异性免疫反应。一般来说，载体或赋形剂是药用载体或赋形剂，如无菌水、盐水溶液、缓冲盐水溶液、葡萄糖水溶液、甘油水溶液、乙醇、未感染鸡蛋的尿囊液(即，正常的尿囊液“NAF”)或其组合。根据本领域已建立的方法可以制备出确保无菌、pH、等渗性和稳定性的这种溶液。一般来说，所选择的载体或赋形剂要能够使过敏反应和其他不期望的效应降到最小，并且适合特定的给药途径，例如，皮下注射、肌肉注射、鼻内给药等。
一般来说，本发明的流感病毒以足以刺激针对一种或多种流感病毒株的特异性免疫反应的剂量给药。优选的是，给予流感病毒后能够激发保护性的免疫反应。刺激抗一种或多种流感病毒株的保护性免疫反应的剂量和方法是本领域技术人员所熟知的，例如，对于灭活的流感病毒来说，单次给药剂量范围约为1-1000 HID50(人感染剂量)，即，约105-108pfu(噬斑形成单位)。另外，给药剂量可以为无佐剂的约10-50μg，例如，约15μg HA，或者含佐剂的更小剂量。给药剂量通常可根据，例如，年龄、身体状况、体重、性别、饮食、给药间隔和其他临床因素，在这个范围内调整。预防性疫苗制剂可全身给药，例如，利用针头和注射器或无针注射装置通过皮下注射或肌肉注射给药。另外，疫苗制剂可通过滴、大颗粒气溶胶(超过约10微米)或向上呼吸道内喷雾鼻内给药。虽然上述给药途径都可以产生保护性的***免疫反应，但是鼻内给药具有更多的益处，可在流感病毒进入部位激发粘膜免疫。对于鼻内给药来说，减毒活病毒疫苗通常是优选的，例如，减毒的、冷适应性的和/或温度敏感的重组或重配流感病毒。虽然优选通过单次给药来刺激保护性免疫反应，但是通过相同或不同途径多次给药可以达到更理想的预防效果。
另外，可以利用含流感病毒的树突状细胞的体外或体内靶向作用刺激免疫反应。例如，增殖的树突状细胞与足量的病毒接触足够的时间以使树突状细胞捕获流感病毒抗原。然后通过标准的静脉移植方法将细胞转移到待免疫受体体内。
另外，用于流感病毒或其亚单位预防性给药的制剂还可以包含一种或多种能增强对流感病毒抗原的免疫反应的佐剂。合适的佐剂包括：皂甙、矿物质凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普流罗尼多元醇(pluronic polyols)、多聚阴离子、肽、油或碳氢化合物乳剂、卡介苗(BCG)、短小棒状杆菌以及合成的佐剂QS-21和MF59。
如果需要，预防性流感病毒疫苗可以结合一种或多种免疫刺激分子一起给药。免疫刺激分子包括具有免疫刺激、免疫增强和促炎症反应活性的各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，例如白细胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生长因子(例如，粒细胞-巨噬细胞(GM)-集落刺激因子(CSF))；以及其他免疫刺激分子，如巨噬细胞炎症因子、Flt3配基、B7.1、B7.2等。免疫刺激分子可以和流感病毒处于同一制剂中一起给药，也可以单独给药。可以给予蛋白或编码蛋白的表达载体以产生免疫刺激效应。
在另一个实施方式中，包含流感病毒基因组节段的本发明的载体结合上述合适的药用载体或赋形剂可用于将异源核酸引入到宿主生物或宿主细胞如哺乳动物细胞内，例如，来源于受试人的细胞。一般来说，异源核酸被***到基因或基因节段的非必需区，例如节段7的M基因。异源多核苷酸序列可编码多肽或肽，或者RNA如反义RNA或核酶。然后通过制备包含异源核酸的重组病毒将异源核酸引入到宿主或宿主细胞内，按照上面所描述的给予病毒。在一个实施方式中，异源多核苷酸序列并非来源于流感病毒。
另外，可以通过将载体共转染到感染流感病毒的细胞内从而将包含异源核酸的本发明的载体引入到宿主细胞内并在其中表达。任选地，细胞随后回输或转移给受体，通常利用已建立的转移或移植方法将细胞转移到目的组织、器官或***部位(如上所述)内。例如，造血谱系的干细胞，如骨髓、脐带血或外周血来源的造血干细胞可利用标准的转移或输注技术转移到受体体内。
另外，包含异源核酸的载体可以被转移到受体体内的细胞中。一般来说，这种方法包括给予靶细胞群(例如，血细胞、皮肤细胞、肝细胞、神经(包括脑)细胞、肾细胞、子宫细胞、肌肉细胞、肠细胞、宫颈细胞、***细胞、***细胞等，以及各种细胞、组织和/或器官来源的肿瘤细胞)载体颗粒。给药途径可以是***给药，例如，通过静脉注射病毒颗粒，或者通过各种方法将病毒颗粒直接转移到目的部位，其中包括注射(例如，使用针头或注射器)，无针疫苗转移，局部给药，或者推进组织、器官或皮肤部位。例如，病毒颗粒可通过吸入、口服、静脉注射、皮下注射、真皮下注射、真皮内注射、肌肉注射、腹腔注射、鞘内注射转移，或者通过***或直肠给药，或者通过在身体的腔隙或其他部位内放置病毒颗粒给药，例如，在手术期间。
通过将包含编码治疗性或预防性有效多肽(或肽)或RNA(例如，反义RNA或核酶)的异源多核苷酸的本发明的载体在体外或体内引入到靶细胞群内，一般来说，编码目的多肽(或肽)或RNA的多核苷酸与“表达载体”和“其他表达元件”部分所描述的合适调节序列操作性连接。任选地，除了编码治疗性或预防性活性多肽或RNA的多核苷酸以外，载体还可以包含其他治疗性或预防性多肽，例如，抗原、共刺激分子、细胞因子、抗体等，和/或标记等。
在一个实施方式中，本发明提供了包含本发明的重配和重组病毒(或其部分)的组合物，这些病毒已用试剂如保泰松处理过以清除潜在的癌基因。相应的，无癌基因的疫苗组合物特别包含在本发明的实施方式中。
本发明的方法和载体可用于治疗性或预防性处理各种疾病，其中包括遗传性和获得性疾病，例如，作为疫苗处理病毒、细菌等引起的感染性疾病。5.11试剂盒
为了促进本发明的载体和载体***的应用，任何载体，例如，通用流感病毒质粒、突变的流感病毒多肽质粒、流感病毒多肽文库质粒等，和为了试验目的或治疗目的用于流感病毒包装和感染的其他组分，例如，缓冲物、细胞、培养基等都可以包装成试剂盒的形式。一般来说，试剂盒除了包含上述组分以外还可以包含其他材料，例如，用于执行本发明方法的说明书、包装材料和容器。
5.12病毒核酸和蛋白的操作
在本发明中，可以根据大家熟知的分子生物学技术处理本发明的包含犬RNA polI调节序列的核酸或其他核酸、表达载体、流感病毒核酸和/或蛋白等。无数这类方法的详细操作规程，其中包括扩增、克隆、诱变、转化等，可见于下列文献的描述，例如，欧舒贝尔(Ausubel)等《当代分子生物学操作规程》(Current Protocols in Molecular Biology)(2000年增补)约翰威利出版公司(John Wiley & Sons)，纽约(“Ausubel”)；森布鲁克(Sambrook)等《分子克隆-实验室手册》(Molecular Cloning -A Laboratory Manual)(第2版)，1-3卷，纽约冷泉港冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，N.Y.)，1989(“Sambrook”)，以及贝格尔(Berger)和金莫尔(Kimmel)《分子克隆技术指导，酶学方法》(Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology)152卷，加州圣地亚哥学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.，SanDiego，CA)(“Berger”)。
