CN1436237A

CN1436237A - 与提高或降低哺乳动物***率有关的核苷酸序列

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Publication number: CN1436237A
Application number: CN01811320A
Authority: CN
Inventors: 奥利·V·P·里特沃斯; 乔治·H·戴维斯; 苏珊·M·加洛韦; 肯尼恩·P·麦克纳蒂
Original assignee: AGRES Ltd
Current assignee: Agres Ltd.
Priority date: 2000-05-05
Filing date: 2001-05-04
Publication date: 2003-08-13
Also published as: AU2001260821B2; BR0110616A; ZA200208963B; CA2408051A1; AU6082101A; EP1292674B1; WO2001085926A3; EP1292674A2; RU2283866C2; DE60134852D1; MXPA02010868A; ATE401403T1; AR028411A1; NZ500844A; JP2003532414A; US20040092007A1; WO2001085926A2

Abstract

本发明涉及与提高或降低哺乳动物***率有关的核苷酸序列。具体地，本发明涉及在与杂合性雌性哺乳动物***率提高有关的基因中的突变；这些突变导致杂合性雌性哺乳动物不育。对所述突变基因序列的了解可以在用于鉴定携带该突变基因的纯合性雌性和雄性哺乳动物的杂合子的检验中应用，从而提高或降低雌性哺乳动物的***率，或引起雌性哺乳动物不育或生育能力降低。

Description

与提高或降低哺乳动物***率有关的核苷酸序列

本发明涉及与提高或降低哺乳动物***率有关的核苷酸序列。

具体地，本发明广泛涉及在与杂合性雌性哺乳动物***率提高有关的基因中的突变；这些突变导致杂合性雌性哺乳动物不育。对所述突变基因序列的了解可以在用于鉴定携带该突变基因的纯合性雌性和雄性哺乳动物的杂合子的检验中应用。对所述基因的生物学功能及其突变的了解也可以用于提高或降低雌性哺乳动物的***率，或用于引起哺乳动物不育或生育能力降低。

背景技术

本说明书中引用的所有文献，包括专利或专利申请都是作为参考而引入。并非认可任何参考文献组成现有技术。这些参考文献中的讨论表明了它们的作者的观点，本申请人保留对所引用的文件的准确性和针对性进行争辩的权利。显然，尽管本文引用了多篇现有技术的出版物，但无论是在新西兰还是任何其它国家，这种引用并不意味着认可这些文件就是现有技术中公知常识的一部分。

Inverdale高生育力基因(FecX^I)是绵羊的主要高生育力基因，它最初是在罗姆尼羊群(Inverdale)中发现的，这种羊群由具有高产仔率的罗姆尼母羊(A281)产生的后代组成。种群隔离研究表明，上述基因位于X染色体上(Davis等，1991)。杂合型I+母羊中该基因的单个拷贝可提高***率(多排大约一个卵)，提高产仔率(每只母羊产大约0.6只羊羔)。携带该基因的两个拷贝的纯合型II母羊卵巢小且无功能，属于不育型(Davis等，1992)。对I+和II型绵羊胎儿的研究表明，胎儿直到接近百日龄时卵巢发育仍然正常：生殖细胞发育，卵泡发育，以及卵泡的早期生长阶段都正常。但在II型胎儿中，胎儿期达到100天后，初级生长阶段以外的卵泡发育减弱，未见正常的次级卵泡(Smith等，1997)。当II型动物体内***直径增大(＞40um)时，没有迹象表明颗粒细胞增殖，这与通常观察到的情况相反(Braw Tal等，1993；McNatty等，1995a；Smith等，1997)。因此，II型动物在胎儿期、新生儿期和成年期存在幼稚的无功能的卵巢，是由于卵泡发育在初级生长阶段被终止。

第二个高产的罗姆尼羊群(Hanna，1995)也携有与Inverdale羊群表型相似的X-连锁的突变，但未发现它与Inverdale羊群有关联。将携带Inverdale的公羊与携带Hanna的母羊交配，得到无生育能力的纯合型雌性动物，由此证实，Hanna动物在Inverdale基因中包含突变(FecXH)(Davis等，1995)。这一Hanna品系在Invermay作为区别于Inverdale品系的另一个群体而被保留下来。

在寻找导致Inverdale性状的基因的过程中，本发明人构建了绵羊X-染色体的遗传连锁图谱(Galloway等，1996)，并将Inverdale基因定位在距离微卫星标志10cM的一个侧翼区(Galloway等，1999)。所述基因在绵羊X-染色体上的定位，使寻找其它哺乳动物X-染色体上候选基因的范围缩小，因为，几乎无一例外地，在一种动物的X染色体上出现的基因也会出现在其它哺乳动物的X染色体上(Ohno，1973)。

Inverdale基因在X染色体上的遗传，为获得高产的携带单拷贝Inverdale的母羊提供了一种方便的途径，因为携带Inverdale的公羊的所有后代都会通过遗传获得该基因。公羊饲养者使用一种遗传标志测试来鉴定能出售的携带相应性状的公羊，商人则购买这些公羊用于产出高产的母羊，然后使它们与终端种畜(terminal sire)交配，得到将被屠宰的后代。Inverdale基因的商业应用已经在现有的终端种畜交配***中显示出极大的优势，每购买一只Inverdale公羊，比通常一只公羊的价值增加$1760(Amer等，1998)。要产出携带所述基因的高质量公羊，必须能够区分非携带者(++母羊或+Y公羊)和单拷贝携带者(I+母羊或IY公羊)。

有一种遗传标志测试是根据所述基因周围微卫星标志的遗传而开发的(即单元型测试)(Galloway等，1999)；参见图1。但现有的测试仅能鉴定出那些从已知携带者遗传了Inverdale单元型的动物，并非100％精确，因为它不能检测Inverdale基因本身。在Hanna品系的绵羊中，衍生自X染色体相同区域但携带不同版本的Inverdale的单元型，与A281的后代的单元型不同。

1996年的研究结果显示，生长分化因子9(GDF-9)作为转化生长因子β(TGF-β超家族的一员，在成年小鼠的***中特异性表达，并且是这种***中卵泡发生过程(folliculogenesis)所必需的(Dong等，1996)。GDF-9的信使RNA只在***中合成，从原始/初级单层卵泡阶段直到***后的阶段都能合成，雌性GDF-9敲除小鼠由于在此初级单层卵泡阶段的卵泡发育停止而变得不育。Inverdale基因纯合型动物都没有生育能力，它们与GDF-9敲除小鼠具有相似的表型(McNatty等，1995b)。后来有人将GDF-9定位于绵羊的5号染色体上，并因此不导致Inverdale表型(Sadighi等，1998)。

该家族另一个相关成员GDF-9B，也称为BMP15，在小鼠和人类的卵巢中被发现，并且与GDF-9共表达(Laitinen等，1998，Dube等，1998)。BMP15被定位于小鼠的X染色体上，接近Fscl(Dube等，1998)。Fscl(纤维鞘成分)也称为Akap4(A激酶锚着蛋白4)，它已被定位在小鼠X染色体上距离着丝粒1.6cM之处(Mouse Genome Database(MGD)，October 1999)和人的X染色体的p11.2区带上(Dube等，1998)。在Inverdale绵羊(++，I+和II基因型)中，使用不能区分这些基因型的分子探针进行的初步研究表明，GDF-9B mRNA在初级卵泡而非原始卵泡的***中表达，而且在卵巢中该mRNA仅在***中表达(Galloway等2000。

TGF-ss超家族的成员具有类似的基因结构。GDF-9B编码区包含在由4.2kb(人)和3.5kb(小鼠)的内含子分隔的两个外显子中(Dube等，1998)。在人类中，全长1176bp的编码序列产生392个氨基酸的前原肽，它的前17个氨基酸对应于一个分泌信号。人和小鼠中的前原肽包括蛋白切割位点，通过切割产生一段125个氨基酸的成熟、活性C末端肽和一段N末端原肽产物(Laitinen等，1998，Dube等，1998)。内含子序列位于原肽结构域内，因此完整的成熟编码区位于外显子2的区域内。

人的BMP15(GDF-9B)野生型的序列公开在US 5,728,679和US5,635,372中。野生型蛋白也已经公开，可用于治疗骨和软骨和/或其它***的缺陷，以及用于伤口复原和组织修复。

本发明人在表达Inverdale或Hanna表型的绵羊中鉴定了绵羊GDF-9B基因的一种突变形式，并首次发现这种GDF-9B突变型导致这些绵羊的***增加，还负责纯合型绵羊的生育力。

本发明广泛涉及上述突变的序列及其相应的编码蛋白。

发明内容

相应地，本发明一个方面提供了一种分离的突变的GDF-9B核酸分子，其含有选自下组的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，或SEQ ID NO：7；

b)能在严格条件下与(a)中分子杂交的序列；

c)由(a)定义的分子的功能性变体或片段；

d)与(a)，(b)或(c)定义的分子互补的序列；和

e)对应于(a)-(d)中任一项的分子的反义序列。

所述核酸分子可以是RNA，cRNA，基因组DNA或cDNA分子，也可以是单链或双链。所述核酸分子还任选还有一或多个合成的、非天然的、或发生了改变的核苷酸碱基，或它们的组合。

本发明还提供了一种鉴定携有突变的GDF-9B核酸分子的哺乳动物的方法，该方法包括以下步骤：

(i)获得该哺乳动物的组织样品或血液样品；

(ii)从该样品中分离DNA；

(iii)可选地，从步骤(i)获得的DNA中分离GDF-9B DNA；

iv)可选地，用探针检测所述DNA，该探针与本发明的突变的GDF-9BDNA互补；

v)可选地，扩增突变的GDF-9B DNA的量，并且；

vi)确定步骤(ii)中获得的GDF-9B序列DNA是否携带与不育有关，或与***的增加或降低有关的突变。

优选扩增步骤(v)可通过任何便捷方法进行，如聚合酶链式反应(PCR)，或连接酶链式反应。

本发明另一方面提供了一种遗传标记，其通过DNA来筛选***增加或不育的哺乳动物，所述遗传标记包含核酸分子，该核酸分子与本发明第一方面所述的核苷酸序列特异性杂交，或者与包含或相关于突变的GDF-9B核酸分子的基因组DNA特异性杂交。

哺乳动物可以是雄性或者雌性，还可以是人，或家养动物，宠物，动物园动物或野生哺乳动物。优选哺乳动物选自人、绵羊、牛、山羊、鹿、马、camelid、负鼠(possum)、猪、小鼠、大鼠、鼬鼠(weasel)、兔(rabbit)、野兔(hare)、雪貂(ferret)、猫和狗。

