CN1378592A - 在无rna酶和有机溶剂的条件下应用切向流过滤来纯化质粒dna的方法 - Google Patents

在无rna酶和有机溶剂的条件下应用切向流过滤来纯化质粒dna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明描述了从含有质粒DNA的原核细胞中纯化该质粒DNA的方法。该方法包括如下步骤:(a)消化所述细胞;(b)将细胞培养约4到24小时以进行裂解并溶解,但不对RNA进行酶促消化;(c)除去来自细胞的裂解物杂质以提供一种质粒DNA溶液;(d)使该溶液流经切向流过滤装置而过滤,以获得含有该质粒DNA的回流液;(e)回收该回流液。

Description

在无RNA酶和有机溶剂的条件下应用切向 流过滤来纯化质粒DNA的方法
                        发明背景
                        发明领域
本发明涉及一种纯化质粒DNA的方法。更明确的说，本发明提供一种简单的、可放大的(scalable)方法，其利用了切向流过滤，从而比传统的基于碱裂解的方法获得更多的高纯度质粒。
                    相关领域的描述
从细胞培养物中纯化质粒DNA是许多研究和药学应用的必要先决条件。一般而言，质粒纯化方法分为两个阶段，初步细胞破碎/质粒分离步骤和随后的一个或多个连续的纯化步骤。初始的分离步骤的最常用方法是两种方法的改进法：一种方法是采用煮沸使质粒释放(Holmes和Quigley，Anal.Biochem.，114：193-197(1981))，第二种方法是采用碱性pH和清洁剂引起细菌膜的溶解(Birnboim和Doly，Nucleic Acids Res.，7：1513-1523(1979))。这两种方法都使质粒DNA从其细胞溶质的位置释放。
除了常用氯化铯梯度超离心(Clewell和Helinski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，62：1150-1152(1969))外，下游纯化步骤常涉及从杂质中选择性沉淀质粒(Lis和Schleif，Nucleic Acids Res.，2：383-389(1975)；Ishaq等.，Biotechniaues，9：19-24(1990)；Kondo等.，Anal.Biochem.，198：30-35(1991)；Chakrabarti等.，Biotech.APPl.Biochem.，16：211-215(1992))，和/或采用柱层析(Horn等.，Human Gene Ther.，6：565-573(1995)；美国专利5,707,812；Chandra等.，Anal.Biochem.，203：169-172(1992)；Marquet等，BioPharm：26-37(1995)；Johnson和Ilan，Anal.Biochem.，132：20-25(1983)；Vincent和Goldstein，Anal.Biochem.，110：123-127(1981))。柱层析方案基于反相(Edwardson等.，Anal.Biochem.，152：215-220(1986)；Johnson等.，Biotechniaues，4：64-70(1986)；van Helden和Hoal，New Nucleic AcidTechniques，Walker编(Humana Press：Clifton，NJ，1988)，pp.61-74))，普通相(Marko等.，Anal.Biochem.，121：382-387(1982))，离子交换(Perbal，APractical Guide to Molecular Cloning(Wiley：New York，1984)，pp.165-175；Colman等.，Eur.J.Biochem.，91：303-310(1978)；Garon和Petersen，Gene Anal.Tech.，4：5-8(1987)；Kim和Rha，Biotech.Bioeng.，33：1205-1209(1989)；Ohmiya等.，Anal.Biochem.，189：126-130(1990))，大小排阻层析(Van Helden和Hoai，同上；Perbal，同上；Cornelis等.，Plasmid，5：221-223(1981)，Micard等.，Anal.Biochem.，148：121-126(1985)；Moreau等.，Anal.Biochem.，166：188-193(1987)；Raymond等.，Anal.Biochem.，173：125-133(1988)；Hansen和Rickett，Anal.Biochem.，179：167-170(1989))，和混合式(Flanagan et，Anal.Biochem.，153：299-304(1986))方法。
代替这些方法的方法包括在质粒纯化时在96-孔板模式的碱裂解时采用0.2微米膜代替离心分离(Ruppert等.，Anal.Biochem.，230：130-134(1995))，使用双水相分离(Cole，Biotechnigues，11：18-24(1991))，和使用离子交换膜(vanHuynh等.，Anal.Biochem.，211：61-65(1993))。通常，这些方法需要其它的纯化步骤，涉及基于有机溶剂的提取(例如，苯酚/氯仿)或沉淀(例如异丙醇，乙醇)步骤，以及外源酶的添加(例如RNase，蛋白酶K)以便产生足够纯度的质粒。
质粒DNA纯化的其它技术还包括基于聚乙二醇的DNA纯化方法(Lis和Schleif，同上；美国专利5,707,812，其中将短链聚合醇加入裂解物中，使裂解物结合到用于纯化的柱或膜上)；质粒DNA的酸-酚纯化(Zasloff等.，Nucleic Acids Res.，5：1139-1153(1978))；和各种用于科研的较小规模质粒DNA纯化方法(Sambrook等.，Molecular Cloning：A Laboratorv Manual，2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press：New York，1989)；Ausubel等编CurrentProtocols in Molecular Biology，(John Wiley & Sons：New York，1989)).Ausubel等编Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley & Sons：NewYork，1989))DNA-RNA分离技术见Roman和Brown，J.Chromatogr.，592；3-12(1992).