除了上述参考文献以外，用于，例如，扩增本发明的cDNA探针，的体外扩增技术，如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、Q-复制酶扩增技术以及其他RNA聚合酶介导的技术(例如，NASBA)的操作规程可见于下列文献中：谬理斯(Mullis)等(1987)，美国专利号4,683,202；《PCR操作规程-方法和应用指导》(PCRProtocols A Guide to Methods and Applications)(英尼斯(Innis)等编)，加州圣地亚哥学术出版社有限公司(Academic Press Inc.San Diego，CA)(1990)(“Innis”)；阿恩海姆(Arnheim)和莱维森(Levinson)(1990)C&EN 36；The Journal Of NIH Research(1991)3：81；科(Kwoh)等(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86，1173；格威特利(Guatelli)等(1990)Proc Natl Acad Sci USA 87：1874；娄麦尔(Lomell)等(1989)J Clin Chem 35：1826；兰德格恩(Landegren)等(1988)Science 241：1077；凡布莱恩特(Van Brunt)(1990)Biotechnology 8：291；吴(Wu)和沃莱斯(Wallace)(1989)Gene 4：560；巴瑞格(Barringer)等(1990)Gene 89：117，以及苏克纳南(Sooknanan)和麦莱克(Malek)(1995)Biotechnology 13：563。本发明中用于克隆核酸的其他方法包括沃莱斯(Wallace)等的美国专利No.5,426,039。通过PCR扩增大核酸的改良方法在陈(Cheng)等(1994)Nature 369：684和其中的文献中有描述。
本发明的某些多核苷酸，例如，寡核苷酸，可利用各种固相策略合成，其中包括以单核苷酸和/或三核苷酸为基础的亚磷酰胺耦联化学。例如，可通过将活化的单体和/或三体顺序添加到正在延伸的多核苷酸链上来合成核酸序列。参见，例如，卡尤思，M.H(Caruthers，M.H.)等(1992)Meth Enzymol 211：3。
在合成目的序列时，基本上任何核酸都可以从许多公司定购，如米德兰标准试剂公司(The Midland Certified Reagent Company)([email protected])、泛美基因公司(TheGreat American Gene Company)(www.genco.com)、快速基因有限(ExpressGen，Inc.)(www.expressgen.com)、操纵子技术有限公司(Operon Technologies，Inc.)(www.operon.com)、以及许多其他公司。
另外，通过，例如，定向诱变，可实现病毒多肽上选定的氨基酸残基的取代。例如，包含与理想表型特征，例如，减毒表型、冷适应性、温度敏感性，功能相关的氨基酸取代的病毒多肽可通过将特异性突变引入编码多肽的病毒核酸节段内来制备。定向诱变方法是本领域熟知的，见于，例如，上述欧舒贝尔(Ausubel)，森布鲁克(Sambrook)，和贝格尔(Berger)的描述。许多用于定向诱变的试剂盒都可以购买到，例如，Chameleon定向诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla)，按照厂家的说明书可用于将，例如，一个或多个氨基酸取代，分别引入到编码甲型或乙型流感病毒多肽的基因组节段内。5.13其他病毒
本发明的核酸、载体和方法还可用于其他重组病毒的表达和纯化。下面的讨论为思考如何使载体适用于其他这类病毒提供了指导。
如果靶病毒包含正链节段化RNA基因组，那么犬RNA pol I启动子优选定位在内部转录单位内的cDNA的上游(单向***)。在这个实施方式中，可以制备正链RNA用于直接***到新病毒内。然而，利用单向***制备包含负链节段化RNA基因组的靶病毒的实施方式也包含在本发明的范围内。
如果靶病毒包含负链节段化RNA基因组，那么犬RNA pol I启动子优选定位在内部转录单位内的cDNA的下游(双向***)。在这个实施方式中，可以制备负链RNA用于直接***到新病毒内。利用双向***制备包含正链节段化RNA基因组的靶病毒的实施方式也包含在本发明的范围内。
本发明还可用于制备包含感染性的或非感染性的非节段化RNA基因组(单链的或双链的)的病毒。一般而言，只是简单地将感染性病毒基因组RNA引入到宿主细胞内就足以导致细胞内病毒生命周期的启动以及最终完整病毒的产生。例如，只是简单地将小核糖核酸病毒基因组RNA引入到宿主细胞内就足以导致完整小核糖核酸病毒的产生。包含非感染性基因组RNA的病毒的生命周期的启动通常需要再引入其他病毒蛋白，这些蛋白通常和基因组一起携带在病毒颗粒内。例如，副流感病毒III携带RNA依赖的RNA聚合酶，在新感染的宿主细胞内，该聚合酶的存在是病毒基因组RNA复制的启动和病毒mRNA的转录所必须的；如果缺少聚合酶，副流感病毒III基因组RNA就是非感染性的。在本发明的制备包含感染性非节段化基因组RNA的病毒的实施方式中，只是简单地将本发明的双表达质粒引入到合适的宿主细胞内就足以导致完整病毒的产生，其中的双表达质粒携带包含病毒基因组的核酸。在制备包含非感染性非节段化基因组RNA的病毒的实施方式中，其他表达质粒也可能必须和携带病毒基因组的双表达质粒一起被引入到宿主细胞内。其他质粒应当表达启动病毒生命周期所必须的蛋白，这些质粒通常在感染时被引入到宿主细胞内(例如，RNA依赖的RNA聚合酶)。
在制备包含感染性非节段化RNA基因组的微小RNA病毒的实施方式中，包含完整病毒基因组的cDNA被***到本发明的双启动子表达质粒内。外部转录单位内的上游启动子，优选pol II启动子，指导包含完整病毒基因组的正链mRNA的合成一多聚蛋白从mRNA翻译，单个蛋白从多聚蛋白中裂解和释放(例如，通过多聚蛋白内的蛋白酶)。由于病毒基因组包含正链RNA，因此内部转录单位(单向***)内的第二上游启动子，优选犬RNA pol I，可指导基因组正链拷贝的合成。如果病毒基因组包含负链RNA，那么内部转录单位(双向***)内的第二下游启动子，优选犬RNA pol I，可指导基因组负链拷贝的合成。利用单向***制备负链非节段化RNA病毒的实施方式包含在本发明的范围之内。同样，利用双向***制备正链非节段化RNA病毒的实施方式也包含在本发明的范围之内。
本发明也可用于制备包含非感染性非节段化RNA基因组的病毒，其中不合成多聚蛋白。例如，本***可用于制备弹状病毒科的病毒或副粘病毒科的病毒，优选副流感病毒III，在其生命周期中，通常会由病毒来源的RNA依赖的RNA聚合酶从基因组负链RNA合成多个单顺反子mRNA；单个蛋白从单顺反子mRNA翻译。在这些实施方式中，包含启动子，优选pol II启动子，的外部转录单位指导病毒基因组的正链多顺反子拷贝的合成，通常只有第一基因(NP)从该顺反子翻译。另外，包含启动子，优选pol I启动子，的内部转录单位指导基因组RNA拷贝的表达，用于***到新病毒内。由于副流感病毒III病毒基因组包含负链RNA，因此内部转录单位的启动子优选位于cDNA的下游(双向***)。如果病毒基因组包含正链RNA，那么内部转录单位的启动子优选位于cDNA的上游(单向***)。利用双向***制备包含正链RNA基因组的病毒的实施方式和利用单向***制备包含负链RNA基因组的病毒的实施方式都包含在本发明的范围之内。其他病毒蛋白(表达自多顺反子mRNA的蛋白除外)也是病毒转录和复制(L和P)所必须的，这些蛋白可由不同的表达质粒分别提供。
本发明还包含制备包含双链节段化RNA基因组的病毒的实施方式。在这些实施方式中，包含靶病毒基因组各个基因的质粒被***到本发明的双启动子表达质粒内。质粒可以是单向质粒，也可以是双向质粒。外部转录单位内的启动子，优选pol II启动子，可指导各个基因的mRNA转录子的表达，该mRNA翻译成被其编码的蛋白。内部转录单位内的启动子，优选pol I启动子，可指导正链(单向***)或负链(双向***)的转录。然后，合成出的第一链可作为模板用于病毒RNA聚合酶合成互补链。所得到的双链RNA产物被***到新病毒内。
6.具体实施方式
1.包含犬RNA聚合酶I调节序列的分离核酸。
2.实施方式1所述的核酸，其中，所述调节序列是启动子。
3.实施方式1所述的核酸，其中，所述调节序列是增强子。
4.实施方式1所述的核酸，其中，所述调节序列是增强子和启动子。
5.实施方式1所述的核酸，其中，所述RNA聚合酶调节序列包含SEQ ID NO：1的1到1804位核苷酸或其功能活性片段。
6.实施方式1、2、3、4或5所述的核酸，其中，所述调节序列与编码负链病毒基因组RNA或相应的cRNA的cDNA操作性连接。
7.实施方式6所述的核酸，其中，所述负链病毒基因组RNA是流感病毒基因组RNA。
8.实施方式6或7所述的核酸，其中，所述核酸还包含转录终止序列。
9.包含实施方式1、2、3、4、5、6、7或8所述核酸的表达载体。
10.实施方式9所述的表达载体，其中，所述表达载体包含细菌的复制起点。