本发明另一方面提供了一种分离的多肽，其由具有上述(a)-(d)中任一项所述序列的核酸分子编码。优选所述多肽具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：8，或其功能性变体或片段。

本发明另一方面提供了一种分离的多肽，其具有包含SEQ ID NO：10或其功能性变体或片段的氨基酸序列。

本发明还有一方面提供了一种分离的核酸分子，其具有包含SEQ IDNO：9或其功能性片段或变体的核苷酸序列。

本发明还有一方面提供了一种分离的核酸分子，其编码基本上如上所述的多肽。

本发明还有一方面提供了一种调节雌性哺乳动物***率的方法，该方法包括给予该哺乳动物有效量的突变的GDF-9B多肽，野生型GDF-9B多肽，或其中任一种的功能性片段或变体。

本发明还提供了一种增加雌性哺乳动物***率的方法，所述哺乳动物未携带突变的GDF-9B核酸分子，该方法包括给予该哺乳动物有效量的突变的GDF-9B多肽或其功能性变体或片段。

本发明还提供了一种增加雌性哺乳动物***率的方法，所述哺乳动物携带两个拷贝的突变的GDF-9B核酸分子，该方法包括给予该哺乳动物有效量的野生型GDF-9B多肽。

本发明另一方面提供了一种增加或降低***率的方法，或者诱导雌性哺乳动物不育的方法，所述方法包括给予有效量的选自下组的制剂，从而抑制野生型或突变型GDF-9B多肽的生物活性：

a)免疫有效量的野生型或突变型GDF-9B多肽，或其功能性片段或变体；

b)反义核酸分子，其针对的DNA能编码野生型或突变型GDF-9B多肽，或它们的功能性片段或变体；

c)能与野生型或突变型GDF-9B多肽或其功能性片段或变体结合的配体，或者野生型或突变型GDF-9B多肽或其功能性片段或变体的抗原。

本发明进一步的方面提供了一种组合物，其包含有效量的突变的GDF-9B多肽或该多肽的功能性片段或变体，以及药学或兽医学可接受的载体或稀释剂。

本发明还有一方面提供了一种组合物，其包含有效量的选自下组的制剂以及药学或兽医学可接受的载体或稀释剂：

a)根据本发明的突变的GDF-9B多肽；

b)根据本发明的野生型GDF-9B多肽；

c)针对本发明的野生型或突变型GDF-9B多肽的反义核酸分子；

d)能与本发明的野生型或突变型GDF-9B多肽结合的配体，或者本发明的野生型或突变型GDF-9B多肽的抗原。

本发明还有一方面提供了一种构建体或载体，其包含基本上如上所述的核酸分子。

本发明还提供了一种宿主细胞，其被包含本发明核酸分子的载体或构建体转化。

本发明还有一方面提供了一种分离的核酸分子，其含有选自SEQ IDNO：12或SEQ ID NO：14，或其功能性活性片段或变体的核苷酸序列。

本发明还提供了一种分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO：13和SEQID NO：15的氨基酸序列。

本发明还有一方面提供了一种分离的功能性活性多肽变体，其如SEQID NO：11所示。

本发明还有一方面提供了一种分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO：16所示的核酸序列。

本发明还提供了一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。

本发明还涉及一种在负鼠中降低***率或诱导不育的方法，包括给予有效量的多肽，该多肽具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列或其功能性变体或片段。

上文所述的本发明范围很广，本领域技术人员将认识到，本发明并不限于上述，还包括以下部分说明并给出实施例的实施方案。

附图说明

本发明的具体优选方面将参照附图加以说明。在附图中：

图1显示绵羊X染色体的遗传连锁图谱。基因间距表示为Kosamabi厘摩(cM)。Inverdale基因定位在阴影条所示的区域。

图2a显示Inverdale绵羊中GDF-9B的外显子2的核苷酸序列。Inverdale T→A核苷酸取代(加工位点以外的92个核苷酸)的位置用粗体表示。受该取代影响的三联密码用下划线标记。对多肽进行蛋白切割的加工位点以及TGA终止密码子用框表示。成熟肽编码序列介于上述两个框之间。

图2b显示Hanna绵羊中GDF-9B的外显子2的核苷酸序列。HannaC→T核苷酸取代(加工位点以外的67个核苷酸)的位置用粗体表示。受该取代影响的三联密码用下划线标记。使原肽经蛋白切割产生成熟片段的加工位点以及TGA终止密码子用框表示。成熟肽编码序列介于上述两个框之间。

图2c显示图2a中bp394-599的核苷酸序列。

图2d显示图2b中bp394-599的核苷酸序列。

图2e显示图2a中bp472-486的核苷酸序列。

图2f显示图2b中bp448-462的核苷酸序列。

图3a显示GDF-9B Inverdale蛋白的推定的氨基酸序列，所述蛋白由图2a的核苷酸序列编码。图中显示了成熟GDF-9B的正常形式，原肽部分以斜体表示。由于Inverdale碱基取代而产生的氨基酸(天冬氨酸，D)用粗体表示。

图3b显示截短的GDF-9B Hanna蛋白的推定的氨基酸序列，所述蛋白由图2b的核苷酸序列编码。图中显示了成熟GDF-9B多肽的正常形式，原肽部分以斜体表示。Hanna突变体中，野生型氨基酸(谷氨酰胺，Q)变成了终止密码子(END)。

图4显示了绵羊与人和小鼠的GDF-9B的推定氨基酸序列的比较。序列上方的括号中的数字表示成熟肽的氨基酸位置。空心三角表示Leu多态性的位置，实心三角表示单个内含子的位置。假定的RRAR加工位点和保守的半胱氨酸用阴影表示。氨基酸23和31位的FecX^I和FecX^H突变的位置用粗体表示。

图5显示Inverdale，Hanna和野生型绵羊GDF-9B序列的层析谱——显示了发生突变的区域。

图6显示预测的FecX^I蛋白与来自其它物种的TGF超家族成员的突变区域的对比排列。

图7显示绵羊X染色体上含有GDF9-B基因的区域的连锁图谱。

图8显示携带Inverdale FecX^I突变的绵羊和非携带者，利用对强制PCR片段的XbaI消化，而进行SNP变体检测试验的结果：非携带者，(I+)杂合子携带者和(II)纯合子携带者都显示在雌性纯合子(样品A1，A2)，雄性携带者(样品A5，A10)和雄性非携带者(样品A3，A4，A6，A7，A8，A11，A12和A13)的侧面。

发明详述

这是首次发现，Inverdale和Hanna绵羊的GDF-9B基因中的突变，导致杂合型动物***率增加而纯合型动物不育。

本文中“包括”是指“包括但不限于”，“包含”也具有相应的涵义。

术语“分离的”是指基本上从天然能产生所述核酸的细胞或生物所含的各种杂质序列中分离或纯化出来，包括经标准纯化技术纯化的核酸，通过重组技术(包括PCR技术)制备的核酸，以及合成的核酸。优选从表达Inverdale或Hanna表型的绵羊的基因组DNA中分离所述核酸分子。

术语“***调节”是指与在未处理的哺乳动物中的观察结果相比，***率的增加或降低。

术语“配体”是指能与另一分子(如多肽或肽)结合的任何分子，应包括，但不限于抗体和噬菌体展示分子。

上述方法中使用的探针和引物也是本发明的一部分。这些探针和引物可包含能在严格条件下与突变的GDF-9B基因序列杂交的本发明核酸分子的片段。所述探针和引物也可以用于研究所述突变基因的结构和功能，以及用于从除了表达Inverdale或Hanna表型的绵羊以外的其它哺乳动物中获得该基因的同系物。

核酸探针和引物可以根据本发明的核酸来制备。“探针”包括附带有可检测的标记或报道分子的分离的核酸。常用的标记包括放射性同位素、配体、化学发光试剂或荧光试剂，以及酶。

核酸的“片段”是核酸的一部分，其比全长短，并至少包含一段在下述严格条件下可与本发明核酸分子或其互补序列特异性杂交的最短序列。多肽的“片段”是多肽的一部分，其比全长短，但仍然保留了提高或降低哺乳动物***率，或导致哺乳动物不育的生物学功能。因此，本发明的片段具有本发明核酸或多肽的至少一种生物学活性。

“引物”是短的核酸，优选长度为15个核苷酸或更长的寡核苷酸，其可通过核酸杂交而与互补的靶DNA链退火，形成所述引物与所述靶DNA链的杂交体，然后利用聚合酶(优选DNA聚合酶)沿靶DNA链延伸。引物对可用于扩增核酸序列，如通过聚合酶链式反应(PCR)或本领域熟知的其它扩增方法。PCR引物对可来自本发明的核酸序列，例如通过使用为此目的而设计的计算机程序，如Primer(Version 0.5^1991，Whitehead Instituteof Biomedical Research，Cambridge，MA)。

制备和使用探针和引物的方法在，例如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，2^nd ed，vol.1-3，ed Sambrook等.Cold Spring HarbourLaboratory Press，Cold Spring Harbour，NY，1989中有说明。

探针或引物可以是在溶液中自由存在，也可以经标准方法共价或非共价连接于固相支持物上。

使用特异性扩增引物对扩增靶核酸序列(如通过PCR)时的严格条件，是能使该引物对仅与靶核酸序列杂交的条件，在这样的条件中，具有相应野生型序列(或其互补序列)的引物可与所述靶核酸结合。

除碱基组成、互补链长度和杂交核酸之间核苷酸碱基错配的数目外，核酸杂交还可被如下条件影响，如盐浓度、温度、或有机溶剂，这些是本领域技术人员很容易理解的。

当涉及探针或引物时，术语“特异于(靶序列)”表示，在包含靶序列的指定样品中，所述探针或引物在严格条件下仅与所述靶序列杂交。

在一个实施方案中，本发明提供了一种遗传标记，其用于借助DNA来筛选绵羊、山羊、牛、鹿、小鼠、大鼠或任何其他商业上重要的哺乳动物的***增加或不育。本发明提供了使用核酸分子鉴定动物个体中序列变体的工具(means)，其中所述核酸分子包含源自突变的GDF-9B DNA序列，或与突变的GDF-9B基因相连的基因组DNA的序列，所述序列变体与该动物的***增加或不育有关。尽管这些变体不一定直接导致***增加或不育的性状，但它们与这些性状关系密切，因而足以预测这种性状。鉴定这些序列变体的方法是本领域所熟知的，包括但不限于，限制性片段长度多态性(RFLP)，AFLP，对突变的GDF-9B基因内的DNA或与突变的GDF-9B基因相连的DNA进行直接测序，或者对串联重复单元的可变数量(VNTR)或微卫星多态性(二元核苷酸重复或三元核苷酸重复)进行鉴定和定性，对单核苷酸多态性(SNP)进行检测和定性。

