CN1464057A - 具有骨骼肌刺激活性和免疫调节作用的趋化素样因子超家族 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新的具有骨骼肌刺激活性和免疫调节作用的趋化素样因子超家族的核苷酸序列与氨基酸序列，生产趋化素样因子超家族的方法及含有趋化素样因子超家族的载体与宿主细胞。本发明还涉及趋化素样因子超家族成员的抗体，含有趋化素样因子超家族的药物组合物，以及拮抗剂和激活剂。本发明的趋化素样因子超家族的多核苷酸和多肽在治疗肌肉萎缩或其它退行性病变，造血***疾病和/或免疫***疾病方面具有重要意义。

Description

具有骨骼肌刺激活性和免疫调节作用的趋化素样因子超家族

技术领域

本发明涉及细胞因子。更具体地说，本发明涉及新的具有骨骼肌刺激活性和免疫调节作用的趋化素样因子超家族的核苷酸序列与氨基酸序列，生产趋化素样因子超家族的方法及含有趋化素样因子超家族的载体与宿主细胞。本发明还涉及趋化素样因子超家族的抗体，含有趋化素样因子超家族的药物组合物，以及拮抗剂和激活剂。本发明进一步涉及趋化素样因子超家族的多核苷酸和多肽在制备肌肉萎缩或其它退行性病变，造血***疾病和/或免疫***疾病的药物组合物中的应用。

发明背景

细胞因子是由细胞合成并分泌的在机体的生理和病理过程中发挥重要作用的小分子多肽的总称。细胞因子包括白细胞介素、集落刺激因子、干扰素、肿瘤坏死因子、生长因子和趋化因子等。

细胞因子具有多种生理功能：它们可以调节机体的免疫功能，参与细胞的增殖与分化，促进血管内皮细胞增殖和新生血管生成，在抗肿瘤和抗微生物感染方面也具有重要意义。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，人们对细胞因子及其受体的结构功能有了更深入的了解，利用基因工程技术生产的重组细胞因子及其拮抗剂已经作为药物用于临床，并取得良好疗效。如髓样造血祖细胞抑制因子1(MPIF-1)作为造血保护剂用于肿瘤大剂量放、化疗中，有望成为新一代的生物工程药物(MarshallA，HGS Launches“first”genomics product in clinic.Nat Biotechnol 1998，16：129)。这提示细胞因子在肿瘤、造血功能障碍性疾病、自身免疫性疾病等疑难病症的治疗中具有广阔的应用前景。

趋化因子(chemokine，又称趋化素)，是一类结构相似，分子量8-12KD，具有细胞趋化作用的小分子多肽，它们在机体的免疫防御、免疫调节、炎症反应、造血调节、血管生成等方面具有重要作用。

趋化素样因子(chemokine-like factor，CKLF)是由本发明人最先克隆成功并命名的细胞因子。功能研究发现，CKLF1具有广谱的趋化活性和增殖刺激活性(参见国际申请：PCT/CH00/00026)，而CKLF2是CKLF的全基因产物，编码152个氨基酸。

发明简述

在本发明中，本发明人进一步公开了CKLF2的功能，并在CKLF2的蛋白和核酸序列基础上，利用NCBI的blastp、blastn及tblast数据库，成功得到了其它8个趋化素样因子超家族成员的新基因，经检索，这8个新基因编码的蛋白质为新序列。下文称为趋化素样因子相关蛋白1-8(chemokine-like factor related protein1-8，CKLF-RP1-8)。新的CKLF-RP1-8及CKLF2共同构成了本发明所说的“趋化素样因子超家族”，简称CKLF超家族，其具有骨骼肌刺激活性和免疫调节作用。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种分离的核苷酸序列，其包含新的具有骨骼肌刺激活性和免疫调节作用的趋化素样因子超家族的核苷酸序列或其片段，所述核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA。

本发明优选一种分离的核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：5、SEQID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17所示的多核苷酸或其片段。

本发明还提供了与趋化素样因子超家族的多核苷酸杂交，并且与之具有至少70％同源性的多核苷酸。

本发明提供含有趋化素样因子超家族的多核苷酸序列的载体。

本发明提供含有趋化素样因子超家族的载体的宿主细胞，其可以经所述载体转化、转染或转导得到。

本发明提供了用基因工程手段生产本发明趋化素样因子超家族的成熟多肽的方法。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了含有趋化素样因子超家族的氨基酸序列。

本发明还提供了趋化素样因子超家族的的变异体、类似物、衍生物或活性片段。

本发明还包括对本发明趋化素样因子超家族成员的多肽或其片段具有特异性的多克隆和单克隆抗体。

本发明还提供一种药物组合物，其含有本发明的趋化素样因子超家族成员或其活性片段，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明提供了一种拮抗剂，其可以抑制或封闭本发明的趋化素样因子超家族的或其片段的生物活性。

本发明提供了一种激活剂，其可以激活本发明的趋化素样因子超家族或其片段的生物活性。

此外，本发明进一步提供本发明的趋化素样因子超家族的多核苷酸和多肽在制备治疗肌肉萎缩或其它退行性病变，造血***和/或免疫***疾病的药物组合物中的应用。

附图简述

图1显示趋化素样因子超家族成员之间的保守氨基酸序列。

图2显示趋化素样因子超家族成员之间亲源性示意图。

图3显示趋化素样因子超家族成员的穿膜区结构示意图。

图4显示趋化素样因子超家族成员的染色体定位示意图。

图5显示趋化素样因子超家族成员的载体构建示意图。

图6A和图6B显示CKLF2引起小鼠肌母细胞系C2C12细胞形态的变化，其中图6A：C2C12/pcDB；图6B：C2C12/CKLF2，从图中可见，CKLF2促进C2C12细胞肌管形成。

图7A-图7D显示四种不同方法研究CKLF2对C2C12细胞的促增殖作用的结果，其中图7A.细胞计数法；图7B.MTT法；图7C.细胞周期研究；图7D.H3掺入实验。

图8显示CKLF2促进C2C12细胞特异分子MCK的活性。

图9显示CKLF2促进C2C12细胞分化特异转录因子Myogenin表达。其中

1：C2C12/pcDB诱导分化1天；2：C2C12/pcDB诱导分化2天；

3：C2C12/pcDB诱导分化3天；4：C2C12/pcDB诱导分化4天；

5：C2C12/CKLF2诱导分化1天；6：C2C12/CKLF2诱导分化2天；

7：C2C12/CKLF2诱导分化3天；8：C2C12/CKLF2诱导分化4天。

图10A-图10C显示CKLF-RP2的组织表达谱，其中图10A：1.分子量标准，2.骨骼肌，3.脑，4.肾脏，5.骨髓，6.肝脏，7.心脏；图10B：1.分子量标准，2.***癌，3.肠癌，4.肺腺癌，5.乳腺癌，6.卵巢；图10C：1.分子量标准，2.胎儿胸腺，3.胎儿骨骼肌，4.胎脾，5.胎肝，6.胎心。

图11显示CKLF-RP2对Hela细胞的促增殖作用。

图12A和图12B显示CKLF-RP2对脾细胞的促增殖作用，其中图12A：pcDB空载体注射小鼠；图12B：pcDB-CKLF-RP2注射小鼠。

发明详述

本发明是通过如下技术方案实现的：发明人在人CKLF2的蛋白和核酸序列基础上，利用生物信息学方法成功克隆了大鼠和小鼠CKLF2序列，它们与人CKLF2有相似的结构和功能。在人和小鼠CKLF2的蛋白和核酸序列基础上，利用蛋白质数据库和人的表达序列标签(Expression Sequence Tag，简称EST)进行数据检索和同源性比较，通过EST Assembly machine(网址为 http：∥www.tigem.it)进行EST拼接，根据全长cDNA序列设计特异的引物，并选择高表达相应基因的单链cDNA文库进行扩增，成功分离并克隆了其它8个趋化素样因子超家族成员的新基因。经检索，这8个趋化素样因子超家族成员的蛋白质为新序列。根据它们被发现的先后顺序及与CKLF2的亲源性不同，分别被命名为趋化素样因子相关蛋白1-8(CKLF-RP1-8)。

新的CKLF-RP1-8及本发明人以前公开的CKLF2共同构成了本发明所说的“趋化素样因子超家族”。本发明的趋化素样因子超家族具有骨骼肌刺激活性和免疫调节作用。

CKLF-RP1-8和CKLF2在蛋白质一级序列上有明显的同源性，有相似的穿膜结构，而且在染色体上紧密连锁(参见实施例一)，这符合基因超家族的特征。现在的研究发现，很多基因家族如：趋化因子，defensin等基因家族成员在染色体上成基因簇形式出现，在一级结构上有同源性，而且有相似的功能。基因家族成员在一级结构上同源性不高，但少数关键氨基酸相同即可以具有相同的空间结构，而蛋白质的空间结构对于维持蛋白质的功能更为重要。

CKLF2和CKLF-RP1-8与A4分化蛋白有同源性(A4分化蛋白在结肠上皮细胞的分化过程中高表达，具有调控细胞增殖和分化的作用)。这种同源性分析是用NCBI的BlastP检索功能发现的，这种序列同源性比较的结果是国际认可的。CKLF2和CKLF-RP1-8与A4分化蛋白的同源性在22.4％-33％之间。

根据本发明的一个方面，本发明提供了含有编码趋化素样因子超家族的分离的多核苷酸序列或其片段，所述多核苷酸序列包括cDNA、基因组DNA及RNA。

本发明趋化素样因子超家族的多核苷酸序列包括趋化素样因子相关蛋白1-8的多核苷酸序列和CKLF2的多核苷酸序列。

本发明的CKLF-RP1-8和CKLF2的多核苷酸序列可以分别编码如SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQID NO：14，SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18所示的成熟多肽，也可以包括上述成熟多肽的编码序列和附加编码序列，还可以包括上述成熟多肽的编码序列和非编码序列，例如内含子、编码序列5’或3’端的非编码序列等。上述多核苷酸序列的片段也应包含在本发明范围内。这些片段可以用作引物或者杂交探针，用于检测编码本发明的趋化素样因子超家族的多核苷酸序列。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体。多核苷酸的变异体可以是天然存在的等位基因变异体、mRNA不同剪切变异体或非天然存在的变异体。这些变异体与本发明趋化素样因子超家族成员可以在功能上相同、相似或不同，但最好是编码与其生物学活性基本相同的多肽。例如，本发明人目前已发现CKLF-RP1至少有4种不同的变异体，分别编码286，242，240和170个氨基酸，其中编码170个氨基酸的序列与CKLF超家族其它成员可比性最好，因此本专利以此为CKLF-RP1的代表(信号肽分析发现，四种不同大小的蛋白的信号肽切割位点相同即产生相同的成熟蛋白，因此可选其中之一作为代表)。CKLF-RP1的另外一种形式CKLF-H1-A编码149个氨基酸，其真核细胞转染上清能明显刺激骨髓细胞和淋巴细胞的增殖(详见专利公开号：CN1283693A)。每一个给定基因可以不具有，具有1个，或者多个等位基因变异体，其可以带有核苷酸取代、***或加入，但实质上没有改变所编码多肽的功能的多核苷酸的可替代形式。

所述趋化素样因子超家族的多核苷酸序列最好是以分离形式提供的。本发明所述“分离的”是指该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列分离出来，还指该DNA或其片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

本发明的趋化素样因子超家族的多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA，DNA可以是双链或是单链形式，单链DNA可以是编码链或是非编码链(反义链)。本领域普通技术人员已知，反义链或者其一部分(反义寡核苷酸)可用于抑制细胞内本发明趋化素样因子超家族成员的表达。本发明的趋化素样因子超家族的核苷酸序列可以来自任何物种，特别是哺乳动物，包括牛、羊、猪、鼠、马，优选人类。

本发明优选一种分离的核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、或SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：17所示的多核苷酸或其片段。SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15或17所示的多核苷酸分别为编码本发明趋化素样因子超家族成员CKLF-RP1-8和CKLF2的cDNA序列，在Genbank中的登录号分别为：CKLF-RP1：AF278577；CKLF-RP2：AF479260；CKLF-RP3：AF479813；CKLF-RP4：AF479814；CKLF-RP5：AF479262；CKLF-RP6：AF479261；CKLF-RP7：AF479263；CKLF-RP8：AF474370；CKLF2：AF135380。

详细地说，本发明优选一种分离的包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的多核苷酸序列，其中，如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列来源于人睾丸cDNA文库，全长793个核苷酸，并包含编码CKLF-RP1蛋白的序列，(例如编码序列(CDS)：核苷酸128-640)和5’非编码区(核苷酸1-127)及3’非编码区(核苷酸441-793)。或者，更优选一种分离的核苷酸序列，其只包含编码CKLF-RP1蛋白序列，例如SEQ IDNO：1所示的编码序列：核苷酸128-640。

本发明优选一种分离的包含如SEQ ID  NO：3所示的核苷酸序列的多核苷酸序列，其中如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列来源于人睾丸cDNA文库，全长1065个核苷酸，包含编码CKLF-RP2蛋白的序列，(例如编码序列(CDS)：核苷酸153-899)和5’非编码区(核苷酸1-152)及3’非编码区(核苷酸900-1065)。或者，更优选一种分离的核苷酸序列，其只包含编码CKLF-RP2蛋白序列，例如SEQ ID NO：3所示的编码序列：核苷酸153-899。