11.实施方式9所述的表达载体，其中，所述表达载体包含可在原核细胞内筛选的可选标记。
12.实施方式9所述的表达载体，其中，所述表达载体包含可在真核细胞内筛选的可选标记。
13.实施方式9所述的表达载体，其中，所述表达载体包含多克隆位点。
14.实施方式13所述的表达载体，其中，所述多克隆位点相对于犬RNA聚合酶I调节序列定向以使被***到多克隆位点内的编码序列受调节序列的控制而表达。
15.一种用于制备流感病毒基因组RNA的方法，该方法包括转录实施方式7所述的核酸，从而合成流感病毒基因组RNA。
16.一种用于制备重组流感病毒的方法，该方法包括培养包含实施方式9、10、11、12、13或14所述的表达载体以及表达编码一种或多种流感病毒多肽的mRNA的一种或多种表达载体的犬细胞，其中的流感病毒多肽选自：PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1和NS2；以及分离重组流感病毒。
17.实施方式16所述的方法，其中，使用了辅助病毒。
18.实施方式16所述的方法，其中，所述制备的流感病毒是感染性的。
19.实施方式16、17或18所述的方法，其中，所述方法可导致产生至少1×103PFU/ml流感病毒。
20.一种包含实施方式1、2、3、4、5、6、7或8所述核酸的细胞。
21.一种包含实施方式9、10、11、12、13或14所述表达载体的细胞。
22.实施方式20或21所述的细胞，其中，所述细胞是犬细胞。
23.实施方式22所述的细胞，其中，所述犬细胞是肾细胞。
24.实施方式23所述的细胞，其中，所述犬肾细胞是MDCK细胞。
25.一种用于在培养的犬细胞内制备重组节段化负链RNA病毒的方法，其中的负链RNA病毒具有3个以上的基因组vRNA节段，所述方法包括：(a)将能够在所述细胞内表达基因组vRNA节段以提供所述病毒的完整基因组vRNA节段的第一套表达载体引入到犬细胞群内；(b)将能表达编码所述病毒的一种或多种多肽的mRNA的第二套表达载体引入到所述细胞内；以及(c)培养所述细胞从而制备病毒颗粒。
26.实施方式25所述的方法，其中，所述感染性流感病毒颗粒被制备。
27.实施方式25或26所述的方法，其中，所述辅助病毒被使用。
28.一种用于在培养的犬细胞内制备感染性流感病毒颗粒的方法，所述方法包括：(a)将一套表达载体引入到犬细胞群内，其中的表达载体能在所述细胞内表达(i)基因组vRNA节段以提供所述病毒的完整基因组vRNA节段以及(ii)编码所述病毒的一种或多种多肽的mRNA；(b)培养所述细胞从而制备所述病毒颗粒。
29.一种转录流感病毒的vRNA节段的方法，该方法包括使犬pol I聚合酶多肽与包含选自SEQ ID Nos 1-19的核酸的多核苷酸接触，其中所述的核酸与编码所述负链病毒的所述vRNA节段的cDNA分子操作性连接；以及分离转录的vRNA节段。
30.实施方式29所述的方法，其中，所述vRNA在宿主细胞内转录。
31.实施方式16、17、18、19、25、26、27或28所述的方法，其中，各表达载体处于不同的质粒中。
32.包含多个载体的组合物，其中，所述多个载体包括含有犬pol I启动子的载体，犬pol I启动子与流感病毒PAcDNA操作性相连，后者与转录终止序列相连；含有犬pol I启动子的载体，犬pol I启动子与流感病毒PB1 cDNA操作性相连，后者与转录终止序列相连；含有犬pol I启动子的载体，犬pol I启动子与流感病毒PB2 cDNA操作性相连，后者与转录终止序列相连；含有犬pol I启动子的载体，犬pol I启动子与流感病毒HA cDNA操作性相连，后者与转录终止序列相连；含有犬pol I启动子的载体，犬pol I启动子与流感病毒NP cDNA操作性相连，后者与转录终止序列相连；含有犬pol I启动子的载体，犬pol I启动子与流感病毒NA cDNA操作性相连，后者与转录终止序列相连；含有犬pol I启动子的载体，犬pol I启动子与流感病毒M cDNA操作性相连，后者与转录终止序列相连；以及含有pol I启动子的载体，犬调节序列与流感病毒NS cDNA操作性相连，后者与转录终止序列相连。
33.实施方式32所述的组合物，该组合物还包含一种或多种表达mRNA的表达载体，其中的mRNA编码的一种或多种流感病毒多肽选自：PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1和NS2。
34.包含实施方式32或33所述组合物的宿主细胞。
35.包含通过实施方式16、17、18、19、25、26、27或28所述方法制备的病毒的疫苗。
36.包含制备自病毒的免疫原性组合物的疫苗，其中的病毒是根据实施方式16、17、18、19、25、26、27或28所述的方法制备的。
37.实施方式35或36所述的组合物，其中，所述不同的表达载***于不同的质粒上。
7.实施例
下面的实施例只是用于说明本发明，并不意味着以任何方式限制本发明。7.1实施例1：在MDCK细胞内培养流感病毒株
本实施例描述了用于培养流感病毒的几个细胞系的特征。评价了用于制备野生型(wt)和实验室适应性如冷适应性(ca)来源的遗传重配体甲型和乙型流感病毒株的几种不同的细胞系和原代细胞，其中包括MRC-5、WI-38、FRhL-2、PerC6、293、NIH 3T3、CEF、CEK、DF-1、Vero和MDCK。虽然许多类型的细胞都能有限地支持某些冷适应性的流感病毒株的复制，但是只有MDCK能够始终如一地产生高效价的甲型和乙型病毒。例如，研究发现，PerC6细胞能够支持某些wt和ca乙型病毒的复制，其水平与MDCK细胞内的复制水平相似，尽管其生长动力学不相同(参见图1)。但是，PerC6不能支持许多ca甲型病毒的复制。图2描述的是wt和ca A/Sydney/05/97和A/Beijing/262/95病毒的生长曲线。在这两个例子中，ca病毒株都无法在PerC6细胞内良好复制。同样，图3描述了wt和caA/Ann Arbor/6/60的生长曲线，证明ca病毒株无法在PerC细胞内有效复制，wt A/AnnArbor/6/60的复制也不像在MDCK细胞内那样健康。通过实时PCR分析PerC细胞内的流感病毒复制，结果表明在感染后的最初24小时内，ca和wt甲型流感病毒株的病毒RNA(vRNA)都有增加，但是只有野生型病毒株持续增加到120小时以上，ca病毒株未出现这种结果。相反，在MDCK细胞内，wt和ca vRNA都有增加，并且在第3天时达到平台期。参见图4。
另外还检测了MDCK细胞支持潜在的大流行疫苗ca A/Vietnam/1203/2004复制的能力。用低感染复数的ca A/Vietnam/1203/2004感染MDCK细胞，并在感染后的不同时间点测定上清中的病毒。感染后48小时，caA/Vietnam/1203/2004的效价达到约8 log10 TCID50/mL，在接下来的3到4天中保持稳定。参见图5。
在该试验中，在含10％美国胎牛血清的培养基或合适的无血清培养基(例如，SFMV100)中扩增得自ATCC的MDCK细胞(登录号CCL-34)以有限的一段时间，以制备前-主细胞(pre-master cell)原液用于初步的特征研究。对合适的无血清培养基的描述见于2004年12月23日提交的美国临时申请No.60/638,166；2005年1月5日提交的美国临时申请No.60/641,139；以及2005年12月16日提交的美国专利申请No.11/304,589，本文都已完整纳入作为参考。细胞在两种类型的培养基中都可以良好生长，两种细胞原液都支持冷适应性疫苗株和大流行株的复制，分别如下面的表1和图5所示。
表1
冷适应性的流感病毒株在含血清和无血清培养的
MDCK细胞内的繁殖力比较。
为了研究负责在PerC细胞内限制性生长的基因节段，利用8质粒拯救技术制备流感病毒株A/AA/6/60的每一个基因节段的7:1重配体。参见，例如，美国专利6,951,754有关8质粒流感病毒拯救***的代表性描述。图6显示的是每一种7:1重配体的示意图和命名策略。然后分析所得到的重配体在PerC细胞内的复制能力。参见图7。生长限制表型似乎定位在PB2和PB1基因节段。利用本领域熟知的方法可以绘制出负责这个表型的精确定位的详细图谱。例如，在已鉴定的基因节段上比较wt和ca病毒株的序列可以确定其特异性差别，然后可以在wt或ca病毒株上进行回复突变。然后分析这种突变株在PerC6细胞内的生长能力。抑制wt病毒株生长或允许ca病毒株生长的任何突变都可以被鉴定为导致生长限制表型的突变。