所述多肽可如下产生：在适当的宿主细胞中表达适当的载体，该载体包含本发明的核酸分子或其功能性变体或片段。本领域技术人员对此可以理解。

克隆载体可以根据所使用的宿主或宿主细胞来选择。有效宿主通常具备以下特征：

(a)自我复制的能力；

(b)针对任何特定的限制性内切核酸酶具有唯一的靶点；以及

(c)优选，携带编码易于筛选的标记(如抗生素抗性)的基因。

具有这些特性的两种主要载体是质粒和细菌病毒(噬菌体)。目前优选的载体包括：pUC，pBlueScript，pGEM，PGEX，pBK-CMV，λZAP,λGEM和pSP系列。但上述所列并非限制本发明的范围。

本发明的DNA分子可通过与适当的调控序列可操作地连接在具有复制能力的表达载体中而被表达。调控序列可包括如复制起点，启动子，增强子和转录终止序列。对表达载体中包含的调控序列的选择取决于被用来表达所述DNA的宿主或宿主细胞的类型。

一般情况下，原核生物，酵母或哺乳动物细胞是有用的宿主。术语“宿主”还包括质粒载体。合适的原核宿主包括大肠杆菌(E.coli)，芽孢杆菌属(Bacillus)，和假单胞菌属(Pseudomonas)的许多种。常用的启动子，如β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子***是本领域熟知的。与所选宿主相容的任何现有启动子***都可使用。酵母中使用的载体也是现有的和熟知的。一个合适的例子是2μ复制起点质粒。

类似的，在哺乳动物细胞中使用的载体也是众所周知的。这样的载体包括SV-40、腺病毒、逆转录病毒来源的DNA序列、单纯疱疹病毒的已知衍生物，以及衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体。

其它真核表达载体是本领域所熟知的(如，P.J.Southern & P.Berg,J.Mol.Appl.Genet.1 327-341(1982)；S.Subramani等，Mol.Cell.Biol.1，854-864(1981)；R.J.Kaufmann & PA.Sharp，“Amplification and Expression ofSequences Cotransfected with a Modular Dihydrefolate ReducaseComplementary DNA Gene,J.Mol.Biol.159，601-621(1982)；R.J.Kaufmann& PA.Sharp，Mol.Cell.Biol.159，601-664(1982)；S.I.Scahill等，“ExpressionAnd Characterization Of The Product Of A Human Immune InterferonDNAgENE In Chinese Hamster Ovary Cells，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80，4654-4659(1983)；G Urlaub & L.A.Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.77，4216-4220(1980)。

可用于本发明的表达载体包含至少一个表达调控序列，该调控序列与将要表达的DNA序列或片段可操作地连接。所述调控序列***载体以便控制并调节所克隆的DNA序列的表达。可用的表达调控序列的实例如 lac***， trp***， tac***， trc***，λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域，酵母酸性磷酸酶的糖酵解启动子(如Pho5)，酵母α接合因子的启动子，以及来源于多形瘤、腺病毒、逆转录病毒、和猿猴病毒的启动子(如SV40的早期和晚期启动子)，以及其它已知可以控制原核和真核细胞和它们的病毒的基因表达的序列，或其组合。

在载体的构建中，通过简便快捷的分析就可区分包含异源DNA的载体和未经修饰的载体，这也是有利的。这些分析中可以使用的报道***包括报道基因，其他可检测的标记(它们产生可以定量的颜色变化)，抗生素抗性等。一种优选的载体中使用了β-半乳糖苷酶报道基因，该基因通过在X-gal平板上有蓝色表型的克隆来检测。这便于进行选择。一个实施方案中，β-半乳糖苷酶基因被编码多角体蛋白的基因所代替，该基因通过用X-gal染色使克隆呈现白色表型而检测。这种蓝-白颜色选择可用做检测重组载体的有用标记。

一旦选定，就可按照常规方法从培养物中分离载体，如冻融抽提，然后纯化。

为了进行表达，可将包含本发明DNA和调控信号的载体***或转化至宿主或宿主细胞中。可用于表达的宿主细胞包括众所周知的原核和真核细胞。合适的原核宿主包括，如大肠杆菌，如大肠杆菌，S G-936，大肠杆菌HB101，大肠杆菌W3110，大肠杆菌X1776，大肠杆菌X2282，大肠杆菌，DHT，和大肠杆菌MR01，假单胞菌属，芽孢杆菌属，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，以及链霉菌属(Streptomyces)。合适的真核细胞包括酵母和其它真菌、昆虫、动物细胞，如组织培养中的COS细胞，CHO细胞，人的细胞。

基于所使用的宿主，用适合于所述细胞的标准技术进行转化。对于原核细胞或包含细胞壁实质的其它细胞，可使用钙处理方法(Cohen，S NProceedings，National Academy of Science，USA 69 2110(1972))。对于不具有这种细胞壁的哺乳动物细胞，优选Graeme和Van Der Eb的磷酸钙沉淀法(Virology 52：546(1978))。酵母中的转化可用Van Solingen等(J.Bact.130：946(1977))和Hsiao等(Proceedings，National Academy of Science，76：3829(1979))的方法进行。

当用合适的载体转化了选定的宿主后，通过培养宿主细胞，可产生所述被编码的多肽或肽，通常是融合蛋白的形式。本发明的多肽或肽可通过上述快速分析来检测。然后根据需要回收并纯化这些多肽或肽。回收和纯化可利用本领域任何已知方法进行，如吸附于阴离子交换树脂，并随后洗脱。这种产生本发明多肽或肽的方法组成了本发明的另一方面。

用本发明载体转化的宿主细胞也形成本发明的又一方面

此外，与本发明的核苷酸序列和氨基酸序列基本相同的核苷酸或肽也可以应用在优选的实施方案中。这里所述的“基本相同”是指两种序列，当它们通过GAP或BESTFIT(核苷酸和肽)用默认的缺口权重进行对比排列时，或者通过计算机算法BLASTP(肽)或BLAST X(核苷酸)计算时，共享至少60％，优选75％，最优选90-95％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置是由保守氨基酸取代产生的不同。例如，具有类似的化学特性如荷电性或极性的氨基酸的取代不太可能影响蛋白的特性。实例包括用谷氨酰胺取代天冬酰胺，或者用谷氨酸取代天冬氨酸。

本文所用术语“变体”是指与本发明的序列“基本相同”的核苷酸、多肽和肽序列。这种变体可能源自对天然核苷酸或氨基酸序列的修饰(如***、取代或缺失一个或多个核苷酸或氨基酸)，或者也可能是天然产生的变体。术语“变体”还包括，与本发明序列在定义为2x SSC 65℃的标准条件下，或优选在定义为6x SSC 55℃的严格条件下，能进行杂交的同源序列，只要所述变体能调节雌性哺乳动物的***率。当需要这种变体时，适当改变天然DNA的核苷酸序列。这种改变可通过DNA的合成或通过对天然DNA的修饰来实施，如通过位点特异性诱变或盒式诱变。优选用本领域的标准技术，对cDNA或基因组DNA上需要序列修饰的部分，进行位点特异性引物介导的诱变。

术语“蛋白或多肽”是指由本发明核酸分子编码的蛋白，包括具有相同生物活性(即调节***的能力)的片段、突变体和同系物。本发明的蛋白或多肽可从天然来源分离，通过重组核酸分子的表达产生，或者化学合成。

本发明另一方面提供了突变的GDF-9B多肽在调节哺乳动物***率方面的应用，所述多肽具有图3a或3b所示的氨基酸序列，或这些序列的具有与其基本相同的活性的变体或片段。

所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的突变型或野生型GDF-9B或其抗体或抗原，或其变体。

优选地，对***率的调节包括：给予针对突变的GDF-9B的配体或抗原，以降低内源性突变型GDF-9B的水平，从而在雌性哺乳动物中诱导不育。

本发明另一个方面提供了能与本发明多肽结合的配体。更普遍的，所述配体是一种抗体。应理解术语“抗体”包括保留了与本发明所述多肽结合的能力的抗体片段或类似物，包括但不限于Fv，F(ab)₂片段，scFv分子等等。抗体可以是多克隆或单克隆的，优选单克隆抗体。在部分实施方案中，配体可以是噬菌体展示分子。

本发明另一方面提供了一种组合物，它至少包含本发明的多肽以及可药用或兽用的载体或稀释剂。当然，可在该组合物中包含不止一种的本发明多肽。

本发明还有一方面提供了一种试剂盒，它可鉴定携带有单拷贝的本发明突变型GDF-9B核酸分子(杂合型)的雄性和雌性哺乳动物，和/或携带有两个拷贝的本发明突变型GDF-9B核酸分子(纯合型)的雌性哺乳动物，所述试剂盒包含：

·用于扩增GDF-9B的合适区域的引物对；并任选一或多种

·用于扩增(如PCR扩增)的缓冲盐溶液；

·脱氧核苷酸混合物；

·热稳定性DNA聚合酶；

·来自被检测物种的对照DNA；

·合适的标准物；

·适当的检测***，其可以包含每对带有荧光标记或其它标记的引物中的一种，或用于检测产物的带有标记的探针；和

·扩增以及对扩增产物后续检测的说明和方案以及对结果的解释。

本发明还提供了一种试剂盒，用于检测哺乳动物中循环的突变型GDF-9B蛋白。这种试剂盒可包含本领域技术人员熟悉的标准ELISA或酶免疫分析试剂盒；例如，这种试剂盒可包含特异性针对突变的DF-9B蛋白的抗体，以及用于增强该信号的标准第二抗体放大组分。所述抗体可与荧光标记或放射性标记或发光标记偶联，或可对所述第二抗体进行标记。也可应用合适的溶液，对照，缓冲液，说明及方案。

现在将提供本发明的实施例，所述实施例并非是作为对本发明的限制。

动物

本项研究所测试的动物，有的来自位于Invermay Agricultural Centre和Woodlands Research Station的AgResearch Inverdale饲养群，还有的来自Mr Arnold Gray，Orawia，Southland(Gray和Davis，1995)可供出售的群体。