切向流过滤(TFF)，或错流过滤是一种流体以冲刷方式直接流过膜表面的分离技术(Gabler，ASM News，50：299(1984))。这种冲刷运动有助于使被膜阻挡的物质不在滤膜表面形成一层，这个情况就是众所周知的浓差极化。TFF可用于使被该膜拦截的溶液(回流液)浓缩和/或脱盐，或收集已流过膜的物质(滤过液)。小于孔径(或标称分子量截留值(NMWC))的物质能够通过膜并且能去热原质、澄清或者与较高分子量或更大的物质分离。大于孔径或NMWC的物质被膜阻隔并且被浓缩，冲洗或与低分子量物质分离。用于TFF的原理、理论和装置在Michaels等，“切向流过滤”，分离技术，药学和生物技术应用(W.P..Olson编，Interpharm Press，Inc.，Buffalo Grove，IL，1995)。也可参见美国专利5,256,294和5,490,937，其描述高效切向流过滤(HP-TFF)，它是TFF的改进技术，和WO 87/04169，其描述了切向流亲和超滤技术，它涉及使待纯化的溶液与一种能选择性结合该待纯化物质的亲和凝胶混合，然后对该溶液进行TFF，使得除结合物以外的所有成分都透过滤膜。
使用物理分离技术例如TFF或其他的错流过滤技术纯化病毒、核酸、噬菌体和其他生物物质的其它方法已有很多出版物提及(Richards和Goldmintz，J.Virol.Methods，4：147-153(1982)；Fernandez等.，Acta Biotechnol.，12：49-56(1992)；Matsushita等.，Kagaku Koaaku Ronbunshu，20：725-728(1994)；Rembhotkar和Khatri，Anal.Biochem.，176：373-374(1989)；WO 98/05673，1998年2月12日公开；EP 307,373；Sekhar等.，Hum.Gene Ther.，7：33-38(1996)).。
随着质粒DNA作为生物药物在基因治疗方面的日益增加的应用，对能用于从转化的原核生物中分离出中等量和大量的这种分子的简单、高效和可放大式纯化工艺的需求不断增加。当前可用于大量产生科研材料或供应临床实验的质粒纯化方法的使用受到多种原因的限制。这些纯化方法涉及使用大量的可燃性有机溶剂(例如乙醇和异丙醇)，有毒化学试剂(例如溴乙锭、酚、和氯仿)。超速离心和“旋转柱(spin-column)”适合于少量科研物质的制备，不适合大量生产生物制药所需的材料。
另外，许多当前的质粒纯化方法涉及RNA酶，特别是牛源RNA酶的加入。基于对牛海绵状脑病(BSE)的考虑，来源于牛的物质在制药方面日益不受欢迎(Hill等.，Nature，389：448-450(1997))。总之，希望避免在质粒制剂中加酶，因为随后这些分子必须通过纯化除去。
涉及凝胶过滤层析的纯化，由于操作中固有的低上样能力而受阻，一份报告报道，上样量限制在柱体积的近2％(McClung和Gonzales，Anal.Biochem.，177：378-382(1989)).。
                        发明的概述
本发明提供一种从原核细胞中纯化质粒DNA的方法，其包括下述步骤：
(a)消化细胞；
(b)培养细胞大约4到24个小时以使其裂解并溶解，但不进行RNA的酶促消化；
(c)除去来自细胞的裂解杂质，以提供一种质粒DNA溶液；
(d)采用切向流过滤装置过滤这种溶液，得到含有该质粒DNA的回流液；
(e)收集回流液。
这种细胞优选是细菌细胞。步骤(c)优选通过离心使细胞裂解物中的质粒DNA与裂解物杂质分离，从而提供一种含有质粒DNA的上清溶液。
在另一实施方案中，本发明提供了含有按照上述方法制备的质粒DNA的组合物。
本文提供了一种简单、可放大、基于过滤的纯化质粒DNA的方法，它可以非常高的产率产生高纯度质粒。这种方法通过将溶解步骤从不足30分钟延长到约4-24小时，改进了经典的基于碱性裂解质粒提取法。提取后新增TFF步骤以纯化残余的杂质。本发明的方法不涉及任何有机溶剂、RNA酶、蛋白酶K的应用、高速离心或柱层析步骤。有机溶剂的使用可引起安全和法令方面的关注，因为可能在最终产物中留下痕量的有机溶剂，而且这些溶剂是有毒的和可燃的，在大规模纯化中大量使用时将引起严重的危险和排放/环境问题。该方法通常每升细菌培养物产生15到20mg的质粒DNA并在改进的碱裂解法步骤后除去残留的99％以上的RNA和95％以上的蛋白。采用这种方法分离的质粒与采用经典氯化铯梯度法分离的质粒相比有相似的转染能力。
由于本发明的质粒DNA已纯化到很高的纯度，它能够有效的用于基因治疗和其他基因传递技术例如涉及脂类载体的技术，可获得重复性高的高效转染。本方法正如所需求能够比较容易按比例扩大投产。
                      附图简述
图1A和图1B是经大小排阻层析评估质粒DNA从RNA中的纯化。图1A是在TFF纯化之前对醋酸钾上清液的分析。图1B描述对TFF最终汇集物的分析结果。数值表示在260纳米的总吸光率的百分数。
                    优选实施方案详述
定义：
这里所述“滤过液”定义为透过了滤膜的样品部分。
这里所述“回流液”定义为没有透过滤膜的样品部分。
“切向流过滤”或“TFF”或“错流过滤”是指一种过滤方法其中使样品混合物循环通过膜的上部，同时应用压力使溶质和小分子透过膜。一般，溶液平行于滤膜而流动，使得流体连续不断的清洁滤膜的表面，排除不可滤过的溶质的阻塞。膜两边的压力差引起流体和可以滤过的溶质流过滤膜。这可通过一种连续流动过程实现，因为溶液在滤膜以上反复流过，而同时，能透过该滤膜的液体被持续抽离至另一个回路中。
这里所述“裂解物杂质”定义为含有所需质粒DNA的混合物中所有不必要的组分，包括染色体DNA、宿主蛋白、细胞碎片包括细胞膜碎片、碳水化合物、小的降解的核苷酸、宿主RNA、脂多糖等等。
短语“不进行RNA的酶促消化”意思是不存在诸如RNA酶等能消化RNA(包括细胞RNA或宿主RNA)的酶。