7.2实施例2：MDCK细胞的致瘤性
MDCK的两种前-主细胞原液分别在含血清的培养基和无血清培养基中培养，利用无胸腺裸鼠模型评价其潜在致瘤性，其所处的阶段代表传了5代的细胞，然后预计细胞可用于疫苗制备。为了评价致瘤性，107细胞皮下注射到包括10只小鼠的实验组中，84天后处死动物并检查。在无血清培养基中传代的细胞接种的10只动物中有6只观察到了肿瘤形成。相反，在含10％胎牛血清的培养基中传代的细胞接种的动物都没有观察到肿瘤形成，尽管在接种部位观察到了某些纤维肉瘤，如表2所示，在血清中传代的细胞是非致瘤性的。
表2
在两种不同培养基中传代的MDCK细胞的致瘤性和细胞核学
*TP50：在50％的动物体内诱导出肿瘤所需要的细胞数
ND：未做
如表2所示，对在各自培养基中培养的两种前主细胞原液的第4代和第20代细胞进行核型分析。在10％FCS中传代的非致瘤性细胞平均包含78个中期染色体，含其他数目(70到82)染色体的细胞分布相对有限。而在无血清培养基中传代的细胞所含的中期染色体中位数也是78，但是明显有更多的细胞含有范围从53到82个中期染色体的非整倍染色体数。在两种情况下，传代后细胞核学都未发生改变。
7.3实施例3：使MDCK细胞适应在无血清培养基中生长
得自ATCC的MDCK细胞在含经γ射线照射的FBS的培养基中传代。然后这些细胞在经选择可支持细胞库制备的无血清培养基制剂中传代有限的次数。无血清培养基在美国临时申请号60/638,166和60/641,139以及美国专利申请11/304,589中有描述。这些附加的传代在37℃或33℃下进行。MDCK细胞在包含植物来源的添加剂而不是血清的培养基中传代所产生的细胞其核型与在含FCS的培养基中传代的MDCK细胞的核型相似(数据未显示)。
7.4实施例4：MDCK细胞的克隆
通过有限稀释对细胞进行生物学克隆以确保可以得到起源于一个遗传背景的细胞。根据各种表型特征筛选克隆，其中包括倍增时间和相关致瘤性以及病毒产生情况。在概念试验的初步证据中，在含FCS的培养基中得到54个MDCK克隆。将这些克隆传代，用低感染复数的ca A/New Caledonia/20/99感染每一个克隆。感染后数天取出上清，并通过TCID50测定上清中的病毒量。只有少数克隆可以产生相对较高效价的病毒，这些克隆产生的病毒量远远高于非克隆的亲本细胞所产生的病毒量。具有超级生物学和生理学特性的克隆用于建立主细胞库(MCB)，如下所述。
7.5实施例5：主细胞库的检测和表征
全面检测MCB以确保不会出现外源因子。例如，利用一种或多种PCR和/或抗体特异性试验检测已有的病毒因子，如下面的表3所示。
表3
MCB的检测方案
| 通用试验 |
| 无菌 |
| 支原体 |
| 体外外源因子(多个细胞系) |
| 体内外源因子 |
| PERT |
| 共培养 |
| 细胞核学 |
| 电镜 |
| 致瘤性完整细胞(TP50) |
| 细胞DNA的致癌性 |
| 细胞裂解物的致癌性 |
| 牛病毒per 9CFR |
| 猪病毒per 9CFR |
| PCR＊/Ab特异性的 |
| AAV 1和2型 |
| HCMV |
| EBV |
| HSV |
| 乙型、丙型和戊型肝炎病毒 |
| HHV 6、7和8 |
| HIV 1和2 |
| HPV |
| HTLV I和II |
| 多瘤(BK和JC病毒) |
| 环病毒 |
| 犬细小病毒 |
| 犬瘟热 |
| 腺病毒 |
| SV40 |
7.6实施例6：细胞培养物来源的流感病毒的临床前特征
本实施例描述了制备自细胞培养物以及鸡蛋的流感病毒株的特征，并且比较了两个***所产生的病毒。一般而言，流感病毒适于用作人疫苗，并且具有使病毒适用于这种用途的生物学特性。在这个实施例中，流感病毒是冷适应性的(ca；具有在较低温度下有效复制的能力)、温度敏感的(ts；在体外温度较高时复制受限)、以及减毒的(att；在雪貂肺组织内检测不到复制)，在本文中被称为ca ts att株。比较包括：病毒产物的生物化学、抗原性和遗传学评价(测序)；病毒在人细胞内复制后的生物学和生物化学特征；在获得许可的生物模型中的复制；以及在获得许可的动物模型中的免疫原性。
7.6.1遗传学、生物化学和抗原性比较
A/H1N1、A/H5N1、A/H3N2和乙型病毒的ca ts att株可在MDCK细胞内以相对较高的效价复制。另外，在MDCK细胞内传代这些ca ts att株也不会改变其基因组序列。三个ca ts att株，ca A/Sydney/05/97、ca A/Beijing/262/95和ca B/Ann Arbor/1/94在MDCK细胞内传代一次或两次，测定所有6个内部基因的完整编码区的序列，并且与起始材料相比较。结果没有检测到核苷酸发生改变，证明通过这种底物进行的这种传代不会改变三个病毒株的遗传学组合物。在MDCK细胞内制备的不同疫苗株上分析其他序列特征，疫苗制备的条件期望可以模拟制备过程，其中包括培养基组合物、输入剂量(moi)、孵育温度和收获时间。根据这些初步数据估计MDCK制备的病毒的基因组序列没有发生改变。
由于在MDCK细胞内传代后基因组的遗传学特征是稳定的，因此预计难以区别在鸡蛋内或在MDCK细胞内制备的疫苗的生物学特性。但是，从细胞培养物中获得的初级病毒产物与鸡蛋制备的产物相比还是有些细微的差异，特别是与病毒蛋白的翻译后修饰有关的方面，其中包括HA和NA，或者与病毒膜内的脂质组合物有关的方面；二者都可能改变病毒粒子的整体物理特性。与细胞培养物制备的和鸡蛋制备的疫苗的抗原性有关的初步临床前数据表明在这个重要的参数上没有检测到差异。几个疫苗株的鸡蛋原液通过MDCK细胞传代，利用参考抗血清通过测定HAI效价来确定两种产物的抗原性。如表4所示，所有HAI效价都在彼此的2倍以内，说明细胞内复制的疫苗与鸡蛋来源的材料相比抗原性没有发生改变。
表4
鸡蛋内和MDCK细胞内制备的病毒株的HAI效价
7.7实施例7：培养的人上皮细胞的感染
在一个实施方式中，为了评价MDCK和鸡蛋制备的疫苗在人源细胞内复制后的生物化学、生物学和结构相同性，疫苗可在相关的二倍体人源细胞内传代1次，如正常人支气管上皮细胞(NHBE)。这种传代可用于模拟在人呼吸道内的单次感染事件，因而能够模拟子代病毒的比较，病毒最终负责激发有效的免疫反应。这些材料可用于测定疫苗的血凝素(结合和融合)和神经氨酸酶活性，以及其他生物化学和结构研究，其中包括电镜、总粒子比例的感染性以及病毒基因组当量。总之，这些比较可用于证明细胞来源的疫苗与鸡蛋制备的疫苗一样有效和安全。分析研究的结果总结在表5中。
表5
比较细胞和鸡蛋制备的疫苗的临床前研究
| 体内(雪貂) | 体外＊ |
| 减毒/复制在上呼吸道内的复制范围在上呼吸道内的复制动力学 | 病毒结合血凝集效价与不同唾液酸的结合 |
| 免疫原***叉反应动力学 | 物理特性EM形态学感染的粒子∶总粒子(基因组) |
| 感染性能检测到复制所需的剂量产生抗体反应所需的剂量 | 融合活性最适宜pH最适宜温度 |
| 基因组序列 | |
| 神经氨酸酶活性 |
*比较原始产物与在人源细胞内传代一次的产物
7.8实施例8：临床前动物模型
雪貂是用于评价减毒流感疫苗和组分疫苗株的减毒特性和免疫原性的有效动物模型。从MCB制备的细胞来源的流感病毒株的表现与鸡蛋制备的相同病毒株比较。在可控的试验中头对头地比较这些材料可以高水平地确保这些病毒产物的可比性。
为了评价两种疫苗感染雪貂或者说在雪貂内被接纳的能力，轻度麻醉动物，鼻内接种细胞或鸡蛋制备的病毒制备物。在接种后的几个时间点收集洗鼻材料，利用现有的几种方法中的一种方法测定病毒量以评价病毒在动物上呼吸道内的复制动力学和范围。试验在一个剂量范围内开展，包括多个病毒株以及不同的三价混合物，以归纳细胞培养物制备株和鸡蛋制备株的相对感染性。这些试验同样也可用于评价流感病毒的免疫原性，这种特性与病毒启动感染的能力有内在联系。在接种后的不同时间点(周)采集动物的血样并收集洗鼻液；这些样品用于评价血清抗体以及对感染产生的鼻内IgA反应。这些数据的最大值、感染性、血清抗体和粘膜抗体反应将用于比较和评价细胞制备的疫苗和鸡蛋制备的疫苗的感染性。预计最可能的结果是细胞制备的和鸡蛋制备的疫苗株具有相似的感染性和免疫原性。如果细胞来源的疫苗比鸡蛋来源的产物感染性更高或免疫原性更强，那么就需要进一步的试验来评价采用较低剂量的可能性。