所有携带Inverdale的动物都是最初的Inverdale母羊(A281)的后代，正是在该母羊中首次发现了Inverdale基因。

表型测量

通过腹腔镜检查来确定母羊的携带状态，从而鉴别不育的II型母羊，或者通过***率来区分I+携带者与++非携带者。

公羊的携带状态可以根据它们的后代的***率来确定。自从在II型母羊中发现不育的卵巢后，一种更快速检测公羊后代的方法得到应用，该方法使每只公羊与7-10只I+母羊交配，然后对6月龄的后代进行腹腔镜检。只要发现不育的II型后代，就可以将该公羊确认为携带者。这样做的目的是保证每只公羊产生5只后代，因为在一个只有5只后代的样本中，产生IY公羊(没有带条纹(streak)卵巢的后代)的可能性仅0.031(Davis等1994)。

DNA纯化和测序

从每只动物的5-10ml全血中的白细胞中纯化DNA(Montgomery和Sise，1990)。对所有亚克隆和PCR产物的测序由Otago大学基因研究中心(University of Otago Centre for Gene Research)提供的商业服务(ABI 373自动测序仪)完成。

DNA标记

能扩增绵羊DNA的微卫星(二核苷酸重复单元)标记由上述AgResearch Molecular Biology Unit开发(Galloway等，1996)，或来自牛和绵羊的基因作图库。如前所述将新的标记定位在绵羊的X染色体上(Galloway等，1996)。

对绵羊GDF-9B基因产物的PCR扩增和限制性消化

使用聚合酶链式反应(PCR)的标准条件扩增基因组DNA。引物可根据人和小鼠的序列来设计(Galloway等，2000)，经证实它们成功地从绵羊DNA中扩增得到基因片段。含有单核苷酸突变的PCR产物用市售限制酶Spel，BsrSI和/或Xbal按照厂商建议的标准条件进行消化。PCR产物和限制性片段化产物通过在2-3％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离来鉴定，同时在凝胶上进行电泳的还有市售DNA分子量标志。

测序以及对突变进行检测的方法

我们对PCR片段的所有三种基因型(Inverdale FecX+，Hanna FecXH和野生型FecX)中的绵羊GDF-9B基因进行了测序(Galloway等，2000)，测序在ABI 373测序仪上完成。我们通过对至少6只携带每一种等位基因(Fecx^I，FecX^H和FecX⁺)的动物的基因组DNA中覆盖完整编码区的序列进行测定，证实了单碱基取代。除了FecX^H或FecX^I碱基取代(图2a和2b)，在绵羊GDF-9B基因中仅测出另一种变异，即在某些动物的信号序列中L10或L11的位置上缺失一个Leu密码子(CTT)(碱图4和5)。所述Leu缺失与FecX^H或FecX^I等位基因无关，与品种(breed)有关。FecX^H C→T取代致使BsrSI限制性位点(actg/gn)丢失，但获得SpeI位点(a/ctagt)。我们证实：在FecX^H/FecX^H母羊和FecX^H/Y公羊中，跨越该区域的一段541 bp的PCR片段经SpeI切割，产生了476和65 bp片段，但在FecX^I和野生型动物中并非如此，由此证实了上述碱基取代。在每种等位基因都有一个拷贝的绵羊(FecX^I/FeX^H)中，鉴定了所有三种片段(541，476和65bp)。类似地，在FecX^I和野生型动物出现了BsrSI切割片段，但在FecX^H携带者中没有。使用引物：

#12(GAAGTAACCAGTGTTCCCTCCACCCTTTTCT)；和

#13(CATGATTGGGAGAATTGAGACC))

从FecX^I携带者的DNA产生了一段154bp的PCR产物，该产物产生了一个强制性XbaI位点。XbaI(t/ctaga)可以切割携带A等位基因(tctaga)的FecX^I/FecX^I母羊和FecX^I/Y公羊的PCR产物，但不能切割携带T等位基因(tctagt)的野生型或FecX^H的PCR产物。因此，XbaI通过除去仅出现在FeeX^I携带者中的30个核苷酸的引物#12，而将154bp的PCR产物切割为124bp的片段。所有限制性消化都按照厂家说明在PCR产物的等份试样上进行，片段在3％FMC Metaphor琼脂糖凝胶上分离。

连锁作图的方法

我们如前所述(Galloway等，1996)，用CRIMAP，通过多点分析，构建了绵羊X染色体遗传连锁图谱，并对另外几个遗传标记MAOA，McM551，OarMP1，和TIMPI进行了定位(Galloway等，2000)。FecX^I和GDF-9B被定位在雌性Inverdale连锁作图家族中，通过使9只雄性携带者(FecX^I/Y)与雌性野生型交配，产生62个杂合型FecXI/FecX⁺雌性第二代，就得到该家族。这62只雌性动物与10只FecX^I/Y雄性动物交配，得到96个纯合型FecX^I/FecX^I或杂合型FecX^I/FecX⁺雌性后代。我们通过腹腔镜检确定Inverdale动物的携带状态，以便鉴定不育的FecX^I/FecX^I母羊，通过对雌性后代进行子孙测试和腹腔镜检来鉴定FecX^I/Y公羊。出身通过遗传标记来证实，在第三代中选出的所有FecX^I/FecX⁺雌性动物都是FecX^I/FecX^I不育的雌性动物的同胞(sibling)。未能从第一代收集到野生型雌性动物的DNA。我们根据基因编码区中的T→A突变对GDF-9B进行作图。

结果

测序结果

对Inverdale和Hanna中编码完整成熟肽的基因组DNA的PCR片段进行了测序。所测序的区域还包括位于外显子2中的原肽的绝大部分(从距离人/小鼠内含子/外显子3’侧70个碱基之处至tga终止密码子以外30个碱基)。将来自这两个绵羊品系的GDF-9B序列与野生型绵羊的序列进行比较。测序数据表明，在GDF-9B成熟肽中有两种不同的单碱基取代，其中一种出现在Inverdale品系中，另一种出现在Hanna品系中(图2)。

在Hanna动物中，位于成熟肽加工位点远端的第67位的核苷酸C是T。这使密码子CAG(编码谷氨酰胺(G))变成TAG(编码终止信号)，从而产生截短的成熟蛋白(图3b)。

在Inverdale动物中，位于成熟肽加工位点远端的第92位的核苷酸T变成A，使密码子GTC(缬氨酸(G))变成(天冬氨酸(D))(图3a)。

单个碱基取代的验证

通过对至少6个携有每种基因型(Inverdale，Hanna和野生型非携带者)的动物进行测序，验证了这些单碱基取代。每一动物测序至少一次(表1)。在这组动物中，野生型动物中未发现Inverdale取代或Hanna取代，Hanna动物中未发现Inverdale取得，反之亦然。

表1

对Inverdale和Hanna动物中单个碱基取代的测序鉴定。

所有动物具有已知品系的已知基因型(+＝野生型等位基因，I＝Inverdale等位基因，H＝Hanna等位基因，Y＝Y-染色体)。数字表示来自该动物的单个序列鉴定出相应序列变异的次数。

Hanna Inverdale

基因型动物编号 Cag(wt) Tag gTc(wt) gAc

IY公羊 667 2 2

IY公羊 3432 1 1

II母羊 2663 1 1

HY公羊 9513 3 3

HY公兰 4864 1 1

HH母羊 7133 2 2

HI母羊 7141 2 2 2 2

HI母羊 4865 1 1 1 1

H+母羊 7151 1 1 1

I+母羊 2682 1 1 1+Y罗姆尼羊 7610 2 2++罗姆尼羊 2884 2 2++罗姆尼羊 2958 2 2+Y罗姆尼羊 1079 1 1+Y美利奴羊 100 2 2++美利奴羊 121 1 1

限制酶搜索研究表明，Hanna碱基取代在其附近产生SpeI酶切割位点(a/ctagt)并除去BsrSI(actg/gn)位点。这些切割位点如下证实：SpeI能将HY和HH动物中跨该区域的541bpPCR片段切割成476bp和65bp的片段，但在IY和+Y动物中却不是如此。在携带一个拷贝的Inverdale基因和一个拷贝的Hanna基因的绵羊(HI)中，541bp和476bp的片段都可以找到。

类似地，研究显示BsrS1切割来自IY和+Y动物的片段，但不切割来自HY动物的片段，HI绵羊则显示这两种带。

Inverdale碱基取代未能在该取代位点产生或除去任何酶解位点，因此制备了一种强制性RFLP引物，它在Inverdale等位基因的PCR产物中而不是在野生型中导入XbaI切割位点(t/ctaga)。含有导入的XbaI位点的PCR产物仅在出现Inverdale A突变的情况下产生，在Hanna或野生型动物中不产生。在这种情况下，所述PCR产物被XbaI切割，去除30个碱基，导致最终产物的长度改变。

Inverdale DNA链..TTTCAAGACAGCTT..

30b PCR引物末端-tttct

在PCR终产物中产生XbaI切割位点tctaga

应用该方法，来自2HY，1 HH，2+Y和3++动物的PCR片段不被XbaI切割，而来自36II和12IY动物的PCR片段被切割。一例HI动物和47例I+动物显示，切割的和未切割的片段都有，预计为杂合型动物。

测序及突变的检测

我们使用针对人、小鼠和绵羊的序列设计的引物(Galloway等，2000)，对绵羊GDF-9B基因的cDNA和基因组DNA序列进行了测序。绵羊基因与人、小鼠和大鼠的基因类似(Laitinen等，1998；Dube等，1998；Aaltonen等，1999；Jaatinen等，1999)，都具有TGFβ超家族其它成员的典型基因特征。这一全长1179bp的序列编码393个氨基酸的前原肽(图4)，它包括被近5.4kb的内含子分隔的两个外显子。25个氨基酸的预测的信号肽位于244个氨基酸的原区之前，125个氨基酸的推定的C末端成熟肽区域不包括RRAR蛋白酶切割位点。绵羊编码区在核苷酸水平上与人的编码区有82.9％的同源性，与小鼠的有78.8％的同源性，与大鼠的有78.4％的同源性。

我们还对Inverdale(FecX^I)和Hanna(FecX^H)携带者的基因组DNA进行了测序(图5)。FecX^H携带者的成熟肽编码区第67位核苷酸上的C→T转换，导致在第23位氨基酸(未经加工的蛋白质中第291位残基)处，由一个提前终止密码子取代了谷氨酸(Q)。FecX^H携带者的成熟肽这么早就提前截短，则很可能导致GDF-9B功能的完全丧失。在FecX^I携带者的成熟肽的第92位核苷酸处，出现与此不同的T→A转换。这一突变使得第31位的残基(未经加工的蛋白质上第299位残基)由缬氨酸(V)变为天冬氨酸(D)。这种FecX^I突变是所述蛋白质的高度保守区域中的一个非保守转换。来自不同物种的所有其它TGFβ超家族成员在该位置仅包含保守的疏水氨基酸缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸(图6)。