本发明优选一种分离的多核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。其中如SEQ ID：5所示的核苷酸序列来源于人胎盘cDNA文库，全长1514个核苷酸，其包含编码CKLF-RP3蛋白的序列，(例如编码序列(CDS)：核苷酸75-623)和5’非编码区(核苷酸1-74)及3’非编码区(核苷酸624-891)。或者，更优选一种分离的核苷酸序列，其只包含编码CKLF-RP3蛋白序列，例如SEQ ID NO：5所示的编码序列：核苷酸75-623。

本发明优选一种分离的多核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。该SEQ ID：7所示的核苷酸序列来源于人脾脏cDNA文库，全长1118个核苷酸，其包含编码CKLF-RP4蛋白的序列，(例如编码序列(CDS)：核苷酸183-809)和5’非编码区(核苷酸1-182)及3’非编码区(核苷酸810-1118)。或者，更优选一种分离的核苷酸序列，其只包含编码CKLF-RP4蛋白序列，例如SEQ ID NO：7所示的编码序列：核苷酸183-809。

本发明优选一种分离的多核苷酸序列，其包含如SEQID NO：9所示的核苷酸序列。其中SEQ ID：9所示的核苷酸序列来源于人***癌cDNA文库，全长988个核苷酸，其包含编码CKLF-RP5蛋白的序列，(例如编码序列(CDS)：核苷酸191-661)和5’非编码区(核苷酸1-190)及3’非编码区(核苷酸662-988)。或者，个更优选一种分离的核苷酸序列，其只包含编码CKLF-RP5蛋白序列，例如SEQ ID NO：9所示的编码序列：核苷酸191-661。

本发明优选一种分离的多核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。其中SEQ ID：11所示的核苷酸序列来源于人***癌cDNA文库，全长1917个核苷酸，其包含编码CKLF-RP6蛋白的序列，(例如编码序列(CDS)：核苷酸123-674)和5’非编码区(核苷酸1-122)及3’非编码区(核苷酸675-1917)。或者，更优选一种分离的核苷酸序列，其只包含编码CKLF-RP6蛋白序列，例如SEQ ID NO：11所示的编码序列：核苷酸123-674。

本发明优选一种分离的多核苷酸序列，其包含如SEQ ID  NO：13所示的核苷酸序列。该SEQ ID：13所示的核苷酸序列来源于人胎盘cDNA文库，全长1177个核苷酸，其包含编码CKLF-RP7蛋白的序列，(例如编码序列(CDS)：核苷酸44-571)和5’非编码区(核苷酸1-143)及3’非编码区(核苷酸572-1177)。或者，更优选一种分离的核苷酸序列，其只包含编码CKLF-RP7蛋白序列，例如SEQ ID NO：13所示的编码序列：核苷酸44-571。

本发明优选一种分离的多核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。该SEQ ID：15所示的核苷酸序列来源于人扁桃体cDNA文库，全长1177个核苷酸，其包含编码CKLF-RP8蛋白的序列，(例如编码序列(CDS：核苷酸262-783)和5’非编码区(核苷酸1-261)及3’非编码区(核苷酸784-1177)其中，核苷酸17为n，表示目前尚不能确定该位置为何种核苷酸。或者，更优选一种分离的核苷酸序列，其只包含编码CKLF-RP8蛋白序列，例如SEQ ID NO：15所示的编码序列：核苷酸262-783。

本发明优选一种分离的多核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。该SEQ ID：17所示的核苷酸序列全长459个核苷酸，其包含编码CKLF2蛋白的序列，例如编码序列(CDS)：核苷酸1-459。

本领域普通技术人员已知，本发明的趋化素样因子超家族成员的核苷酸序列可以完全相同于如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQIDNO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17所示的编码序列，也可以由于遗传密码的简并性，不完全等同于上述核苷酸的编码序列。例如，根据每个具体的原核宿主或者真核宿主所使用的密码子的频率不同，可以选择相应的密码子，从而提高所述的多核苷酸在相应的宿主中表达效率。也可以为了获得比天然的核苷酸序列具有更好性能的多核苷酸，如更长的半衰期，转换密码子。

本发明还进一步涉及与本发明趋化素样因子超家族多核苷酸序列杂交的多核苷酸，条件是序列间存在至少有70％，更优选90％，最优选95％同源性的多核苷酸序列。特别涉及在严格条件下与本发明趋化素样因子超家族基因杂交的多核苷酸，所说的“严格条件”已知杂交发生在低于Tm(melting temperature，融解温度)5℃至低于Tm20-25℃的条件下。所述多核苷酸可以含有至少20个碱基，优选至少30个碱基并且更优选至少50个碱基与本发明趋化素样因子超家族成员的多核苷酸杂交且与之具有如上所述同源性，并且可以保留或不保留活性。例如，这样的多核苷酸可以用作本发明如SEQID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17所示的多核苷酸的探针，用于回收多核苷酸或用作诊断探针或PCR引物。

本发明的趋化素样因子超家族成员多核苷酸序列可以依据标准的PCR扩增技术将cDNA，mRNA或者基因组DNA作为模板，并选取合适的寡核苷酸引物扩增得到。这样得到核苷酸可以克隆进合适的载体中，并用DNA分析技术进行序列描述。也可以通过标准DNA合成技术得到，例如，使用可以按本领域熟知的固相亚磷酸酰胺三酯法在DNA合成仪上合成。

在本发明的一个优选实施方式中(参见实施例一)，CKLF-RP1-5，7，8的全长cDNA序列是以CKLF2蛋白质序列为基础，对蛋白质数据库和人的表达序列标签(EST)进行数据检索和同源性比较，通过EST Assembly machine(网址为http：∥www.tigem.it)进行EST拼接后，利用完整的读码框架设计特异引物，其中CKLF-RP6的全长cDNA序列参考NCBI释放的序列设计引物，并通过选择表达相应基因的单链cDNA文库，进行PCR扩增得到。

本发明公开了携带上述本发明趋化素样因子超家族多核苷酸序列的载体。这样的载体包括染色体、非染色体来源的或合成的DNA序列，例如SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒、杆状病毒以及病毒DNA(如牛痘病毒、腺病毒、家畜痘病毒)，条件是这些载体能够在所选择的宿主细胞中复制并存活。

可用各种已知的方法将适当的DNA序列***到载体的适当限制性核酸内切酶位点中。正向或者反向***到表达载体中的DNA序列被可操作地连接到适当的表达控制序列即启动子，以指导mRNA合成。这样的启动子的例子包括RSV、HIV、CMV或SV40启动子，大肠杆菌lac或trp启动子、噬菌体λPL启动子及在原核或真核细胞或其病毒中控制基因表达的其他启动子。此外，表达载体可含有启动翻译的核糖体结合位点及转录终止子，还可以包括用于扩增表达的合适序列。此外，载体优选含有一个或多个选择标志基因，以提供被转化的宿主细胞的可选择表型特征，如适用于真核细胞的新霉素抗性或二氢叶酸还原酶基因，或适用于大肠杆菌中的氨苄青霉素或四环素抗性基因。必要时，为了提高编码本发明趋化素样因子超家族成员的DNA在高等真核细胞中的转录效率，可在载体中***增强子序列。另外，必要时也可在启动子和下游结构序列之间***一个能指导翻译产物向周质或细胞外培养基中分泌的前导序列(分泌信号)。或者，可根据需要导入编码融合蛋白质的异源DNA序列，所说的融合蛋白可包括一个赋予所需特征，如用于稳定被表达之产物的或简化其纯化步骤的N未端识别肽。

具体地说，适用于原核细胞的市售表达载体一般均带有可选择标志和细胞复制原点，带有lacI、T7、λPL和trp等细菌启动子，以及已知克隆载体pBR322(ATCC37017)的其他遗传元件。这样的市售载体包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)。可根据所选用的适当启动子和待表达的结构基因序列来选择衍生于pBR322的适当载体。适用于真核细胞的载体带有真核细胞启动子如CMV、SV40等，这样的载体包括pMT-hIL-3(马大龙，狄春辉，庞健等(1991)高技术通讯11：26-29)、pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)，以及pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。在本发明的一个优选实施例中(参见实施例一)，本发明的趋化素样因子超家族的多核苷酸序列是利用将PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体中(Promega)进行纯化测序；在本发明的另一个优选实施例中(参见实施例二)，携带本发明的趋化素样因子超家族成员的载体是采用真核表达质粒pcDNA3-Myc-His(B)(Invitrogen)构建。

本发明提供了携带有本发明趋化样因子超家族基因的克隆载体或表达载体转导、转化或转染的宿主细胞。转导、转化或转染的方法包括本领域已知的病毒感染、氯化钙转染法、脂质体转染法、电穿孔法或微粒轰击法等。为了活化启动子、选择转化体或扩增所需的基因，可以在适当修饰的常规营养培养基中培养被转导、转染或转化的宿主细胞。培养中所使用的温度、pH等培养条件一般都是由所选用的表达特定蛋白质的宿主细胞决定的，并且这些条件都是本领域技术人员熟知的。

可使用任何适当的宿主细胞表达本发明的多核苷酸，可提到的适当宿主的例子有：原核细胞如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等；低等真核细胞如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇和中国家蚕细胞；植物细胞；高等真核细胞如哺乳动物细胞如CHO、COS细胞。哺乳动物表达***的例子包括人细胞系，如Hela、293和U937细胞系，以及COS、CHO和BHK细胞系。在本发明的优选实施例中(参见实施例一)，采用的原核宿主细胞为XL-1Blue菌，真核宿主为小鼠肌母细胞系C2C12细胞系(参见实施例三)，及Hela细胞系(参见实施例五)。

本发明还提供了一种生产多肽的方法，包括以下步骤：

(1)在适于表达的条件下，培养本发明趋化素样因子超家族的宿主细胞；

(2)从细胞培养物中获得所述载体携带的多核苷酸编码的多肽。

具体地说，在转化宿主细胞并在被转化的宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法(如温度变动或化学特质诱导)诱导启动子，然后继续培养。培养完成后，可用离心法收集细胞，并用任何已知的方法，如冻融法、超声处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。可以用各种已知的方法从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的趋化素样因子超家族成员及其变异体多肽，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、超滤法、离子交换层析法、磷酸纤维层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法及高压液柱层析法。

根据本发明的另一个方面，编码本发明的趋化素样因子超家族成员的核苷酸序列或其片段可以用作杂交探针，用于染色体鉴定。利用已知的技术，该序列可以特异地靶向某个特异的染色体或染色体的某个特定位点。这些技术包括荧光原位杂交(FISH)，荧光激活细胞分类术(FACS)或者构建人工染色体库例如，酵母人工染色体库，细菌人工染色体库，细菌P1构建库或染色体cDNA文库等(参见Price，C.M.(1993)Blood Rev.7：127-134，and Trask，B.J.(1991)Trends Genet.7：149-154.)。

在本发明的一个优选实施例中，利用本发明的趋化素样因子超家族成员的全长cDNA序列或其片段在NCBI HGP数据库中进行检索，分析其基因组成和染色体定位。如实施例一所示，CKLF2和CKLF-RP1-4位于16号染色体，而且紧密连锁，目前尚未发现其间有其它已知基因。CKLF-RP5位于14号染色体，CKLF-RP6，7，8在3号染色体上成基因簇形式出现(见图4)。基因组成分析发现，CKLF2和CKLF-RP1，2，6，8由4个外显子组成，CKLF-RP3，4，5，7由5个外显子组成(见表5)。

按照本发明，对本明的DNA进行染色体作图将这些序列与疾病相关基因联系起来的第一个重要步骤。一旦完成了序列的精确染色体定位作图，即可将该序列的物理位置与遗传图数据联系起来。然后通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传)来鉴定作图定位于同一染色体区域上的基因与疾病之间的关系。然后，可确定受损或未受损个体间的cDNA或基因组DNA的差异。如果在某些或全部受损个体中观察到突变，而正常个体中没有观察到这种突变，则该突变便很可能是致病因素。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了含有推定的趋化素样因子超家族成员的氨基酸序列，推定的趋化素样因子超家族成员的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2，SEQID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQID NO：12，SEQ IDNO：14，SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18所示。上述氨基酸序列的片段也应包含在本发明范围内。这样的多肽片段包含如SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18所示至少15个连续的氨基酸序列。

在本发明的一个优选实施例中，CKLF-RP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，全长170个氨基酸。prosite计算机软件分析，其具有4个跨膜区，分别位于氨基酸残基23-40，47-69，79-101，108-130。CKLF-RP-1具有典型的Cys-Cys结构特征(简称CC结构)，即保守的两个半胱氨酸相邻，如SEQID NO：2所示氨基酸残基124-125，其为大多数趋化素因子的结构特点。

在本发明的一个优选实施例中，CKLF-RP2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，全长248个氨基酸。prosite计算机软件分析，其具有4个跨膜区，分别位于氨基酸残基94-111，116-135，142-116，179-198。

在本发明的一个优选实施例中，CKLF-RP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，全长182个氨基酸。prosite计算机软件分析，其具有3个跨膜区，分别位于氨基酸残基61-83，103-122，132-151。

在本发明的一个优选实施例中，CKLF-RP4的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，全长208个氨基酸。prosite计算机软件分析，其具有4个跨膜区，分别位于氨基酸残基59-77，87-109，121-143，148-170。

在本发明的一个优选实施例中，CKLF-RP5的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，全长156个氨基酸。prosite计算机软件分析，其具有4个跨膜区，分别位于氨基酸残基35-56，60-82，95-114，119-136。