许多免疫原性和复制试验可在雪貂模型上进行以评价单一单位人用剂量的细胞培养物来源的疫苗。用ca ts att病毒株感染通常会在雪貂体内激发强大而快速的抗体反应。另外，按常规方法测定了每一个ca ts att病毒株，结果显示病毒可表达减毒(att)表型，在鼻咽内复制到相对较高的效价，而在这些动物的肺内的复制无法检测到。在细胞培养物内培养对这些生物特性的影响也作了评价。但是，不可能观察到任何差异，因为att表型是这些病毒株的遗传组合物的不可分割的部分。在给予这些动物单次人用剂量以后评价这些病毒株的生长动力学和交叉反应。这可激发出能与一个遗传谱系内的多个病毒株产生交叉反应的血清抗体；预计细胞来源的疫苗也有同样的能力。
这些相似性评价应该能够使我们对原始病毒产物的潜在生物化学和/或生物物理学差异有更深入的了解，这些评价也证明了这些后天获得的差异对ca ts att病毒株特性的影响，其中病毒株的这些特性是通过在人源细胞内首次传代或动物试验测定的。根据到目前为止掌握的序列信息，预计因在MDCK细胞上制备而获得的免疫原性特性不会对ca ts att病毒株产生影响。
雪貂作为动物模型用于流感病毒已多有报道，通常雪貂用于评价ca ts att病毒株的减毒表现和免疫原性。一般来说，8-10周龄的动物用于评价减毒特性；常见的试验设计是每个实验组或对照组包含n＝3-5只动物。利用8周到6个月大的动物进行免疫原性研究，通常每个实验组或对照组需要n＝3-5只动物。这些动物数可以提供足够的信息用于两组之间统计学有效性的比较或观察重要性的比较。在大多数试验过程中可以观察到流感样病征，但不十分确定。雪貂不会表现出食欲或体重下降、鼻流涕或眼分泌物的病征；观察流感病毒样疾病的病征是试验的必要组成部分，加以干预如给予镇痛药是不合适的。如果出现不舒服的其他信号，如口腔溃疡或体重明显下降，与主治兽医商议后可以对动物进行适当处理。
7.9实施例9：主病毒种子(MVS)的建立
目前所用的流感病毒疫苗株是通过用野生型病毒和甲型或乙型MDV共转染鸟细胞并根据所期望的6:2基因簇分离和筛选子代病毒而制备的。这个过程需要病毒在鸟细胞培养物和/或SPF鸡蛋内多次传代。最近，质粒拯救被用于制备流感病毒制备物。在这个过程中，来自于经重复检测和特征鉴定的细胞库的Vero(非洲绿猴)细胞用，例如，8DNA质粒，电穿孔，每一个质粒包含8个流感病毒RNA节段中一个节段的cDNA拷贝。电穿孔后数天，这些电穿孔细胞的上清中就有流感病毒了。然后将上清接种到SPF鸡蛋内以扩增和生物克隆疫苗株。这两个过程都可以产生疫苗株，这些疫苗株可以接种到SPF鸡蛋内生产MVS。虽然质粒拯救技术有多种优势，其中包括更可靠地定时、遗传性质更准确的基因节段以及受野生型分离株的外源因子污染的可能性更小，但是这两种方法制备的不同MVS彼此是难以区别的，都可用于启动大批量的疫苗生产。利用本发明的方法和组合物，这种方法适于利用MDCK细胞而不是Vero细胞来进行质粒拯救。
疫苗株的最终扩增可在MDCK细胞库来源的细胞上进行。这种最终扩增利用MDCK细胞的小规模培养物(＜20L)就可完成。收集、浓缩来自于这些细胞的上清并进行特征鉴定/检测以制备MVS。
7.10实施例10：犬RNA pol I调节序列的克隆
本实施例描述了犬18S核糖体RNA基因以及该基因的5’核酸序列的克隆。
首选，利用MasterPure DNA纯化试剂盒(威斯康星州麦迪逊震源生物技术公司(EPICENTRE Biotechnologies；Madison，WI))分离MDCK细胞(登录号CCL-34，ATCC)的基因组DNA。序列比对显示18S rRNA基因在犬、人、鼠、小数、大鼠和鸡中有约90％的相同性。根据靠近18S rRNA基因5’端的保守区上的序列设计引物对，用于从MDCK基因组DNA中PCR扩增一个约500bp的片段，该片段可作为探针通过Northern印迹检测膜上包含互补序列的消化片段。用BamH I(约2.2kb)和RcoR I(约7.4kb)分别消化基因组DNA可以分别得到一个限制性酶切片段。将两个片段克隆到pGEM 7载体(威斯康星州麦迪逊帕玛咖公司(Promega Corp.；Madison，WI))内以进行下一步的分析。包含EcoR I片段的质粒已于2006年4月19日提交给美国典型培养物收集中心保藏，分配的A.T.C.C.登录号为_________。
比对通过限制性酶切分析获得的两个克隆，并通过对两个克隆的两个末端的测序来确定两个克隆的方向。EcoR I片段的限制性酶切图谱显示在图8中。下一步，确定5’EcoR I位点与3’方向上下一个BamH I位点之间的片段的完整核酸序列，然后装配成一个包含约3530个碱基的核苷酸序列。这个序列显示在图9A-C中(SEQ IDNO：1)。
下一步，进行引物延伸试验以鉴定表达自犬RNA pol I调节元件的转录子的起始核苷酸。简言之，从MDCK细胞分离总RNA。标记的寡核苷酸引物与RNA复性，用于启动DNA向18s rRNA的5’末端合成。为了鉴定转录子的第一个核苷酸，根据常规的以双脱氧核苷酸为基础的方法利用相同的引物对rRNA进行测序。通过比较引物延伸试验所获得的核酸的长度与测序反应所得的各种核酸的长度可以确定18srRNA的第一个碱基。第一个被转录的核苷酸(+1位)是图9A-C所示的核苷酸序列的1804位碱基。
为了确定这个核苷酸上游的序列是否包含足够的调节元件以指导下游基因的转录，利用标准技术构建一个包含调节序列控制之下的EGFP基因的构建体。这个构建体所使用的EGFP基因是霍夫曼(Hoffmann)等(2000)，制备甲型流感病毒的“双义”方法：从一个模板合成vRNA和mRNA(“Ambisense”approach for the generation ofinfluenza A virus：vRNA and mRNA synthesis from one template)Virology15：267(2)：310-7)所描述的EGFP基因。然后利用常规的技术将这个构建体转染到MDCK细胞内。转染后24小时，从转染细胞中分离RNA，与编码EGFP基因的标记DNA进行Northern印迹分析。检测到合适大小的转录子说明转染到MDCK细胞内的质粒包含能够指导调节元件3’端序列转录的调节序列。
7.11实施例11：犬RNA聚合酶I调节元件的鉴定
本实施例描述了犬RNA聚合酶I调节元件-犬RNA聚合酶I启动子的鉴定和特征。
通过检查犬启动子序列控制下的18s rRNA转录起始位点5’端的序列就可以确定犬RNA pol I启动子和其他调节区。另外，简单的删除试验也可用于鉴定有效转录起始所必须的序列。在一个这样的删除试验中，通过定向诱变将一个限制性酶切位点引入到编码图9A-C所示的核苷酸序列的质粒内，或者在质粒上鉴定出一个限制性酶切位点。引入的限制性酶切位点位于上述+1核苷酸，也就是图9A-C所示序列的1804位核苷酸，3’下游约50个核苷酸处。通过定向诱变在图9A-C所示核苷酸序列的5’端相对于+1位置鉴定或引入另一个限制性酶切位点。
然后通过用合适的限制性内切酶消化将包含这些限制性酶切位点的载体线性化。下一步，利用合适的核酸酶(例如，外切核酸酶I、外切核酸酶III等)消化线性核酸。在不同的时间点终止反应就可以将转录起始位点5’区上的不同大小的片段删除。下一步，将线性质粒从新环化并转化到合适的宿主细胞内，然后筛选以鉴定包含理想删除的质粒。另外，可以合成合适的寡核苷酸，其中包含位于被引入的删除片段两侧的序列。然后通过标准技术利用这种寡核苷酸制备包含环-出删除序列的衍生物。通过标准技术，寡核苷酸还可用于制备定向取代。
通过将质粒转染到MDCK细胞内并利用上述Northern印迹技术检测从质粒转录出的RNA可以确定不同删除或取代突变子启动转录的能力。通过比较允许转录的质粒序列与不允许转录的质粒序列，可以鉴定犬RNA聚合酶I启动子的序列。然后利用常规技术克隆编码这个序列的核酸。