本文中“分子量截留值”是指被膜截留90％的球状溶质的分子量。参见Filtron目录，1995/96，p.5。能透过膜或被膜截留的颗粒的实际分子量取决于给定分子的大小、构象和电荷，膜孔或基质的性质，以及溶液的电导率和pH值。
本文中“纯化的”质粒是与杂质诸如内毒素、蛋白和RNA分离的，优选至少由大约95％的质粒和大约5％的RNA组成，更优选至少由98％质粒和大约2％RNA组成的质粒，如大小排阻层析在260纳米处测量的那样。优选在这类纯化的质粒制剂中内毒素水平低于300,000EU/ml，更优选低于30,000EU/ml。
                  本发明的实施方式
已发现质粒DNA能利用TFF在无RNA酶的情况下从含有该质粒DNA的原核细胞以大产率高度纯化。优选本文中质粒DNA的大小范围为大约2Kb到50Kb，更优选大约2Kb到15Kb，TFF使用的选择性截留分子量大于约500kD，优选约500kD到1000kD。
本文所述质粒DNA从原核细胞培养物优选细菌发酵物，更优选大肠杆菌的组分分离、或提取。从原核细胞分离的质粒DNA包括自然产生的质粒也包括重组质粒，这种质粒含有目的基因，包括例如标记基因或治疗基因。发酵可以在任何适合所用细胞生长的液体培养基中进行。
本文中要纯化的DNA质粒可以是具有任何特征的任何染色体外DNA分子，只要它的大小范围符合上述规定。质粒可以是高拷贝型、低拷贝型或逃逸质粒，并且可以是单链或双链DNA、超螺旋质粒DNA、或DNA片段。它们可以含有多个遗传元件包括选择性基因、多接头、复制起点、启动子、增强子、前导序列、聚腺苷酰化位点、和终止序列。质粒可含有基本上是任何来源的哺乳动物的基因、优选治疗基因、更优选编码人类目的多肽的基因。这些治疗基因包括能够在合适宿主中表达以补偿宿主细胞中的缺陷型基因或抑表达型基因的功能基因或基因片断，以及表达后抑制宿主细胞基因的功能的那些基因或基因片断，包括例如反义序列，核酶、转显性(transdominant)抑制剂和其类似物。
在消化和裂解细胞以提取质粒DNA之前，一般首先从发酵培养基中收获细胞。从液体培养基中收获细胞的常规方法都是合适的，包括离心、过滤和沉降。
本文所述方法的第一步涉及消化细胞。消化可采用常规程序(例如，Birnboim和Doly的技术，出处同上)，但是优选加入诸如溶菌酶之类的消化酶，混合，然后在低于室温的温度下，优选在冰上保温这些混合物。
本文所述方法的第二步涉及细胞的裂解和溶解，这导致RNA的化学消化。这一步进行约4到24小时，优选约6到24小时，更优选约10到24小时，还更优选约15到24小时，最优选约20到24小时。通常，在收获细胞后，将细胞重悬在缓冲液中，然后用具有裂解和溶解细胞功能的一种或更多的试剂处理指定的时间。这些试剂的例子包括碱(例如稀碱例如氢氧化钠)和/或清洁剂。优选碱和清洁剂一起使用。另一优选实施方案中，为了最大限度的去除内毒素，清洁剂是例如十二烷基硫酸钠(SDS)、胆酸、去氧胆酸、或TRITON X-114TM、最优选SDS或去氧胆酸。为了获得质粒的最大释放和杂质基因组DNA的清除，优选清洁剂是阴离子型，更优选SDS，胆酸，或去氧胆酸，最优选SDS或去氧胆酸。
细胞裂解/溶解步骤在没有消化RNA的酶例如RNA酶存在的情况下进行。优选此方法也在没有可能损害细胞壁的酶处理的情况下进行，这种损害可能是因为任何可能的动物病毒的污染。优选采用不剪切染色体DNA的方法，从而易于将其清除而且避免污染最终的质粒DNA产物。细菌细胞的优选裂解方法涉及Birnboim和Doly，出处同上，描述的碱裂解法或本文实施例1中所报道的其改进法。
在裂解和溶解后，处理细胞以去除裂解物杂质包括细胞碎片如蛋白、细胞壁、或膜，染色体DNA、和宿主蛋白。此去除步骤一般包括沉淀、离心、过滤、和/或沉降，这些步骤取决于采用的细胞类型和裂解方法。如果采用碱裂解，优选将所得裂解物酸化以沉淀染色体DNA和宿主蛋白。然后，细胞碎片和其他杂质优选采用标准方法例如离心、过滤或沉降，优选离心而清除。然后任选采用硅藻土过滤上清溶液使其澄清并且减少上清中宿主RNA的浓度。在适当的条件下，采用沉淀剂从澄清的滤液中沉淀质粒DNA，收集并且重悬于缓冲液。随后，优选在适当的条件下用一种沉淀剂从缓冲液中沉淀宿主RNA、蛋白和脂多糖而非质粒DNA。最后，优选收集滤液，然后在适当的条件下，使用沉淀剂重新沉淀质粒DNA，并且将沉淀的质粒DNA重新悬浮以备后续TFF过滤步骤中使用。
本方法的下一个步骤涉及通过一个TFF装置过滤该溶液。在过滤之前，采用短链聚合醇处理质粒DNA，使其不会结合TFF膜。TFF方法示意图如WO 98/05673的图1所示。实施HP-TFF所用采样装置如美国专利5,256,294的图2、3和4所示。过滤膜根据例如要纯化的质粒DNA的大小和构象来选择，其截留分子量大于约500kD，优选大约500到1000kD。一般而言，用于本文TFF的过滤膜正如Gabler，出处同上，所述。它们一般是微孔(MF)或超滤型(UF)的合成膜；反向渗透(RO)型的膜一般不适用于这种用途，因为它们的孔径范围太小。
一般MF型的孔径为0.1到10微米，它能够阻挡所有大小大于此级别的粒子。超滤膜(UF)有更小的孔，以被截留的球状蛋白来表征。它们可用于从1,000到1,000,000标称分子量(道尔顿)的范围，这对应于约0.001到0.05微米。UF膜一般是不对称的，在上游表面有一薄膜或薄层是其分离能力的真正所在。这种UF膜通常最适合本发明的应用。
本发明的方法很适合于商业或半商业规模的应用。它能够半连续运转，也就是含有所需质粒DNA的溶液连续流动通过一个切向流过滤器，直到大批量溶液全部被过滤，接着从所需质粒DNA中连续流动分离杂质。洗涤步骤也能在过滤步骤之间***。然后能够处理新的批次的溶液。按照这种方法，能够连续循环进行操作，从而在相对较短时间内大量产生具有可接受的纯度的所需产物。
在这样的条件下，质粒DNA被保留在回流液中，而杂质包括许多蛋白、细胞膜碎片，碳水化合物、小的降解的核苷酸等等，透过膜进入滤出液。商业过滤装置包括Pall-Filtron(Northborough，MA)，Millipore(Bedford，MA)，和Amicon(Danvers，MA)。任何可用于进行TFF的过滤装置都在此合适，包括例如平板装置、螺旋卷筒、中空纤维、管式或单片装置、开放通道装置等等。