在本发明的一个优选实施例中，CKLF-RP6的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，全长183个氨基酸。prosite计算机软件分析，其具有4个跨膜区，分别位于氨基酸残基43-64，73-94，107-126，135-156。

在本发明的一个优选实施例中，CKLF-RP7的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，全长175个氨基酸。prosite计算机软件分析，其具有4个跨膜区，分别位于氨基酸残基40-59，69-91，103-125，145-167。

在本发明的一个优选实施例中，CKLF-RP8的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示，全长173个氨基酸。prosite计算机软件分析，其具有4个跨膜区，分别位于氨基酸残基46-68，78-100，113-130，140-162。

在本发明的一个优选实施例中，CKLF2的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，全长152个氨基酸。prosite计算机软件分析，其具有4个跨膜区，分别位于氨基酸残基24-40，45-67，74-96，106-128。

正如本领域技术人员已知，上述跨膜区优选一系列疏水氨基酸，例如亮氨酸，缬氨酸，丙氨酸等。

对本发明的趋化素样因子超家族蛋白进行序列分析，表明CKLF2与CKLF-RP1-8之间有保守的氨基酸序列(参见图1)；彼此之间有不同程度的同源性，CKLF2和CKLF-RP1具有典型的Cys-Cys(简称CC结构)的结构特征，而CKLF-RP2-8则不具备CC结构；进化树分析发现CKLF2与CKLF-RP1的亲源关系最近，而CKLF-RP3和CKLF-RP5的亲源关系最近(参见图2)。穿膜区分析发现，除了CKLF-RP3有3个潜在的穿膜区外，CKLF2和CKLF-RP1，2，4，5，6，7，8均为4次跨膜蛋白(参见表4)。染色体定位研究发现，CKLF2和CKLF-RP1-4在16号染色体上紧密连锁，CKLF-RP5定位于14号染色体，CKLF-RP6，7，8在3号染色体上成基因簇形式出现。因此，本发明的趋化素样因子超家族代表一个新基因超家族，CKLF-RP1-8与CKLF2不仅在蛋白质一级结构上具有同源性，而且有相似的穿膜区，体外和体内研究表明该超家族成员具有骨骼肌刺激活性和免疫调节作用。

本发明的趋化素样因子超家族的多肽可以是天然的，合成的，半合成的，或者重组产生。本发明的趋化素样因子超家族成员可按常规的生物工程方法由宿主细胞中的重组DNA序列编码产生多肽产物。也可按照Steward and Young(Steward，J.M.andYoung，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd Ed.，Pierce Chemical Company，Rockford，I11.，(1984))描述的方法用Appl ied Biosystem合成仪或PioneerTM肽合成仪按固相化学技术合成，或者可使用衍生于本发明的DNA构建体的mRNA，在无细胞翻译***中产生所需的蛋白质。

本发明同时提供了趋化素样因子超家族成员的变异体(variant)、类似物(mimetic)、衍生物(derivative)或活性片段。

这里所述“变异体”是指氨基酸序列具有一个或者多个改变。正如本领域普通技术人员已知，变异体可以具有“保守性”变化，即替换的氨基酸具有相似的结构和化学特性，例如，以异亮氨酸替换亮氨酸。在少数情况下，变异体也可以具有“非保守性”变化，例如，以色氨酸替换甘氨酸。变异体还可以包括氨基酸的缺失，或者***或者两者兼有。没有消除生物活性的氨基酸替换，***或者缺失可以利用领域已知的计算机软件分析，例如DNADNASTAR software。这里所述的变异体，优选与本发明的趋化素样因子超家族成员的氨基酸序列具有至少80％，更优选至少90％同源性的多肽。最优选与SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQID NO：18所示本发明的氨基酸序列具有95％同源性的多肽。“同源性”是通过多肽之间氨基酸序列的比较以及保守序列氨基酸残基的数量而确定的。

这里所述术语“类似物”是指其结构是由本发明趋化素样因子或其片段的结构发展而来，因此能够影响部分或者全部的与本发明的趋化素样因子超家族的作用。

这里所述“衍生物”可以指化学修饰的本发明趋化素样因子超家族，例如本发明多肽的氨基酸序列中的一个或多个残基带有烷基、酰基，或者氨基等取代基，也包括具有附加序列的、或与其它化合物融合的本发明趋化素样因子超家族。例如为了便于纯化，在本发明的侧翼融合其它的氨基酸残基，又如与聚乙二醇或脂质融合以提高多肽的半寿期。

所谓趋化素样因子的多肽片段是指具有部分或全部本发明趋化素样因子成员的多肽，它至少由20个氨基酸组成，优选由40个以上氨基酸组成，多肽片段最好具有基本上与本发明多肽相同或相似的生物活性。

本发明还涉及使用本发明的多核苷酸作为诊断试剂，检测突变形式的基因以诊断因体内本发明的趋化素样因子超家族成员表达不足或表达过量所导致的疾病或病理状态。

可用各种技术在DNA水平上检测携带趋化素样因子超家族成员基因突变的个体。可从病人的体液中，如血液、尿液、唾液或活体或尸检材料中得到用于诊断试验的核酸。可以使用基因DNA或RNA直接进行检测，也可以使用PCR方法(Saiki et al.，Nature324：163-166，1986)扩增DNA后再进行检测。可用直接DNA测序法分析参考基因和突变基因之间的序列差异。另外，也可利用克隆的DNA片段作为探针并结合PCR方法，以高敏感性和特异性来检测特定的DNA片段，例如可联合使用测序引物和由扩增的PCR产物产生的单链PCR产物或单链模板分子。

可以在含有或不含变性剂的凝胶，特别是高分辨率凝胶中检测DNA的电泳迁移率来完成基于DNA序列差异的遗传学试验。可在变性甲酰胺梯度凝胶上区分不同序列的DNA片段(如参见Myers et al.，Science 230：1242，1985)。另外，也可用核酸酶保护检测法或化学裂解法(如参见Cotton et al.，PNAS，USA，85：4397-4401，1985)揭示特定部位的序列改变。

本发明还涉及检测各种组织中趋化素样因子超家族成员蛋白质水平改变的诊断试验法。用于检测得自宿主体内样品中的趋化素样因子超家族成员蛋白质水平的检测法是本领域技术人员已知的，并包括放射免疫法、竞争性结合法、Western印迹分析法及酶联免疫吸附法(ELISA)。其中优选的方法是ELISA法。

本发明还包括对本发明趋化素样因子超家族成员的多肽或其片段具有特异性的多克隆和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里所述的“特异性”是指抗体能结合于本发明的趋化素样因子超家族基因产物或片段。优选那些能与本发明的趋化素样因子超家族的基因产物结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制本发明趋化素样因子超家族成员基因产物的抗体，也包括那些并不影响本发明趋化素样因子超家族成员功能的抗体。本发明还包括那些能本发明趋化素样因子超家族成员变异体、类似物、衍生物或活性片段结合的抗体。

上述抗体不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域普通技术人员已知的各种方法进行制备。例如，纯化的本发明趋化素样因子成员基因产物或其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达本发明的趋化素样因子超家族成员或具有其抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体优选单克隆抗体，其可利用杂交瘤技术制备(见Kohler等人，Nature 256：495；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T cell Hybridaomad，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的各类抗体可以利用本发明的趋化素样因子超家族基因产物或其片段或功能区，通过常规免疫技术获得，这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与本发明趋化素样因子成员的基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如，E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明还提供一种药物组合物，其含有本发明的趋化素样因子超家族成员或其活性片段，以及一种或多种药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。

“药物可接受的盐”指适于与人或动物的组织接触，而无过多的毒性、刺激、***反应等。药物可接受的盐是本领域熟知的。这种盐可以在本发明趋化素样因子超家族成员多肽的最终分离和纯化的过程中制备，也可以将游离的碱或酸与适当的有机或无机酸或碱反应单独制备。代表性酸加成盐包括但不限于乙酸盐、二己酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、3-苯基丙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。能用于形成药物可接受盐的优选的酸是盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。药物可接受的碱加成盐中的阳离子包括但不限于碱金属或碱土金属离子如锂、钠、钾、钙、镁和铝等，以及非毒性季铵阳离子如铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、二乙基胺、乙基胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。优选的碱加成盐包括磷酸盐、tris和乙酸盐。

本发明的趋化素样因子超家族成员蛋白可以与药物可接受的赋形剂或载体结合形成药物组合物。药物可接受的载体或赋形剂指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料。所述药物组合物适于胃肠外、舌下、脑池内、***内、腹膜内、直肠内、颊内、肿瘤内或表皮给药。胃肠外给药包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下、关节内注射和输注。适于胃肠外给药的药物组合物包括无菌水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于在临使用前在无菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。适宜的水性或非水性载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、羧甲基纤维素、植物油和可注射的有机酯如油酸乙酯。这些组合物还可以含有防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂等佐剂。加入等渗剂如糖类、氯化钠等可能是有利的。表皮给药包括在皮肤、黏膜上、以及在肺和眼的表面给药。这样的药物组合物包括粉剂、软膏、滴剂、透皮贴剂、离子电渗疗法装置以及吸入剂等。在适于吸入的组合物中，本发明趋化素样因子超家族成员被压缩或含于压缩气体如氮气或液化气体推进剂中。优选地，本发明趋化素样因子超家族成员不溶于液化推进介质中。直肠或***给药的组合物优选为栓剂，它可以通过将本发明的趋化素样因子超家族成员与适宜的非刺激性赋形剂或载体如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合制备，所述赋形剂或载体在室温为固态，在体温下为液态，因此在直肠或***腔内熔化并释放出活性化合物。

当以上述或其他方式进行治疗时，治疗有效量的本发明趋化素样因子超家族成员可以是本发明多肽的纯净形式、药物可接受的盐形式，或选择性使用药物可接受的赋形剂。对任何特定患者的具体治疗有效剂量取决于许多因素，包括所治疗的疾病和气其严重程度；所用具体化合物的活性；所用的特定组合物；患者的年龄、体重、性别、饮食和一般健康状况；给药时间；给药途径；具体化合物的***速度；治疗的持续时间联合或同时服用的其他药物等。例如，在局部给药时，本发明趋化素样因子超家族成员多肽总的日剂量为0.05-20mg/kg体重，在***给药时的日剂量为0.15-50mg/kg体重。因此，组合物的单一剂量形式可以含有构成日剂量的全部或其一部分的量。

本发明提供了一种拮抗剂，其可以抑制或封闭本发明的趋化素样因子超家族成员或其片段的生物活性，其可以包括蛋白，核酸，碳水化合物等。拮抗剂可以与一种或多种药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂结合形成药物组合物。

本发明提供了一种激活剂，其可以激活本发明的趋化素样因子超家族成员或其片段的生物活性。激活剂可以包括蛋白，核酸，碳水化合物，小分子，或者其它直接或者间接增强本发明趋化素样因子超家族成员或其片段的化合物或者组合物。激活剂可以一种或多种药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂结合形成药物组合物。

本发明还涉及本发明的趋化素样因子超家族的多核苷酸和多肽在制备***、造血***和/或免疫***疾病的药物组合物中的应用。

在本发明的一个实施例中，(参见实施例3)进一步研究了CKLF2的功能，其除了具有国际专利申请(参见国际申请：PCT/CH00/00026)中提及的促进COS-7细胞骨骼细胞增殖的功能外，还具有促进C2C12细胞增殖和分化的功能，图6尤其显示了CKLF2促进C2C12细胞肌管形成(参见实施例三)，表明本发明的趋化素样因子超家族成员可以用于治疗肌肉萎缩或其它退行性病变。应该提及的是，增殖中的骨骼细胞更易于接受外源DNA，因而在使用DNA疫苗或注射DNA药物治疗疾病时，可以同时注射本发明的趋化素样因子超家族成员，以促进DNA疫苗或药物吸收，提高免疫及治疗效果。

而在本发明的另一个优选实施例中(参见实施例四、五)，本发明人以CKLF-RP2为代表，研究了趋化素样因子超家族的组织表达谱和功能。利用CKLF-RP2的特异性引物，以Clontech公司生产的单链cDNA文库模板，进行PCR扩增的结果显示，CKLF-RP2在正常成人组织中的表达水平较低，而在胚胎和肿瘤组织中的表达水平较高。CKLF-RP2的表达谱与CKLF1和已申请专利的细胞因子CKLF-H1-A(参见专利公开号：CN1283693A)的表达谱相似。CKLF-RP2在胚胎和肿瘤组织中的表达水平较高，显示本发明的多核苷酸序列可以作为一个诊断指标，结合限制性片段长度多肽性分析(RFLP)、荧光原位杂交法(FISH)等方法，检测体内因本发明趋化素样因子超家族成员表达不足或过量所致的病理状态。同样，也可以使用本发明趋化素样因子超家族成员蛋白的纯化产物，通过放射性免疫分析、竞争性结合法、Western印迹分析法或酶联免疫吸附法(ELISA)达到相同的目的。

体外研究发现，CKLF-RP2对Hela细胞具有明显的促增殖作用，(参见实施例五)，同时表达谱分析表明其在肿瘤组织中，例如***癌、肠癌、肺腺癌、乳腺癌等的表达水平较高(参见实施例四)，提示CKLF-RP2在肿瘤的发生、发展和转移中起重要的作用，利用CKLF-RP2反义寡核苷酸阻断CKLF-RP2表达或利用抗CKLF-RP2抗体中和CKLF-RP2的作用，对肿瘤治疗，尤其***癌、肠癌、肺腺癌、乳腺癌等肿瘤治疗将起重要的作用。