另外，利用本领域熟知的其他方法，例如，利用微小基因组方法，可以从SEQ IDNO：1所提供的核酸上绘制出犬RNA pol I启动子。参见，例如，公开的美国专利申请20050266026，该申请使用了被称为pFlu-CAT的流感病毒微小基因组报告子，其中包含受pol I启动子控制的克隆的反义CAT基因。也可参见，霍夫曼(Hoffmann)等(2000)，制备甲型流感病毒的“双义”方法：从一个模板合成vRNA和mRNA(“Ambisense”approach for the generation of influenza A virus：vRNA and mRNAsynthesisfrom one template)Virology 15：267(2)：310-7)所描述的EGFP微小基因组；以及普莱斯契卡(Pleschka)等，(1996)J.Virol.70(6)：4188-4192所描述的CAT微小基因组***pPOLI-CAT-RT。
为了使用这些***鉴定有效转录起始所必须的序列并确定其特征，将上述不同删除/取代突变体或SEQ ID NO：1的亚序列***到所选择的报告质粒(例如，PFlu-CAT、EGFP微小基因组)内，这样报告基因的反义拷贝的转录就需要依赖删除或取代突变体控制的转录起始。上述包含EGFP的构建体通常可用于制备这种删除或取代突变体。下一步，病毒RNA依赖的RNA聚合酶从转录自报告质粒的负链RNA合成正链mRNA。这个正链mRNA随后被细胞机器翻译，这样就可以检测到报告蛋白(EGFP或CAT)的活性。
在试验中，一套包含PB1、PB2、PA和NP或PB1、PA、NP(-PB2作为阴性对照)的cDNA的表达质粒与包含甲型流感病毒EGFP微小基因组或pFlu-CAT报告子的质粒一起被转染到MDCK细胞内，其中甲型流感病毒EGFP微小基因组或pFlu-CAT报告子处于推测的犬RNA pol I调节序列的控制之下。然后在允许报告序列转录和翻译的条件下培养细胞。
利用常规技术检测报告蛋白的活性。对于EGFP来说，在转染后48小时用相差显微镜或荧光显微镜观察被转染的细胞。另外，流式细胞术也可用于检测EGFP的表达。在使用包含CAT基因的微小基因组的试验中，pFlu-CAT用于测定聚合酶活性。在这个试验中，通过直接检测CAT蛋白(例如，通过ELISA)、通过检测编码CAT的mRNA(例如，通过Northern印迹)、或通过检测CAT活性(例如，检测放射性标记的乙酰基向合适底物的转移)作为报告子活性的指示物可以测定CAT的表达。
例如，将来自于MDCK克隆的表现出启动子活性的DNA片段(参见上述引物延伸和转录分析)克隆到***片段的上游，该***片段包含分别连接到反义EGFP基因5’末端和3’末端的流感病毒的5’和3’非翻译区，其后是鼠Pol I终止子(参见图11)。共制备了三个独立的构建体，它们所***的MDCK序列不同：SEQ ID NO：1的MDCK序列1-1802(-1)、1-1803(+1)和1-1804(+2)。这些构建体分别与流感病毒复制蛋白(PBl、PB2、PA和NP)的表达载体一起通过电穿孔引入到MDCK细胞内。电穿孔后24小时用荧光显微镜检查细胞。如图12所示，所有三个MDCK片段，-1、+1和+2(分别位于上排左、中、右侧)都可产生EGFP荧光，而缺乏启动子活性的构建体只展示出背景荧光(下排左侧)。1-1803(+1)片段产生了最高水平的荧光。包含驱动EGFP表达的CMV启动子的质粒作为阳性对照(下排右侧)。
流感病毒复制蛋白只复制真正的流感病毒vRNA末端。每一个包含MDCK pol I序列的质粒都能产生EGFP信号说明犬调节序列片段具有启动子活性，可以产生具有正确流感病毒vRNA末端的RNA，而这个末端能够支持流感病毒的复制。
其他可用于鉴定犬RNA pol I调节序列并能确定其特征的试验包括RNA足迹试验。在这个试验中，包含，例如，图9A-C所示序列，的RNA分子与犬RNA聚合酶I的一个或多个亚单位接触。犬RNA pol I的一个或多个亚单位根据其特定亲和性与合适的RNA序列结合。下一步，RNA酶，例如，RNA酶I，用于降解未被犬RNA聚合酶的一个或多个亚单位保护的RNA。然后灭活RNA酶，从RNA聚合酶I的一个或多个保护亚单位中分离被保护的RNA片段。分离出的片段包含被RNA聚合酶I的一个或多个亚单位结合的序列，是具有启动子/增强子活性的序列的极佳候选者。另外，这些足迹试验还可以在存在犬RNA聚合酶I的不同亚单位的情况下进行以确定哪一个亚单位与哪一个RNA序列结合。这些试验可以帮助确定不同结合序列的活性，例如，通过不同犬Pol I聚合酶亚单位与来自于其他物种的已知序列以及结合特异性的RNA聚合酶I亚单位的序列比较。
体外技术也可用于监测从推测的犬RNA pol I调节序列的转录。在这些技术中，SEQ ID NO：1的上述不同删除/取代突变子或其他亚序列与目的转录子操作性连接。然后将一组转录所必须的犬RNA聚合酶I蛋白加到转录子上。通过检测犬RNA聚合酶I蛋白所合成的RNA转录子来检测有效转录，例如，通过Northern印迹技术。
相同的试验可用于鉴定其他犬RNA pol I调节元件，例如，影响RNA pol I转录的增强子、抑制子或其他元件。一般来说，在这种试验中，包含SEQ ID NO：1的删除、取代或亚序列的报告构建体的表达水平与上述鉴定的微小RNA pol I启动子的表达水平比较。通过比较表达水平，可以确定是否存在与转录增强或降低有关的元件。
7.12实施例12：在MDCK细胞内进行流感病毒拯救
本实施例描述了利用实施例10所克隆的犬RNA pol I调节元件在MDCK细胞培养物中拯救(rescue)流感病毒。
利用常规的分子生物学技术构建编码犬RNA pol I启动子和/或18s rRNA上游存在的本发明的其他核酸控制之下的病毒基因组RNA的表达载体。这种构建体可用于在MDCK细胞内拯救流感病毒。
有关使用表达质粒表达流感病毒蛋白和基因组RNA以获得病毒RNA的操作规程的进一步指导见于，例如，美国专利号5,578,473、5,576,199、5,820,871、5,854,037，国际专利公开号WO00/60050，美国专利公开号2002/0164770和2004/01422003的描述，其中的病毒RNA与产生感染性病毒颗粒的蛋白有关。
虽然为了澄清和理解的目的在上面已在某些细节上对本发明作了描述，但是很明显，本领域的技术人员通过阅读本公开可以在形式和细节上作出各种修改，只要不偏离本发明的真正范围就可以。例如，上述所有技术和设备可任意组合使用。出于所有目的，本申请所引用的所有出版物、专利、专利申请或其他文献都已完整纳入本文作为参考，这就如同各个出版物、专利、专利申请和/或其他文献皆被明确并独立地纳入本文作为参考。另外，出于所有目的，以下美国临时专利申请通过引用全文纳入本文：2006年4月19日提交的U.S.60/793,522；2006年4月19日提交的U.S.60/793,525；2005年7月22日提交的U.S.60/702,006；2005年7月15日提交的U.S.60/699,556；2005年7月15日提交的U.S.60/699,555；2005年6月21日提交的U.S.60/692,965；以及2005年7月21日提交的U.S.60/692,978。
序列表
<110>米迪缪尼疫苗股份有限公司(MedImmune Vaccines，Inc)
G.杜克(Duke，Gregory)
G.坎宝(Kemble，George)
J.杨(Young，James)
王兆悌(Wang，Zhaoti)
<120>用于在犬细胞内表达反义病毒RNA的方法和组合物
<130>FL412PCT
<150>60/793,522
<151>2006-04-19
<150>60/793,525
<151>2006-04-19
<150>60/702,006
<151>2005-07-22
<150>60/699,555
<151>2005-07-15
<150>60/699,556
<151>2005-07-15
<150>60/692,965
<151>2005-06-21
<150>60/692,978
<151>2005-06-21
<160>19
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>3532
<212>DNA
<213>家犬(Canis familiaris)
<400>1
aattctggag aaacagattg tgttataaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaaa 60
gagaaaatcc ttatgttctt tgagcctccc ctccccccca gaattgagtt cctcttccac 120