过滤膜的表面积取决于需要纯化的质粒DNA的量。膜应是低结合力材质，以便将吸附损失降低到最少，优选耐久的，可清洗的并且与所用缓冲液在化学上相容的膜。商业上有许多合适的过滤膜，例如醋酸纤维素类、聚砜类、聚醚砜类和聚偏二氟乙烯类。优选膜的材料是聚砜或聚醚砜。
样品缓冲液通过膜表面时采用切向流循环进行过滤。在TFF期间，在膜的两边加上压力差，其使小的分子通过膜而回流液重新循环。通常调节流速以保持压差恒定。一般而言，压力越大流速越大则过滤越快，但是高流速易于导致核酸在通过膜时发生剪切或损失。另外，各种TFF装置也有一定的操作压力限制。因此，压力应按照制造商的说明书进行调节。平板式装置，优选压力是5到30psi，最优选10到15psi。应选择循环泵以确保对核酸的最少剪切。通常，循环泵是在进料管路上的蠕动泵或隔膜泵，压力通过调节回流阀来控制。
过滤通常按照渗滤模式进行。可选地，样品溶液先不加入缓冲液而进行过滤直至浓缩到所需体积。一旦浓缩完成后，就要加入渗滤缓冲液，将过滤持续到洗去小分子杂质的回流液，并清除不必要的溶剂和盐类。渗滤可以连续也可以不连续。优选连续渗滤而且进行到5到500倍体积的等价物被交换。通常根据所需纯度，核酸结合的杂质越多渗滤的次数越多。
为了进一步提高TFF之后纯化质粒DNA的产率，任选将回流液再循环通过过滤器，此时渗透阀关闭几分钟以清除残留的质粒DNA。回收回流液并且再加入缓冲液冲洗膜过滤器。再收集回流液并与含有纯化的质粒DNA的初始回流液混合。然后将进料液浓缩并对缓冲液例如TRISTM透析获得纯化的质粒DNA。
采用本文TFF方法纯化的质粒DNA可以直接使用或根据初始样品中杂质的水平和类型和所需用途进一步纯化。这样纯化的质粒DNA可以用于许多应用，例如分子生物学应用诸如克隆或基因表达、或用PCR、RT-PEC、树形体的形成(dendromer formation)等等进行的诊断应用。在治疗性应用方面，例如，可用于基因治疗或作为疫苗使用或用于基因免疫，优选进一步纯化TFF步骤得到的质粒DNA。离子交换层析可以用于进一步纯化质粒DNA。
将质粒DNA样品上柱，所用上柱缓冲液的盐浓度低于质粒DNA从层析柱洗脱的浓度。通常，盐浓度为10到50mS，取决于采用的树脂。弱的阴离子交换树脂使用较低电导性的溶液，而强的阴离子交换树脂使用较高电导性溶液。采用几个柱体积的缓冲液洗柱以清除与树脂结合较弱的物质。按照常规方法采用缓慢连续的盐梯度，例如最高至1.5M NaCl的Tris-HCl缓冲液从层析柱上洗脱级分。然后从层析柱上收集样品级分。在中等规模的制备(例如从约100mg到3g质粒DNA)中，预计出现质粒DNA峰时，级分一般为至少50ml到2L，然后增加体积。分别测定每一级分的质粒DNA的产率和纯度。另外，对每一级分进行鲎试剂(LAL)分析，以测定每一份级分中残留的内毒素水平。将含有高水平质粒DNA和低水平内毒素的级分集中。
根据上面的方案纯化的质粒DNA应与脂类载体结合以用于基因治疗，需要将质粒DNA交换进入低电导的缓冲液，优选通过渗滤完成。低电导的缓冲液指电导小于约10mS，优选小于约1mS的任何缓冲液。
在上述方案的各步骤中，对质粒DNA的产率和纯度进行分析测量较有利。这类分析通常在每一步纯化步骤之前和之后进行，并对每一来自，例如制备型离子交换层析的含核酸的级分进行。优选的分析方法包括用高效液相层析(HPLC)或大小排阻层析(SEC)分析纯度，用分光光度法评估产率，用银染色和SDS-PAGE分析蛋白，用琼脂凝胶电泳和Southern印迹分析DNA。
借助于下面的实施例将更充分的理解本发明。但是，这些例子并不限制本发明的范围。所有引用的文献和专利都引入作为参考。
实施例1
材料和方法
VIII因子细胞糊的产生
为了纯化VIII因子质粒，将已用VIII因子基因转化的大肠杆菌(美国专利5,618,788和5,633,150)在10升的发酵罐中培养，用放线菌酮处理以获得最大的质粒DNA产率。
大肠杆菌的转化和过夜发酵
为了纯化质粒而不是VIII因子，将转化感受态大肠杆菌(DH5a)细胞(Gibco-BRL)按照制造商的说明转化以扩增氨苄青霉素抗性(AmpR)质粒。菌落的过夜培养物在补充羧苄青霉素(50mg/mL)的LB培养基中生长。
大肠杆菌的碱裂解
根据Bimboim和Doly，出处同上，方法的改良后对大肠杆菌进行碱裂解，如下所示。每克(湿重)大肠杆菌细胞悬浮在8mL的50mM葡萄糖/25mMTris-HCl/10mM EDTA(GTE)，pH8中。然后加入总量为0.8mL的溶菌酶溶液(GTE中2mg/mL)(Canadian Lysozyme Company，Abbotsford，BritishColumbia)，在混合后，使细胞在冰上培养30分钟。向混合液中每克细胞加入总量为16mL的溶液，该溶液含有0.2mM NaOH和1％SDS(或如所指明的其他洗涤剂)，并在室温下慢慢连续搅拌培养过夜(或指定的时间)。每克细胞加入总量为12mL的5M的醋酸钾，pH4.8，在混合后，将混合物冰浴。在培养10分钟后，将混合物以13,000g离心30分钟。收集上清然后使其通过几层MIRACLOTHTM(Calbiochem-Novabiochem Corporation，San Diego，CA)材料过滤澄清。
采用TFF纯化质粒
如上所述从大肠杆菌分离的质粒DNA在TFF装置(TFF膜包和膜包夹持器来自Pall Filtron Corporation，Northborough，MA)中纯化，处理10到15克(通常在过夜振动培养后观察的量)的细胞采用0.5平方英尺的聚醚砜膜。膜的标称截留分子量为500或1000kDa。TFF装置的进料速度设为0.5升/分钟/平方英尺膜。试验表明为了使初始超滤滤出液中的产率损失降低到最小的程度，超滤前，需要使超滤膜在正常操作条件下用澄清的上清液平衡15到20分钟。所有的试验都在维持恒定的跨膜压力(TMP)的情况下进行。经数次试验测定优选的TMP约10到15psi.。在这些条件下滤液流速接近每平方英尺膜每小时1.5升。为了纯化质粒，将进料溶液浓缩两倍，然后用8-10倍体积的20mM Tris-HCl，pH7.6进行透析。