体内研究发现，与注射空载体对照小鼠相比，注射CKLF-RP2真核表达质粒小鼠的脾脏内内各种细胞密度明显增加(参见实施例五)，表明CKLF-RP2有造血细胞刺激作用，此活性与CKLF1、CKLF2和已申请专利的细胞因子CKLF-H1-A(参见专利公开号：CN 1283693A)的造血刺激活性相似，提示CKLF-RP2具有促进骨髓细胞增殖的作用，这与CKLF1、CKLF2和CKLF-H1A的促骨髓细胞增殖作用非常相似。因此本发明的趋化素样因子超家族成员可以刺激机体的造血功能，可以用于治疗造血***疾病，包括原发性或继发性造血功能障碍等病症。尤其是，注射CKLF-RP2真核表达质粒小鼠的脾脏内红细胞和淋巴细胞密度明显增加，提示本发明的趋化素样因子超家族成员在免疫调节和造血刺激中具有重要作用。

优选实施例

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一、CKLF-RP1-8全长cDNA的克隆化和特性分析

1、CKLF-RP1-5，7，8全长cDNA的EST拼接：

利用CKLF2蛋白质序列对蛋白质数据库(NCBI的blastp)和人的表达序列标签(Expression Sequence Tag，简称EST)进行数据检索和同源性比较，发现多组EST序列(见表1)，通过EST Assembly machine(网址为http：∥www.tigem.it)进行EST拼接，形成重叠群(contig)再次进行BLAST拼接，找到完整的读码框架；CKLF-RP6的全长cDNA序列参考NCBI释放的序列设计引物进行扩增。

表1用于CKLF-RP1-5，7，8全长cDNA序列拼接的EST序列

	全长cDNA序列拼接的EST序列
		CKLF-RP1	BI464188，AL038679，AI632227，AI242300，BG389971，AI540221，AI269738，AI217152，AI962574，AA921931，AA193255，AI825627，AI695900
CKLF-RP2	BG826826，AA778552，BG212551，AI201364，AW663435，AI223025
		CKLF-RP3	AL542357，AL551269，AL514858，AL526558，BG744169，AL544210，AL550478，BG758446，BG748053，AL527977，BI199176，BG697860，BG323663，BG323505
CKLF-RP4	AL530351，BF327262，AW297066，BF331942，and AI208468
		CKLF-RP5	BF530674，BF346190，AI147740，AA452430，AI553750，AI567497，AW296102，AA452257，AI471151
CKLF-RP7	BG182013，BG189368，BG189930，BG193535，AW080832，BE869501，BF793712，AI693734，AI564525，BG213702，BG216957，BG656425
		CKLF-RP8	AL528672，AL570224，AL528671，AL543749，BG761693，BE740519，BG761693，BE740519，BG477819，BG340845，BG282018，BG478235，BI459684

2、CKLF-RP1-8的cDNA克隆化：

根据EST拼接得到的CKLF-RP1-5，7，8全长cDNA序列和NCBI预测的CKLF-RP6的全长cDNA序列设计特异的引物(见表2)，根据EST来源不同和Unigene分析结果，选择高表达相应基因的单链cDNA文库(购自Clontech)，进行PCR扩增，(94℃，5分钟；94℃，20秒，58℃，20秒，72℃，30秒，35循环；72℃，7分钟)。纯化PCR产物，克隆至pGEM-T Easy载体中(Promega)，连接产物转化XL-1Blue菌，用蓝白斑筛选阳性克隆。测序质粒用Tip-20 Mini-preparation试剂盒(Qiagen)进行纯化，3100测序仪进行DNA序列分析，证明EST拼接正确。

         表2用于CKLF-RP1-8cDNA扩增的引物序列及cDNA文库

	上游引物	下游引物	cDNA文库
				CKLF-RP1	CACCATGGATCCTGAACACGC	AGCGATTCGACAGACACGTGC	睾丸
CKLF-RP2	AAGGACACCGAGTCAGTCATG	TCATTTCTTTCCCTTTGCTGGCC	睾丸
				CKLF-RP3	CGCGAGAAGAGGGGAGCCAG	ATCTCGCAGTGCCCATAGCC	胎盘
CKLF-RP4	GGGCGGCAGCATGCGG	GGCAGGTCCTCACGTGTCCAG	脾脏
				CKLF-RP5	GCCTCCATCTCTGCCTACATG	GGCTCCACTGTCCTCTCTGC	***癌
CKLF-RP6	ACGATGGAGGAGCCGC	TCACTGTATGGTCCTGGATCTC	***癌
				CKLF-RP7	CTGGGGCCGCGCAATG	TAACAAAGGCAGAGATGGAGAGGAG	胎盘
CKLF-RP8	CACGATGGAGAACGGAGCGG	GGGCTCAGGCACCACAATG	扁桃体

3、CKLF2与CKLF-RP1-8之间的同源性比较

得到CKLF-RP1-8的cDNA序列后，发现其编码的蛋白质为新序列，如SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16所示。SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15为相应的核苷酸序列，其中，CKLF2在Genbank中的登录号为AF135380，CKLF-RP1-8的Accession numbers分别为：CKLF-RP1：AF278577；CKLF-RP2：AF479260；CKLF-RP3：AF479813；CKLF-RP4：AF479814；CKLF-RP5：AF479262；CKLF-RP6：AF479261；CKLF-RP7：AF479263；CKLF-RP8：AF474370。专利查新发现，CKLF-RP1-8序列均为新序列。蛋白质序列分析表明CKLF2与CKLF-RP1-8之间有保守的氨基酸序列(图1)；彼此之间有不同程度的同源性(表3)，CKLF2和CKLF-RP1具有典型的Cys-Cys(简称CC结构)的结构特征，而CKLF-RP2-8则不具备CC结构；在进化过程中，CKLF2和CKLF-RP1，CKLF-RP3和CKLF-RP5的亲源性最近(图2)。表3趋化素样因子超家族成员之间的保守序列分析

4、CKLF2和CKLF-RP1-8的穿膜区分析：

用Prosite计算机软件分析CKLF2和CKLF-RP1-8的蛋白质序列。

结果：

除了CKLF-RP3有3个潜在的穿膜区之外，CKLF2和CKLF-RP1，2，4-8均为4次跨膜蛋白(如表4和图3所示)。

表4 CKLF超家族成员穿膜区分析

	第1个	第2个	第3个	第4个
					CKLF2	24-40	45-67	74-96	106-128
CKLF-RP1	23-40	47-69	79-101	108-130
					CKLF-RP2	94-111	116-135	142-166	179-198
CKLF-RP3	61-83	103-122	132-151
					CKLF-RP4	59-77	87-109	121-143	148-170
CKLF-RP5	35-56	60-82	95-114	119-136
					CKLF-RP6	43-64	73-94	107-126	135-156
CKLF-RP7	40-59	69-91	103-125	145-167
					CKLF-RP8	46-68	78-100	113-130	140-162

5、染色体定位和基因组成分析：

得到CKLF-RP1-8序列并进行相应分析后，发现CKLF2和CKLF-RP1-8之间具有一定的亲源性，为进一步研究它们之间的相关性，用CKLF2和CKLF-RP1-8的全长cDNA序列在NCBI HGP数据库中进行检索，并分析其基因组成和染色体定位。

结果：

CKLF2和CKLF-RP1-4位于16号染色体，而且紧密连锁，CKLF2和CKLF-RP1之间仅有325bp，CKLF-RP1和CKLF-RP2之间仅有322bp，CKLF-RP2与CKLF-RP3之间、CKLF-RP3与CKLF-RP4之间分别为15kb和6kb。目前尚未发现其间有其它已知基因。CKLF-RP5位于14号染色体，CKLF-RP6，7，8在3号染色体上成基因簇形式出现(见图4)。基因组成分析发现，CKLF2和CKLF-RP1，2，6，8由4个外显子组成，CKLF-RP3，4，5，7由5个外显子组成(见表5)。

                     表5 CKLF超家族成员的基因组成

	外显子1	外显子2	外显子3	外显子4	外显子5
						CKLF2	1-226	225-385	386-482	483-663
CKLF-RP1	1-208	209-371	372-469	470-774
						CKLF-RP2	1-437	438-597	598-698	699-1055
CKLF-RP3	1-222	223-378	379-476	477-593	594-1508
						CKLF-RP4	1-368	369-547	548-645	646-914	922-1118
CKLF-RP5	1-317	318-470	471-564	565-648	649-726
						CKLF-RP6	1260	261-438	439-538	539-1917
CKLF-RP7	1-188	189-361	362-459	460-541	542-1143
						CKLF-RP8	1-410	411-583	584-699	700-1133

实施例二、真核表达质粒的构建

真核表达质粒pcDNA3-Myc-His(B)(简称pcDB购自Invitrogen公司)。如图5所示，用EcoR I酶切释放出CKLF2及CKLF-RP1-8片段，将之连接至经EcoR I酶切后并用CIP处理后的pcDB载体中，构建了pcDB-CKLF2和pcDB-CKLF-RP1-8载体。

实施例三、CKLF2对C2C12细胞的促增殖和促分化作用

1、C2C12/CKLF2稳定表达细胞株的建立：

利用高效转染试剂SuperFect(Qiagen)，将纯化的pcDB-CKLF2和pcDB分别转染C2C12细胞(购自美国ATCC细胞库)，质粒转染细胞72小时后，在培养基中加入G418，G418从低浓度逐渐升至高浓度，至500μg/ml，两周后筛出高表达克隆，进行后续实验。pcDB和pcDB-CKLF2稳定转染克隆分别命名为C2C12/pcDB和C2C12/CKLF2。

2、CKLF2引起的C2C12细胞形态的变化：

(1)在同样条件下培养C2C12/CKLF2和C2C12/pcDB细胞。

(2)细胞染色和细胞形态。

用FITC-Phalloidin对C2C12细胞进行染色，方法如下：用预冷的PBS(PH7.4)洗细胞，2％多聚甲醛固定，0.1％TrintonX100处理，用预冷的PBS(PH7.4)再洗一次细胞，在细胞中加入200ng/ml的FITC-Phalloidin(Sigma)，室温放置30分钟。

结果：

如图6所示，与C2C12/pcDB细胞相比，C2C12/CKLF2细胞融合加速，肌管增大而且较多。

3、CKLF2对C2C12细胞的促增殖作用：

CKLF2促进C2C12细胞肌管形成，提示CKLF2能促进C2C12细胞分化或能促进其增殖或二者兼而有之。为进一步研究其作用机制，首先观察了CKLF2对C2C12细胞的促增殖作用。将相同量的C2C12/CKLF2和C2C12/pcDB细胞铺至细胞培养板中，培养2-3天后，分别用细胞计数、H3掺入实验、MTT法和细胞周期分析，研究CKLF2对C2C12细胞的促增殖作用，方法如下：

(1)细胞计数法：将C2C12/CKLF2细胞和C2C12/pcDB细胞分别以8000个细胞/孔的密度接种在6孔板中，连续培养5天，用0.25％trypsin-EDTA将细胞消化下来，重悬在含0.4％台盼蓝的PBS缓冲液中，进行活细胞染色、计数。

(2)MTT法：将C2C12/CKLF2细胞和C2C12/pcDB细胞分别以1000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，连续培养5天，每孔加10μlMTT(10mg/ml)，继续培养6小时，加100μl裂解液，570nm波长测OD值。

(3)细胞周期分析：当C2C12/CKLF2和C2C12/pcDB细胞长至70-80％满时，用PBS洗细胞，0.25％trypsin-EDTA消化细胞，然后用75％乙醇过夜固定细胞。将细胞用PBS洗并重悬于0.5mlPBS中，RnaseA处理30分钟以消化RNA。最后，用propidium iodide(PI)染细胞(终浓度为20μg/ml)，置于暗处30分钟，用Becton-Dickinson公司的FACScan检测，利用CellFIT software分析数据。

(4)[³H]掺入实验：通过检测DNA的合成，间接反映细胞的增殖状况。将C2C12/CKLF2细胞和C2C12/pcDB细胞分别以1000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，24小时后，每孔中加入1μCi/ml的[³H]，继续培养6小时，用TamTec(Perkin Elmer)细胞收获仪收取细胞，MicroBetaWindows Workstation(Wallac)检测掺入的[³H]值。

结果：

如图7所示，四种不同方法(A.细胞计数法；B.MTT法；C.细胞周期研究；D.H3掺入实验)得到相似的结果，即与空载体对照相比，CKLF2能明显促进C2C12细胞的增殖。

4、CKLF2对C2C12细胞的促分化作用：

图7显示CKLF2能直接促进C2C12细胞增殖，为明确CKLF2是否能直接促进C2C12细胞分化，观察了在C2C12/CKLF2细胞80％满时，C2C12细胞分化特异性分子MCK(小鼠肌酸激酶)、MLC(肌球蛋白轻链)的表达、MCK的活性和肌细胞分化特异转录因子Myogenin的表达水平，其方法如下：

(1)RNA提取和实时定量RT-PCR检测MCK、MLC的表达

用Trizol(购自美国生命公司)提取细胞总RNA，SUPERSCRIPTTM制备单链cDNA文库，应用ABI PRISM 7700(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)对MLC2和MCK分子进行实时定量PCR分析。