对绵羊GDF-9B作图

为了定位FecX^I，我们制作了绵羊X-染色体的遗传连锁图谱(Galloway等，1996)，并将FecX^I定位在绵羊X染色体中心区上间隔10cM的侧翼标志之间(图7)。在三代共177个动物中发现了Inverdale表型的连锁关系，其中最多有96次指示性(informative)雌性减数***。连锁作图表明，FecX^I位于包含TIMPI和MAOA的区域(与人的Xpl1.2-11.4同线)，而不位于包含PHIA1，XIST和ATP7A的区域(人Xq13)。通过绵羊中位于OarMP1附近的断裂点可将这两组基因归属到人和小鼠X染色体上的不同同线(syntenic)组。GDF-9B经作图定位于人Xpl1.2以及小鼠X染色体的同线区(Dube等，1998；Aaltonen等，1999)。我们在作图中将绵羊GDF9B定为与在我们的Inverdale图谱中的FecX^I一样的10cM间隔，在78例共-信息(co-informative)雌性减数***中，未发现FeX^I表型与BMP15的重组体，参见表2。

表2

FeX^I与绵羊X染色体上的基因和标志的连锁标志重组体数共-信息减数*** 重组分数(θ) Lod评分(雌性)TGLA68 7 176 0.17 4.20MAOA 2 143 0.15 1.49McM551 9 196 0.07 11.61GDF-9B 0 213 0 23.18TIMP1 0 177 0 12.34TGLA54 0 170 0 10.54OarMPI 1 206 0.01 18.79ATP7A 1 147 0.08 2.08XIST 2 148 0.13 2.20PHKA1 4 176 0.08 8.47OarAE133 5 211 0.07 14.57

对Inverdale图谱中FecX^I表型的CRIMAP两点连锁分析

在野生型和FeX^I绵羊编码TIMP1的DNA之间未发现显著的序列差异，在其它FecX^I携带者中鉴定并发(subsequent)重组体的工作，排除了TIMP1作为FecX^I候选者的可能。

使用分离的多肽和抗体来控制***

通过大肠杆菌产生成熟的GDF-9B蛋白，其含有如SEQ ID No：10所示的野生型序列，通过化学方法使其与匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)偶联，将这种抗原在弗氏完全佐剂(FCA)中的制剂给10只非发情期的罗姆尼母羊(0.4mg/只母羊)皮下注射(sc)。另外9只罗姆尼母羊仅注射(sc)KLH在FCA中的制剂作为对照(0.4mg/只母羊)。然后，每隔一个月，对所有动物加强注射抗原(0.2mg/母羊KLH-GDF9B或0.2mg/母羊KLH)在Span，Tween，油佐剂中的制剂。当这些母羊进入繁殖季节时(大概是在初次免疫接种的3-4个月后)，通过切除了输精管并配了带有标记的挽具的公羊检查出一些有发情行为的母羊，对这些母羊进行腹腔镜检，以便观察卵巢表面的黄体(corpora lutea)(即，***部位)。10只接受KLH-GDF-9B处理的母羊中的7只，以及所有9只接受KLH处理的母羊都显示有发情行为。在显示发情行为的KLH-GDF9B免疫组和KLH免疫组绵羊中，平均***率见表3。

表3

在使用匙孔嘁血蓝(KLH)或偶联有KLH的大肠杆菌表达型GDF9B抗原反复免疫后，表现发情行为的绵羊中的平均***率

处理组	几何平均***率(95％置信区间)	表现发情行为的绵羊的数量
处理组	几何平均***率(95％置信区间)	表现发情行为的绵羊的数量	KLH	1.4(1.2，1.7)	9
KLH-GDF9B	4.5(2.7，7.5)	7	KLH	1.4(1.2，1.7)	9

KLH-GDF-9B动物相比于KLH对照动物，***率显著增加(p＜0.001)ANOVA，

表明发情的KLH-GDF-9B动物中***率的增加与抗体对GDF-9B的应答有关的+证据见表4

表4

在使用KLH或偶联有KLH的大肠杆菌来源的GDF9B成熟肽对母绵羊反复免疫之前或之后，绵羊血浆中的平均(范围)抗体水平。表中所示数值是在490nm处的吸光值，它代表了针对GDF-9B的抗体的水平。

处理组	免疫前	免疫
处理组	免疫前	免疫	KLH	＜0.3	＜0.3
KLH-GDF-9B(大肠杆菌表达的成熟蛋白)	＜0.3	1.932(1.454-2.613)	KLH	＜0.3	＜0.3

将绵羊血浆稀释为1∶5000后，通过ELISA测定抗体水平。ELISA法包括，将96孔板用100ng/孔大肠杆菌表达的全长GDF-9B包被，经适当的封闭处理并连续洗板后，用100μl稀释的绵羊血浆和100μl试验缓冲液温育。用绵羊血浆温育后，洗板数次，加入兔抗绵羊HRP，37℃1小时。然后洗板，用邻苯二胺加过氧化氢显色，用硫酸终止显色。

在另一项证实绵羊GDF-9B的功能性变体能影响卵泡发育的研究中，10只雌性小鼠腹膜内(ip)免疫大肠杆菌来源的绵羊GDF-9B成熟蛋白(0.2mg)在FCA(0.22ml)中的制剂，另外10只雌性小鼠用牛α-乳清蛋白(0.2mg)在FCA(0.22 ml ip)中的制剂免疫，作为对照。然后，用相应抗原在Span/Tween/油中的混合物，以2周的间隔，加强免疫3次(第1次0.1mg，第2次和第3次0.05mg)，末次加强免疫的1周后，处死动物。将卵巢固定在Bouin′s含水固定剂中，进行形态度量学分析(morphometric analysis)。用***性随机取样方法测定卵巢前囊(preantral)和卵巢囊(antral)中正在发育的卵泡的总数。数据见表5。

表5

小鼠用绵羊GDF9B或牛α-乳清蛋白免疫后，卵巢前囊和卵巢囊中卵泡的平均数量

处理组	前囊状或囊状卵泡	卵泡的几何平均数(95％置信区间)
处理组	前囊状或囊状卵泡	卵泡的几何平均数(95％置信区间)	牛α-乳清蛋白	前囊状	329(291，371)
囊状	80(55，115)			前囊状	329(291，371)
囊状	80(55，115)	GDF9B		前囊状	261(233，292)
囊状	84(57，124)			前囊状	261(233，292)

The number of preantral follicles in the GDF9B处理组小鼠的前囊状卵泡数显著低于牛α-乳清蛋白处理组小鼠的，p＜0.005(ANOVA)。这两种处理组的小鼠在囊状卵泡数方面没有显著性差异。

表明前囊状卵泡数的差异与抗体对GDF-9B的应答有关的证据如下。小鼠经反复免疫后，稀释至1∶50,000的血清中平均(范围)抗体水平是2.18(1.28-2.90)，而所有用α-乳清蛋白免疫的小鼠没有应答(即＜0.1)。抗体水平用ELISA法检测，以490nm处的吸光值表示。

在另一项研究中，我们通过给予与绵羊GDF-9B肽序列对应的抗原，而在受体动物中诱导不育。为获得不育性，我们合成了一段15个氨基酸的肽序列，它对应于突变的野生型绵羊GDF-9B成熟区的一种变体，它还带有一个可以与匙孔嘁血蓝(KLH)偶联成抗原的C-末端半胱氨酸。我们所用的肽序列是：SEVPGPSREHDGPESC。在此项研究中，给10只非发情期的罗姆尼母羊注射0.4mg/只母羊的KLH-GDF-9B肽抗原在弗氏完全佐剂中的制剂，9只非发情期的罗姆尼母羊注射0.4mg/母羊KLH抗原作为对照组。然后，每隔一个月，用抗原在Span/Tween/油中的混合物加强免疫(sc)6次(0.2mg/母羊，每次)，每周用切除了输精管的公羊监控发情行为2-3次。在末次加强免疫之前一周左右，通过腹腔镜检评价***率。

所有9只KLH处理组母羊表现出有规律的周期性发情行为，而10只KLH-GDF-9B肽处理组母羊中，仅有1只表现出发情行为。KLH对照组母羊的***率的几何平均值(以及95％置信区间)为1.5(1.1，1.9)，而9只未发情的KLH-GDF-9B肽处理组母羊的***率为0.1例有发情行为的KLH-GDF-9B肽处理组母羊的***率为5。这些数据明确表明，通过给予抗体或突变的GDF-9B抗原或其变体，可以诱导不育。

在未显示发情的9只KLH-GDF-9B(16体)(即15体+c-末端半胱氨酸)肽(SEQ ID NO：11)处理组动物中，对***的诱导与抗体对GDF-9B的应答有关，这方面的证据见表3c。

表6

母羊反复用KLH或与KLH偶联的GDF-9B 16体肽免疫之前或之后，血浆中平均(范围)抗体水平。数值表示在490nm的吸光值，代表了GDF-9B抗体的水平

处理组	免疫前	免疫
处理组	免疫前	免疫	KLH	＜0.3	＜0.3
KLH-GDF-9B(16体肽)	＜0.3	2.392(1.085-3.000)	KLH	＜0.3	＜0.3

抗体水平用表4所述ELISA方法检测。

总之，上述结果表明，通过给予GDF-9B抗原，在接受抗原的动物体内产生抗体，可改变卵泡的活力，并因此影响对***率的调节。

针对突变进行的DNA检验

GDF-9B基因的序列变体可通过各种方法确定，这些方法是本领域技术人员熟知的，它们被设计成特别用于鉴定等位基因之间的差异。尤其是，这些方法可用于鉴定Inverdale(FecX^I)和Hanna(FecX^H)单核苷酸多态性(SNP)，即FecX^H携带者中的C→T转换以及FecX^I携带者中的T→A转换，但是这类方法也可应用于其它哺乳动物中可能出现的该基因的其它等位变体。样品可以来自DNA或直接来自点样在FTA纸上的全血孔或来自毛发或卵泡。

其中一种方法包括，用限制酶切割专门来自一种等位基因而不是另一种等位基因的DNA，或切割含有引物以及一种等位基因或另一种等位基因的PCR片段，其中所述引物被设计成包含一个切割位点。