氯化铯密度梯度离心
采用氯化铯梯度分离质粒的操作如Clewell和Helinski，出处同上，和Miller，Meth.Enzvmol.，152：145-170(Berger和Kimmel，eds)(Academic Press：San Diego，CA，1987)的描述。
大小排阻分析
将100uL样品注射至已用20mM Tris-HCl，pH7.5平衡的TSK-G5000PWTM柱(7.5×300mm)(Tosohaas，Montgomeryville，PA)进行分析。柱以1ml/min的流速运行。通过260nm处的吸光率监测层析柱的流出液。将质粒的洗脱体积与经氯化铯方法标准分离的进行比较。
293细胞的转染和VIII因子活性的分析
将本文的纯化质粒转染进入293人胚肾细胞，该细胞原本维持在含有10％热灭活的胎牛血清的PS19培养基中。用lipofectin试剂(BRL，Gaithersburg，MD)按照制造商的说明书形成脂质/DNA转染复合物，每复合物含1μg质粒DNA。然后将该混合物加入35-mm孔(6孔板)中的细胞中，再加入培养基。在转染后24小时，收集培养基，采用ELISA分析VIII因子并用COATEST VIII：C/4TM试剂盒(Chromogenix AB，Moelndal，Sweden)按照制造商的说明书分析VIII因子的活性。
测定蛋白
用Bradford方法(Bradford，Anal.Biochem.，72：248-254(1976))以牛血清白蛋白作为标准品测定蛋白的浓度。
结果：
影响质粒分离和纯化的因素
分析了几种不同类型的阴离子、阳离子和非离子型洗涤剂在溶菌酶消化后产生可溶性质粒的能力。阴离子洗涤剂，作为一类，对于质粒的释放是最有效的。另外，用EcoR1(New England Biolabs，Beverly，MA)限制酶消化从阴离子洗涤剂制备的质粒制品，未显示基因DNA杂质的存在。最后发现，阴离子洗涤剂类产生的可溶性质粒的内毒素含量低得多(表1)。
                           表1
使用不同的洗涤剂溶解VIII因子质粒对于所得内毒素含量的影响
洗涤剂 内毒素(EU/ml)     n
阴离子型：
SDS  28,000     5
胆酸 220,000     3
去氧胆酸 18,000     2
非离子，两性离子型：
TRITON X-100TM  2,600,000     3
TRITON X-114TM  100,000     1
TWEEN 20TM  600,000     1
TWEEN 80TM  140,000     3
BRIJ 35TM  1,000,000     1
NONIDET NP-40TM  840,000     3
W-1TM  2,700,000     2
ZWITTERGENT 3-14TM  3,000,000     1
阳离子型：
苯扎氯铵 2,5000,000     2
溴化十二烷基三甲基铵 1,300,000     2
溴化十四烷基三甲基铵 1,000,000     1
溴化十六烷基三甲铵 1,000,000     1
调查了在两种不同的洗涤剂存在时暴露于氢氧化钠的时间延长的影响。增加培养时间杂质RNA的总体大小的量均以时间依赖性方式显著降低。培养24小时后，在SDS溶解和螯合溶解的产物中几乎没有探测到RNA。不限于任何理论，认为在暴露于碱性条件的时间延长后，杂质RNA可能充分降解，从而允许质粒DNA通过TFF从RNA和其他低分子量杂质(例如蛋白、内毒素)中纯化。为了最大量的纯化，选择能够截留质粒的最大的膜孔径。500,000和1,000,000Da标称截留分子量的膜可以满足这种需要。采用暴露于氢氧化钠和SDS长达4和24小时的质粒进行初期试验表明优选暴露24小时以便用TFF清除RNA。
纯化的VIII因子质粒的鉴定
与氢氧化钠/SDS培养4或24小时然后采用UF/DF纯化的上述分离的质粒，与用标准氯化铯梯度技术制备的质粒，在用琼脂凝胶上表现相似。采用大小排除层析法评估在质粒制品中共纯化的RNA量。如图1所示，99％以上的杂质RNA通过过滤步骤清除。所得TFF汇集液中的蛋白浓度为10到30μg/ml，这些蛋白构成了醋酸钾上清中的总蛋白减少95％以上。在5步分离制备后，VIII因子质粒的产率为每克细胞(湿重)2.2±0.8mg质粒。内毒素含量为2400±1700EU/ml(n＝3)。
TFF方法纯化的质粒的活性
采用TFF方法分离含有VIII因子基因的质粒DNA并与采用常规CsCl方法(Miller，出处同上)分离的相同的质粒比较转染293-HEK细胞的能力。如表2所示，采用本文中改良的碱裂解法和TFF方法分离的质粒DNA的活性与采用CsCl梯度分离的质粒相似。
                        表2
       TFF和CsCl-纯化的VIII因子质粒的表达水平对比
质粒 VIII因子(ELISA)(mU/ml) VIII因子活性(mU/ml)
TFF纯化型(4小时NaOH培养)     4.0     11.1
TFF纯化型(24小时NaOH培养)     3.8     9.9
CsCl(发酵罐)     2.6     6.3
CsCl(摇瓶)     8.6     14.7
所述方法在多种质粒上的应用
采用六种不同大小的不同质粒评估TFF方法的可信度，所述质粒已转化进入大肠杆菌并在摇瓶中振荡培养过夜。如表3所示，不管回收的质粒大小如何，每一种制品得到最小为每克细胞(湿重)2mg的纯化质粒DNA。
                          表3
            用不同质粒进行的基于TFF的质粒分离