gacctcttct cattcaaccc aatagacaag tatttggggg ggggggtcag gtcccagacg 180
ctgagagggt ggaggtgaag gtggtgcggg gggggggggg cacaccgtcc tctccagcgc 240
ctttggttca gacctccttc gtgacctccc tccctccctc cctccctcct ccctcctcct 300
cctcctccct cttcgtctta taaatatata aataaaatcc taaagaaaag aaaaagaaaa 360
aaaaaaaaag gaaggacacg agaaaaaacg gtgcatccgt tgccgtcctg agagtcctcg 420
cctggtttcg gctctacgtt ccctccctga cctcggaaac gtgcctgagt cgtcccggga 480
gccccgcgcg gcgagcgcga ccccctttcg ggcggcagcg ggcccggacg gacggacgga 540
cggacggacg ggttttccaa ggctcccccg ccccgggagg acgggggttc gcggtgcgcg 600
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acggcctcgc cgcccggatc tgtcccgctg tcgttcgcgc cggttgtcgg gtgccactgg 720
cggccgcttt tatagagcgt gtccctccgg aggctcggcg gcgacaggca aggaacagct 780
ttggtgtcgg tttcccgggg ccgagttcca ggaggagggc ggctccggcg cgagcgtctg 840
tcgccggggc ctcggcgcga tgcgctcgcc ggagattgga ctccggagct gcgagggagt 900
gtcgccgtcg cccgtgtcgc ccgtgtccgc tccgcctcgc tcccggagga ggccgtgcgg 960
gccgcctggg tgggtcgacc agcaccgccg gtggctcctc ctcgcccgcg cggaccgacc 1020
tgggcgcctc gggggcgggg gacagggtgt gtcccgccgt ccgtcctgtg gctccgggcg 1080
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ggaccggtct gagcctggag gggaagcccg tgggtggcgc gacagacccg gctgcgggca 1200
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tccccgccgg caggcgcggt tattttcttg cccgagatga acattttttg ttgccaggta 1800
ggtgctgaca cgttgtgttt cggcgacagg cagacagacg acaggcagac gtaaaagaca 1860
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gagcggccct cccctcctcc gcgggggagg gccggcccga cgccgcgctg ctcaccgccc 2700
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ggtcgcctca ggtgcctgag gccgagcggt ggcgtcgttt ccttccccgg cgactcccct 2820
cgggctgccg ccgccgtcgt cggcgtgtcc gaggagcggg tggtggaaga agtcggcaag 2880
ggaggcgcac ccgtgcccct ggcgggggcg cgggcgcctc gtcttccttc ccctctcctc 2940
tcctcccccc tcgcgcgccg gcggggggtg ggtggcgtgg ggcggtgtga ctcggaggac 3000
ttggcggggc tcgtgaggcc gcggcgggcc gggccacgcc gcggcgcttg ccagccgagg 3060
ggctgcccct ctctccggca cgggtcgtgt ccccgtctcc gtccctctct ctcgcgctcg 3120
cgggaggcgg ggagctctct cctctgggcg gtgacgtgac cacgccgtgc gcgggcgagg 3180
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cccttgccgg agatccgccc cccgccccgc gagcctgtcg gccccggagc gccgcctggt 3300
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<210>2
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<212>DNA
<213>家犬(Canis familiaris)
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<213>家犬(Canis familiaris)
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<213>家犬(Canis familiaris)
<400>4
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<213>家犬(Canis familiaris)
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cggttatttt cttgcccgag atgaacattt tttgttgcca ggtaggtgct gaca 114
<210>6
<211>85
<212>DNA
<213>家犬(Canis familiaris)
<400>6
gtgacctgtg gctggtcccc gccggcaggc gcggttattt tcttgcccga gatgaacatt 60
ttttgttgcc aggtaggtgc tgaca 85
<210>7
<211>59
<212>DNA
<213>家犬(Canis familiaris)
<400>7
aggcgcggtt attttcttgc ccgagatgaa cattttttgt tgccaggtag gtgctgaca 59
<210>8
<211>164
<212>DNA
<213>家犬(Canis familiaris)
<400>8
ttgatgattt ttcaaagtcc tcccggagat cactggcttg gcggcgtggc ggcgtggcgg 60
cgtggcggcg tggcggcgtg gcggcgtggc gtctccaccg acccgtatcg cccctcctcc 120
cctccccccc cccccccgtt ccctgggtcg accagatagc cctg 164
<210>9
<211>137
<212>DNA
<213>家犬(Canis familiaris)
<400>9
ttgatgattt ttcaaagtcc tcccggagat cactggcttg gcggcgtggc ggcgtggcgg 60
cgtggcggcg tggcggcgtg gcggcgtggc gtctccaccg acccgtatcg cccctcctcc 120
cctccccccc ccccccc 137
<210>10
<211>109
<212>DNA
<213>家犬(Canis familiaris)
<400>10
ttgatgattt ttcaaagtcc tcccggagat cactggcttg gcggcgtggc ggcgtggcgg 60