(2)肌酸激酶活性检测

应用Sigma公司的肌酸磷酸激酶活性分析试剂盒检测小鼠肌酸激酶活性。用去离子水溶解NADH底物，加入细胞裂解物，混匀，放置5分钟，用POLARstar galaxy(BMGtechnologies，Australia)分光光度计检测340nm时的吸收波谱。在每一个细胞培养孔中加入300μl底物和10μl细胞裂解物。所有实验至少重复两次。

(3)Western Blot分析Myogenin的表达水平

从肌母细胞和肌管中提取核蛋白，用Coomassie Plus Protein Assay Reagent Kit(Pierce)对提取蛋白进行定量。SDS-PAGE(浓度为10％)分离蛋白质，并转至Hybond-ECL膜上。一抗与蛋白反应后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG.抗体，用ECL显色液显色(Pierce)。

结果：

如表6所示，与C2C12/pcDB相比，C2C12/CKLF2细胞的MCK、MLC的表达水平增加，MCK的活性也明显提高(图8)；Myogenin的表达水平也明显增加(图9)，证明CKLF2能促进C2C12细胞分化。

表6 CKLF2促进C2C12表达肌细胞特异分子MCK和MLC2

分子标记MCKMLC2	C2C12/CKLF2细胞倍数变化第1天    第2天    第3天    第4天
		+6      +4      +18      +3528+1.6    +1.2    +5.8     +6.9

实施例四、CKLF-RP2的组织表达谱研究

利用CKLF-RP2的特异性引物(见表2)和Clontech公司生产的单链cDNA文库进行PCR扩增。在25μl反应体系中，加入1μl模板，扩增条件为：95℃，5分钟；95℃，20秒，58℃，20秒，72℃，30秒，35cycles；72℃，7分钟。取10μlPCR产物在琼脂糖胶中电泳。

结果：

如图10所示，CKLF-RP2在正常成人组织中的表达水平很低，而在胚胎和肿瘤组织中有较高水平的表达，这与CKLF1、CKLF2和CKLF-H1A的组织表达谱相似。

实施例五、CKLF-RP2对Hela细胞促增殖作用

利用电穿孔法将pcDB-CKLF-RP2和pcDB分别转染Hela细胞(ATCC CCL 2)，以2000个细胞/孔的密度将细胞铺至96孔板中，72小时后，每孔加10μlMTT(浓度500μg/ml的MTT，继续培养4-6小时以后，加入100μl细胞裂解液(20％SDS，50％DMSO，PH4.5)，37℃孵育过夜后，在BioTek ELIsa Reader上读取OD_570nm的吸收值。

结果：

如图11所示，与空载体对照组相比，CKLF-RP2能明显促进Hela细胞的增殖。

实施例六、CKLF-RP2对造血细胞的促增殖作用

将100μgCKLF-RP2真核表达质粒pcDB-CKLF-RP2和100μg空载体对照质粒pcDB分别注射6周Balb/c小鼠骨骼肌。2星期后，取小鼠各重要脏器，固定，包埋，作石蜡切片，苏木精和曙红(HE)染色，镜下观察。(放大倍数为10×10)

结果：

如图12所示，与空载体对照组相比，pcDB-CKLF-RP2注射组小鼠的脾脏内各种细胞密度明显增加，表明CKLF-RP2有造血细胞刺激作用，此活性与CKLF1、CKLF2和CKLF-H1A的造血刺激活性相似。

实施例七制备抗体

用纯化的重组蛋白或合成的多肽来免疫动物以产生抗体。具体方法如下：重组分子用层析法进行分离后备用。也可以用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化，用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白条带从凝胶中切下，对小鼠进行腹或皮下注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。

获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀本发明的基因产物的能力加以评估。

                      序列表<110>北京大学<120>具有骨骼肌刺激活性和免疫调节作用的趋化素样因子超家族<130>D0204068F<160>18<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>793<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(128)..(640)<400>1cgtagagccg ggtgcacgcg ccggggaggt agccaacagc cgttgggacg cgacgctggt    60tcccatggtg gagagccagc cgctgccgcg tgcactggtt cagacggcca ggccctaggg    120acccacc atg gat cct gaa cac gcc aaa cct gag tca tcc gag gca cct      169

    Met Asp Pro Glu His Ala Lys Pro Glu Ser Ser Glu Ala Pro

    1               5                   10tca ggg aac ttg aaa caa ccg gag act gcc gca gcc ctg ctg agt ctt      217Ser Gly Asn Leu Lys Gln Pro Glu Thr Ala Ala Ala Leu Leu Ser Leu15                  20                  25    30atc tta gga gca tta gct tgt ttc atc atc acc caa gcc aat gag tca      265Ile Leu Gly Ala Leu Ala Cys Phe Ile Ile Thr Gln Ala Asn Glu Ser

            35                  40                  45ttt ata aca atc aca agt ctg gaa atc tgc att gtc gtt ttt ttt att      313Phe Ile Thr Ile Thr Ser Leu Glu Ile Cys Ile Val Val Phe Phe Ile

        50                  55                  60cta ata tat gtg cta acc ctt cac cac ttg ctg acc tat tta cat tgg      361Leu Ile Tyr Val Leu Thr Leu His His Leu Leu Thr Tyr Leu His Trp

    65                  70                  75ccc tta ctt gat ctt acc aac agt atc att aca gct gtg ttc ctt tca      409Pro Leu Leu Asp Leu Thr Asn Ser Ile Ile Thr Ala Val Phe Leu Ser

80                  85                  90gta gtt gcc atc ttg gcc atg caa gaa aag aaa aga agg cat tta ctc      457Val Val Ala Ile Leu Ala Met Gln Glu Lys Lys Arg Arg His Leu Leu95                  100                 105                          110tat gtc ggg ggg tcc ctg tgt ctc aca gcg gta atc gtg tgt tgc atc      505Tyr Val Gly Gly Ser Leu Cys Leu Thr Ala Val Ile Val Cys Cys Ile

            115                 120                 125gat gcg ttt gtg gtc acc acg aag atg agg acc aac ttg aaa aga ttc      553Asp Ala Phe Val Val Thr Thr Lys Met Arg Thr Asn Leu Lys Arg Phe

        130                 135                 140ctg gga gtc gaa gtt gaa agg aag ctt tcc ccc gcc aag gac gcc tac      601Leu Gly Val Glu Val Glu Arg Lys Leu Ser Pro Ala Lys Asp Ala Tyr

    145                 150                 155ccc gaa acc ggc ccc gac gcc ccg cag agg ccc gcc tga agccagcccg       650Pro Glu Thr Gly Pro Asp Ala Pro Gln Arg Pro Ala

160                 165                 170gcgccctagc agatgcacgt gtctgtcgaa tcgctgcctc cgagcccacc cccgagctcg    710catgctgtca cccattccag cctaaatgtg accataaaat tagggctgct gcttttatcg    770agaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa                                            793<210>2<211>170<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400> 2Met Asp Pro Glu His Ala Lys Pro Glu Ser Ser Glu Ala Pro Ser Gly1                5                  10                  15Asn Leu Lys Gln Pro Glu Thr Ala Ala Ala Leu Leu Ser Leu Ile Leu

        20                  25                  30Gly Ala Leu Ala Cys Phe Ile Ile Thr Gln Ala Asn Glu Ser Phe Ile

    35                  40                  45Thr Ile Thr Ser Leu Glu Ile Cys Ile Val Val Phe Phe Ile Leu Ile

50                  55                  60Tyr Val Leu Thr Leu His His Leu Leu Thr Tyr Leu His Trp Pro Leu65                  70                  75                  80Leu Asp Leu Thr Asn Ser Ile Ile Thr Ala Val Phe Leu Ser Val Val

            85                  90                  95Ala Ile Leu Ala Met Gln Glu Lys Lys Arg Arg His Leu Leu Tyr Val

        100                 105                 110Gly Gly Ser Leu Cys Leu Thr Ala Val Ile Val Cys Cys Ile Asp Ala

   115                  120                 125Phe Val Val Thr Thr Lys Met Arg Thr Asn Leu Lys Arg Phe Leu Gly

 130                135                 140Val Glu Val Glu Arg Lys Leu Ser Pro Ala Lys Asp Ala Tyr Pro Glu145                 150                 155                 160Thr Gly Pro Asp Ala Pro Gln Arg Pro Ala

            165                 170<210>3<211>1065<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(153)..(899)<400>3ggttggcatt cggtggtcct ggcagttagc tgagcacgcc ctctgagccg ctcggtggac     60accaggcact ctagtaggcc tggcctaccc agaaacagca ggagagagaa gaaacaggcc     120agctgtgaga agccaaggac accgagtcag tc atg gca cct aag gcg gca aag       173

                                Met Ala Pro Lys Ala Ala Lys

                                1               5ggg gcc aag cca gag cca gca cca gct cca cct cca ccc ggg gcc aaa       221Gly Ala Lys Pro Glu Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Pro Gly Ala Lys

    10                  15                  20ccc gag gaa gac aag aag gac ggt aag gag cca tcg gac aaa cct caa      269Pro Glu Glu Asp Lys Lys Asp Gly Lys Glu Pro Ser Asp Lys Pro Gln

25                  30                  35aag gcg gtg cag gac cat aag gag cca tcg gac aaa cct caa aag gcg      317Lys Ala Val Gln Asp His Lys Glu Pro Ser Asp Lys Pro Gln Lys Ala40                  45                  50                  55gtg cag ccc aag cac gaa gtg ggc acg agg agg ggg tgt cgc cgc tac      365Val Gln Pro Lys His Glu Val Gly Thr Arg Arg Gly Cys Arg Arg Tyr

            60                  65                  70cgg tgg gaa tta aaa gac agc aat aaa gag ttc tgg ctc ttg ggg cac      413Arg Trp Glu Leu Lys Asp Ser Asn Lys Glu Phe Trp Leu Leu Gly His

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   170                  175                 180ctt att ggt gcg gct gga gtt ttt gct ttt atc gat gtg tgt ctt caa      749Leu Ile Gly Ala Ala Gly Val Phe Ala Phe Ile Asp Val Cys Leu Gln185                  190                 195aga aac cac ttc aga ggc aag aag gcc aaa aag cat atg ctg gtt cct      797Arg Asn His Phe Arg Gly Lys Lys Ala Lys Lys His Met Leu Val Pro200                 205                 210                  215cct cca gga aag gaa aaa gga ccc cag cag ggc aag gga cca gaa ccc      845Pro Pro Gly Lys Glu Lys Gly Pro Gln Gln Gly Lys Gly Pro Glu Pro

            220                 225                  230gcc aag cca cca gaa cct ggc aag cca cca ggg cca gca aag gga aag      893Ala Lys Pro Pro Glu Pro Gly Lys Pro Pro Gly Pro Ala Lys Gly Lys

        235                 240                 245aaa tga cttggaggag gctcctggtg tctgaaacgg cagtgtattt tacagcaata       949Lystgtttccact ctcttccttg tcttctttct ggaatggttt tcttttccat tttcattacc    1009acctttgctt ggaaaagaat ggattaatgg attctaaaag cctaaaaaaa aaaaaa        1065<210>4<211>248<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Met Ala Pro Lys Ala Ala Lys Gly Ala Lys Pro Glu Pro Ala Pro Ala1               5                   10                  15Pro Pro Pro Pro Gly Ala Lys Pro Glu Glu Asp Lys Lys Asp Gly Lys

        20                  25                  30Glu Pro Ser Asp Lys Pro Gln Lys Ala Val Gln Asp His Lys Glu Pro

    35                 40                   45Ser Asp Lys Pro Gln Lys Ala Val Gln Pro Lys His Glu Val Gly Thr

50                  55                  60Arg Arg Gly Cys Arg Arg Tyr Arg Trp Glu Leu Lys Asp Ser Asn Lys65                  70                   75                 80Glu Phe Trp Leu Leu Gly His Ala Glu Ile Lys Ile Arg Ser Leu Gly

        85                      90                  95Cys Leu Ile Ala Ala Met Ile Leu Leu Ser Ser Leu Thr Val His Pro

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    115                 120                 125Ile Leu Leu Tyr Ser Phe Ala Ile His Arg Tyr Ile Pro Phe Ile Leu

130                 135                 140Trp Pro Ile Ser Asp Leu Phe Asn Asp Leu Ile Ala Cys Ala Phe Leu145                 150                 155                 160Val Gly Ala Val Val Phe Ala Val Arg Ser Arg Arg Ser Met Asn Leu

            165                 170                 175His Tyr Leu Leu Ala Val Ile Leu Ile Gly Ala Ala Gly Val Phe Ala

        180                 185                 190Phe Ile Asp Val Cys Leu Gln Arg Asn His Phe Arg Gly Lys Lys Ala

    195                 200                 205Lys Lys His Met Leu Val Pro Pro Pro Gly Lys Glu Lys Gly Pro Gln

210                 215                 220Gln Gly Lys Gly Pro Glu Pro Ala Lys Pro Pro Glu Pro Gly Lys Pro225                 230                 235                 240Pro Gly Pro Ala Lys Gly Lys Lys

            245<210>5<211>1514<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(75)..(623)<400>5ccgggtttcc gcttccctcc gggcgcgaga agaggggagc caggccgagc cccggcccta    60ccgacgccgc cgcc atg tgg ccc cca gac ccc gac ccc gac ccg gac ccc      110

            Met Trp Pro Pro Asp Pro Asp Pro Asp Pro Asp Pro

            1               5                   10gag cct gcc ggc ggc tcc cgt ccc ggc ccc gcg gtc ccc ggg ctc cgc      158Glu Pro Ala Gly Gly Ser Arg Pro Gly Pro Ala Val Pro Gly Leu Arg