质粒大小(kb) 分子量(kDa) 回收(mg质粒) 产率(mg质粒/g细胞糊)
    5.6     3,600     31     2.8
    5.8     3,700     29     2.6
    6.0     3,900     20     2.0
    6.2     4,000     22     2.2
    7.9     5,100     72     7.3
    10.0     10,000     未测     2.2
结论
这里描述了一种简单、可放大用于纯化大量转染感受态的质粒的方法，这种方法基于延长裂解/溶解时间(约4至24小时)，然后采用TFF纯化。采用这种方法每升过夜培养物产生7到20mg质粒，比先前报道(Ishaq等.，出处同上；Kondo等.，出处同上；Chakrabarti等.，出处同上；Chandra等.，出处同上Miller，出处同上)的数值高几倍。而且采用这种方法分离的质粒具有的细胞转染活性与采用经典方法分离的质粒的水平相当。
采用TFF方法观测到的内毒素比采用其他纯化方法(Miller，出处同上)的含量高。但是，与先前的观察(Cotten等.，Gene Ther.，1：239-246(1994)；Weber等.，Biotechniaues，19：930-940(1995))相反，这样的内毒素含量不会对质粒转染细胞和表达蛋白的能力产生不利影响。况且，如果必要，这些内毒素含量能够通过进一步的纯化例如离子交换层析法基本去除。
这里描述的基于TFF的纯化方法可采用标准的TFF放大原理容易地进行放大。最后，通过对几种不同的分子量的质粒的有效使用，这种方法表明了它的广泛应用性。

Claims (19)

1.一种从含有质粒DNA的原核细胞中纯化该质粒DNA的方法，其包括下述步骤：
(a)消化所述细胞；
(b)在不对RNA进行酶促消化的前提下，将这些细胞培养约4到24小时，以便实施裂解和溶解；
(c)除去细胞裂解物的杂质，以获得一种质粒DNA溶液；
(d)使所述溶液流经切向流过滤装置而过滤，获得含有质粒DNA的回流液；
(e)收集这种回流液。
2.权利要求1所述方法，其中所述细胞是细菌细胞。
3.权利要求1所述方法，其中所述细胞是大肠杆菌的细胞。
4.权利要求1所述方法，其中所述质粒DNA的大小为大约2到50kb。
5.权利要求1所述方法，其中步骤(a)采用溶菌酶进行。
6.权利要求1所述方法，其中步骤(b)进行约10到24小时。
7.权利要求1所述方法，其中步骤(b)进行约20到24小时。
8.权利要求1所述方法，其中所述培养步骤在碱性条件下进行。
9.权利要求1所述方法，其中所述培养步骤在洗涤剂存在的条件下进行。
10.权利要求8所述方法，其中所述培养步骤在洗涤剂存在的条件下进行。
11.权利要求9所述方法，其中所述洗涤剂是离子型的。
12.权利要求11所述方法，其中所述洗涤剂是阴离子型的。
13.权利要求12所述方法，其中所述洗涤剂是十二烷基磺酸钠、胆酸、去氧胆酸。
14.权利要求1所述方法，其中步骤(c)通过离心使裂解物的杂质与质粒DNA分离，得到作为上清液的质粒DNA溶液。
15.权利要求1所述方法，其中所述过滤装置带有截留分子量大于约500kD的膜。
16.权利要求1所述方法，其还包括从回流液中回收质粒DNA。
17.权利要求1所述方法，还包括用一种缓冲液对所述回流液进行透析。
18.权利要求1所述方法，还包括对所述回流液进行离子交换层析。
19.一种组合物，其含有按照权利要求1的方法制备的质粒DNA。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102137708A (zh) * 2008-08-28 2011-07-27 巴克斯特国际公司 使用中空纤维膜浓缩对剪切敏感的生物聚合物的方法
CN103525866A (zh) * 2013-03-22 2014-01-22 人福医药集团股份公司 制备质粒的方法

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6602414B2 (en) * 2000-03-30 2003-08-05 Formulations Pro Molecule separation device and method combining multiple filtration media
WO2002024232A2 (en) * 2000-09-25 2002-03-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Pei: dna vector formulations for in vitro and in vivo gene delivery
US6995246B1 (en) * 2000-10-19 2006-02-07 Akzo Nobel N.V. Methods for removing suspended particles from soluble protein solutions
GB0028361D0 (en) * 2000-11-21 2001-01-03 Glaxo Group Ltd Method of separating extra chromosomal dna from other cellular components
JP3547715B2 (ja) * 2001-03-06 2004-07-28 榮 新垣 ベクター精製用装置及び方法
GB0107634D0 (en) * 2001-03-27 2001-05-16 Fermentas Ab Nucleic acid purification
EP2290098A1 (en) 2002-01-28 2011-03-02 Ambion, Inc. Preparing crude biological extracts using protease, suitable for preparing cDNA
