CN1412203A - 藻类多糖的提取分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的藻类多糖的提取分离方法是利用多糖、糖蛋白溶于水的特性，用水提法浸取，并用乙醇分级沉淀的方法分离，最后用阴离子交换柱，和凝胶排阻层析纯化多糖。本发明方法以一般藻类为原料，提取、纯化各种藻类的胞内、外多糖，并且可实现藻蛋白和藻多糖的共同提取，保持蛋白和蛋白多糖的生物活性。最大限度的增加原料的利用率，降低生产成本。本发明方法适合于大规模生产，且能普遍应用于各种藻类多糖的分离纯化。
Description
技术领域
本发明涉及藻类多糖的提取分离方法。
背景技术
海藻是自然界中分布最广的光合原核生物，具有很高的营养价值，海藻蛋白含有人体必需的各种氨基酸，维生素、多种微量元素、γ-亚麻酸和一些天然色素等。藻多糖具有很高的药用价值，在提高人体非特异性免疫功能，抗缺氧、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、降血糖、降血脂方面具有显著的作用。海藻多糖(seaweed polysaccharide，SP)中的活性物质多为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸等单糖组成的水溶酸性、中性多糖。以往的藻多糖提取纯化技术主要集中在胞外多糖的提取上，且常用的是热水浸泡法，例如，中国专利公开号1220999所述的多糖提取技术，结果往往导致多糖蛋白的活性丧失。中国专利公开号1280855所用技术，虽提到破壁问题，但此方法不可避免的导致糖蛋白的变性和某些多糖的水解。再如中国专利公开号1112128所述的方法，虽避免了过高的温度所导致的糖蛋白的损伤，但有可能破坏某些多糖组分。
发明内容
本发明的目的是为克服上述存在问题，提供一种藻类多糖的提取分离方法。本发明的藻类多糖的提取分离方法是利用多糖、糖蛋白溶于水的特性，用水提法浸取，并用乙醇分级沉淀的方法分离，最后用阴离子交换柱，和凝胶排阻层析纯化多糖。具体包括以下步骤：
1)取新鲜藻或藻粉加蒸馏水或磷酸缓冲溶液混合，进行超声破碎；
2)将上述破碎液离心、弃沉淀，取上清；
3)将上清脱去蛋白；
4)在脱去蛋白的溶液中加入2～3倍于该溶液体积的乙醇进行沉淀，离心收集沉淀，丙酮洗涤，干燥，得粗多糖；
5)取粗多糖溶于蒸馏水或Tris-HCl缓冲液，制成饱和溶液，离心弃沉淀，将上清上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，以Tris-HCl为洗脱液，进行NaCl梯度洗脱，苯酚-硫酸法跟踪检测，收集单一峰，透析去离子后上样于sephadexG-100或sephadex G-75柱，以去离子水进行洗脱，收集单一峰，冷冻干燥得纯化的单一藻多糖。
本发明中所说的将上清脱去蛋白的方法，可采用以下几种方法中的任一种：
a)上清用Sevage法脱蛋白；
在上清液中加等体积的氯仿-异戊醇，(氯仿与异戊醇的体积比为5∶1)，震荡后静置2小时，7000～8000rmp离心15分钟，反复多次sevage法脱蛋白直至无蛋白。
b)上清先用蛋白酶酶解，酶解液再用Sevage法脱蛋白；
采用酶解结合Sevage法脱蛋白效果较好，一般用木瓜蛋白酶酶解，在40℃～45℃酶解5小时，酶剂用量为上清0.5％。
c)上清先用季铵盐析，再用Sevage法脱蛋白；
d)上清先用季铵盐析，然后用蛋白酶酶解，酶解液再用Sevage法脱蛋白。
由于藻类蛋白有很高的营养价值，在用Sevage法脱蛋白前，先用季铵(如硫酸铵)进行盐析，则能够析出大部分蛋白，能将去除的蛋白利用起来，且此蛋白可以复性，可作它用。
本发明中，若采用新鲜藻，则新鲜藻与蒸馏水或磷酸缓冲液一般以重量体积比1∶2的比例混合，磷酸缓冲液的pH值为7.6，浓度为50～100mmol/L。若采用藻粉，则藻粉与蒸馏水或磷酸缓冲液一般以重量体积比1∶20的比例混合，磷酸缓冲液的pH值为7.6，浓度为50～100mmol/L。
本发明中，溶解粗多糖的Tris-HCl缓冲液的pH值通常为7～8，浓度为10～50mmol/L。作梯度洗脱的NaCl浓度为0.1-0.8mol/L。
多糖的检测可用苯酚-硫酸法，将0.2ml样品用蒸馏水稀释到2ml，加入6％的苯酚溶液1ml，再加入5ml浓硫酸，反应20分钟后在490nm处检测OD值。
本发明方法以一般藻类为原料，提取、纯化各种藻类的胞内、外多糖，并且可实现藻蛋白和藻多糖的共同提取，保持蛋白和蛋白多糖的生物活性。最大限度的增加原料的利用率，降低生产成本。本发明方法适合于大规模生产，且能普遍应用于各种藻类多糖的分离纯化。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但本发明并不局限于此实施例。