    15                  20                  25gcc ctg ctg ccg gcg cgg gct ttc ctc tgc tct ctc aaa ggc cgc ctc      206Ala Leu Leu Pro Ala Arg Ala Phe Leu Cys Ser Leu Lys Gly Arg Leu

30                  35                  40ctg ctg gcc gag tcg ggt ctc tca ttc atc act ttt atc tgc tat gtg      254Leu Leu Ala Glu Ser Gly Leu Ser Phe Ile Thr Phe Ile Cys Tyr Val45                  50                  55                  60gcg tcc tca gca tct gcc ttc ctc aca gcg cct ctg ctg gag ttc ctg      302Ala Ser Ser Ala Ser Ala Phe Leu Thr Ala Pro Leu Leu Glu Phe Leu

            65                  70                  75ctg gcc ttg tac ttc ctc ttt gct gat gcc atg cag ctg aat gac aag      350Leu Ala Leu Tyr Phe Leu Phe Ala Asp Ala Met Gln Leu Asn Asp Lys

        80                  85                      90tgg cag ggc ttg tgc tgg ccc atg atg gac ttc ctg cgc tgt gtc acc      398Trp Gln Gly Leu Cys Trp Pro Met Met Asp Phe Leu Arg Cys Val Thr

    95                  100                 105gcg gcc ctc atc tac ttt gct atc tcc atc acg gcc atc gcc aag tac      446Ala Ala Leu Ile Tyr Phe Ala Ile Ser Ile Thr Ala Ile Ala Lys Tyr

110                 115                 120tcg gat ggg gct tcc aaa gcc gct ggg gtg ttt ggc ttc ttt gct acc      494Ser Asp Gly Ala Ser Lys Ala Ala Gly Val Phe Gly Phe Phe Ala Thr125                 130                 135                  140atc gtg ttt gca act gat ttc tac ctg atc ttt aac gac gtg gcc aaa      542Ile Val Phe Ala Thr Asp Phe Tyr Leu Ile Phe Asn Asp Val Ala Lys

            145                 150                 155ttc ctc aaa caa ggg gac tct gca gat gag acc aca gcc cac aag aca      590Phe Leu Lys Gln Gly Asp Ser Ala Asp Glu Thr Thr Ala His Lys Thr

        160                 165                 170gaa gaa gag aat tcc gac tcg gac tct gac tga aggcctggcg ggtgccttgg    643Glu Glu Glu Asn Ser Asp Ser Asp Ser Asp

   175                   180caacctgagc cacacaggcc tccacccctg cgcctcacag gggtcgctgg cgttggagcg    703gaggcctgga cttctgagtt gcagaggggg ctgcggacac agcaggcccc ctacagcctc    763aggttctgcc tgagcccagc ctaccaggct tgcccctcag ctcagcactg ttgaccacgc    823tgcgtatgag ggcatcttgg gtatcccact ccttctcccc atttctgtcc cacagccttc    883agccctttaa cgtctctgcc aaaaaccagc acaaggagac aaagcagagc cttgtctgta    943tctgggcagc aggtgttcca tgctgctagg tggcgggggt cgggggtctt ctgtttcact    1003aacaggaaca aagacagaaa ccatgacagg gctgccccgc caggccccgg tgggtttgtc    1063tgcacttggt gctcctgccc acaccagcca ctttggtgac aatgaccctt ccaagaatct    1123ttggttcaag gagcaccagt tccctcttca ttcttgaagc agggagaaat tgacctttgc    1183cttgtcgccc aggaagtggg gctcggcacc cataactaac acctcccacc cttggaaacc    1243atgtcttctg ggggtgagat gaccattctg ggtctaagac tgtttcaaag aagagctcat    1303agactgactg gtccagaaga cagagggtac aacagtggca tcacagtgac agtgtcatgg    1363ggagctgggc gggcccagcc aaaccctcct tcttcctaga gcccagccag caggcaggag    1423ttcctggacc ctcaggacag gaaacttcag acttagggca ggctatgggc actgcgagat    1483gagaccgctt tgtgtcacct acgatatacg a                                   1514<210>6<211>182<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>6Met Trp Pro Pro Asp Pro Asp Pro Asp Pro Asp Pro Glu Pro Ala Gly1               5                  10                   15Gly Ser Arg Pro Gly Pro Ala Val Pro Gly Leu Arg Ala Leu Leu Pro

        20                  25                  30Ala Arg Ala Phe Leu Cys Ser Leu Lys Gly Arg Leu Leu Leu Ala Glu

    35                  40                  45Ser Gly Leu Ser Phe Ile Thr Phe Ile Cys Tyr Val Ala Ser Ser Ala

50                  55                  60Ser Ala Phe Leu Thr Ala Pro Leu Leu Glu Phe Leu Leu Ala Leu Tyr65                  70                  75                  80Phe Leu Phe Ala Asp Ala Met Gln Leu Asn Asp Lys Trp Gln Gly Leu

            85                  90                  95Cys Trp Pro Met Met Asp Phe Leu Arg Cys Val Thr Ala Ala Leu Ile

            100             105             110Tyr Phe Ala Ile Ser Ile Thr Ala Ile Ala Lys Tyr Ser Asp Gly Ala

    115                 120                 125Ser Lys Ala Ala Gly Val Phe Gly Phe Phe Ala Thr Ile Val Phe Ala

130                 135                 140Thr Asp Phe Tyr Leu Ile Phe Asn Asp Val Ala Lys Phe Leu Lys Gln145                 150                 155                 160Gly Asp Ser Ala Asp Glu Thr Thr Ala His Lys Thr Glu Glu Glu Asn

            165                 170             175Ser Asp Ser Asp Ser Asp

       180<210>7<211>1118<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(183)..(809)<400>7agcggaccga gccgcagccg cagccgggcg gcgggcgaga ggcggcggcg gcgggcgggc     60cgcgggcagt cagtcgggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcgatgcgg cggccccgct    120gagtccgccc gctcctggcg ccgggagcca gccgcgcgag gcggcccggg ccgggcggca    180gc atg cgg agc ggc gag gag ctg gac ggc ttc gag ggc gag gcc tcg       227Met Arg Ser Gly Glu Glu Leu Asp Gly Phe Glu Gly Glu Ala Ser

1                5                 10                   15agc acc tcc atg atc tcg ggc gcc agc agc ccg tac cag ccc acc acc      275Ser Thr Ser Met Ile Ser Gly Ala Ser Ser Pro Tyr Gln Pro Thr Thr

            20                  25                   30gag ccg gtg agc cag cgc cgc ggg ctg gcc ggc ctg cgc tgc gac ccc      323Glu Pro Val Ser Gln Arg Arg Gly Leu Ala Gly Leu Arg Cys Asp Pro

        35                  40                  45gac tac ctg cgc ggc gcg ctc ggc cgc ctc aag gtc gcc caa gtg atc      371Asp Tyr Leu Arg Gly Ala Leu Gly Arg Leu Lys Val Ala Gln Val Ile

    50                  55                   60ttg gcc ctg att gca ttc atc tgc ata gag acc atc atg gca tgc tcc      419Leu Ala Leu Ile Ala Phe Ile Cys Ile Glu Thr Ile Met Ala Cys Ser

65                  70                  75ccg tgt gaa ggc ctc tac ttt ttt gag ttt gtg agc tgc agt gcg ttt      467Pro Cys Glu Gly Leu Tyr Phe Phe Glu Phe Val Ser Cys Ser Ala Phe80                  85                  90                  95gtg gtg act ggc gtc ttg ctg att atg ttc agt ctc aac ctg cac atg      515Val Val Thr Gly Val Leu Leu Ile Met Phe Ser Leu Asn Leu His Met

           100                  105                 110agg atc ccc cag atc aac tgg aat ctg aca gat ttg gtc aac act gga      563Arg Ile Pro Gln Ile Asn Trp Asn Leu Thr Asp Leu Val Asn Thr Gly

        115                 120                 125ctc agc gct ttc ctt ttc ttt att gct tca atc gta ctg gct gct tta      611Leu Ser Ala Phe Leu Phe Phe Ile Ala Ser Ile Val Leu Ala Ala Leu

    130                 135                 140aac cat aga gcc gga gca gaa att gct gcc gtg ata ttt ggc ttc ttg      659Asn His Arg Ala Gly Ala Glu Ile Ala Ala Val Ile Phe Gly Phe Leu

145                 150                 155gcg act gcg gca tat gca gtg aac aca ttc ctg gca gtg cag aaa tgg      707Ala Thr Ala Ala Tyr Ala Val Asn Thr Phe Leu Ala Val Gln Lys Trp160                165                 170                 175aga gtc agc gtc cgc cag cag agc acc aat gac tac atc cga gcc cgc      755Arg Val Ser Val Arg Gln Gln Ser Thr Asn Asp Tyr Ile Arg Ala Arg

            180                 185                 190acg gag tcc agg gat gtg gac agt cgc cct gag atc cag cgc ctg gac      803Thr Glu Ser Arg Asp Val Asp Ser Arg Pro Glu Ile Gln Arg Leu Asp

        195                 200                 205acg tga ggacctgcct ggatcctcct ccctcccgtc ctcgtgcctg tctctcagtc       859Thraagttttctt tcccttgtcc tgtcagattt ccatgtgatt cagttgaatt ttgtcctctt    919tggtaaaagt tcattttggg aaagggtttc ccgagtggcc cagtgggcgg gtccgcggtg    979gagttgggag gcccacgttc ctcagcgttt ggggctgtgg agcagccggc gtcactgccc    1039aggtccactt gaggtcttac ctgccctgaa gcacaggctt cctttgactc tgagccacct    1099tgtacgtgtg tagaaaata                                                 1118<210>8<211>208<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>8Met Arg Ser Gly Glu Glu Leu Asp Gly Phe Glu Gly Glu Ala Ser Ser1               5                   10                  15Thr Ser Met Ile Ser Gly Ala Ser Ser Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Glu

        20                  25                  30Pro Val Ser Gln Arg Arg Gly Leu Ala Gly Leu Arg Cys Asp Pro Asp

    35                  40                  45Tyr Leu Arg Gly Ala Leu Gly Arg Leu Lys Val Ala Gln Val Ile Leu

50                  55                  60Ala Leu Ile Ala Phe Ile Cys Ile Glu Thr Ile Met Ala Cys Ser Pro65                  70                  75             80Cys Glu Gly Leu Tyr Phe Phe Glu Phe Val Ser Cys Ser Ala Phe Val

            85                  90                  95Val Thr Gly Val Leu Leu Ile Met Phe Ser Leu Asn Leu His Met Arg

        100                 105                 110

Ile Pro Gln Ile Asn Trp Asn Leu Thr Asp Leu Val Asn Thr Gly Leu

    115                 120                 125Ser Ala Phe Leu Phe Phe Ile Ala Ser Ile Val Leu Ala Ala Leu Asn

130                 135                 140His Arg Ala Gly Ala Glu Ile Ala Ala Val Ile Phe Gly Phe Leu Ala145                 150                 155                 160Thr Ala Ala Tyr Ala Val Asn Thr Phe Leu Ala Val Gln Lys Trp Arg

           165                 170                 175Val Ser Val Arg Gln Gln Ser Thr Asn Asp Tyr Ile Arg Ala Arg Thr

        180                185                  190Glu Ser Arg Asp Val Asp Ser Arg Pro Glu Ile Gln Arg Leu Asp Thr

    195                 200                 205<210>9<211>988<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(191)..(661)<400>9ggagggccca tctgggcaag gcccccagcg cctgccttct ctcccggggc cctgtgggca     60agcctcctgc ttcactttca ggtttctcga agtgccttct tgctcctgtc tgtttcccca    120tcctgccaga tttctgtttc tcttgctggg cttttggcag tagggggctg tgttggtggg    180ccctacgaag atg ctc agt gct cga gat cgc cgg gac cgg cac cct gag       229

        Met Leu Ser Ala Arg Asp Arg Arg Asp Arg His Pro Glu

        1               5                   10gag ggg gta gtt gca gag ctc cag ggc ttc gcg gtg gac aag gcc ttc      277Glu Gly Val Val Ala Glu Leu Gln Gly Phe Ala Val Asp Lys Ala Phe

 15                 20                  25ctc acc tcc cac aag ggc atc ctg ctg gaa acc gag ctg gcc ctg acc      325Leu Thr Ser His Lys Gly Ile Leu Leu Glu Thr Glu Leu Ala Leu Thr30                  35                  40                  45ctc atc atc ttc atc tgc ttc acg gcc tcc atc tct gcc tac atg gcc      373Leu Ile Ile Phe Ile Cys Phe Thr Ala Ser Ile Ser Ala Tyr Met Ala

            50                  55                  60gcg gcg cta ctg gag ttc ttc atc aca ctt gcc ttc ctc ttc ctc tat      421Ala Ala Leu Leu Glu Phe Phe Ile Thr Leu Ala Phe Leu Phe Leu Tyr

        65                  70                  75gcc acc cag tac tac cag cgc ttc gac cga att aac tgg ccc tgt ctg      469Ala Thr Gln Tyr Tyr Gln Arg Phe Asp Arg Ile Asn Trp Pro Cys Leu

    80                  85                  90gac ttc ctg cgc tgt gtc agt gcc atc atc atc ttc ctg gtg gtc tcc      517Asp Phe Leu Arg Cys Val Ser Ala Ile Ile Ile Phe Leu Val Val Ser