FecX^H C→T取代导致BsrSI限制下位点(actg/gn)丢失，得到SpeI位点(a/ctagt)。我们通过证实：SpeI可将FecX^H/FecX^H母羊和FecX^H/Y公羊中横跨该区域的541bpPCR产物切割为476和65bp的片段，但不能切割FecX^I和野生型绵羊中的片段，从而证实了这一碱基取代。在每种等位基因有一个拷贝的绵羊(FecX^I/FecX^H)中，鉴定了所有三种片段(541，476和65bp)。类似地，BsrSI可切割FecX^I和野生型动物的片段，但不切割FecX^H携带者的片段。

使用引物：

#12(GAAGTAACCAGTGTTCCCTCCACCCTTTTCT)；和

#13(CATGATTGGGAGAATTGAGACC)

从FeX^I携带者的DNA得到154bp的PCR产物，该产物产生了一个强制性XbaI限制性位点。XbaI(t/ctaga)切割携带A等位基因(tctaga)的FecX^I/FecX^I母羊和FecX^I/Y公羊的PCR产物，但不切割携带T等位基因(tctagt)的野生型或FecX^H的PCR产物。因此，XbaI通过去除仅FecX^I携带者含有的30个核苷酸的引物#12，而将上述154bp的PCR产物切割为124bp的片段，见图8。

产物在含有溴化乙锭的3％FMC Metaphor琼脂糖凝胶上电泳，在紫外光下观察。

另一种SNP检测方法包括使用荧光标记的引物以及上述强制性RFLP方法，并在诸如ABI377等测序仪上观察产物。

另一种SNP检测方法包括使用Taqman等位基因鉴别方法或SnaPshot^TMddNTP引物延伸试剂盒(此处***说明书)。Taqman等位基因鉴别法应用了探针技术，该项技术利用AmpliTaq GoldDNA聚合酶的5′-3′核酸酶活性，从而能通过释放荧光性报道分子直接检测PCR产物。在等位基因鉴别试验中用到了两种探针，它们分别对每种等位基因，并分别含有不同的报道分子染料。Snapshot***根据对未标记的寡核苷酸引物进行的双脱氧单核苷酸(荧光标记)延伸反应来检测单核苷酸多态性(SNP)。另一种SNP检测法应用了质谱测定数，其中在有双脱氧核苷酸存在时，围绕SNP或突变的区域通过PCR扩增，寡核苷酸引物通过上述SNP或突变得到延伸。SNP变体根据质量差异进行检测。

本领域技术人员显而易见，尽管为了清楚和便于理解的目的对本发明进行详细描述，仍然可以在不脱离本说明书和权利要求书公开的本发明的范围的前提下，可以对本文描述的实施方案和方法进行各种修改。

本文所引用的参考文献列举如下，它们都全文引入作为参考。

参考文献Aaltonen，J.，Laitinen，M.P.，Vuojolainen，K.，Jaatinen，R.，Horelli-Kuitnen，N.，Seppa，L.，Louhio，H.，Tuuri，T.，Sjoberg，J.，Butzow，R.，Hovata，O.，Dale，L.和Ritvos，O.(1999)人生长分化因子9和其同系物GDF-9b在早期卵泡发生期间***中的表达(Human growth differentiation factor 9(GDF-9)and its novelhomolog GDF-9b are expressed in oocytes during early folliculogenesis).临床内分泌学与代谢杂质(J.Clin Endocrinol Metab)84：2744-2750.Amer，P.R.，McEwan，J.C.，Dodds，K.G.和Davis，G.H.1998：绵羊中Inverdale生产力基因商业应用的成本受益分析(Cost benefit analysis ofcommercial use of the Inverdale prolificacy gene in sheep).新西兰社会动物生产学报(Proceedings of the New Zealand Society of Animal Production)58：157-160.Braw-Tal，R.，McNatty，K.P.，Smith，P.，Heath，D.A.Hudson，N.L.，Phillips，D.J.，McLeod，B.J.和David，G.H.1993：X-连锁的Inverdale基因(FecX¹)纯合的母羊卵巢缺乏次级和第三级卵泡却包含许多异常结构(The ovaries of eweshomozygouis for the X-linked Inverdale gene(FecX1)are devoid of secondaryand tertiarv follicles but contain many abnormal stmctures).生殖生物学(生殖生物学(Biology 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gene(FecX¹)).生殖生物学(Biology of reproduction)57：1183-1192.

序列表<110> 农业研究有限公司(Agresearch Limited)

苏珊，加洛韦(Galloway，Susan)

肯尼思，麦克纳蒂(McNatty，Kenneth)

乔治，戴维斯(Davis，George)

奥利，里特沃斯(Ritvos，Olli)<120> 与提高或降低哺乳动物***率有关的核苷酸序列<130> 30929X144<150> NZ 500844<151> 2000-05-05<160> 17<170> PatentIn version 3.0<210> 1<211> 778<212> DNA<213> 土耳其盘羊(Ovis aries)<220><221> CDS<222> (1)..(762)<220><221> mat_peptide<222> (388)..()<220><221> mutation<222> (479)..(479)<223> Inverdale中为核苷酸a而野生型中为核苷酸t，Inverdale中为密码子

gac而野生型中为密码子gt<220><221> misc feature<222> (376)..(387)<223> 弗林蛋白酶序列<220><221> misc_feature<222> (763)..(765)<223> 终止密码子<400> 1ctt cac cta act cat tcc cac ctc tcc tgc cat gtg gag ccc tgg 45Leu His Leu Thr His Ser His Leu Ser Cys His Val Glu Pro Trp

-125 -120 -115gtc cag aaa agc cca acc aat cac ttt cct tct tca gga aga ggc 90Val Gln Lys Ser Pro Thr Asn His Phe Pro Ser Ser Gly Arg Gly

-110 -105 -100tcc tca aag cct tcc ctg ttg ccc aaa act tgg aca gag atg gat atc 138Ser Ser Lys Pro Ser Leu Leu Pro Lys Thr Trp Thr Glu Met Asp Ile

-95 -90 -85atg gaa cat gtt ggg caa aag ctc tgg aat cac aag ggg cgc agg gtt 186Met Glu His Val Gly Gln Lys Leu Trp Asn His Lys Gly Arg Arg Val

-80 -75 -70cta cga ctc cgc ttc gtg tgt cag cag cca aga ggt agt gag gtt ctt 234Leu Arg Leu Arg Phe Val Cys Gln Gln Pro Arg Gly Ser Glu Val Leu

-65 -60 -55gag ttc tgg tgg cat ggc act tca tca ttg gac act gtc ttc ttg tta 282Glu Phe Trp Trp His Gly Thr Ser Ser Leu Asp Thr Val Phe Leu Leu

-50 -45 -40ctg tat ttc aat gac act cag agt gtt cag aag acc aaa cct ctc cct 330Leu Tyr Phe Asn Asp Thr Gln Ser Val Gln Lys Thr Lys Pro Leu Pro-35 -30 -25 -20aaa ggc ctg aaa gag ttt aca gaa aaa gac cct tct ctt ctc ttg agg 378Lys Gly Leu Lys Glu Phe Thr Glu Lys Asp Pro Ser Leu Leu Leu Arg

-15 -10 -5agg gct cgt caa gca ggc agt att gca tcg gaa gtt cct ggc ccc tcc 426Arg Ala Arg Gln Ala Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser

-1 1 5 10agg gag cat gat ggg cct gaa agt aac cag tgt tcc ctc cac cct ttt 474Arg Glu His Asp Gly Pro Glu Ser Asn Gln Cys Ser Leu His Pro Phe

15 20 25caa gac agc ttc cag cag ctg ggc tgg gat cac tgg atc att gct ccc 522Gln Asp Ser Phe Gln Gln Leu Gly Trp Asp His Trp Ile Ile Ala Pro30 35 40 45cat ctc tat acc cca aac tac tgt aag gga gta tgt cct cgg gta cta 570His Leu Tyr Thr Pro Asn Tyr Cys Lys Gly Val Cys Pro Arg Val Leu

50 55 60cac tat ggt ctc aat tct ccc aat cat gcc atc atc cag aac ctt gtc 618His Tyr Gly Leu Asn Ser Pro Asn His Ala Ile Ile Gln Asn Leu Val

65 70 75agt gag ctg gtg gat cag aat gtc cct cag cct tcc tgt gtc cct tat 666Ser Glu Leu Val Asp Gln Asn Val Pro Gln Pro Ser Cys Val Pro Tyr

80 85 90aag tat gtt ccc att agc atc ctt ctg att gag gca aat ggg agt atc 714Lys Tyr Val Pro Ile Ser Ile Leu Leu Ile Glu Ala Asn Gly Ser Ile

95 100 105ttg tac aag gag tat gag ggt atg att gcc cag tcc tgc aca tgc agg 762Leu Tyr Lys Glu Tyr Glu Gly Met Ile Ala Gln Ser Cys Thr Cys Arg110 115 120 125tgacggcaaa ggtgca 778<210> 2<211> 254<212> PRT<213> 土耳其盘羊(Ovis aries)<220><221> misc_feature<222> (376)..(387)<223> 弗林蛋白酶序列<220><221> misc_feature<222> (763)..(765)<223> 终止密码子<400> 2Leu His Leu Thr His Ser His Leu Ser Cys His Val Glu Pro Trp

-125 -120 -115Val Gln Lys Ser Pro Thr Asn His Phe Pro Ser Ser Gly Arg Gly

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-80 -75 -70Leu Arg Leu Arg Phe Val Cys Gln Gln Pro Arg Gly Ser Glu Val Leu

-65 -60 -55Glu Phe Trp Trp His Gly Thr Ser Ser Leu Asp Thr Val Phe Leu Leu

-50 -45 -40Leu Tyr Phe Asn Asp Thr Gln Ser Val Gln Lys Thr Lys Pro Leu Pro-35 -30 -25 -20Lys Gly Leu Lys Glu Phe Thr Glu Lys Asp Pro Ser Leu Leu Leu Arg

-15 -10 -5Arg Ala Arg Gln Ala Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser

-1 1 5 10Arg Glu His Asp Gly Pro Glu Ser Asn Gln Cys Ser Leu His Pro Phe

15 20 25Gln Asp Ser Phe Gln Gln Leu Gly Trp Asp His Trp Ile Ile Ala Pro30 35 40 45His Leu Tyr Thr Pro Asn Tyr Cys Lys Gly Val Cys Pro Arg Val Leu