JP2005538717A (ja) 2002-09-13 2005-12-22 ヴァレンティス，インコーポレイテッド 核酸のプレパラティブスケールの精製のための装置および方法
US8501402B2 (en) 2003-03-24 2013-08-06 Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh & Co Kg Methods and devices for producing biomolecules
CN1283792C (zh) 2003-11-14 2006-11-08 余伟明 生物大分子组分相分离法
US7790039B2 (en) * 2003-11-24 2010-09-07 Northwest Biotherapeutics, Inc. Tangential flow filtration devices and methods for stem cell enrichment
SE0400490D0 (sv) 2004-02-26 2004-02-26 Amersham Biosciences Ab Plasmid purification
EP1856262B1 (en) * 2005-01-31 2012-08-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Upstream and a downstream purification process for large scale production of plasmid dna
US20080113357A1 (en) * 2006-06-29 2008-05-15 Millipore Corporation Filter device for the isolation of a nucleic acid
US7964350B1 (en) 2007-05-18 2011-06-21 Applied Biosystems, Llc Sample preparation for in situ nucleic acid analysis
WO2008150826A1 (en) * 2007-05-31 2008-12-11 Ge Healthcare Uk Limited Modified spin column for simple and rapid plasmid dna extraction
EP2088196A1 (en) 2008-02-08 2009-08-12 Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG Methods and devices for producing biomolecules
WO2009129524A2 (en) * 2008-04-18 2009-10-22 The General Hospital Corporation High-throughput plasmid dna preparation
EP2955233A1 (en) 2008-12-19 2015-12-16 Life Technologies Corporation Proteinase K inhibitors, methods and compositions therefor
ES2734973T3 (es) 2009-12-01 2019-12-13 Translate Bio Inc Administración de ARNm para el aumento de proteínas y enzimas en enfermedades genéticas humanas
WO2012135679A2 (en) 2011-04-01 2012-10-04 Emd Millipore Corporation Nanofiber containing composite structures
EP2717893B1 (en) 2011-06-08 2019-05-08 Translate Bio, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods for mrna delivery
WO2013185067A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
EP3467108B1 (en) 2013-03-14 2024-05-22 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
IL290953B2 (en) 2013-03-14 2024-01-01 Ethris Gmbh CFTR mRNA Assemblies and Related Methods and Uses
MX2016005237A (es) 2013-10-22 2016-08-12 Shire Human Genetic Therapies Terapia de acido ribonucleico mensajero para la deficiencia de argininosuccinato sintetasa.
EP3060258A1 (en) 2013-10-22 2016-08-31 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for phenylketonuria
DK178664B1 (en) * 2013-10-25 2016-10-24 Amphi Consult V Martin Hesselsøe Aps A system and a method for concentrating traces of tissue from aquatic organisms in a water sample and use thereof