95                  100                 105ttt gca gct gtg acc tcc cgg gac gga gct gcc att gct gct ttt gtt      565Phe Ala Ala Val Thr Ser Arg Asp Gly Ala Ala Ile Ala Ala Phe Val110                 115                 120                 125ttt ggc atc atc ctg gtt tcc atc ttt gcc tat gat gcc ttc aag atc      613Phe Gly Ile Ile Leu Val Ser Ile Phe Ala Tyr Asp Ala Phe Lys Ile

            130                 135                 140tac cgg act gag atg gca ccc ggg gcc agc cag ggg gac cag cag tga      661Tyr Arg Thr Glu Met Ala Pro Gly Ala Ser Gln Gly Asp Gln Gln

        145                 150                 155ctctggggct acctggctcc taggcccagc cagccagaga ggacagtgga gcccagacac    721gtctcttgat tattatagcc cagcgctaaa cccaaccaag cctaaagagt tggctggagt    781actgggaatt atcttggagc tgtgtcagga ttggtatcat gaatttgcaa gagggacatg    841ggggggggga gggagaaatt gacctagctc ccataattat taaaaaaagg ggcctaatct    901caggccatac cacttttaag gctaataggt taataaggga aaggaaaagt tgactgttag    961acaaccagat  ttttgttata  tatccgc                                  988<210>10<211>156<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>10Met Leu Ser Ala Arg Asp Arg Arg Asp Arg His Pro Glu Glu Gly Val1               5                   10                  15Val Ala Glu Leu Gln Gly Phe Ala Val Asp Lys Ala Phe Leu Thr Ser

        20                  25                  30His Lys Gly Ile Leu Leu Glu Thr Glu Leu Ala Leu Thr Leu Ile Ile

    35                  40                  45Phe Ile Cys Phe Thr Ala Ser Ile Ser Ala Tyr Met Ala Ala Ala Leu

 50                 55                  60Leu Glu Phe Phe Ile Thr Leu Ala Phe Leu Phe Leu Tyr Ala Thr Gln65                  70                  75                  80Tyr Tyr Gln Arg Phe Asp Arg Ile Asn Trp Pro Cys Leu Asp Phe Leu

            85                  90                  95Arg Cys Val Ser Ala Ile Ile Ile Phe Leu Val Val Ser Phe Ala Ala

        100                 105                 110Val Thr Ser Arg Asp Gly Ala Ala Ile Ala Ala Phe Val Phe Gly Ile

    115                 120                 125Ile Leu Val Ser Ile Phe Ala Tyr Asp Ala Phe Lys Ile Tyr Arg Thr

130                 135                 140Glu Met Ala Pro Gly Ala Ser Gln Gly Asp Gln Gln145                 150                 155<210>11<211>1917<212> DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(123)..(674)<400>11caggcggaag ccggggagaa ggcccaggaa gtgacggccg cctcccggct accggggact     60tctggagtcc gagaagtcaa cggcgcggtt gctgcggccg ccgcgctccc cggcccgagg    120cg atg gag aac gga gcg gtg tac agc ccc act acg gag gag gac ccg       167Met Glu Asn Gly Ala Val Tyr Ser Pro Thr Thr Glu Glu Asp Pro1               5                   10                  15ggc ccc gcc aga ggc ccc cgg agc ggc ctc gct gcc tac ttt ttc atg      215Gly Pro Ala Arg Gly Pro Arg Ser Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Phe Met

            20                  25                  30ggc cgg ctc cca ttg ctc cgg cgc gtt ctc aag ggc ttg cag ctg ttg      263Gly Arg Leu Pro Leu Leu Arg Arg Val Leu Lys Gly Leu Gln Leu Leu

        35                  40                  45ctg tct ctg ctg gcc ttc atc tgt gaa gaa gtt gta tca caa tgt act      311Leu Ser Leu Leu Ala Phe Ile Cys Glu Glu Val Val Ser Gln Cys Thr

    50                  55                  60tta tgt gga gga ctt tat ttt ttt gag ttt gta agc tgc agt gcc ttt      359Leu Cys Gly Gly Leu Tyr Phe Phe Glu Phe Val Ser Cys Ser Ala Phe

65                  70                  75ctt ctg agt ctc ctt ata ctg att gtg tat tgc act cca ttt tat gag      407Leu Leu Ser Leu Leu Ile Leu Ile Val Tyr Cys Thr Pro Phe Tyr Glu80                  85                  90                  95aga gtt gat acc aca aaa gta aaa tca tcg gat ttt tat att act ttg      455Arg Val Asp Thr Thr Lys Val Lys Ser Ser Asp Phe Tyr Ile Thr Leu

            100                105                  110gga aca gga tgt gtg ttt ttg ttg gca tcc atc att ttt gtt tcc aca      503Gly Thr Gly Cys Val Phe Leu Leu Ala Ser Ile Ile Phe Val Ser Thr

        115                 120                 125cat gac agg act tca gct gag att gct gca att gtg ttt gga ttt ata      551His Asp Arg Thr Ser Ala Glu Ile Ala Ala Ile Val Phe Gly Phe Ile

    130                 135                 140gca agt ttt atg ttc cta ctt gac ttt atc act atg ctg tat gaa aaa      599Ala Ser Phe Met Phe Leu Leu Asp Phe Ile Thr Met Leu Tyr Glu Lys

145             150                     155cga cag gag tcc cag ctg aga aaa cct gaa aat acc act agg gct gaa      647Arg Gln Glu Ser Gln Leu Arg Lys Pro Glu Asn Thr Thr Arg Ala Glu160                 165                 170                 175gcc ctc act gag cca ctt aat gcc taa agactctggg gagcagatgt            694Ala Leu Thr Glu Pro Leu Asn Ala

            180tacctaaggt agtgaccctg cattgtggtg cctgagccct ggcagaagct cttgtaaaat    754ttgttaattg tttaaaccac ttcttttgga gagcaagggg aaggtcaaga aggcagtttt    814atcaatattg tgtcagtcac cacaaagtag gccagataag ttaaaaaaaa ttttttttta    874aataataatt gaaacttatc tcaaatggag attttggtgg gaggaggaga aaacaattgt    934ttttaaatca cacagctcaa cggttgataa atgattctgt cattctgtta caggtcattc    994ttttactagg cttagcttcc aaattatgct ttatagctgt ataaacatcg tgattatatt    1054catctactta gaaattgttt tatttttaaa ttaatttgct tagctgtttg ttttgatgct    1114tagattatgt tctgttaatg ggaatttaac atatttaaga aaccaatatt taaaatgttg    1174gtctaggttt ttttccttaa catatattac caggctttac tgtatttcac tcagccttaa    1234atgttataat atttttggat aacggttatt aattctttga gaccttcgta tagcctataa    1294aatgtatggg agatgttggt attttatgtg tataaaagca acaatatcag caacttcgtg    1354tttatactgc accttggttg ttgatgtcaa gtaaaaaaaa gattgttttg taacacataa    1414aaaaatggaa gaaactgata ccacacctaa ggaccaaaga taagaaagac tttttgccca    1474agacagtgaa agtaattata aaaacaagct ttgaccactt accaagtatc tgaagagatg    1534agttcatact atgatttaga aagtggttca attcccctgt tggcatatga ttatttttac    1594taaaattaat acagctctgt gggtcttcct tagtgttttc tttgaagcca atctgttttt    1654tttaggacac cagcctttgg tttttcatct gttcgagatg cctcttctct gtctccttat    1714cagatagaaa tggagtcatg tgctgctgct tcatctagca gaggttggcc tctggctctg    1774acactttttg tcagttgtct ttaggtggtc ctgaatcttg ggcccttttg attgtgaata     1834ctgtgtagca ggatcttgag agtccttgtt cttacatagg cattgctcta gtttgtcttt     1894ggcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa                                             1917<210>12<211>183<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>12Met Glu Asn Gly Ala Val Tyr Ser Pro Thr Thr Glu Glu Asp Pro Gly1               5                   10                  15Pro Ala Arg Gly Pro Arg Ser Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Phe Met Gly

        20                  25                  30Arg Leu Pro Leu Leu Arg Arg Val Leu Lys Gly Leu Gln Leu Leu Leu

    35                  40                  45Ser Leu Leu Ala Phe Ile Cys Glu Glu Val Val Ser Gln Cys Thr Leu

50                  55                  60Cys Gly Gly Leu Tyr Phe Phe Glu Phe Val Ser Cys Ser Ala Phe Leu65                  70                  75                  80Leu Ser Leu Leu Ile Leu Ile Val Tyr Cys Thr Pro Phe Tyr Glu Arg

            85                  90                  95Val Asp Thr Thr Lys Val Lys Ser Ser Asp Phe Tyr Ile Thr Leu Gly

        100                 105                 110Thr Gly Cys Val Phe Leu Leu Ala Ser Ile Ile Phe Val Ser Thr His

    115                 120                 125Asp Arg Thr Ser Ala Glu Ile Ala Ala Ile Val Phe Gly Phe Ile Ala

130                 135                 140Ser Phe Met Phe Leu Leu Asp Phe Ile Thr Met Leu Tyr Glu Lys Arg145                 150                 155                 160Gln Glu Ser Gln Leu Arg Lys Pro Glu Asn Thr Thr Arg Ala Glu Ala

            165                 170                 175Leu Thr Glu Pro Leu Asn Ala

        180<210>13<211>1177<212>DNA<213>智人(Homo sa piens)<220><221>CDS<222>(44)..(571)<400>13ggcagctgcc cggggaggcg gtcaggcgag ctggggccgc gca atg tcg cac gga       55

                                            Met Ser His Gly

                                            1gcc ggg ctc gtc cgc acc acg tgc agc agc ggc agc gcg ctc gga ccc      103Ala Gly Leu Val Arg Thr Thr Cys Ser Ser Gly Ser Ala Leu Gly Pro5                   10                  15                  20ggg gcc ggc gcg gcc cag ccc agc gcg agc ccc ttg gag ggg ctg ctg      151Gly Ala Gly Ala Ala Gln Pro Ser Ala Ser Pro Leu Glu Gly Leu Leu

            25                  30                  35gac ctc agc tac ccc cgc acc cac gcg gcc ctg ctg aaa gtg gcg caa      199Asp Leu Ser Tyr Pro Arg Thr His Ala Ala Leu Leu Lys Val Ala Gln

        40                  45                  50atg gtc acc ctg ctg att gcc ttc atc tgt gtg cgg agc tcc ctg tgg      247Met Val Thr Leu Leu Ile Ala Phe Ile Cys Val Arg Ser Ser Leu Trp

    55                  60                  65acc aac tac agc gcc tac agc tac ttt gaa gtg gtc acc att tgc gac      295Thr Asn Tyr Ser Ala Tyr Ser Tyr Phe Glu Val Val Thr Ile Cys Asp

70                  75                  80ttg ata atg atc ctc gcc ttt tac ctg gtc cac ctc ttc cgc ttc tac      343Leu Ile Met Ile Leu Ala Phe Tyr Leu Val His Leu Phe Arg Phe Tyr85                  90                  95                  100cgc gtg ctc acc tgt atc agc tgg ccc ctg tcg gaa ctt ctg cac tat      391Arg Val Leu Thr Cys Ile Ser Trp Pro Leu Ser Glu Leu Leu His Tyr

            105                 110                 115tta atc ggt acc ctg ctc ctc ctc atc gcc tcc att gtg gca gct tcc      439Leu Ile Gly Thr Leu Leu Leu Leu Ile Ala Ser Ile Val Ala Ala Ser

        120                 125                 130aag agt tac aac cag agc gga ctg gta gcc gga gcg atc ttt ggt ttc      487Lys Ser Tyr Asn Gln Ser Gly Leu Val Ala Gly Ala Ile Phe Gly Phe

    135                 140                 145atg gcc acc ttc ctc tgc atg gca agc ata tgg ctg tcc tat aag atc      535Met Ala Thr Phe Leu Cys Met Ala Ser Ile Trp Leu Ser Tyr Lys Ile

150                 155                 160tcg tgt gta acc cag tcc aca gat gca gcc gtc tga tgaggccaca           581Ser Cys Val Thr Gln Ser Thr Asp Ala Ala Val165                 170                 175acccctaggc ccctcaggag ctttgcagag aggaggacgt gtactccagg cgaggcctct    641ggacctgtgt tcctgtgcca aagtcctgtc aggctggtgg gcaccaggaa aggcctgcac    701cctcttcctg ctctcccagg aagccagctc cctgagctcc tgagccagcc ggaaactctt    761cctccagcct tccggggaga acatccctcc cattctggga aaggaaagca gcctccaggg    821aaatgttttc tgccttcctg cttctagaac cacctcaggt actgatgaac cccacttagc    881acagctgaag gggtttgtga atactcccgc ctaaatccct tctacttcac tcctcagggg    941agtgaagtgc cttaagaaac aaagccctgt cctaatttat ctagcttgtc agtccggtct    1001tagagatacc ctctttcctg aagtgaggcg tgcctgtaga aacactatgt ggtcagcctg    1061tccccaagga gatcttgtgt ctcctctcca tctctgcctt tgttaccagt gtgcatgtgt    1121ttgtgtgttt ttttaataaa atattgactc ggccagttaa aaaaaaaaaa aaaaaa        1177<210>14<211>175<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>14Met Ser His Gly Ala Gly Leu Val Arg Thr Thr Cys Ser Ser Gly Ser1               5                   10                  15Ala Leu Gly Pro Gly Ala Gly Ala Ala Gln Pro Ser Ala Ser Pro Leu