实施例1：
取新鲜螺旋藻藻泥500g，加入1000ml水，室温破碎15分钟。7500rmp.离心15分钟，弃沉淀。加木瓜蛋白酶0.5g，45℃温浴5小时。样品加入等体积的氯仿-异戊醇(氯仿与异戊醇的体积比为5∶1)，剧烈振荡，静置2小时，7500rmp离心10分钟，重复以上步骤，直至无沉淀。上清用2～3倍体积乙醇沉淀(取上清加乙醇，直至无沉淀)。最后沉淀用丙酮洗涤数次，干燥得粗多糖8克，多糖产率为1.6％。
将上述粗多糖溶解于20ml pH值为7.6，浓度为10mmol/L的Tris-HCl中，7500rmp离心10分钟弃沉淀。将上清上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH值为7.6的Tris-HCl作洗脱液，以浓度为0.1-0.8mol/L的NaCl作梯度洗脱，流速控制在6ml/min。收集的产物用苯酚-硫酸法在490nm处检测光吸收值，得到三个吸收峰。分别收集三个吸收峰(组分I、II、III)，并在流动水中透析脱盐。将透析后溶液浓缩，再分别上样于sephadex G-75柱，以双蒸水作洗脱液，流速控制在lml/min，同样用苯酚硫酸法跟踪检测。结果表明，组分I、II、III过G-75后均是一个对称峰，说明此组分为单一组分，将组分I冷冻干燥后得2g白色蓬松的藻多糖。
实施例2：
取50克螺旋藻藻粉，加入1000ml磷酸缓冲液，室温破碎20分钟。7500rmp离心15分钟，弃沉淀。样品加入等体积的氯仿-异戊醇(氯仿与异戊醇的体积比为5∶1)，剧烈振荡，静置2小时，7500rmp离心10分钟，重复4次以上步骤，直至无沉淀。上清用2～3倍体积乙醇沉淀(取上清加乙醇，直至无沉淀)，丙酮洗涤沉淀，干燥得粗多糖4克，产率为8％。
将上述粗多糖溶解于20ml pH值为7.6，浓度为10mmol/L的Tris-HCl中，7500rmp离心10分钟弃沉淀。将上清上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH值为7.6的Tris-HCl作洗脱液，以浓度为0.1-0.8mol/L的NaCl作梯度洗脱，流速控制在6ml/min。收集的产物用苯酚-硫酸法在490nm处检测光吸收值，得到二个吸收峰。分别收集二个吸收峰(组分I、II)，并在流动水中透析脱盐。将透析后溶液浓缩，上样于sephadex G-75柱，以双蒸水作洗脱液，流速控制在1ml/min，同样用苯酚硫酸法跟踪检测。结果表明，组分I过G75后是一个对称峰，将组分I冷冻干燥后得1.5g白色蓬松的藻多糖。
Claims (5)
1.藻类多糖的提取分离方法，其特征是包括以下步骤：
1)取新鲜藻或藻粉加蒸馏水或磷酸缓冲溶液混合，进行超声破碎；
2)将上述破碎液离心、弃沉淀，取上清；
3)将上清脱去蛋白；
4)在脱去蛋白的溶液中加入2～3倍于该溶液体积的乙醇进行沉淀，离心收集沉淀，丙酮洗涤，干燥，得粗多糖；
5)取粗多糖溶于蒸馏水或Tris-HCl缓冲液，制成饱和溶液，离心弃沉淀，将上清上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，以Tris-HCl为洗脱液，进行NaCl梯度洗脱，苯酚一硫酸法跟踪检测，收集单一峰，透析去离子后上样于sephadexG-100或sephadex G-75柱，以去离子水进行洗脱，收集单一峰，冷冻干燥得纯化的单一藻多糖。
2.根据权利要求1所述的藻类多糖的提取分离方法，其特征是步骤3)所说的将上清脱去蛋白的方法有以下几种；
a)上清用Sevage法脱蛋白；
b)上清先用蛋白酶酶解，酶解液再用Sevage法脱蛋白；
c)上清先用季铵盐析，再用Sevage法脱蛋白；
d)上清先用季铵盐析，然后用蛋白酶酶解，酶解液再用Sevage法脱蛋白。
3.根据权利要求1所述的藻类多糖的提取分离方法，其特征是步骤1)新鲜藻与蒸馏水或磷酸缓冲液以重量体积比1∶2的比例混合，磷酸缓冲液的pH值为7.6，浓度为50～100mmol/L。
4.根据权利要求1所述的藻类多糖的提取分离方法，其特征是步骤1)藻粉与蒸馏水或磷酸缓冲液以重量体积比1∶20的比例混合，磷酸缓冲液的pH值为7.6，浓度为50～100mmol/L。
5.根据权利要求1所述的藻类多糖的提取分离方法，其特征是溶解粗多糖的Tris-HCl缓冲液的pH值为7～8，浓度为10～50mmol/L。
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