50 55 60His Tyr Gly Leu Asn Ser Pro Asn His Ala Ile Ile Gln Asn Leu Val

65 70 75Ser Glu Leu Val Asp Gln Asn Val Pro Gln Pro Ser Cys Val Pro Tyr

80 85 90Lys Tyr Val Pro Ile Ser Ile Leu Leu Ile Glu Ala Asn Gly Ser Ile

95 100 105Leu Tyr Lys Glu Tyr Glu Gly Met Ile Ala Gln Ser Cys Thr Cys Arg110 115 120 125<210> 3<211> 778<212> DNA<213> 土耳其盘羊(Ovis aries)<220><221> CDS<222> (1)..(453)<220><221> mat_peptide<222> (388)..()<220><221> mutation<222> (454)..(454)<223> Hanna中为核苷酸t而野生型中为核苷酸c，Hanna中为密码子

tag而野生型中为密码子ca<220><221> misc_feature<222> (376)..(387)<223> 弗林蛋白酶序列<220><221> misc_feature<222> (454)..(456)<223> 提前终止密码子<400> 3ctt cac cta act cat tcc cac ctc tcc tgc cat gtg gag ccc tgg 45Leu His Leu Thr His Ser His Leu Ser Cys His Val Glu Pro Trp

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20 25 30ttc cag cag ctg ggc tgg gat cac tgg atc att gct ccc cat ctc tat 144Phe Gln Gln Leu Gly Trp Asp His Trp Ile Ile Ala Pro His Leu Tyr

35 40 45acc cca aac tac tgt aag gga gta tgt cct cgg gta cta cac tat ggt 192Thr Pro Asn Tyr Cys Lys Gly Val Cys Pro Arg Val Leu His Tyr Gly

50 55 60ctc aat tct ccc aat cat gcc atc atc cag aac ctt gtc agt gag ctg 240Leu Asn Ser Pro Asn His Ala Ile Ile Gln Asn Leu Val Ser Glu Leu65 70 75 80gtg gat cag aat gtc cct cag cct tcc tgt gtc cct tat aag tat gtt 288Val Asp Gln Asn Val Pro Gln Pro Ser Cys Val Pro Tyr Lys Tyr Val

85 90 95ccc att agc atc ctt ctg att gag gca aat ggg agt atc ttg tac aag 336Pro Ile Ser Ile Leu Leu Ile Glu Ala Asn Gly Ser Ile Leu Tyr Lys

100 105 110gag tat gag ggt atg att gcc cag tcc tgc aca tgc agg tgacggcaaa 385Glu Tyr Glu Gly Met Ile Ala Gln Ser Cys Thr Cys Arg

115 120 125ggtgca 391<210> 6<211> 125<212> PRT<213> 土耳其盘羊(Ovis aries)<220><221> misc_feature<222> (376)..(378)<223> 终止密码子<400> 6Gln Ala Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser Arg Glu His1 5 10 15Asp Gly Pro Glu Ser Asn Gln Cys Ser Leu His Pro Phe Gln Asp Ser

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65 70 75Ser Glu Leu Val Asp Gln Asn Val Pro Gln Pro Ser Cys Val Pro Tyr

80 85 90Lys Tyr Val Pro Ile Ser Ile Leu Leu Ile Glu Ala Asn Gly Ser Ile

95 100 105Leu Tyr Lys Glu Tyr Glu Gly Met Ile Ala Gln Ser Cys Thr Cys Arg110 115 120 125<210> 11<211> 16<212> PRT<213> 土耳其盘羊(Ovis aries)<400> 11Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser Arg Glu His Asp Gly Pro Glu Ser Cys1 5 10 15<210> 12<211> 206<212> DNA<213> 土耳其盘羊(Ovis aries)<220><221> CDS<222> (1)..(204)<223> 突变周围Inverdale GDF9B核苷酸序列的亚型<220><221> mutation<222> (86)..(86)<223> Inverdale突变的位置<400> 12ggc agt att gca tcg gaa gtt cct ggc ccc tcc agg gag cat gat ggg 48Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser Arg Glu His Asp Gly1 5 10 15cct gaa agt aac cag tgt tcc ctc cac cct ttt caa gac agc ttc cag 96Pro Glu Ser Asn Gln Cys Ser Leu His Pro Phe Gln Asp Ser Phe Gln

20 25 30cag ctg ggc tgg gat cac tgg atc att gct ccc cat ctc tat acc cca 144Gln Leu Gly Trp Asp His Trp Ile Ile Ala Pro His Leu Tyr Thr Pro

35 40 45aac tac tgt aag gga gta tgt cct cgg gta cta cac tat ggt ctc aat 192Asn Tyr Cys Lys Gly Val Cys Pro Arg Val Leu His Tyr Gly Leu Asn

50 55 60tct ccc aat cat gc 206Ser Pro Asn His65<210> 13<211> 68<212> PRT<213> 土耳其盘羊(Ovis aries)<400> 13Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser Arg Glu His Asp Gly1 5 10 15Pro Glu Ser Asn Gln Cys Ser Leu His Pro Phe Gln Asp Ser Phe Gln

20 25 30Gln Leu Gly Trp Asp His Trp Ile Ile Ala Pro His Leu Tyr Thr Pro

35 40 45Asn Tyr Cys Lys Gly Val Cys Pro Arg Val Leu His Tyr Gly Leu Asn

50 55 60Ser Pro Asn His65<210> 14<211> 206<212> DNA<213> 土耳其盘羊(Ovis aries)<220><221> CDS<222> (1)..(60)<223> 突变周围Hanna GDF9B核苷酸序列的亚型<220><221> mutation<222> (61)..(61)<223> Hanna突变的位置<400> 14ggc agt att gca tcg gaa gtt cct ggc ccc tcc agg gag cat gat ggg 48Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser Arg Glu His Asp Gly1 5 10 15cct gaa agt aac tagtgttccc tccacccttt tcaagtcagc ttccagcagc 100Pro Glu Ser Asn

20tgggctggga tcactggatc attgctcccc atctctatac cccaaactac tgtaagggag 160tatgtcctcg ggtactacac tatggtctca attctcccaa tcatgc 206<210> 15<211> 20<212> PRT<213> 土耳其盘羊(Ovis aries)<400> 15Gly Ser Ile Ala Ser Glu Val Pro Gly Pro Ser Arg Glu His Asp Gly1 5 10 15Pro Glu Ser Asn

20<210> 16<211> 1519<212> DNA<213> 帚尾袋貂(Trichosurus vulpecula)<220><221> Intron<222> (1)..(712)<220><221> CDS<222> (713)..(1519)<220><221> mat_peptide<222> (1178)..()<220><221> exon<222> (713)..(1519)<220><221> misc_feature<222> (1166)..(1177)<223> 弗林蛋白酶序列<400> 16tttgtttatc tatgtcccaa atattttttt ctccttttgg agcaaatgca aaggaaaggg 60acttagctgg tgaagaatca gggtaggttg gaacacccac taaggaaagt gaaactatag 120aaagagcact aggtctggac ctgggttaga atcctgtctt tgccacatct tagccgtgta 180accttaggca agtggcttaa cttctctggg ccttcatttt atcttctgta aaatgagaca 240tttccaactg tggtctccat gcatttgcat tagctgttcc ctgtgcctgg aatgccctcc 300ctcctttgtg tctcagaatc cttaatcttt cttctatctt cttttcttct cttcccctac 360ttcccagtta ctactgctct ctccctcctc aaatcacatt atgctgttct tacccattcg 420cacattatcg gattccaatc ctgctctctg cacggccccc cacccccggt agaacatgag 480cttcttgaag gccaggcttg tttttcctct ctatggtgcc tgacatatac aggagcttaa 540taaacacttg ttgaccagat agtgtggagc tggctttgag ggggaagtga acctccccct 600aattggtcat ttatgatgcc aagggagaag gcctaacaga actcttctct tggtcaggtg 660ggttgggaag ctgacattct gttcttctta ccaccttcat tttctctgtg ca ggt 715

Gly

-155ccc tgg tat gtg caa acc cta gac ttc cca ctt cgg cca aac cgt 760Pro Trp Tyr Val Gln Thr Leu Asp Phe Pro Leu Arg Pro Asn Arg

-150 -145 -140gac atg gac cat ctg gtg agg gcc gct gtt gct tac cgc cct cgc 805Asp Met Asp His Leu Val Arg Ala Ala Val Ala Tyr Arg Pro Arg

-135 -130 -125ctc cgc cta tct cac tcc cat ctt tcc tgc cat gtg gaa ccc tgg 850Leu Arg Leu Ser His Ser His Leu Ser Cys His Val Glu Pro Trp

-120 -115 -110gcc cac aag agc acc atc ctc ctg gga gga ggc tcc cca ggc ttt gct 898Ala His Lys Ser Thr Ile Leu Leu Gly Gly Gly Ser Pro Gly Phe Ala

-105 -100 -95ttg ccg gag gcc tgg gca gaa atg gat ctc acc aat tac att cag cag 946Leu Pro Glu Ala Trp Ala Glu Met Asp Leu Thr Asn Tyr Ile Gln Gln

-90 -85 -80caa gtt cag cct caa aag ggg agg aga gtc ctt cac atc caa gtc agg 994Gln Val Gln Pro Gln Lys Gly Arg Arg Val Leu His Ile Gln Val Arg

-75 -70 -65tgt cag cag caa gaa agg aca gag att ggc ctt ggg tgg agg cag gcc 1042Cys Gln Gln Gln Glu Arg Thr Glu Ile Gly Leu Gly Trp Arg Gln Ala

-60 -55 -50ttg gct act gac act gct ttc ctg gtt ctg tat ttc aac aat acc ttt 1090Leu Ala Thr Asp Thr Ala Phe Leu Val Leu Tyr Phe Asn Asn Thr Phe-45 -40 -35 -30aaa agt gtg cca cga atg gag ctg cca gaa ctt ctg gtg ggg gac cct 1138Lys Ser Val Pro Arg Met Glu Leu Pro Glu Leu Leu Val Gly Asp Pro

-25 -20 -l5gag gga gcc gat ctc ctt tcc ctg gcc cgg cga gtc cgt cag gtg ggc 1186Glu Gly Ala Asp Leu Leu Ser Leu Ala Arg Arg Val Arg Gln Val Gly

-10 -5 -1 1cct gta agg tct gaa gca cct ggc cag tca ctg gag cag aca cag tgt 1234Pro Val Arg Ser Glu Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Gln Thr Gln Cys

5 10 15tct ctc cat cct ttc cag gtt agc ttc cac cag ctg ggc tgg gag aac 1282Ser Leu His Pro Phe Gln Val Ser Phe His Gln Leu Gly Trp Glu Asn20 25 30 35tgg atc att gcc ccc cat ctg tac agc cca aac tac tgc aag ggg gcc 1330Trp Ile Ile Ala Pro His Leu Tyr Ser Pro Asn Tyr Cys Lys Gly Ala

