CN1995062A - 一种小麦麸皮抗冻蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种小麦麸皮抗冻蛋白的制备方法,属于小麦加工副产物的综合利用技术领域。本发明以小麦麸皮为原料,经水提取、硫酸氨沉淀、离子交换色谱、凝胶过滤色谱和冷冻干燥等步骤,分离得到小麦麸皮抗冻蛋白。本发明首次介绍了从小麦麸皮中分离纯化抗冻蛋白的方法。所得小麦麸皮抗冻蛋白产品可用于农业、食品、医学等行业,从而实现小麦麸皮的有效增值和利用。
Description
技术领域
一种小麦麸皮抗冻蛋白的制备方法,属于小麦加工副产物的综合利用技术领域。
背景技术
小麦麸皮是小麦加工的副产物,每年小麦麸皮的产量在2000多万吨以上,资源丰富,值得开发和利用。目前,我国小麦麸皮主要用作畜禽饲料、发酵培养基等,价格低廉,对于许多大型的面粉加工企业来说,如果能实现小麦麸皮的有效增值和利用,将具有十分重要的经济效益和社会效益。
抗冻蛋白是一种具有非依数性降低冰点作用的蛋白质,在动物、植物、昆虫等有机体抵抗外界寒冷环境的过程中具有重要的作用。它在极低的浓度下就可以使有机体提高抵抗寒冷的能力,可以避免在冷冻-解冻后肌体的损伤。因此,抗冻蛋白在农业、食品、医学等领域都具有非常重要的作用。
北方冬小麦在生长过程中,经受冷应激,在其麸皮中会产生抗冻蛋白以抵抗外界的寒冷。因此,以北方冬小麦麸皮为原料,制备抗冻蛋白,可以广泛应用于农业、食品、医学等领域,市场前景广阔。在农业生产中,可以将抗冻蛋白基因转入目标作物,以提高目标作物的耐寒能力,扩展作物的生存环境;在食品工业中,抗冻蛋白具有改善食品质构,延长食品保质期等功能;在医学领域中,抗冻蛋白可以使低温保护***细胞、***和其它体细胞等的存活率提高,可以在冷冻手术中保护肌体细胞等作用。随着抗冻蛋白应用范围的不断扩展,抗冻蛋白的市场将进一步扩大。
发明内容
本发明的目的是提供一种小麦麸皮抗冻蛋白的制备方法,最大限度地将小麦麸皮中的抗冻蛋白提取出来,并对其进行分离纯化,以开发天然有效的低温保护剂,从而实现麸皮的增值和深加工。
本发明的技术方案:以小麦麸皮为原料,用小麦麸皮质量/体积比10倍量的去离子水提取,所得提取液使用80%的硫酸氨沉淀,将沉淀在抗冻蛋白提取液中复溶,浓缩,冻干,得小麦麸皮抗冻蛋白粗品;将小麦麸皮抗冻蛋白粗品再次在抗冻蛋白提取液中复溶,依次经过离子交换柱和凝胶过滤柱进行分离纯化,最终得到小麦麸皮抗冻蛋白,其纯度达到84.47%;
(1)去离子水提取:将小麦麸皮与10倍质量/体积比的去离子水混合,20℃,200转/分钟搅拌4小时,将混合液在2000g的离心力下离心30分钟,收集上清液;
(2)用硫酸氨沉淀:向上清液中缓慢加入硫酸氨粉末,达到80%硫酸氨的饱和浓度,静置60分钟。将静置后的混合液在2000g的离心力下离心30分钟,收集沉淀;
(3)复溶、透析、冻干得到粗品:将沉淀复溶于抗冻蛋白提取液中,将复溶的蛋白液放置于截留分子量为6000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液充分透析;透析后,使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩,当浓缩到本次复溶液原体积的1/15时,停止浓缩,进行冷冻干燥,该冻干粉为小麦麸皮抗冻蛋白粗品;
(4)粗品复溶:将小麦麸皮抗冻蛋白粗品复溶于抗冻蛋白提取液中,浓度为20mg/ml;
(5)离子交换色谱纯化:用DEAE Sepharose Fast Flow柱,Φ30×300mm,对小麦麸皮抗冻蛋白粗品进行分离,分离首先使用1.2ml/min的抗冻蛋白提取液洗脱1小时,接着使用0-1.5M NaCl梯度洗脱,流速为1.2ml/min,紫外检测器检测波长为280nm,收集图1中的P3馏分,将P3馏分放置于截留分子量为6000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液透析,透析后,使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩,当浓缩到本次复溶液原体积的1/15时,停止浓缩,进行冷冻干燥,得到P3馏分冻干粉;
(6)凝胶过滤色谱纯化:将P3馏分的冻干粉复溶于抗冻蛋白提取液中,使用Sephadex G75,Φ20×800mm,进一步进行分离,洗脱液为抗冻蛋白提取液,流速为0.8ml/min,收集图2中的P2馏分,将P2馏分放置于截留分子量为6000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液透析,透析后,使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩,当浓缩到本次复溶液原体积的1/15时,停止浓缩,进行冷冻干燥,标记为P32,即为小麦麸皮抗冻蛋白冻干粉产品。
所用抗冻蛋白提取液的组成为:含1mM蛋白酶抑制剂的20mM磷酸盐缓冲液,pH8.0。
本发明所制备的麸皮抗冻蛋白为纯天然产品,在加工过程中未添加任何有毒,有害的物质,因此可以广泛的应用于农业、食品、医学、生物技术等行业。
本发明的有益效果:通过硫酸氨沉淀、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、冷冻干燥等方法,将麸皮中的抗冻蛋白进行分离,显著的提高了麸皮的价值,为谷物的深加工提出一条新的途径。
附图说明
图1小麦麸皮抗冻蛋白粗品使用离子交换柱的分离效果。
图2P3冻干粉使用凝胶过滤色谱柱的分离效果。
图3HPLC检测小麦麸皮抗冻蛋白的纯度
具体实施方式
实施例1