cgtggcggcg tggcggcgtg gcggcgtggc gtctccaccg acccgtatc 109
<210>11
<211>55
<212>DNA
<213>家犬(Canis familiaris)
<400>11
ttgatgattt ttcaaagtcc tcccggagat cactggcttg gcggcgtggc ggcgt 55
<210>12
<211>299
<212>DNA
<213>家犬(Canis familiaris)
<400>12
ttgatgattt ttcaaagtcc tcccggagat cactggcttg gcggcgtggc ggcgtggcgg 60
cgtggcggcg tggcggcgtg gcggcgtggc gtctccaccg acccgtatcg cccctcctcc 120
cctccccccc cccccccgtt ccctgggtcg accagatagc cctgggggct ccgtggggtg 180
ggggtggggg ggcgccgtgg ggcaggtttt ggggacagtt ggccgtgtca cggtcccggg 240
aggtcgcggt gacctgtggc tggtccccgc cggcaggcgc ggttattttc ttgcccgag 299
<210>13
<211>244
<212>DNA
<213>家犬(Canis familiaris)
<400>13
ggcggcgtgg cggcgtggcg gcgtggcggc gtggcgtctc caccgacccg tatcgcccct 60
cctcccctcc cccccccccc ccgttccctg ggtcgaccag atagccctgg gggctccgtg 120
gggtgggggt gggggggcgc cgtggggcag gttttgggga cagttggccg tgtcacggtc 180
ccgggaggtc gcggtgacct gtggctggtc cccgccggca ggcgcggtta ttttcttgcc 240
cgag 244
<210>14
<211>190
<212>DNA
<213>家犬(Canis familiaris)
<400>14
gcccctcctc ccctcccccc ccccccccgt tccctgggtc gaccagatag ccctgggggc 60
tccgtggggt gggggtgggg gggcgccgtg gggcaggttt tggggacagt tggccgtgtc 120
acggtcccgg gaggtcgcgg tgacctgtgg ctggtccccg ccggcaggcg cggttatttt 180
cttgcccgag 190
<210>15
<211>134
<212>DNA
<213>家犬(Canis familiaris)
<400>15
gggctccgtg gggtgggggt gggggggcgc cgtggggcag gttttgggga cagttggccg 60
tgtcacggtc ccgggaggtc gcggtgacct gtggctggtc cccgccggca ggcgcggtta 120
ttttcttgcc cgag 134
<210>16
<211>106
<212>DNA
<213>家犬(Canis familiaris)
<400>16
gccgtggggc aggttttggg gacagttggc cgtgtcacgg tcccgggagg tcgcggtgac 60
ctgtggctgg tccccgccgg caggcgcggt tattttcttg cccgag 106
<210>17
<211>80
<212>DNA
<213>家犬(Canis familiaris)
<400>17
tggccgtgtc acggtcccgg gaggtcgcgg tgacctgtgg ctggtccccg ccggcaggcg 60
cggttatttt cttgcccgag 80
<210>18
<211>217
<212>DNA
<213>家犬(Canis familiaris)
<400>18
ggcgtggcgt ctccaccgac ccgtatcgcc cctcctcccc tccccccccc cccccgttcc 60
ctgggtcgac cagatagccc tgggggctcc gtggggtggg ggtggggggg cgccgtgggg 120
caggttttgg ggacagttgg ccgtgtcacg gtcccgggag gtcgcggtga cctgtggctg 180
gtccccgccg gcaggcgcgg ttattttctt gcccgag 217
<210>19
<211>56
<212>DNA
<213>家犬(Canis familiaris)
<400>19
tcgcggtgac ctgtggctgg tccccgccgg caggcgcggt tattttcttg cccgag 56
Claims (20)
1. 一种包含犬RNA聚合酶I调节序列的分离核酸。
2. 如权利要求0所述的核酸，其特征在于，所述调节序列是启动子。
3. 如权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述RNA聚合酶I调节序列包含SEQID NO：1的1到1803位核苷酸或其功能活性片段。
4. 如权利要求0、2或3所述的核酸，其特征在于，所述调节序列与编码负链病毒基因组RNA或相应的cRNA的cDNA操作性连接。
5. 如权利要求4所述的核酸，其特征在于，所述核酸还包含转录终止序列。
6. 如权利要求5所述的核酸，其特征在于，所述负链病毒基因组RNA是流感病毒基因组RNA。
7. 一种包含如权利要求6所述核酸的表达载体。
8. 一种用于制备流感病毒基因组RNA的方法，该方法包括转录如权利要求6所述的核酸，从而制备流感病毒基因组RNA。
9. 一种用于制备重组流感病毒的方法，该方法包括培养包含如权利要求7所述表达载体和一种或多种表达mRNA的表达载体的犬细胞，其中所述mRNA编码的一种或多种流感病毒多肽选自下组：PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1和NS2；以及分离重组流感病毒。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述制备的流感病毒是有感染性的。
11. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法可导致产生至少1×103PFU/ml流感病毒。
12. 一种包含如权利要求7所述表达载体的细胞。
13. 如权利要求12所述的细胞，其特征在于，所述细胞是犬细胞。
14. 如权利要求13所述的犬细胞，其特征在于，所述犬细胞是肾细胞。
15. 如权利要求14所述的犬肾细胞，其特征在于，所述犬肾细胞是MDCK细胞。
16. 一种用于在培养的犬细胞内制备重组节段化负链RNA病毒的方法，其中的负链RNA病毒具有3个以上的基因组vRNA节段，所述方法包括：(a)将能够在所述细胞内表达基因组vRNA节段以提供所述病毒的完整基因组vRNA节段的第一套表达载体引入到犬细胞群内；(b)将能够表达编码所述病毒的一种或多种多肽的mRNA的第二套表达载体引入到所述细胞内；以及(c)培养所述细胞从而制备病毒颗粒。
17. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述感染性流感病毒颗粒被制备。
18. 一种用于在培养的犬细胞内制备感染性流感病毒颗粒的方法，所述方法包括：(a)将一套表达载体引入到犬细胞群内，其中的表达载体能够在所述细胞内表达(i)基因组vRNA节段以提供所述病毒的完整基因组vRNA节段以及(ii)编码所述病毒的一种或多种多肽的mRNA；(b)培养所述细胞从而制备所述病毒颗粒。
19. 一种通过如权利要求16所述方法制备的病毒。
20. 如权利要求16、17或18所述的方法，其特征在于，使用了辅助病毒。
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