40 45 50tgt cca cgg gtg cta cac tct ggc ctc cga tca ccc aac cat gcc atc 1378Cys Pro Arg Val Leu His Ser Gly Leu Arg Ser Pro Asn His Ala Ile

55 60 65att cag aac ctt atc aac gag ctg gtg gat aga agc atc ccc cga ccc 1426Ile Gln Asn Leu Ile Asn Glu Leu Val Asp Arg Ser Ile Pro Arg Pro

70 75 80tca tgc gtc cct tac aag tac atg ccc att agt gtc ctg ctg att gag 1474Ser Cys Val Pro Tyr Lys Tyr Met Pro Ile Ser Val Leu Leu Ile Glu

85 90 95gcc agt ggc agc atc ctg tac aaa gaa tat gag gac atg att gcc 1519Ala Ser Gly Ser Ile Leu Tyr Lys Glu Tyr Glu Asp Met Ile Ala100 105 110<210> 17<211> 269<212> PRT<213> 帚尾袋貂(Trichosurus vulpecula)<220><221> misc_feature<222> (1166)..(1177)<223> 弗林蛋白酶序列<400> 17Gly Pro Trp Tyr Val Gln Thr Leu Asp Phe Pro Leu Arg Pro Asn-155 -150 -145Arg Asp Met Asp His Leu Val Arg Ala Ala Val Ala Tyr Arg Pro-140 -135 -130Arg Leu Arg Leu Ser His Ser His Leu Ser Cys His Val Glu Pro-125 -120 -115Trp Ala His Lys Ser Thr Ile Leu Leu Gly Gly Gly Ser Pro Gly-110 -105 -100Phe Ala Leu Pro Glu Ala Trp Ala Glu Met Asp Leu Thr Ash Tyr Ile-95 -90 -85 -80Gln Gln Gln Val Gln Pro Gln Lys Gly Arg Arg Val Leu His Ile Gln

-75 -70 -65Val Arg Cys Gln Gln Gln Glu Arg Thr Glu Ile Gly Leu Gly Trp Arg

-60 -55 -50Gln Ala Leu Ala Thr Asp Thr Ala Phe Leu Val Leu Tyr Phe Asn Asn

-45 -40 -35Thr Phe Lys Ser Val Pro Arg Met Glu Leu Pro Glu Leu Leu Val Gly

-30 -25 -20Asp Pro Glu Gly Ala Asp Leu Leu Ser Leu Ala Arg Arg Val Arg Gln-15 -10 -5 -1 1Val Gly Pro Val Arg Ser Glu Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Gln Thr

5 10 15Gln Cys Ser Leu His Pro Phe Gln Val Ser Phe His Gln Leu Gly Trp

20 25 30Glu Asn Trp Ile Ile Ala Pro His Leu Tyr Ser Pro Asn Tyr Cys Lys

35 40 45Gly Ala Cys Pro Arg Val Leu His Ser Gly Leu Arg Ser Pro Asn His50 55 60 65Ala Ile Ile Gln Asn Leu Ile Asn Glu Leu Val Asp Arg Ser Ile Pro

70 75 80Arg Pro Ser Cys Val Pro Tyr Lys Tyr Met Pro Ile Ser Val Leu Leu

85 90 95Ile Glu Ala Ser Gly Ser Ile Leu Tyr Lys Glu Tyr Glu Asp Met Ile

100 105 110Ala

Claims

1.一种分离的突变的GDF-9B核酸分子，包含选自下组的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，或SEQ ID NO：7；

b)能在严格条件下与a)所述分子杂交的序列；

c)一种序列，其为a)所定义的分子的功能性变体或片段；

d)与a)，b)或c)所定义的分子互补的序列；以及

e)对应于a)-d)中任一项所述分子的反义序列。

2.用于在哺乳动物中借助DNA来筛选增加的***或不育特性的遗传标记，它包括下述核酸分子，该核酸分子与权利要求1所述核苷酸序列特异性杂交，或与编码GDF-9B突变基因的基因组DNA特异性杂交，或与相关于GDF-9B突变基因的基因组DNA特异性杂交。

3.权利要求2的遗传标记，其中所述哺乳动物选自人、绵羊、牛、山羊、鹿、马、camelids、负鼠、猪、小鼠、大鼠、兔、野兔、鼬鼠、雪貂、猫和狗。

4.能与权利要求1所述核苷酸序列特异性杂交的探针。

5.能与权利要求1所述核苷酸序列特异性杂交的引物。

6.包含权利要求1所述核酸分子的载体。

7.包含权利要求1所述核酸分子的构建体。

8.被权利要求6或7所述载体或构建体转化的宿主细胞。

9.一种分离的多肽，包含选自下组的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8；或

b)如a)所述的序列的功能性变体或片段。

10.一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或其功能性片段或变体。

11.一种分离的核酸分子，其编码权利要求9的多肽。

12.一种鉴别携带有编码GDF-9B的突变核酸分子的哺乳动物的方法，该方法包括如下步骤：

(i)从所述哺乳动物获得组织或血液样品；

(ii)从该样品中分离DNA；并任选

(iii)从步骤(i)获得的DNA中分离GDF-9B DNA；

(iv)用与权利要求1或11所述突变的GDF-9B DNA互补的探针探测上述DNA；

(v)扩增所述突变的GDF-9B DNA的量；和/或

(vi)确定从步骤(ii)获得的GDF-9B DNA序列是否携带与不育、或***的增加或减少有关的突变。

13.权利要求12的方法，其中所述哺乳动物为雄性或雌性，并携带所述突变的GDF-9B核酸分子的单个拷贝。

14.权利要求13的方法，其中所述哺乳动物是雌性，并携带所述突变的GDF-9B核酸分子的两个拷贝。

15.权利要求12-14中任一项的方法，其中所述哺乳动物选自人、绵羊、牛、山羊、鹿、马、camelids、负鼠、猪、小鼠、大鼠、兔、野兔、鼬鼠、雪貂、猫和狗。

16.一种调节雌性哺乳动物***率的方法，该方法包括给予该哺乳动物有效量的选自下组的制剂：

a)权利要求9的多肽，或

b)权利要求10的多肽。

17.一种增加雌性哺乳动物***率的方法，所述哺乳动物不携带突变的GDF-9B核酸分子，所述方法包括给予该哺乳动物有效量的权利要求9的多肽。

18.一种增加不育的雌性哺乳动物的***率的方法，所述哺乳动物携带突变的GDF-9B核酸分子的两个拷贝，所述方法包括给予该哺乳动物有效量的权利要求10的多肽。

19.一种在雌性哺乳动物中增加或减少***率或诱导不育的方法，包括给予有效量的选自下组的制剂，从而抑制该突变型或野生型GDF-9B多肽的生物学活性：

a)免疫有效量的野生型或突变型GDF-9B多肽，其含有权利要求9或10的氨基酸序列；

b)一种反义核酸分子，它针对编码野生型或突变型GDF-9B多肽的核酸，所述多肽包括权利要求9或10的氨基酸序列；

c)一种配体，它与含有权利要求9或10所述氨基酸序列的野生型或突变型GDF-9B多肽结合，或者是所述多肽的抗原。

20.权利要求18或19的方法，其中所述雌性哺乳动物选自：人、绵羊、牛、山羊、鹿、马、camelids、负鼠、猪、小鼠、大鼠、兔、野兔、鼬鼠、雪貂、猫和狗。

21.一种组合物，它含有有效量的权利要求9的多肽，以及一种可药用或兽用的载体或稀释剂。

22.一种组合物，它含有有效量的选自下组的制剂，以及一种可药用或兽用的载体或稀释剂：

a)一种野生型或突变型GDF-9B多肽，它含有权利要求9或10所述氨基酸序列；

b)一种反义核酸分子，它针对(a)所述的多肽；

c)一种配体，它与(a)所述多肽结合，或者是该多肽的抗原。

23.一种配体，其与权利要求9所述多肽结合。

24.权利要求23的配体，其中所述配体是抗体或含有抗原结合区的抗体片段。

25.权利要求24的配体，其中所述配体为单克隆抗体。

26.权利要求24的配体，其中所述配体是噬菌体展示分子。

27.权利要求1的核酸分子的用途，用于鉴定哺乳动物个体中与***增加、***减少或不育有关的序列变体。

28.一种用于鉴定携带突变型GDF-9B核酸分子的哺乳动物的试剂盒，该试剂盒包含：

a)用于扩增GDF-9B合适区域的引物对；和任选地，下述一项或多项

b)用于DNA扩增的缓冲液；

c)脱氧核苷酸混合物；

d)用于DNA扩增的工具；

e)来自待测物种的对照DNA；

f)适当的标准；以及

g)检测***。

29.一种分离的核酸分子，它含有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列，或其功能活性片段或变体。

30.一种分离的功能性变体多肽，它如SEQ ID NO：11所示。

31.一种分离的核酸分子，它含有SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14所示核酸序列，或上述任一种序列的功能性片段或变体。

32.一种分离的多肽，它如SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15所示，或者是上述任一种序列的功能性片段或变体。

33.一种分离的核酸分子，它含有SEQ ID NO：16所示核苷酸序列，或其功能性片段或变体。

34.一种分离的多肽，它具有SEQ ID NO：17所示氨基酸序列，或其功能性片段或变体。

35一种在负鼠中降低***率或诱导不育的方法，包括给予有效量的权利要求34的多肽。

36.一种分离的核酸分子，基本上参照本文中任何实施例和/或附图而如本文所述。

37.一种分离的多肽，基本上参照本文中任何实施例和/或附图而如本文所述。

38.一种载体，它***了本发明分离的核酸分子，基本上参照本文中任何实施例和/或附图而如本文所述。

39.一种与本发明多肽结合的配体，基本上参照本文中任何实施例和/或附图而如本文所述。

40一种鉴定携带突变型核酸分子的哺乳动物的方法，基本上参照本文中任何实施例和/或附图而如本文所述。

41.一种调节雌性哺乳动物***率的方法，基本上参照本文中任何实施例和/或附图而如本文所述。

42.一种组合物，基本上参照本文中任何实施例和/或附图而如本文所述。

43.本发明的核酸分子在鉴定变体序列方面的应用，基本上参照本文中任何实施例和/或附图而如本文所述。

44.一种鉴定携带突变型GDF-9B核酸分子的哺乳动物的试剂盒，基本上参照本文中任何实施例和/或附图而如本文所述。