准确称量小麦麸皮500g,与5000ml去离子水混匀,20℃,200转/分钟搅拌4小时,将混合液在2000g的离心力下离心30分钟,收集上清液。向上清液中缓慢加入硫酸氨粉末,达到80%硫酸氨的饱和浓度,静置60分钟。将静置后的混合液在2000g的离心力下离心30分钟,收集沉淀,并将上述沉淀复溶于抗冻蛋白提取液中(20mM磷酸盐缓冲液,1mM蛋白酶抑制剂,pH8.0),将复溶的蛋白液放置于截留分子量为6,000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液充分透析。透析后,使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩。当浓缩到原体积的1/15时,停止浓缩,进行冷冻干燥,该冻干粉称为小麦麸皮抗冻蛋白粗品,20克左右。
将小麦麸皮抗冻蛋白粗品复溶于抗冻蛋白提取液中,浓度为20mg/ml。使用DEAE Sepharose Fast Flow柱(Φ30×300mm)对上述粗品进行分离,分离首先使用1.2ml/min的抗冻蛋白提取液洗脱1小时,接着使用0-1.5M NaCl梯度洗脱5小时,流速为1.2ml/min,紫外检测器检测波长为280nm,洗脱分离效果如图1。收集图1中的P3,并将P3放置于截留分子量为6000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液充分透析。透析后,使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩。当浓缩到原体积的1/15时,停止浓缩,进行冷冻干燥,得到P3冻干粉0.5克左右。
将上述P3的冻干粉复溶于抗冻蛋白提取液中,使用Sephadex G75(Φ20×800mm)进一步进行分离,洗脱液为抗冻蛋白提取液,流速为0.8ml/min,洗脱7小时,分离效果如图2。收集P2,并将P2放置于截留分子量为6000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液充分透析。透析后,使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩。当浓缩到原体积的1/15时,停止浓缩,进行冷冻干燥,标记为P32,0.3克左右。
将P32复溶于抗冻蛋白提取液,浓度为2mg/ml。使用Shodex KW804 ProteinColume对P32的纯度进行鉴定。结果见图3。色谱条件为50mM磷酸盐缓冲液进行洗脱,洗脱速度为1.0ml/min,紫外检测器波长为220nm。保留时间为11.694分钟的组分为小麦麸皮抗冻蛋白,根据峰面积计算可以发现,小麦麸皮抗冻蛋白的含量为84.47%。
Claims (3)
1、一种小麦麸皮抗冻蛋白的制备方法,其特征是以小麦麸皮为原料,用小麦麸皮质量/体积比10倍量的去离子水提取,所得提取液使用80%浓度的硫酸氨沉淀,将沉淀在抗冻蛋白提取液中复溶,浓缩,冻干,得小麦麸皮抗冻蛋白粗品;将小麦麸皮抗冻蛋白粗品再次在抗冻蛋白提取液中复溶,依次经过离子交换柱和凝胶过滤柱进行分离纯化,最终得到小麦麸皮抗冻蛋白,其纯度达到84.47%;工艺为:
(1)去离子水提取:将小麦麸皮与10倍质量/体积比的去离子水混合,20℃,200转/分钟搅拌4小时,将混合液在2000g的离心力下离心30分钟,收集上清液;
(2)用硫酸氨沉淀:向上清液中缓慢加入硫酸氨粉末,达到80%硫酸氨的饱和浓度,静置60分钟,将静置后的混合液在2000g的离心力下离心30分钟,收集沉淀;
(3)复溶、透析、冻干得到粗品:将沉淀复溶于抗冻蛋白提取液中,将复溶的蛋白液放置于截留分子量为6000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液充分透析;透析后,使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩,当浓缩到本次复溶液原体积的1/15时,停止浓缩,进行冷冻干燥,该冻干粉为小麦麸皮抗冻蛋白粗品;
(4)粗品复溶:将小麦麸皮抗冻蛋白粗品复溶于抗冻蛋白提取液中,浓度为20mg/ml;
(5)离子交换色谱纯化:用DEAE Sepharose Fast Flow柱,Φ30×300mm,对小麦麸皮抗冻蛋白粗品进行分离,分离首先使用流速1.2ml/min的抗冻蛋白提取液洗脱1小时,接着使用0-1.5M NaCl梯度洗脱5小时,流速为1.2ml/min,紫外检测器检测波长为280nm,收集图1中的P3馏分,将P3馏分放置于截留分子量为6000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液透析,透析后,使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩,当浓缩到本次复溶液原体积的1/15时,停止浓缩,进行冷冻干燥,得到P3馏分冻干粉;
(6)凝胶过滤色谱纯化:将P3馏分的冻干粉复溶于抗冻蛋白提取液中,使用Sephadex G75,Φ20×800mm,进一步进行分离,洗脱液为抗冻蛋白提取液,流速为0.8ml/min,收集图2中的P2馏分,将P2馏分放置于截留分子量为6000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液透析,透析后,使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩,当浓缩到本次复溶液原体积的1/15时,停止浓缩,进行冷冻干燥,标记为P32,即为小麦麸皮抗冻蛋白冻干粉产品。
2、根据权利要求1所述的制备方法,其特征是所用抗冻蛋白提取液的组成为:含1mM蛋白酶抑制剂的20mM磷酸盐缓冲液,pH8.0。
3、一种用权利要求1所述方法制备得到的小麦麸皮抗冻蛋白的应用,其特征是用于农业、食品、医学、生物技术行业。
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