        20                  25                  30Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Tyr Pro Arg Thr His Ala Ala Leu Leu

    35                  40                  45Lys Val Ala Gln Met Val Thr Leu Leu Ile Ala Phe Ile Cys Val Arg

50                  55                  60Ser Ser Leu Trp Thr Asn Tyr Ser Ala Tyr Ser Tyr Phe Glu Val Val65                  70                  75                  80Thr Ile Cys Asp Leu Ile Met Ile Leu Ala Phe Tyr Leu Val His Leu

            85                  90                  95Phe Arg Phe Tyr Arg Val Leu Thr Cys Ile Ser Trp Pro Leu Ser Glu

        100                 105                 110Leu Leu His Tyr Leu Ile Gly Thr Leu Leu Leu Leu Ile Ala Ser Ile

    115                 120                 125Val Ala Ala Ser Lys Ser Tyr Asn Gln Ser Gly Leu Val Ala Gly Ala

130                 135                 140Ile Phe Gly Phe Met Ala Thr Phe Leu Cys Met Ala Ser Ile Trp Leu145                 150                 155                 160Ser Tyr Lys Ile Ser Cys Val Thr Gln Ser Thr Asp Ala Ala Val

            165                 170                 175<210>15<211>1177<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>misc_feature<222>(17)..(17)<223>n＝目前尚未确定为何种核苷酸<220><221>CDS<222>(262)..(783)<400>15ttttggcgac ccagcgnccg ctaactccag ggccccagcg cagctcggga gcccgcgcac     60cgaggcgcta ggggcaccgc gcactagagg gacacccgcc gcgcctggac agcccccggc    120gggcgccccc ctcgcacctc ctgccccgcg cgggccgcgc tcccctcccc cgcgcctgtg    180tccccagggc gcagggtcgc gcgtccagcc ccagacccgc cggggtccct ggggacgcgc    240cagcccggca gtggctcgac g atg gag gag ccg cag cgc gcc cgc tcg cac      291

                    Met Glu Glu Pro Gln Arg Ala Arg Ser His

                    1               5                   10aca gtc acc acc acc gcc agc tcc ttc gca gag aac ttc ttc acc agc      339Thr Val Thr Thr Thr Ala Ser Ser Phe Ala Glu Asn Phe Phe Thr Ser

            15                  20                  25agc agc agc ttc gcc tac gac cgg gag ttc ctc cgc acc ctg ccc ggc      387Ser Ser Ser Phe Ala Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Arg Thr Leu Pro Gly

        30                  35                  40ttc ctc atc gtg gcc gag atc gtt ctg ggg ctg ctg gta tgg acg ctt      435Phe Leu Ile Val Ala Glu Ile Val Leu Gly Leu Leu Val Trp Thr Leu

    45                  50                  55att gct gga act gag tac ttc cgg gtc ccc gca ttt ggc tgg gtc atg      483Ile Ala Gly Thr Glu Tyr Phe Arg Val Pro Ala Phe Gly Trp Val Met

60                  65                  70ttt gta gct gta ttt tac tgg gtc ctc acc gtc ttc ttc ctc att atc      531Phe Val Ala Val Phe Tyr Trp Val Leu Thr Val Phe Phe Leu Ile Ile75                  80                   85                 90tac ata aca atg acc tac acc agg att ccc cag gtg ccc tgg aca aca     579Tyr Ile Thr Met Thr Tyr Thr Arg Ile Pro Gln Val Pro Trp Thr Thr

             95                 100                 105gtg ggc ctg tgc ttt aac ggc agt gcc ttc gtc ttg tac ctc tct gcc      627Val Gly Leu Cys Phe Asn Gly Ser Ala Phe Val Leu Tyr Leu Ser Ala

        110                 115                 120gct gtt gta gat gca tct tcc gtc tcc cct gag agg gac agt cac aac      675Ala Val Val Asp Ala Ser Ser Val Ser Pro Glu Arg Asp Ser His Asn

    125                 130                 135ttc aac agc tgg gcg gcc tca tcg ttc ttt gcc ttc ctg gtc acc atc      723Phe Asn Ser Trp Ala Ala Ser Ser Phe Phe Ala Phe Leu Val Thr Ile

140                 145                 150tgc tac gct gga aat aca tat ttc agt ttt ata gca tgg aga tcc agg      771Cys Tyr Ala Gly Asn Thr Tyr Phe Ser Phe Ile Ala Trp Arg Ser Arg155                 160                 165                 170acc ata cag tga tttaccattt tgataattaa aaggaaaaaa aaaggaagac          823Thr Ile Glntctcactgta aaaacagctg taggtataat gtatattccc agagaattgt atttaactaa    883ttaatgtttt ttatattctt aaatttgctc acaaattgtg gtttgttaca attaaactgg    943atacttattt gcaaagtgtt gtagcttata atggactctt aagtatctta ttaatgtatt    1003aatgtcttca tagatcatat tttcttagac aatgtttaaa tagataaatt gctaatattg    1063agaatgtgtc aagtttggaa acctaacttt taagatgcca gattcttttt tgattaaagt    1123tgcaaaatcc aaaaaaaaaa aaaaaatggc ctcgttggcc tcagcggtgg agct          1177<210>16<211>173<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>16Met Glu Glu Pro Gln Arg Ala Arg Ser His Thr Val Thr Thr Thr Ala1               5                   10                  15Ser Ser Phe Ala Glu Asn Phe Phe Thr Ser Ser Ser Ser Phe Ala Tyr

        20                  25                  30Asp Arg Glu Phe Leu Arg Thr Leu Pro Gly Phe Leu Ile Val Ala Glu

    35                  40                  45Ile Val Leu Gly Leu Leu Val Trp Thr Leu Ile Ala Gly Thr Glu Tyr

50                  55                  60Phe Arg Val Pro Ala Phe Gly Trp Val Met Phe Val Ala Val Phe Tyr65                  70                  75                  80Trp Val Leu Thr Val Phe Phe Leu Ile Ile Tyr Ile Thr Met Thr Tyr

            85                  90                  95Thr Arg Ile Pro Gln Val Pro Trp Thr Thr Val Gly Leu Cys Phe Asn

        100                 105                 110Gly Ser Ala Phe Val Leu Tyr Leu Ser Ala Ala Val Val Asp Ala Ser

    115                 120                 125Ser Val Ser Pro Glu Arg Asp Ser His Asn Phe Asn Ser Trp Ala Ala

130                 135                 140Ser Ser Phe Phe Ala Phe Leu Val Thr Ile Cys Tyr Ala Gly Asn Thr145                 150                 155                 160Tyr Phe Ser Phe Ile Ala Trp Arg Ser Arg Thr Ile Gln

            165                 170<210>17<211>459<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(459)<400>17atg gat aac gtg cag ccg aaa ata aaa cat cgc ccc ttc tgc ttc agt       48Met Asp Asn Val Gln Pro Lys Ile Lys His Arg Pro Phe Cys Phe Ser1               5                   10                  15gtg aaa ggc cac gtg aag atg ctg cgg ctg gca cta act gtg aca tct       96Val Lys Gly His Val Lys Met Leu Arg Leu Ala Leu Thr Val Thr Ser

        20                  25                  30atg acc ttt ttt atc atc gca caa gcc cct gaa cca tat att gtt atc      144Met Thr Phe Phe Ile Ile Ala Gln Ala Pro Glu Pro Tyr Ile Val Ile

    35                  40                  45act gga ttt gaa gtc acc gtt atc tta ttt ttc ata ctt tta tat gta      192Thr Gly Phe Glu Val Thr Val Ile Leu Phe Phe Ile Leu Leu Tyr Val

50                  55                  60ctc aga ctt gat cga tta atg aag tgg tta ttt tgg cct ttg ctt gat      240Leu Arg Leu Asp Arg Leu Met Lys Trp Leu Phe Trp Pro Leu Leu Asp65                  70                  75                  80att atc aac tca ctg gta aca aca gta ttc atg ctc atc gta tct gtg      288Ile Ile Asn Ser Leu Val Thr Thr Val Phe Met Leu Ile Val Ser Val

            85                  90                  95ttg gca ctg ata cca gaa acc aca aca ttg aca gtt ggt gga ggg gtg      336Leu Ala Leu Ile Pro Glu Thr Thr Thr Leu Thr Val Gly Gly Gly Val

            100                  105                  110ttt gca ctt gtg aca gca gta tgc tgt ctt gcc gac ggg gcc ctt att      384Phe Ala Leu Val Thr Ala Val Cys Cys Leu Ala Asp Gly Ala Leu Ile

    115                 120                 125tac cgg aag ctt ctg ttc aat ccc agc ggt cct tac cag aaa aag cct      432Tyr Arg Lys Leu Leu Phe Asn Pro Ser Gly Pro Tyr Gln Lys Lys Pro

130                 135                 140gtg cat gaa aaa aaa gaa gtt ttg taa                                  459Val His Glu Lys Lys Glu Val Leu145                 150<210>18<211>152<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>18Met Asp Asn Val Gln Pro Lys Ile Lys His Arg Pro Phe Cys Phe Ser

            5                   10                  15Val Lys Gly His Val Lys Met Leu Arg Leu Ala Leu Thr Val Thr Ser

        20                  25                  30Met Thr Phe Phe Ile Ile Ala Gln Ala Pro Glu Pro Tyr Ile Val Ile

    35                  40                  45Thr Gly Phe Glu Val Thr Val Ile Leu Phe Phe Ile Leu Leu Tyr Val

50                  55                  60Leu Arg Leu Asp Arg Leu Met Lys Trp Leu Phe Trp Pro Leu Leu Asp65                  70                  75                  80Ile Ile Asn Ser Leu Val Thr Thr Val Phe Met Leu Ile Val Ser Val

            85                  90                  95Leu Ala Leu Ile Pro Glu Thr Thr Thr Leu Thr Val Gly Gly Gly Val

        100                105                 110Phe Ala Leu Val Thr Ala Val Cys Cys Leu Ala Asp Gly Ala Leu Ile

   115                  120                 125Tyr Arg Lys Leu Leu Phe Asn Pro Ser Gly Pro Tyr Gln Lys Lys Pro130                  135                 140Val His Glu Lys Lys Glu Val Leu145                 150

Claims (17)

1、一种分离的多核苷酸序列，所述序列包含选自下列序列的成员：

(1)一种编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多核苷酸或其片段；

(2)一种编码如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多核苷酸或其片段；

(3)一种编码如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多核苷酸或其片段；

(4)一种编码如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多核苷酸或其片段；

(5)一种编码如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的多核苷酸或其片段；

(6)一种编码如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的多核苷酸或其片段；

(7)一种编码如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的多核苷酸或其片段；

(8)一种编码如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的多核苷酸或其片段。

2、根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是cDNA。

3、根据权利要求2所述的多核苷酸，其包含选自下列序列的成员：

(1)一种如SEQ ID NO：1所示的多核苷酸或其片段；

(2)一种如SEQ ID NO：3所示的多核苷酸或其片段；

(3)一种如SEQ ID NO：5所示的多核苷酸或其片段；

(4)一种如SEQ ID NO：7所示的多核苷酸或其片段；

(5)一种如SEQ ID NO：9所示的多核苷酸或其片段；

(6)一种如SEQ ID NO：11所示的多核苷酸或其片段；

(7)一种如SEQ ID NO：13所示的多核苷酸或其片段；

(8)一种如SEQ ID NO：15所示的多核苷酸或其片段。

4、根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是基因组DNA。

5、根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是RNA。

6、一种分离的多核苷酸，其包括能够与权利要求1-5中任一权利要求所述多核苷酸杂交，并且和它们具有至少70％同源性的多核苷酸序列。

7、一种含有权利要求1-5中任一权利要求所述多核苷酸的载体。

8、一种含有权利要求7的载体的宿主细胞，其可以经权利要求7的载体转化、转染或转导得到。

9、一种生产多肽的方法，包括以下步骤：

(1)在适于表达的条件下，培养权利要求8所述的宿主细胞；

(2)从细胞培养物中获得权利要求7所述载体携带的多核苷酸编码的多肽。

10、一种多肽，其包含选自下列序列的成员：

(1)一种具有推定的如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其片段；

(2)一种具有推定的如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或其片段；

(3)一种具有推定的如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列或其片段；

(4)一种具有推定的如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或其片段；

(5)一种具有推定的如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或其片段；

(6)一种具有推定的如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列或其片段；

(7)一种具有推定的如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列或其片段；

(8)一种具有推定的如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列或其片段。

11、权利要求10所述多肽的变异体、类似物、衍生物或活性片段。

12、一种与权利要求10所述多肽特异性结合的抗体。

13、一种药物组合物，其含有权利要求10所述多肽或如SEQ ID NO：18所示多肽，以及一种或多种药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。

14、一种拮抗剂，其可以抑制或封闭权利要求10所述多肽的生物活性。

15、一种激活剂，其可以激活权利要求10所述多肽的生物活性。

16、权利要求1所述的多核苷酸或如SEQ ID NO：17所示多核苷酸在制备肌肉萎缩或其它退行性病变，造血***疾病和/或免疫***疾病的药物组合物中的应用。

17、权利要求11所述的多肽或如SEQ ID NO：18所示多肽在制备治疗肌肉萎缩或其它退行性病变，造血***和/或免疫***疾病的药物组合物中的应用。

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