US10345299B2 (en) 2013-12-18 2019-07-09 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Method for detecting coliform bacteria contained in milk
CN117402871A (zh) 2014-04-25 2024-01-16 川斯勒佰尔公司 信使rna的纯化方法
KR102206959B1 (ko) * 2015-04-17 2021-01-25 이엠디 밀리포어 코포레이션 접선방향 유동 여과 모드에서 작동되는 나노섬유 한외여과막을 사용하여 샘플에서 목적하는 생물학적 물질을 정제하는 방법
DK3294885T3 (da) 2015-05-08 2020-08-10 Curevac Real Estate Gmbh Fremgangsmåde til at fremstille rna
EP4108769B1 (en) 2015-05-29 2023-08-30 CureVac Manufacturing GmbH A method for producing and purifying rna, comprising at least one step of tangential flow filtration
EA201991747A1 (ru) 2017-02-27 2020-06-04 Транслейт Био, Инк. НОВАЯ КОДОН-ОПТИМИЗИРОВАННАЯ мРНК CFTR
CA3063531A1 (en) 2017-05-16 2018-11-22 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mrna encoding cftr
US11174500B2 (en) 2018-08-24 2021-11-16 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger RNA

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3128669A1 (de) * 1981-07-20 1983-02-03 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt "plasmid p svh 1 und seine verwendung"
GB8600582D0 (en) 1986-01-10 1986-02-19 Ca Minister Nat Defence Purifying biological materials
AU605901B2 (en) 1987-09-11 1991-01-24 Ares Trading S.A. Purification process
US5256294A (en) 1990-09-17 1993-10-26 Genentech, Inc. Tangential flow filtration process and apparatus
WO1996002658A1 (en) 1994-07-15 1996-02-01 Merck & Co., Inc. A method for large scale plasmid purification
US6011148A (en) 1996-08-01 2000-01-04 Megabios Corporation Methods for purifying nucleic acids
US5707812A (en) 1996-08-06 1998-01-13 Vical Incorporated Purification of plasmid DNA during column chromatography
EP0853123A1 (de) 1997-01-10 1998-07-15 Roche Diagnostics GmbH Reinigung von DNA durch Cross-Flow-Filtration
CA2995542A1 (en) 1997-09-05 1999-03-11 Genzyme Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of recombinant aav vectors
SE9703532D0 (sv) 1997-09-30 1997-09-30 Pharmacia Biotech Ab A process for the purification of plasmid DNA
AU4314099A (en) 1998-06-01 1999-12-20 Immune Response Corporation, The Novel method of large scale plasmid purification
US6268492B1 (en) 1998-08-10 2001-07-31 Chiron Corporation Methods for purifying non-chromosomal nucleic acid molecules from cells

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102137708A (zh) * 2008-08-28 2011-07-27 巴克斯特国际公司 使用中空纤维膜浓缩对剪切敏感的生物聚合物的方法
CN102137708B (zh) * 2008-08-28 2014-07-09 巴克斯特国际公司 使用中空纤维膜浓缩对剪切敏感的生物聚合物的方法
CN103525866A (zh) * 2013-03-22 2014-01-22 人福医药集团股份公司 制备质粒的方法

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